CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oorD Y SU …

CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oorD Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA

A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori.

FABIAN MATEUS MARTINEZ

TABAJO DE GRADO

Presentado como requisito para optar al título de

MICROBIOLOGO INDUSTIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIA

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTA D.C.

2011

CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oorD Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA

A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori.

FABIAN MATEUS MARTINEZ

DIERECTORA: ALBA ALICIA TRESPALACIOS RANGEL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIA

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTA D.C.

2011

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946

“la Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velara por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes

bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

AGRADECIMIENTOS

Gracias a la Doctora Alba Alicia por permitirme participar en este gran proyecto, por

permitirme aprender cosas nuevas, por enriquecerme no solo como profesional sino

como persona y por enseñarme a aplicar en la práctica lo aprendido durante mi carrera; a

Jenny y Liliana por el apoyo y la colaboración en el laboratorio; a mis amigos y

compañeros que siempre creyeron en mí, y a Paula Ospina por estar conmigo todo el

tiempo dándome fuerzas para continuar en los momentos más difíciles de este proceso,

en el que seguramente habría sido muy difícil continuar sin ese gran apoyo y cariño que

me brindo.

DEDICATORIA

Este trabajo se lo dedico a mi mama, gracias a ella pude lograr ser la persona que soy el

día de hoy, por darme la oportunidad de estudiar y ser cada día mejor gracias a tantos

sacrificios cumplí una de mis grandes metas en la vida; a mi familia completa que siempre

creyeron en mi como profesional y como persona para poder lograr culminar mi carrera

con éxito.

TABLA DE CONTENIDO

1. Resumen…………………………………………………………………………………………………………………. 8

2. introducción……………………………………………………………………………………………………………. 8

3. Justificación del problema y planteamiento del problema……………………………………… 8

3.1 Justificación…………………………………………………………………………………………………………. 8

3.2 Pregunta de Investigación……………………………………………………………………………………. 9

4. Marco Teórico…………………………………………………………………………………………………………. 9

5. Hipótesis………………………………………………………………………………………………………………… 11

6. Objetivos………………………………………………………………………………………………………………… 11

6.1 Objetivo General………………………………………………………………………………………………… 11

6.2 Objetivos Específicos………………………………………………………………………………………….. 11

7. Metodología…………………………………………………………………………………………………………… 12

8. Procedimiento………………………………………………………………………………………………………… 12

9. Diseño……………………………………………………………………………………………………………………. 13

10. Resultados……………………………………………………………………………………………………………. 13

10.1. Mutaciones en el gen oorD………………………………………………………………………………. 14

10.2. CMI y su relación con mutaciones en el gen oorD de H. pylori………………………... 15

11. Análisis de datos obtenidos………………………………………………………………………………….. 17

12. Discusión……………………………………………………………………………………………………………… 19

13. Conclusiones………………………………………………………………………………………………………… 21

14. Recomendaciones………………………………………………………………………………………………… 22

15. Bibliografía…………………………………………………………………………………………………………… 22

1. RESUMEN

Se caracterizaron las mutaciones presentes en el gen oorD de cepas resistentes a

Furazolidona de Helicobacter pylori a partir de aislamientos del microorganismo presente

en biopsias gástricas de 83 pacientes colombianos; se realizo extracción de DNA,

amplificación y posterior secuenciación de las muestras de DNA obtenidas a partir de

dichas muestras y se usaron herramientas estadísticas como Chi cuadrado y test de Kappa

para interpretar los datos y evaluar la relación de las mutaciones con la resistencia de H.

pylori a Furazolidona. Se obtuvieron resultados que indicaron presencia de mutaciones

tanto en las cepas resistentes como en las sensibles al tratamiento con Furazolidona,

mostrando que las mutaciones A408G y C716A no tiene relación con la resistencia a este

antibiótico al haberse presentado en gran cantidad de cepas tanto resistentes como

sensibles y que las mutaciones A489G y C716G si están relacionadas con la resistencia a

Furazolidona por parte del microorganismo.

2. INTRODUCCION

Helicobater pylori es un bacilo Gram negativo, microaerofilico, flagelado que coloniza el

estómago de aproximadamente el 50% de la población mundial y puede causar

enfermedades gastroduodenales como gastritis crónica y carcinoma gástrico (1,2,3).

La erradicación para infecciones causadas por H. pylori resulta en úlceras curadas y puede

reducir el riesgo de cáncer gástrico. A pesar que H. pylori es susceptible a muchos

antibióticos in vitro solo algunos antibióticos pueden ser usados in vivo para erradicar la

infección (3).

3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

3.1. JUSTIFICACION

• En el tratamiento contra H. pylori, el metronidazol es uno de los antibióticos más

utilizados a escala mundial, su empleo en otras afecciones de forma indiscriminada

ha traído como resultado el desarrollo de altos niveles de resistencia. En la terapia

se emplean dosis de 500 mg, 2 veces al día de 1 a 2 semanas combinado con algún

otro antibiótico de segunda línea como amoxicilina o antibióticos bacteriostaticos

como tetraciclina (2).

• En Colombia la prevalencia de la infección es cercano al 80% y no existen

protocolos estandarizados para los imidazoles, solo para el metronidazol, lo que

hace que la resistencia por parte de H. pylori sea un notable problema de salud

publica en nuestro país. Por lo tanto es de gran importancia encontrar nuevas

alternativas para combatir el microorganismo encontrando niveles menores de

resistencia. Una alternativa para remplazar el uso de imidazoles es el uso de

furazolidona, un nitrofurano con características similares a la de los imidazoles

pero con bajas concentraciones mínimas inhibitorias en H. pylori. Por esta razón

usar otras alternativas de tratamiento como la furazolidona que es una muy buena

opción a considerar para lograr erradicar exitosamente este microorganismo.

3.2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN:

¿Es posible encontrar mutaciones en el gen oorD de H. pylori que estén relacionadas con

resistencia a furazolidona?

4. MARCO TEORICO

In vitro H. pylori puede ser inhibido por varios antibióticos, pero in vivo son pocos los

antibióticos que pueden ser utilizados para la erradicación de la bacteria, porque no

tienen la capacidad de llegar a niveles apropiados en la capa de la mucosa gástrica, se

inactivan a pH bajo y por el crecimiento lento de H. pylori (4).

El metronidazol, la calritromicina, la amoxicilina, tetraciclina y los 5-nitrofuranos como

furazolidona son antibióticos ampliamente usados para el tratamiento de H. pylori pero la

resistencia antibiótica de la bacteria principalmente a los imidazoles, ha sido un obstáculo

para su erradicación, sobre todo en países de Latinoamérica, África y Asia, donde la

bacteria tiene una prevalencia hasta del 80%. La infección por H. pylori en estos países es

tratada generalmente con metronidazol, sin embargo estudios recientes han demostrado

que el uso excesivo de este antibiótico para una amplia gama de infecciones, ha

contribuido al desarrollo de resistencia de H. pylori a este tratamiento (4,5).

La resistencia a los imidazoles por parte de la bacteria es dada principalmente por

mutaciones sin sentido presentes en diferentes genes, como fdxA, fdxB, fldA, oorD, PorD,

rdxA y frxA, cuya principal función a nivel bioquímico es producir enzimas con capacidad

redox, que tienen una relación directa con la reducción de los imidazoles activándolos y

resultando en la denaturación del DNA bacteriano (5).

El gen oorD es el gen que codifica para la producción de la enzima 2-oxoglutarato

oxidoreductasa que cataliza la descarbolxilación oxidativa de 2-oxoglutarato para formar

succinil conenzima A (succinil CoA), el mayor intermediario del ciclo de los ácidos

tricarboxilicos. Para producir este compuesto esta enzima cataliza la reducción de

aceptores de electrones de bajo potencial por la reacción:

2-oxoglutarato + CoA + Fdox Succinil-CoA + CO2 + Fdred

La presencia de este gen en H. pylori tiene gran importancia por varias razones, la primera

de ellas es porque este gen podría estar involucrado en la naturaleza microaerofílica de la

bacteria ya que la enzima producida por el gen oorD es altamente sensible al oxígeno.

Otra razón para destacar la importancia del gen oorD es que junto a el gen porD se han

asociado con la resistencia de H. pylori a metronidazol, un antibiótico que al igual que

furazolidona requiere de la reducción de su grupo nitro para ser activado y así una vez en

su forma activa poder atacar el DNA bacteriano causando la muerte del microorganismo;

se cree que la relación que existe entre oorD, porD y la resistencia a metronidazol y

furazolidona se debe a la disminución de la actividad de NADH oxidasa en las cepas

resistentes, lo que hace que aumente la concentración intracelular de oxigeno inhibiendo

así las nitroreductasas encargadas de llevar al metronidazol y furazolidona a su forma

activa (6).

La furazolidona (N-(-5-nitro-2-furfurilidina-)-3-amino-2-oxazolidona) proviene del grupo de

los nitrofuranos sintéticos y posee un gran potencial antimicrobiano. Este fármaco reporta

la inhibición de la biosíntesis de DNA y la división celular a causa de los daños producidos

por el antibiótico en el DNA bacteriano (7). La furazolidona al igual que otros nitrofuranos

deriva su actividad del metabolismo reductivo asociado con nitroreductasas que a través

de la reducción del grupo 5-nitro de la furazolidona a una hidroxilamina intermedia logra

dañar el DNA de la bacteria mediante un ion nitrenium (8, 9).

Figura 1. Reducción del grupo 5-nitro del anillo de Furazolidona (Hall, Et al. 2011)

A pesar de la importancia de este gen en la bacteria no se ha podido determinar de qué

forma o que tanta influencia tiene en la resistencia que desarrolla H. pylori a los

diferentes antibióticos, ya que no es el único gen involucrado en este fenómeno, por lo

tanto la secuenciación del gen podrá ayudar a determinar de que forma este gen influye

en la resistencia desarrollada por la bacteria a la furazolidona (5,6,10).

5. HIPÓTESIS:

Se ha determinado por ensayos anteriores que el gen oorD de Helicobacter pylori confiere

resistencia a furazolidona debido a mutaciones puntuales en varios locus, se puede

afirmar que en los aislamientos obtenidos a partir de biopsias gástricas de población

colombiana se presentan dichas mutaciones.

6. OBJETIVOS

6.1. Objetivo General:

Caracterizar y relacionar las mutaciones en el gen oorD con la resistencia de H. pylori a

Furazolidona en cepas colombianas.

6.2. Objetivos Específicos.

• Amplificar y secuenciar el gen oorD, en cepas de H. pylori susceptibles y resistentes

a Furazolidona.

• Determinar la frecuencia de las mutaciones en los aislamientos estudiados

• Determinar si existe relación entre la presencia de mutaciones y la resistencia a

Furazolidona

• Correlacionar la presencia de mutaciones con los resultados de sensibilidad

antimicrobiana obtenida por la técnica de MIC

7. METODOLOGIA

Tabla 1. Variables usadas en el estudio.

Variable Unidad de medición Tipo de variable

Cepas de H. pylori resistentes y

sensibles a furazolidona.

Cualitativa Independiente

Mutaciones presentes en el gen

oorD de las diferentes cepas

Cualitativa Dependiente

Frecuencia de las mutaciones en las

cepas estudiadas

Numérica Dependiente

8. PROCEDIMIENTO

1. Extracción de DNA de 96 cepas de H. pylori resistentes y sensibles a furazolidona

usando el kit de extracción DNAzol .

2. Amplificación del DNA extraído por medio de la Técnica de PCR usando primers

específicos para oorD reportados en el estudio de Su Et al. 2006.

Tabla 2.

Primers usados para amplificación de DNA por técnica de PCR

PRIMER GEN (enzima) Secuencias Tamaño

fragmento

amplificado

Forward oorD (2-

oxoglutarato

oxidoreductasa)

5´-TTTAGCACAAAGGAGAATG-3´ (457 pb)

Reverse 5´-AACTTGGCGTAATAGGAT-3´

Adaptada de (Su, Et al. 2006)

Tabla 3. Ciclo de amplificación de DNA por medio de la técnica de PCR

Desnaturalización inicial

Desnaturalización Alineación del Primer

Extensión del Primer

95 oC 3 min

95 oC 30 seg

50 oC 30 seg

72oC 30 seg

35 ciclos

3. Secuenciación de los genes amplificados por medio del servicio de la empresa

MacroGen- Korea.

4. Análisis de datos; relación entre mutaciones en el gen y resistencia de H pylori a

Furazolidona

5. Relación entre mutaciones que otorgan resistencia al furazolidona con resistencia a

otros imidazoles como tinidazol y metronidazol

9. DISEÑO

Observacional, Descriptivo, transversal

10. RESULTADOS

Amplificación por PCR y secuenciación de las muestras

La amplificación de las muestras se llevo a cabo usando los primers descritos por Su et al.

Y estandarizando el protocolo amplificación por la técnica de PCR, obteniendo la

amplificación deseada en la mayoría de las muestras enlizadas, esto e comprobó usando la

técnica de electroforesis usando geles de agar de poliacrilamida donde se observaron las

bandas que permitían observar con claridad que las muestras habían sido amplificadas

con éxito como se observa en la figura 2. Posterior a la amplificación por medio de la

técnica de PCR se enviaron las muestras a MACROGEN en donde fueron amplificadas, sin

embargo no todas las muestras pudieron ser amplificadas ni parcial ni totalmente como

fue el caso de las muestras 3, 4, 5, 14, 15 y 49 las cuales fueron excluidas del análisis de

resultados para evitar interpretaciones erróneas de los mismos.

Figura 2. Electroforesis de muestras amplificadas usando técnica de PCR

10.1 Mutaciones del gen oorD

1)

2)

Figura 3. Secuencia del gen oorD en tres diferentes locus (408, 489 y 716) en cepas susceptibles a Furazolidona de H. pylori (1).

Mutaciones encontradas en los tres diferentes locus del gen oorD en 83 cepas de H. pylori relacionadas con resistencia a

furazolidona (2).

En las cepas analizadas y estudiadas se encontraron cuatro diferentes mutaciones en tres

locus del gen diferentes, en el locus 408 una sustitución de A por G que llevo al cambio de

la expresión original de treonina (T) por la expresión de una alanina (A); en el locus 489 se

observo el cambio de A por una G que produjo la expresión de una valina (V) en vez de la

expresión de una isoleucina (I) y por ultimo en el locus 716 donde se realizan dos cambios,

el primero de C (que produciría normalmente asparagina (N)) por A llevando a la

expresión de lisina (K) ò la sustitución de C por G que lleva a la expresión de también de

lisina por parte de la tripleta de nucleótidos resultante de la sustitución como se observa

en a figura 3.

10.2. CMI y su relación con mutaciones en el gen oorD de H. pylori

La resistencia a Furazolidona fue relacionada con las cuatro mutaciones encontradas en

las muestras analizadas y el MIC obtenido en ensayos anteriores realizados en el

laboratorio de Microbiología Especial de la Pontificia Universidad Javeriana.

En el total de las cepas aisladas se obtuvieron un total de 6 cepas resistentes, la número

23, 27, 42, 44, 69, y 74 en donde se observan 2 mutaciones distintas en cada cepa a

excepción de las muestras 69 y 74 la cual solo presenta una, A408G y C716G; A408G y

A489G; A408G y C716G; A408G; y A408G respectivamente. Las cepas sensibles también

presentaron todas las mutaciones a excepción de la A489G que solo se presento en la

cepa resistente numero 27; las mutaciones que más se presentaron fueron la A408G que

se presento en la totalidad de las cepas analizadas y la C716A que se presento en la gran

mayoría de ellas como se observa en la tabla 3 presentada a continuación.

Tabla 3. Relación de CMI y resistencia a furazolidona con resistencia hallada en las cepas estudiadas.

No MIC

MUTACION NUCLEOTIDOS

MUTACION PROTEINA

FURAZOLIDONA CMI ug/ml

PUNTO DE CORTE

RESULTADO POSICISION

A408G POSICISION

A489G POSICISION

C716A POSICISION

C716G POSICISION

T11V POSICISION I38V

POSICISION N113K

1 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO

2 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI









16 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO NO

17 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI

18 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO


20 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI



23 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO SI SI NO SI




27 4 0,5-2 RESISTENTE SI SI NO NO SI SI NO





33 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI SI

34 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI

35 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO





41 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO SI

42 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO SI NO SI NO SI


44 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO SI SI NO SI


46 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO SI




51 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI















69 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO NO SI NO NO





74 4 0,5-2 RESISTENTE SI NO NO NO SI NO NO

75 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI SI




















11. ANÁLISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS.

1. Descriptivo: frecuencias de mutaciones

Tabla 4. Frecuencia de las mutaciones evaluadas en 83 cepas de H. pylori extraídas de biopsias gástricas de pacientes colombianos.

Muestra

Mutación Resistente Sensible Total %

A408G 6 77 83 100

A489G 1 0 1 1,2

C716A 1 31 32 38,55

C716G 2 3 5 6,02

2. Evaluación de la relación entre mutación y resistencia a Furazolidona usando

prueba de Chi cuadrado (X2).

Tabla 5. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación A489G

Presencia mutación Resistente Sensible Total

Si 1 0 1

No 5 77 82

Total 6 77 83

X2= 12,99 P <0,0001

- Existe relación estadísticamente significativa entre la mutación A489G y la

resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas.

Tabla 6. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación C716A


Si 1 31 32

No 5 46 51

Total 6 77 83

X2= 1,308 P= 0,253

- No existe relación estadísticamente significativa entre la mutación C716A y la


Tabla 7. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación C716G


Si 2 3 5

No 4 74 78

Total 6 77 83

X2= 8,52 P= 0,004

- No existe relación estadísticamente significativa entre la mutación C716G y la


3. Comparación de CMI y presencia o ausencia de mutaciones mediante análisis de

concordancia (kappa).


Alguna 4 34 38

Ninguna 2 43 45

Total 6 77 83

Kappa = 0,065 P= 0,286

12. DISCUSION

En el presente estudio se aislaron 83 cepas de H. pylori a partir de biopsias gástricas de

pacientes colombianos donde se obtuvieron varios resultados entre los que se encuentran

la identificación de 6 cepas resistentes a furazolidona con puntos de corte de 4 µg/ml de

furazolidona y cepas sensibles con puntos de corte ≤2µg/ml.

En los 83 asilamientos de H. pylori obtenidos por medio de la extracción de de biopsias

gástricas de pacientes colombianos se encontraron diferentes tipos de mutaciones en las

cuales se observaron cambios de nucleótidos en diferentes locus del gen oorD. En el

trabajo realizado por Su Et al 2006. Se describen cuatro diferentes tipos de mutaciones en

las cuales se encontró sustitución de las bases A por G en la posición 408, A por G en la

posición 489 y C por A ò G en la posición 716. Estas mutaciones encontradas en el gen

oorD se pensaba podrían ser las responsables de la resistencia de H. pylori a furazolidona,

sin embargo en las 83 cepas aisladas en el presente estudio se encontró que la mutación

en la posición 408 en la que se remplaza A por G está presente en la totalidad de las cepas

aisladas, tanto en las resistentes como en las sensibles; esta mutación también descrita

por (Hughes Et al1998). Mostraba una modificación en los aminoácidos de la proteína

específicamente un cambio de treonina por alanina en la estructura de la proteína. Este

hallazgo sugiere que esta mutación ubicada en el nucleótido 408 del gen oorD podría no

estar relacionado con la resistencia que presenta H pylori a furazolidona, sino que podría

tratarse de un polimorfismo presente en la totalidad de las cepas estudiadas por lo que se

debe investigar más a fondo la razón por la cual todas las cepas la presentan y su

frecuencia usando métodos de clonación en cepas recombinantes en las cuales se podría

insertar el gen a evaluar y posteriormente enfrentar el microorganismo genéticamente

modificado al antibiótico de interés para observar si este le otorga o no resistencia (11).

Al igual que la frecuencia de la mutación A408G que se presento en el 100% de las cepas

analizadas, se encontraron mutaciones con una frecuencia media, como en el caso de la

mutación C716A la cual se presento ampliamente (32 cepas) tanto en resistentes como

en sensibles haciendo de esta mutación un potencial polimorfismo que de la misma

manera que la mutación A408G hace presumir que no tienen relación con la resistencia

que presentan algunas cepas de H. pylori a furazolidona.

Las mutaciones con menor frecuencia entre la totalidad de las cepas fueron las C716G que

se presento en 5 cepas de las cuales 2 fueron resistentes y 3 sensibles y la mutación

A489G que se presentó solamente en una cepa resistente. Estas mutaciones se pueden

interpretar de diferentes formas teniendo en cuenta la CMI que presentaron las cepas y el

punto de corte obtenido en la técnica de dilución en agar, ya que en el presente estudio

se tomaron valores de entre 0,5 y 2 µg/ml para cepas sensibles y mayor a 2 µg/ml para cepas

resistentes como reporto Mendonça Et al 2000. Se podría interpretar que un punto de corte de

2µg/ml y de 1µg/ml podrían ser resistencias medias al antibiótico por parte del microorganismo ya

que a pesar de ser valores relativamente pequeños en comparación con otros antibióticos como

metronidazol que presenta una MIC de 8 µg/ml en la mayoría de las cepas aisladas, se observa

inhibición del microorganismos con valores de 0.5µg/ml o menos (13); por lo tanto seria probable

que las mutaciones que otorgan resistencia a furazolidona en H. pylori también estén presentes en

microorganismos con puntos de corte de estos dos valores como sucedió en las cepas con la

mutación C716G las cuales presentaron una MIC de 1, 2 y 4µg/ml.

Un parámetro más para tener en cuenta a la hora de relacionar la resistencia a Furazolidona con

las mutaciones encontradas en las muestras analizadas es las infecciones mixtas que podrían

haberse presentado en las biopsias gástricas extraídas de los pacientes, ya que en ocasiones no se

pudo aislar la cepa pura de H. pylori, se extrajo DNA directamente de la biopsia lo que pudo haber

sido un interferente a la hora de amplificar y secuenciar las muestras mostrando en el

cromatograma de la secuenciación la presencia de varios nucleótidos diferentes en el mismo locus

del gen como se observa en la figura 4.

Figura 4. Cromatograma que muestra la presencia de picos de dos bases (Citosina color azul y Alanina color verde) en la posición 330

del gen que demuestra la presencia de una infección mixta en la muestra numero 69.

En la muestra numero 69 donde está presente la infección mixta se puede observar que la

mutación C716G está presente en una de las cepas amplificadas por lo que se puede atribuir a esta

cepa el resultado de la MIC en el cual se observo la resistencia de la cepa aislada de esta muestra.

Debido a las mutaciones que se presentan a nivel molecular en las cepas estudiadas, se presentan

cambios en la expresión de la proteína, donde se pueden observar variaciones de aminoácidos en

la estructura original de la enzima 2-Oxoglutarato oxidoreductasa; estos cambios de aminoácidos

especialmente el cambio de I por V en la posición 38 puede ser uno de los mayores responsables

de la resistencia de H. pylori a furzolidona, por contribuir a la disminución de NADH oxidasa

haciendo que las concentraciones de O2 aumentaran intracelularmente inactivando las

nitroreductasas que es el mecanismo que se cree responsable a nivel bioquímico de esta

resistencia.

13. CONCLUSIONES

Se encontró que el gen oorD presenta mutaciones que probablemente si estén

relacionadas con resistencia a Furazolidona por parte de H. pylori

Se pudo observar que la mutación A408G descrita por Su Et al. (2006) Como posible

causante de la resistencia a Furazolidona por parte de H. pylori no tiene relación con

este fenómeno ya que se presento en el total de las cepas tanto en resistentes como

en sensibles por lo que podemos concluir que se trata de un polimorfismo.

Se pudo confirmar estadísticamente que las mutaciones C716G y A489G tiene relación

con la resistencia presentada por algunas cepas de H. pylori a Furazolidona.

Fue posible aislar, amplificar y secuenciar el gen oorD de H. pylori y relacionarlo con la

resistencia que presenta el microorganismo a Furazolidona.

14. RECOMENDACIONES

Para confirmar que las mutaciones encontradas en las diferentes cepas resistentes de

H. pylori confieren resistencia a Furazolidona se debería realizar un estudio de

transformación de cepas susceptibles en las cuales se inserte el gen con la mutación a

evaluar y posteriormente enfrentarlo a concentraciones altas del antibiótico y así

determinar fenotípicamente si dichas mutaciones confieren la resistencia al

antibiótico en estudio.

15. BIBLIOGRAFIA

1. Mansour B, burucoa C, Zribi M, Primary resistance to claritromycin, metronidazole

and amoxicillin of Helicobacter pylori isolated from tunisian patients with peptic

ulcers and gastritis: a prospective multicentre study, Annals of Clinical

Microbiology and Antimicrobials 2010, 9:22.

2. Hernandez M, Reyes O, Rodriguez B, The resistence to antibiotics in Helicobacter

pylori, Centro Nacional de Investigaciones Científicas Departamento de

Microbiología e Inmunología, 2008.

3. Jeong J, Mukhopadhyay A, Akada J, Dailididene D, Role of FrxA and RdxA

nitroreductases of Helicobacter pylori in susceptibility and resistance to

metronidazole, Journal of Biotecnology, sept, 2001, pag 5155-5162

4. Gerrits M, Vliet A, Kuipers E, Kusters J, Helicobacter pylori and antimicrobial

resistance: molecular mechanism and clinical implications, Lancet infect dis , 2006

pag 699-709

5. Solca N Bernasconi M, Piffaretti J, Mecanism of Metronidazole Resistance in

Helicobacter pylori: Comparision of the rdxA gene sequences in 30 strains,

Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000 pag 2207-2210.

6. Hughes. N, Clayton. C, Chalk. P; Helicobacter pylori porCDAB and oorDABC genes

encode distinct pyrubate:flavodoxin and 2-oxoglutarate:aceptor oxidoreductases

which mediate electron transport to NADP; Departamente of molecular biology

adn biotechnology, university of Sheffield; journal of bacteriology; 1998, pag 1119-

1128.

7. Basak. J; inter-strand cross-linking of Vibrio cholerae DNA induced by furazolidone:

a quantitative assay by four simple methods; Biophysics division, Saha institute of

nuclear Physics; Fundamental and molecular mechanisms of muagenesis, Elsevier;

1994.

8. Bertenyi. K, Lambert. B; The mutational specificity of furazolidone in the lacI gene

of Escherichia coli; Departament of biology, Carleton university, Ottawa, Canada;

Fundamental and molecular mechanisms of mutagenesis, Elsevier; 1996.

9. Hall. B, Bot. C, Wilkinson. S; Nifurtimox Activation by trypoanosomal type I

nitroreductases generates cytotoxic nitrile metabolites; School of biological an

chemical sciences, Queen Mary University of London; Journal of biological

chimistry; vol 286, pag 13088-13095; 2011.

10. OteroW, Trespalacios A, Oteo E, Helicobacter pylori: Current treatment An

important challenge for gastroenterology,, Asociaciones Colombianas de

Gastroenterología, Endoscopia digestiva, Coloproctología y Hepatología, 2009

11. Arango M, Jaramillo C, Montealegre C; Genotificacion de los polimorfismos -511, -

31 y +3954 de la interleucina-1β humana en una población colombiana con cuadro

de dispepsia; laboratorio de diagnostico molecular y bioinformatica, departamento

de ciencias biológicas, facultad de ciencias, Universidad de los Andes; biomédica

2010; vol 30 pag 199-206.

12. Su. Z, Xu. H, Zhang. C, Shihe. S; Mutations in Helicobacter pylori porD and oorD

genes may contribute to Furazolidone Resistance; Clinical science; 2006.

13. Mendonça. S, Ecclissato. C, Sartori. M; Prevalence of Helicobacter pylori

resistance to Metronidazole, Clarithromycin, amoxicillin, tetracycline, and

Furazolidone in Brazil; Clinica pharmacology and gastroenterology Unit, Sao

Francisco University medica school, Sao Pablo Brazil; Helicobacter vol 5; 2000

CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oorD Y SU …

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