CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE EXPRESION DE GENES PR ...
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Villa de Álvarez, Col., junio de 2013 CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE EXPRESION DE GENES PR MEDIANTE qRT-PCR EN JITOMATE BAJO CONDICIOES DE SIMBIOSIS Claroideoglomus claroideum Xochitl Teniente Castañeda Ingeniería Bioquímica Asesor: Ing. B.Q. Ana Cecilia Ramírez López Villa de Álvarez, Col., 16 de Junio de 2015
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Villa de Álvarez, Col., junio de 2013
CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE
EXPRESION DE GENES PR MEDIANTE qRT-PCR
EN JITOMATE BAJO CONDICIOES DE
SIMBIOSIS Claroideoglomus claroideum
Xochitl Teniente Castañeda
Ingeniería Bioquímica
Asesor:
Ing. B.Q. Ana Cecilia Ramírez López
Villa de Álvarez, Col., 16 de Junio de 2015
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Agradezco a:
Primeramente a Dios por la vida de mis padres José de Jesús Teniente Robles y Catalina
Castañeda Mancilla quienes me brindaron su total apoyo para culminar mi carrera, tanto económica
como moralmente; a mis hermanos quienes fueron testigos de mis desvelos y esfuerzo durante la
realización de mi profesión. A ellos, dedico la victoria de haber llegado a una de mis metas, y quiero
hacerles saber cuan agradecida estoy por ello.
Mis docentes del Instituto Tecnológico de Colima, de los cuales obtuve siempre el apoyo y
sobre todo una gran enseñanza.
Asimismo al Dr. Juan Florencio Gómez Leyva, por darme la oportunidad de trabajar y realizar
este proyecto en convenio con el Instituto Tecnológico de Tlajomulco. Le agradezco a usted por
brindarme nuevos conocimientos y así poder desarrollarme profesionalmente en el área de
investigación.
A todos ustedes, muchas gracias.
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INDICE JUSTIFICACIÓN: ................................................................................................................................... 6
OBJETIVO ............................................................................................................................................ 7
General: ........................................................................................................................................... 7
Específico: ........................................................................................................................................ 7
PROBLEMAS A RESOLVER ................................................................................................................... 7
FUNDAMENTO TEÓRICO .................................................................................................................... 7
Micorrizas ........................................................................................................................................ 7
Tipos de micorrizas .......................................................................................................................... 8
Endomicorrizas ................................................................................................................................ 8
Proceso de infección de la micorriza ............................................................................................... 9
Las micorrizas como agentes protectores de enfermedades. ...................................................... 10
Proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) ............................................................................ 11
β-1,3-glucanasa ......................................................................................................................... 11
Quitina ....................................................................................................................................... 12
Catalasa ..................................................................................................................................... 12
Superóxido dismutasa ............................................................................................................... 13
Peroxidasa ................................................................................................................................. 14
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR ................................................................................................... 14
Extracción de RNA a partir de TRIZOL ....................................................................................... 14
Electroforesis ............................................................................................................................. 15
Cuantificación de la concentración de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría .......... 15
Método de electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) .......................... 16
Tinción de proteínas con Nitrato de plata ................................................................................ 16
PCR en tiempo real .................................................................................................................... 17
PROCEDIMIENTO Y DESRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS ............................................. 18
Establecimiento del sistema de infección utilizando plantas de tomate Micro Tom ................... 18
Aislamiento de esporas micorrizas Claroideoglomus claroideum ................................................ 19
Extracción y cuantificación de proteínas ...................................................................................... 20
Actividades enzimáticas ................................................................................................................ 21
β 1,3-glucanasa.......................................................................................................................... 21
Quitina ....................................................................................................................................... 22
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Catalasa ..................................................................................................................................... 22
Azúcares reductores “DNS” ....................................................................................................... 23
Azúcares totales ........................................................................................................................ 23
Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ................................................ 24
Detección de proteínas con Nitrato de Plata ................................................................................ 25
Extracción de ARN con TRI Reagent® Solution .............................................................................. 26
Cuantificación de RNA ................................................................................................................... 27
Síntesis de ADNc ............................................................................................................................ 27
qRT-PCR en LightCycler Nano ........................................................................................................ 28
RESULTADOS ..................................................................................................................................... 29
Cuantificación de proteínas .......................................................................................................... 30
SDS-PAGE....................................................................................................................................... 30
Determinación de catalasa ............................................................................................................ 32
Como se observa en la Tabla 3, mostraron una similitud de la actividad de catalasa en los dos
ensayos, ya que la mayor cantidad corresponde a las de control seguida por las de micorrizas. 32
Extracción de ARN ......................................................................................................................... 33
qRT-PCR ......................................................................................................................................... 34
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................................... 37
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS ........................................................................ 38
REFERENCIAS .................................................................................................................................... 38
ANEXOS ............................................................................................................................................. 40
FIGURAS Y TABLAS
Fig. 1. Aspecto de las endomicorrizas ................................................................................................ 9
Fig. 2. Proceso de infección a partir de esporas. 1: germinación del hongo en el suelo; 2: desarrollo
del hongo en la raíz; 3: corte transversal de la raíz y observación de las estructuras formadas. . 10
Fig. 3. Germinación de semillas por el método de placa. ............................................................... 18
Fig. 4. Inoculación del sustrato con esporas micorrizicas. .............................................................. 19
Fig. 5. Esporas micorrizas Claroideoglomus claroideum. ................................................................ 20
Fig. 6. Proceso de extracción de proteínas. ..................................................................................... 20
Fig. 7. Método de Bradford en microplaca. ..................................................................................... 21
Fig. 8. Actividad de β 1,3-glucanasa, en microplaca. ....................................................................... 21
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Fig. 9. Actividad de quitinasa. .......................................................................................................... 22
Fig. 10. Actividad de Catalasa........................................................................................................... 23
Fig. 11. Actividad de azucares totales. ............................................................................................. 24
Fig. 12. Equipo y reactivos para la realización del gel de poliacrilamida. ...................................... 24
Fig. 13. Polimerización del gel separador. ....................................................................................... 25
Fig. 14. Triturado de la muestra. ...................................................................................................... 26
Fig. 15. Proceso de extracción de ARN mediante TRI Reagent Solution. ....................................... 27
Fig. 16. Equipo y software LightCycler Nano. .................................................................................. 28
Fig. 17. Comparativa de los tratamientos. ...................................................................................... 29
Fig. 18. Gel de poliacrilamida con tinción de nitrato de plata, en el cual M es el marcador; C1 y C2
son controles; M1 y M2 son de micorriza. ....................................................................................... 31
Fig. 19. Grosor, intensidad e identificación de la bandas mediante el software GelAnalyzer. ..... 32
Fig. 20. Verificación de ARN en gel de agarosa al 1.2%. .................................................................. 33
Fig. 21. ADNc de las plantas control y micorrizicas. ........................................................................ 34
Fig. 22. Graficas de muestras positivas en RT-PCR en tiempo real de oligos a 60 °C. A) Curva de
Ciclos de cuantificación. B) Curva de Disociación. C) Muestras. .................................................... 36
Fig. 23. Graficas de muestras positivas en RT-PCR en tiempo real de oligos a 60 °C. A) Curva de
Ciclos de cuantificación. B) Curva de Disociación. C) Muestras. .................................................... 37
Fig. 24. Verificación de oligos después de realizar el PCR en tiempo real (muestra de micorriza).
........................................................................................................................................................... 37
Tabla 1. Componentes que constituyen el master Mix…………………………………………………………………28
Tabla 2. Evaluación de parámetros fisiológicos de plantas de Tomate en presencia de micorrizas a
los 90 días posinocilación. ................................................................................................................ 29
Tabla 3. Resultados de Catalasa ....................................................................................................... 32
Tabla 4. Resultados del RT-PCR en tiempo real para las plantas de Micorrizas y Control............. 34
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JUSTIFICACIÓN:
El jitomate es una de las hortalizas de mayor importancia a nivel mundial, sin embargo, su
rendimiento se ve afectado por numerosas causas, una de las principales es por problemas
fitosanitarios. Esto ha llevado a desarrollar nuevas tendencias como el uso de la biotecnología a
través del Control Biológico, técnica que implica el conocimiento de microrganismos y su
interacción con las plantas previendo reducir el ataque de enfermedades junto con técnicas
innovadoras que permiten evaluar procesos fisiológicos y bioquímicos en sistemas vegetales.
Además, ayudan a entender ciertos tipos de hongos que favorecen el cuidado de las mismas durante
su sistema de producción.
La justificación para realizar este trabajo es con el fin de aportar al conocimiento del
mejoramiento genético del jitomate (Lycopersicum esculentum), desde un enfoque más puntual con
aplicaciones en la biología molecular de los procesos biológicos relacionados con la genética y
expresiones para la selección, así como un potencial aprovechamiento de características
bioquímicas, que utilizadas en producción agrícola impactan en los aspectos de calidad, sanidad
vegetal, ambiental-ecológico, social y económico; promoviendo un interés en el mercado de
hortalizas, así como globalizar y conservar el acervo genético propio de vegetales.
Por otra parte, las micorrizas pertenecen al grupo de los zigomicetos, forman simbiosis hasta
en un 90% en plantas terrestres. En condiciones favorables, las esporas de los hongos micorrízicos
arbusculares (HMA) germinan para posteriormente iniciar una colonización; debido al carácter de
biotrofos obligados de estos hongos se hace necesario el uso de una planta como hospedero, siendo
el jitomate un cultivo apto por su grado de dependencia micorrízica y de fácil manejo. Durante el
establecimiento de la simbiosis se producen alteraciones citológicas y metabólicas en las células
hospederas, en el cual actúan como señales que se intercambian entre la planta y el hongo. Entre
estos cambios bioquímicos se destacan la variación de actividades enzimáticas, en el cual son
expresadas como mecanismo de defensa, dentro de estas enzimas sobresalen las proteínas de gran
interés para la investigación, que son aquellas relacionadas con la patogénesis (PR). Por lo que su
estudio, facilitaría la comprensión y al mismo tiempo la evaluación de propuestas que determinen
una mayor eficiencia en la aplicación de microorganismos simbióticos a plantas de interés
económico.
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OBJETIVO
General:
Analizar la expresión de los genes PR en jitomate bajo condiciones de simbiosis.
Específico:
1. Establecer un sistema de infección por Micorriza arbuscular (Claroideoglomus claroideum)
en la línea de jitomate MicroTom en condiciones de invernadero.
2. Analizar el perfil de expresión de diferentes genes relacionado a patogénesis (PR) en
condiciones simbióticas mediante análisis de RT-PCR cuantitativo.
3. Analizar el perfil de expresión de las proteínas mediante SDS-PAGE en los diferentes
tratamientos.
4. Realizar ensayos de las actividades enzimáticas de quitinasa, glucanasa, proteasa, catalasa
y superoxido dismutasa (SOD) en los tratamientos.
PROBLEMAS A RESOLVER
Establecer un sistema de confrontación o simbiosis entre planta y micorriza a nivel
invernadero, generando a la vez condiciones óptimas o adecuadas para evaluar la infección.
Aplicar métodos de la biología molecular como extracción y purificación de ácidos nucleicos,
técnicas de reacción en cadena de la polimerasa como qRT-PCR para establecer las
diferencias de expresión génica.
Estandarizar los protocolos para obtener valores óptimos o más exactos.
Determinar si la extracción entre planta y microorganismo es impórtate o relevante para
considerar su aplicación en campo o manejo como biofertlizante o como microorganismo
inductor o con potencial de inducir la resistencia en plantas ante el ataque de patógenos.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Micorrizas
El término micorriza, cuyo significado literal es hongo-raíz, se aplicó por primera vez a las
asociaciones que se establecen entre plantas terrestres y determinados hongos del suelo, siendo
descrito por el patólogo alemán Albert Bernard Frank en 1885 (Frank, A., 1885). Él estableció que
dicha asociación era mutualista dando beneficios a ambos participantes, y comprende la
penetración radical por parte del hongo y la carencia de respuesta nociva hacia éste por parte de la
planta hospedera que lo impida.
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Al ser un fenómeno tan extendido el término “micorrizas” se ha convertido en el nombre
con el que se designan a los hongos implicados en su formación, aunque tal denominación no sea
muy correcta, esas mismas rutas coloquiales han llevado a fijar términos como “micorrizar” (poner
en contacto los hongos micorrizicos con plantas) y “micorrización” (para indicar el establecimiento
de la simbiosis) (Girón, P., 2010).
Tipos de micorrizas
Las plantas terrestres en su mayoría presentan micorrizas, y lo más probable es que las
restantes desciendan de plantas micorrizas que han perdido secundariamente esta característica.
En el caso de los hongos, la mayor parte de las 5000 especies identificadas de micorrizas pertenece
a la división Basidiomycota, mientras que en caso más excepcionales se observan integrantes de
Acomycota. La tercera división que se ha observado formando micorrizas es Glomeromycota, un
grupo que solo se conoce en asociación micorrizógena y cuyos integrantes mueren cuando se les
priva de la presencia de raíces (Read, 1999).
Existen numerosos tipos de micorrizas, que han sido clasificadas en base a su morfología,
fisiología y taxonomía; para esto se pueden distinguir tres grupos que son fundamentales de
acuerdo a su estructura: Ectomicorrizas o formadoras de manto; Ectendomicorrizas, que son las que
incluyen arbutoides y monotropoides; Endomicorrizas, que se caracterizan por la colonización
intracelular del hongo, y a su vez se subdividen en ericoides, orquidoides y asbusculares (Read,
1999).
Endomicorrizas
De esta manera particular, la endomicorriza también conocida como “micorriza vesículo-
arbuscular”, no modifica la morfología de la raíz, sino que es invadida por el micelio. El micelio
invade la raíz, inicialmente es intercelular, pero luego penetra en el interior de las células radicales,
desde la rizodermis hasta las células corticales.
La hifa no septada del hongo crece dentro de las células corticales de la raíz, donde se
forman las vesículas y los arbúsculos (Peterson y Bonfante, 1994). Las vesículas son estructuras de
forma globosa, almacenan sustancias energéticas (lípidos) y funcionan como organelos
reproductivos; crecen dentro y entre las células. Los arbúsculos son estructuras finamente
ramificadas, crecen únicamente dentro de las células y son de vida corta; y son los sitios donde se
realiza el intercambio de nutrimentos entre el hongo y la raíz. Además hifas del hongo son
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abundantes en la corteza radical, desde donde se extienden varios centímetros hacia el suelo
(Campbell, 1987; Castellano y Molina 1989) (Fig. 1); dichas hifas externas absorben agua y
nutrimentos, y en ellas se forman las esporas, que son las estructuras de conservación y
reproducción del hongo.
Fig. 1. Aspecto de las endomicorrizas
Proceso de infección de la micorriza
La infección o colonización de una raíz por parte de un hongo micorrizógeno es un proceso
que involucra una secuencia de etapas reguladoras de una precisa interacción entre endosimbionte
y hospedero. La pre-infección está asociada a la actividad de los propágulo, que pueden ser esporas
o micelios fúngicos. Este último, generalmente se encuentra vinculado a raicillas de plantas vivas o
segmentos de raíz infectada.
La penetración se inicia con la formación de un “punto de entrada” que se caracteriza por
el desarrollo de un abultamiento o apresorio en el punto de contacto sobre la superficie de la raíz.
Cada espora genera un solo punto de entrada, mientras que un segmento de raíz puede
eventualmente generar más de uno.
Una vez que penetre el hongo se asegura un proceso proliferativo que conduce al
establecimiento de una unidad de colonización que puede extender hasta un centímetro de
distancia a partir del punto de penetración. El avance de la infección está restringido a la epidermis
y el parénquima cortical. La unidad de colonización avanza mediante el crecimiento de hifas
aceptadas que se extienden por entre las células corticales y que generan estructuras características
como los arbúsculos y las vesículas (Fig. 2). Algunas semanas después inicia la infección, el hongo
está en condiciones de esporular, lo cual está sujeto a las condiciones ambientales del suelo, en
10
particular la humedad parece ser un factor regulador de importancia, ya que se ha visto que el estrés
hídrico en el suelo dispara la esporulación.
Fig. 2. Proceso de infección a partir de esporas. 1: germinación del hongo en el suelo; 2: desarrollo del hongo en la raíz; 3: corte transversal de la raíz y observación de las estructuras
formadas.
Las hifas externas están en capacidad de reinfectar el mismo sistema de raíz del cual se
origina. Algunas de estas hifas generan “puntos de entrada” que provocan nuevas unidades de
colonización, lo cual supone que la infección avanza a lo largo de la raíz a través de unidades de
colonización discontinua. Este proceso de proliferación se puede trasladar a otros sistemas de raíz
vecinos de la misma o diferente especie de planta.
Las micorrizas como agentes protectores de enfermedades.
Se conoce que gracias a estos microorganismo que están asociados con las raíces ha sido
ampliamente examinados por su papel en suprimir de manera natural o inducida ciertas
enfermedades del suelo, algunos de los cuales pueden extender esta efectividad al resto de la planta
tras activar estos mecanismo de defensa, que pueden reducir el síndrome o síntomas de algunas
enfermedades foliares, este proceso se ha referido como Resistencia Sistémica Inducida (RSI). La RSI
difiere de los mecanismos de antagonismo de receptor, esto se debe porque su acción está basada
en mecanismos de defensa vegetal que son activados por agentes inductores; una vez expresado la
RSI se activan mecanismos de defensa potencialmente múltiples, en el cual participan ciertas
proteínas que incluyen incrementos en la actividad de quitinasas, β-1,3-glucanasas, peroxidas y
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otras proteínas relacionadas con la patogénesis (PR); por ello son muy importantes estos agentes
ya que pueden controlar al patógeno al ser expresados por la misma planta (Escalona, 2002).
En este sentido Cordier et al., (1998) han reportado que la formación de la micorriza
arbuscular induce no únicamente una resistencia localizada, sino que puede inducir una resistencia
sistémica en la raíz de tomate infectadas por P. parasittca. La cual es caracterizada por una gran
reducción en el daño de las raíces y en el desarrollo del hongo, involucrando la acumulación de
moléculas relacionadas con la defensa en asociación con las reacciones de la pared en las raíces del
huésped (Escalona, 2002).
Algo muy importante que se ha demostrado es el hecho de la disminución en el daño de
tejido radical no inoculado del sistema micorrizado, lo que confirma que la liberación de moléculas
inducidas por la simbiosis micorrizica arbuscular en las raíces pueden defender todo el sistema
(Escalona, 2002). Así mismo se ha planteado la posibilidad de un efecto compensatorio en plantas
inoculadas con micorrizas, encontrando que a pesar de que haya infección del patógeno en las hojas,
existe gran producción de las estructuras reproductivas y que las micorrizas permiten que la planta
tenga una buena producción de granos.
Proteínas relacionadas con la patogénesis (PR)
Las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) son inducidas en respuesta a la infección
de las plantas frente a determinados patógenos. Estas se definen como un grupo de polipéptidos
que se acumulan en situaciones patológicas o relacionadas con otros tipos de estrés (Nadal, 2006).
Tienen pesos moleculares relativamente bajos (10-80 Kda), son estables a pH ácido, poseen puntos
isoeléctricos extremos, exhiben alta resistencia a la degradación proteolítica y se secretan al espacio
extracelular o se confinan a una vacuola. Actualmente, estas proteínas se clasifican en 11 familias
(Nadal, 2006) denominadas desde PR-1 hasta PR-11, cada una de las cuales presenta miembros,
tipos y propiedades que las caracterizan. A continuación se describen algunas de las proteínas
relacionadas con la patogénesis.
β-1,3-glucanasa
Las proteínas de grupo PR-2 conocidas comúnmente como enzimas 1,3 glucosidasas o 1,3
glucanasas, son enzimas de la clase hidrolasas, que catalizan la hidrólisis de polímeros de glucano
con enlaces 1,3. El -glucano es un homopolímero de D-glucosa unido en una configuración. La
actividad de la 1,3 glucanasa se divide en dos tipos fundamentalmente: exo y endo. Las
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exoglucanasas hidrolizan la cadena del -glucano por rupturas secuenciales de residuos de glucosa
del terminal no reductor, y como consecuencia los productos de hidrólisis son glucosas. De la misma
manera, las endoglucanasas rompen en sitios al azar de la cadena de polisacáridos, liberando
pequeños oligosacáridos. Para que la hidrólisis ocurra, en la estructura deben estar situados, al
menos, dos residuos de glucosas adyacentes. Las 1,3 glucanasas (GLU) se encuentran altamente
reguladas y están distribuidas ampliamente en las semillas. Hay evidencias de que las GLU son parte
de la defensa de las plantas contra hongos patógenos. Además, tienen importantes funciones en
diversos procesos fisiológicos y del desarrollo, incluyendo embriogénesi, división celular,
germinación de la semilla, movilización de las reservas almacenadas en el endospermo, crecimiento
del tallo y maduración del fruto (Nadal, 2006).
Quitina
La quitina es el polímero más abundante en la naturaleza, después de la celulosa, está
formada por aminoazúcares unidos entre sí por enlaces glicosídicos β-(1→4), que forman una
cadena lineal de unidades de N-acetil-2-amino-2-desoxi-D-glucosa, algunas de las cuales se
encuentran desacetiladas y que desempeñan un papel importante en su estructura molecular, ya
que le permiten formar auténticos tejidos que confieren resistencia y soporte como a las paredes
celulares de muchos hongos, como ascomicetos, basidiomicetos, 1-2-5 ficomicetos e imperfectos.
Está también presente en algunos tunicados y algas clorofíceas. Por su insolubilidad en agua,
tamaño, complejidad molecular y composición heterogénea, la quitina no se degrada dentro de la
célula, sino que los microorganismos recurren a la secreción de enzimas quitinolíticas con diferente
especificidad para transformarla o hidrolizarla como 6 fuente de carbono y nitrógeno. La quitinasa
es una enzima capaz de hidrolizar quitina insoluble en sus componentes oligo y monoméricos. La
actividad de la quitinasa ha sido encontrada en numerosas bacterias y Streptomicetos, hongos,
plantas, invertebrados y vertebrados. Desempeña una función importante en la digestión de
alimentos quitinosos, y puede también servir como enzima potencialmente defensiva contra
patógenos quitinosos (Castro, et. al. 2011).
Catalasa
La catalasa (CAT) es una homoproteína tetramérica, cuyo centro activo está formado por un
grupo hemo en cada subunidad, y está presente en todos los organismos aeróbicos, que existe como
múltiples isoenzimas codificadas por genes nucleares que se encuentran principalmente en los
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peroxisomas y glioxisomas. Las isoenzimas de catalasa difieren en propiedades bioquímicas, así
como en su especificidad, pero su función principal probablemente implica conversión de ácidos
grasos, además de su relación con la lignificación y la fotorrespiración (Mejia, 2014).
La catalasa actúa fundamentalmente sobre el peróxido de hidrogeno producido en la
fotorrespiración y en la β-oxidación de los ácidos grasos, pero a pesar de su restringida localización,
esta enzima desempeña un importante papel en la defensa celular frente al estrés oxidativo, ya que
la reducción de su actividad se relaciona con la acumulación de H2O2, es decir, la expresión del gen
CAT puede ser inducido por este; también se considera como una molécula que se difunde
fácilmente a través de la membrana (Paula, 1994) por que puede ser eliminado en zonas distantes
de su lugar de formación.
Superóxido dismutasa
La enzima superóxido dismutasa (SOD), originalmente descubierta por MacCord y Fridovich
en 1969, es una metaloproteína que cataliza la disminución del radical superóxido para formar
oxigeno molecular y peróxido de hidrogeno. Se conocen tres familias principales de SOD que difieren
en el metal constituyente del grupo protético: cobre/zinc (Cu/Zn-SOD), menganeso (Mn-SOD) o
hierro (Fe-SOD). Estos tres grupos de enzimas, con gran variedad de isoenzimas, presentan diferente
localización subcelular, en el caso de la forma mitocondrial (SOD2), utiliza menganeso como
cofactor, o cobre o zinc en el caso de la forma citosólica (SOD1), y en el cloroplasto dependen de
fierro (SOD3). Estos cofactores activan el centro catalico de la enzima para llevar a cabo la
diminución del anión superóxido (Paula, 1994).
El papel fisiológico de la SOD ha sido objeto de numerosas investigaciones, en la que se le
atribuye un efecto protector frente al daño oxidativo producido por distintas condiciones de estrés
ambiental. La tolerancia a la desecación en plantas superiores y musgos se ha relacionado con la
existencia de elevados niveles de antioxidantes y con una mayor actividad SOD, capaces de evitar la
peroxidación lipídica y las alteraciones de membrana inducidas por deshidratación. La actividad SOD
está también relacionada con la sensibilidad de los tejidos vegetales a las bajas temperaturas y a la
invasión por patógenos. La resistencia a la acción de ciertos patógenos se caracteriza por el
desarrollo de una reacción de hipersensibilidad que origina la muerte de las células próximas al lugar
de penetración del patógeno. Para llevar a cabo esta respuesta, la célula mantiene muy bajos niveles
de actividad SOD, lo que permite que el radical superóxido y las demás especies activas del oxígeno
desencadenen los procesos degenerativos que desembocan en la muerte celular.
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Peroxidasa
La peroxisada (POD) es una hemoproteína monomérica que cataliza la oxidación de un
amplio número de sustrato (fenoles, aminas aromáticas, e hidroquinas) utilizando peróxido de
hidrogeno como cofactor. Se encuentra en la peroxisomas, en los cloroplastos, en las vacuolas y en
la pared celular (Cerón L. E., 2006). Además de estar relacionada en la protección de la célula contra
daños oxidativos causados por el H2O2, también interviene en el pardeamiento enzimático y en los
procesos infecciosos. Así mismo, participa en varios procesos celulares como: desarrollo y
organogénesis de la planta, senescencia, defensa de patógenos y heridas.
Un incremento en la actividad y en la expresión de isoenzias de peroxidasas es característico
de la defensa de las plantas.
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
Extracción de RNA a partir de TRIZOL
El protocolo del método de extracción de RNA total con TRIzol fue elaborado por
Chomcynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi, 1987), el cual está conformado por una solución
monobásica de fenol, isotiocianato de guanidina, y otros componentes propietarios que facilitan el
aislamiento de una variedad de especies de ARN de tamaño molecular grande o pequeño. El reactivo
TRIzol mantiene la integridad del ARN debido a la inhibición altamente eficaz de la actividad de
RNasa, mientras que interrumpen en las células y la disolución de los componentes celulares de la
muestra durante la homogeneización. Este reactivo permite el procesamiento simultáneo de un
gran número de muestras, y es una mejora para el método de aislamiento de ARN en una sola etapa,
también permite realizar la precipitación secuencial de ARN, DNA y proteínas a partir de una sola
muestra (Chomczynski, 1993). Después de homogeneizar la muestra con reactivo TRIzol se añade
cloroformo, permitiendo que el homogeneizado se separe en una capa transparente superior
acuosa (que contiene ARN), una interface, y una capa orgánica inferior rojo (que contiene el ADN y
las proteínas); en el cual RNA se precipita a partir de la capa acuosa con isopropanol; el ADN se
precipita partir de la interface y la capa orgánica con etanol; y la proteína se precipita a partir del
sobrenadante de fenol-etanol por precipitación con isopropanol. El precipitado de ARN, ADN, o
proteína se lava para eliminar impurezas y, se resuspenden para su uso en aplicaciones posteriores.
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Electroforesis
La mayoría de los polímeros biológicos poseen carga eléctrica y por lo tanto, son capaces de
migrar bajo la influencia de un campo eléctrico. El transporte de partículas a través de un disolvente
mediante un campo magnético recibe el nombre de electroforesis (Freifelder, 2003).
La separación de los fragmentos de ADN se realiza por electroforesis en geles de agarosa
(generalmente en horizontal) o poliacrilamida (comúnmente en vertical). En ambos casos, el gel se
separa con distintas concentraciones en función del tamaño de los fragmentos del ADN que se
quieren separar (José Luque, 2006).
Una vez separadas, las moléculas de ADN se visualizan normalmente por la florescencia de
distintos compuestos que se unen a ellas. Aunque el más utilizado es el bromuro de etidio, va siendo
sustituido por otros fluorocromos con mayor poder de detección o menor toxicidad.
Cuantificación de la concentración de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría
Uno de los métodos más simples y utilizados con mayor extensión para determinar la
cantidad de ácidos nucleicos presentes en una solución determinada, es medir la cantidad de luz de
una longitud de onda especifica absorbida por la solución (Karp, 2009). El instrumento empleado
para esta medición es un espectrofotómetro.
Para efectuar este tipo de medición, se coloca la solución en un recipiente especial de cuarzo
de caras aplanadas la cual se coloca en el trayecto de haz de luz del espectrofotómetro. La cantidad
de luz que pasa a través de la solución sin absorberse, es decir la luz transmitida, se mide mediante
fotoceldas situadas en el lado opuesto de la cubeta.
Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes
de onda comprendidas entre los 210 y 300 nm. La absorbancia máxima de las soluciones de ADN y
ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm. Dado que las soluciones
de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm, y las que contienen proteínas hacen lo propio
a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 y 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación
del grado de pureza de los ácidos nucleicos (Somma, 2015).
Los cocientes A260/A280 respectivamente del ADN y el ARN puros son aproximadamente de
1.8 y 2.0; con un paso de luz de 10 nm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A=1
corresponde aproximadamente a 50 µg/ml de ADN bicatenario, 37 µg/ml de ADN monocatenario,
40 µg/ml de ARN o 30 µg/ml de oligonucleótidos.
16
Método de electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
La electroforesis es un método analítico semipreparativo, en el que se separan
biomoléculas, en dependencia entre otros factores de su carga y bajo la acción de un campo
eléctrico, fue empleado por primera vez por Tiselius en el año 1937. Raymond y Weintraub en 1959
emplearon como soporte para la electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE), posteriormente el
método fue perfeccionado por varios investigadores como Davis y Ornstein. La popularidad de este
creció rápidamente y se logró un aumento de la resolución. El dodecil sulfato de sodio (SDS) se
introduce en esta técnica en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes reductores y SDS en la
determinación del peso molecular de proteínas en lo que se denominó electroforesis en geles de
poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE).
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es
químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y
reproducible. Forma además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua,
relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo
prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede
modificar de manera controlada el tamaño del poro.
Tinción de proteínas con Nitrato de plata
Para poder visualizar las proteínas separadas mediante electroforesis (SDS-PAGE) es
necesario emplear métodos de tinción con colorantes orgánicos o bien transferir el gel a una matriz
para que se unan con anticuerpos específicos en alguna proteína de interés.
La tinción con sales de plata fue introducida originalmente por Switzer en 1979, pero a
través del tiempo ha tenido diversas modificaciones, encontrando actualmente una gran variedad
de protocolos que nos permiten realizarla, pero de manera general estos protocolos se clasifican en
dos: la tinción con plata amoniacal o también conocida como tinción alcalina y la tinción ácida donde
se utiliza nitrato de plata. Cada protocolo tiene diferentes ventajas dependiendo del tiempo,
sensibilidad, costo y compatibilidad con otros métodos analíticos, especialmente la espectrometría
de masas (uso de glutaraldehido o formaldehído). Pero los mecanismos precisos de estas tinciones
se basan en la unión de los iones de plata a las cadenas laterales de los aminoácidos (principalmente
grupos carboxilo), que en condiciones adecuadas se reducen a plata metálica, lo que permite
visualizar las proteínas fijadas al gel como bandas o manchas de color marrón.
17
PCR en tiempo real
Los primeros que sentaron las bases para desarrollar la PCR en tiempo real fueron Higuchi
y colaboradores, en 1992, al video grabar en tiempo real la incorporación de bromuro de etidio al
ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV. Desde entonces, el objetivo de la PCR en
tiempo real ha sido detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el
uso de reporteros fluorescentes en la reacción.
El principio de la técnica se basa en la PCR punto final, sólo que la forma en cómo se detectan
y analizan los productos de la amplificación es diferente. El término en tiempo real se refiere a que
la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el
término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra,
a diferencia de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la
secuencia blanco. Precisamente, estas últimas dos características representan grandes ventajas de
la PCR en tiempo real, ya que el producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la
reacción sin que haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa para conocer si la
reacción fue exitosa como sucede en la PCR punto final. La nomenclatura que se usa también es
diferente, si utilizamos ADN genómico entonces hablamos de una qPCR (quantitative PCR), si por lo
contrario, primero obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR.
Actualmente, la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos
nucleicos. Aun teniendo una cantidad muy pequeña de templado, el sistema garantiza una alta
sensibilidad, especificidad y eficiencia. Una de sus aplicaciones más usadas es para cuantificar
cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles del ARNm
procedente de células o tejidos. La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a
partir de concentraciones bajas a diferencia de la PCR, punto final que necesita una mayor
concentración (Tamay de Dios L. et. al., 2013).
Los componentes químicos en la PCR en tiempo real, son los mismos utilizados en la PCR
punto final, sólo que generalmente la enzima, dNTP’s, Mg +, el buffer y el sistema reportero de
fluorescencia para detectar los productos amplificados se venden juntos en una solución conocida
como «Master mix», el agua es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas. Los
primers deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta especificidad y para que
generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb; si éstos son más grandes, la
eficiencia de la reacción disminuye considerablemente.
18
PROCEDIMIENTO Y DESRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
Establecimiento del sistema de infección utilizando plantas de tomate Micro Tom
Las semillas de tomate Micro Tom fueron proporcionadas por el laboratorio de biología
molecular del Instituto Tecnológico de Tlajomulco; en el cual las plantas obtenidas para los ensayos
correspondientes se germinaron por el método en placa, el cual consiste en desinfectar las semillas
(ver Anexos I) y llevarlas a germinar en una caja petri con papel filtro (previamente estéril) y agua
estéril, manteniéndose después en el cuarto de germinación por una semana (Fig. 3).
Fig. 3. Germinación de semillas por el método de placa.
Se colocaron un total de 50 semillas por caja, las germinadas (50%), fueron transplantadas
a macetas de 8.5cm x 9.5cm en sustrato estéril, el cual está conformado por peat moss y perlita en
una proporción de 2:1 respectivamente. Se tomaron 20 plantas, las cuales fueron inoculadas con 40
esporas de micorrizas (obtenidas de plantas de cebolla) justo a la mitad del sustrato (Fig. 4). Para
mantener una nutrición eficiente, se les aplico una vez por semana 15 ml de solución Steiner, baja
en fosfato (20ppm), y se colocaron en un vivero que tiene un sistema de riego automático
(regándose dos vece por día).
19
Fig. 4. Inoculación del sustrato con esporas micorrizicas.
Aislamiento de esporas micorrizas Claroideoglomus claroideum
Para la inoculación de las plantas con esporas de microrriza Claroideoglomus claroideum,
estas fueron aisladas por el método de tamizado en húmedo; que consiste en tomar una muestra
de suelo a una profundidad de 20 cm. Posteriormente, se pesan 50 g de suelo, y se disuelven en un
litro de agua, la mezcla es agitada vigorosamente y puesta a reposar por 15 seg. Después se hace
pasar por los tamices en orden ascendente a su apertura de malla de 40, 80 y 100 micras; seguido
de esto se vertió el sobrenadante en el tamiz, se vuelve a lavar la muestra que quedo en el recipiente
con 500 ml de agua, se agita y se deja reposar por 15 seg y se vuelve a verter en el tamiz; este
proceso se repitió 3 veces. Una vez terminado, se tomaron muestras de suelo del tamiz de 100
micras y se repartió en tubos de centrifuga de 15 ml, se equilibró con agua y llevo a centrifugarse a
2500 rpm por 3 min. Posteriormente se decantó el agua y se resuspendió el sólido en una solución
de sacarosa al 60% y tween 80 al 2%, se agito vigorosamente y se centrifugo nuevamente. Al
término, se pasó el sobrenadante a un papel filtro en un embudo Buchner, para su extracción a
vacío, los sólidos fueron enjuagados con abundante agua. Por último se vaciaron las muestras que
están contenidas en el papel filtro a una caja petri y se revisaron en un microscopio estereoscópico
(Fig. 5); a partir de ahí se aislaron las esporas con ayuda de una micropipeta de 200 µl.
20
Fig. 5. Esporas micorrizas Claroideoglomus claroideum.
Extracción y cuantificación de proteínas
Para la extracción de proteínas se utilizaron las plantas en la última etapa de desarrollo, es
decir, al inicio de la etapa de floración y obtención de fruto; para esto se pasaron 100 mg de tejido
fresco (hojas), las cuales fueron macerados en 0.5 ml de buffer Tris-HCl 50mM pH 7.2 (Fig. 6); se
dejó reposar a 4 °C por 1 hora, posteriormente el homogenizado se centrifugo a 14,000 rpm por 5
min a 4°C. El sobrenadante se recolectó para realizar las mediciones de actividad enzimática y su
perfil proteico.
La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford en microplaca en
un espectrofotómetro de UV-visible, el cual consiste en tomar 10 µl de muestra y 200 µl de colorante
de Bradford, leyéndose la λ 595 nm (Fig. 7).
Fig. 6. Proceso de extracción de proteínas.
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Fig. 7. Método de Bradford en microplaca.
Actividades enzimáticas
β 1,3-glucanasa
Para la cuantificación de la actividad β 1,3-glucanasa se desarrolló por el método descrito
por Ippolito, A., et. al., (2000) efectuando modificaciones en volúmenes de muestras y reactivos
utilizados.
En un tubo eppendorf de 2ml se colocó 250 μl de extracto vegetal, se agregó 2 volúmenes
de laminarin 0.5% y se llevó a incubación en “baño María” a temperatura de 37°C durante 30
minutos. La reacción fue detenida agregando 500 μl de reactivo de DNS (Anexo VI). Se colectaron
200 μl de sobrenadante y fueron puesto en una celda de microplaca, la lectura se registró a una λ
570 nm (Fig. 8).
Fig. 8. Actividad de β 1,3-glucanasa, en microplaca.
Para la curva estándar de la glucosa, se preparan a partir de una solución de glucosa
preparada a 1 mg/ml; para ello se pesaron 25 mg de glucosa y se disolvieron en 25 ml de agua
destilada (dependiendo de la cantidad necesitada). Los estándares se preparan en un tubo de 2ml
(Anexo VI).
22
Quitina
Para cuantificar la actividad de quitinasa se realizó de la misma manera para la
determinación de β 1,3-glucanasa; en el cual se colocaron 250 μl de extracto vegetal, se agregaron
2 volúmenes de quitina coloidal al 0.2% en un tubo eppendorf de 2 ml; se llevó a incubación en
“baño María” a temperatura de 37°C durante 30 minutos. Se detiene la reacción agregando 500 μl
de DNS. Se colecta 200 μl de sobrenadante para colocar en celda de microplaca y se registra la
lectura de absorbancia a 570 nm (Fig. 9).
Fig. 9. Actividad de quitinasa.
Para la curva de la quitinasa, los puntos de la curva se preparan a partir de una solución de
N-acetil-D-glucosamina preparada a 1 mg/ml; para ello: se pesaron 25 mg de GlcANc en 25 ml de
agua destilada dependiendo de la cantidad necesitada. Los estándares se preparan en un tubo de
2ml (Anexo VII).
Catalasa
Para esta prueba, se coloca 115 μl de buffer fosfato de sodio (0.05 M, pH 7.8)*, en seguida
se pipeteo 76 μl de agua desionizada seguido de 23 μl de H2O2 (0.1 M). Al final se agregó 16 μl de
muestra de extracto vegetal y se registró la lectura a 240 nm en periodos de 30 segundos durante 5
minutos (Fig. 10), expresando los resultados como concentración de nM H2O2/s/mg proteína.
23
Fig. 10. Actividad de Catalasa.
Azúcares reductores “DNS”
La concentración de azúcares reductores se determinó utilizando una curva de calibración
de absorbancia en función de concentración. Para obtener esta curva se prepararon soluciones de
0.2-1 mg/ml, de glucosa como estándar. A estas soluciones se les agrego el reactivo DNS y se leyó
la absorbancia de cada dilución a una longitud de onda 540 nm (ver Anexo VIII).
Para la evolución se tomaron50 μl de cada muestra con 50 μl del reactivo DNS, se colocaron
a ebullición (90-100°C) por 60 minutos en baño María e inmediatamente se detuvo la reacción con
baño de agua y hielo. Se agregó a las muestras 500 μl de agua destilada, se agitaron, se dejaron
reposar por 15 min, y se determinó su absorbancia a λ 540 nm. El mismo tratamiento se realizó para
el blanco con agua destilada.
Azúcares totales
La concentración de azúcares totales se determinó a través de una curva de calibración de
la absorbancia en función de la concentración para la cual se prepararon soluciones de 10-70 mg/L
utilizando manosa como estándar. Como blanco para las lecturas se utilizó agua destilada
aplicándole el mismo tratamiento (ver Anexo IX).
Para esto se utilizó el método Fenol-Sulfúrico descrito por Dubois, M (1956), se mezclaron
200 μl de muestra con 200 μl de fenol al 5% en tubos eppendorf de 1 ml y se colocaron en una
gradilla sumergida en baño de agua fría. A los tubos se les añadió 500 μl de ácido sulfúrico, se dejó
reposar por 15 minutos y se analizó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 490 nm.
Los ensayos se realizan por triplicado para obtener valores promedio (Fig. 11).
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Fig. 11. Actividad de azucares totales.
Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Se preparó 5 ml de gel separado al 10% (Tris-HCl 0.375 M, pH 8) de acuerdo al protocolo
determinado por el ITTJ (2014), se midieron 4.02 ml de agua destilada, agregando posteriormente
2.5 ml de Tris-HCl (1.5M con un pH 8.8), 100 µl de SDS al 10%, 3.33 ml de acrilamida-bis, 50 µl de
persulfato de sodio al 10% (recién preparado) y por ultimo 7 µl de TEMED; se homogenizo la mezcla
con ayuda de una puntilla. Después se vertió 4 inyecciones de 825 µl en las placas (previamente
preparado), posteriormente se cubrió con etanol el molde, esto es para eliminar burbujas en el gel
separador (Fig. 12). Una vez polimerizado el gel se retirara el etanol, y con ayuda de papel filtro se
secó el exceso de este (Fig. 13).
Fig. 12. Equipo y reactivos para la realización del gel de poliacrilamida.
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Fig. 13. Polimerización del gel separador.
Para la preparación del gel concentrado al 4% (Tris-HCl 0.125 M, pH 6.8) se utilizaron 1.83
ml de agua destilada, 0.75 ml de Tris-HCl (0.5M, pH 6.8), 30 µl de SDS al 10%, 0.39 ml de acrilamida-
bis, 1.5 µl de persulfato de sodio y por ultimo 5 µl de TEMED, obteniendo un volumen total de 3 ml;
se mezcló todo con ayuda de una puntilla. Posteriormente se inyectaron en la placa 1 ml del gel
concentrado y se colocó el peine.
Para la preparación de las muestras se mezcló 5 µl de buffer de carga (Glicerol 50%, Tris-HCl
20mM, β-mercaptoetanol 0.1%) y se llevó a desnaturalización 95 °C durante 5 min.
Ya que se haya polimerizado por completo el gel, se quitó el peine del gel con mucho
cuidado. Se sacó la placa del portamoldes y se adoso al porta electrodo con el cristal pequeño hacia
dentro. Se colocó a su vez en la cámara de electroforesis y todo junto dentro de la cubeta. Se llenó
el compartimento interior e inferior con buffer de corrida 1X (Tris-base, Glicina y SDS). Después se
inyectaron las muestras en el gel; por último se colocó la tapa del porta electrodo y se corrió a 80 V
por 60 min y posteriormente a 100 V por 60 min.
Detección de proteínas con Nitrato de Plata
Para poder teñir el gel se utilizó la técnica de nitrato de plata, que se llevó a cabo mediante
el protocolo descrito por el ITTJ (2014), en el cual está compuesto de una solución fijadora, nitrato
de plata, solución reveladora y ácido acético. Primero se puso el gel en un recipiente de plástico, en
el cual se añadió 50 ml de solución fijadora de formaldehido (ver Anexo IV), se agito suavemente
durante 10 min. Se retiró la solución fijadora y se lavó el gel dos veces con 50 ml de agua destilada
durante 5 min. Se removió el agua y posteriormente se remojó el gel en 50 ml de solución de 0.2
g/lt de Na2S2O3 (ver anexos) por 1 min en agitación. Se tiró el Na2S2O3 y se volvió a lavar con 50 ml
26
de agua destilada por 20 seg. Se vuelve a retirar el agua y se humedece el gel en 50 ml de solución
de nitrato de plata (ver anexos) agitando suavemente por 10 min. Se tiró el nitrato de plata,
volviendo a lavar con agua y después con un volumen pequeño de solución reveladora de tiosulfato
(ver anexos) se deja en agitación por 30 seg; inmediatamente se sumerge el gel en 50 ml de solución
reveladora de tiosulfato. Se agita lentamente hasta que las bandas obtuvieron una intensidad
adecuada, dejándolo aproximadamente 1 min en la solución. Para poder parar la reacción se
añadieron 2.5 ml de ácido acético al 2.3M (ver anexos) en la solución reveladora, agitándolo por 10
min. Inmediatamente se escaneo el gel en una impresora marca Epson Stylux TX420W, utilizando
un software para realzar el color del gel y poder percibir la tonalidad de las bandas.
Extracción de ARN con TRI Reagent® Solution
Se pesaron aproximadamente 100 mg de muestra vegetal (hoja), el cual se trituro con
nitrógeno líquido; esto es para evitar cualquier reacción biológica en el mortero. Se añadió un 1 ml
de TRI Reagent Solution y se dejó encubar por 5 min a temperatura ambiente (Fig. 14). Después se
le añadió 1 ml de Cloroformo, se agito por 15 seg en un vortex y se dejara reposar por 10 min;
finalmente se centrifuga a 4 °C por 15 min a 12000 rpm.
Fig. 14. Triturado de la muestra.
Se remueve la fase acuosa a otro tubo y se añadió 500 µl de alcohol isopropilico (esto es
para que se precipite el ARN). En seguida se encubo durante 10 min a temperatura ambiente y se
centrifugo a 4 °C por 8 min a 12000 rpm. En cuanto se elimina el sobrenadante, se lava el pellet con
etanol al 75% (se agregara 1 ml de etanol por cada mililitro de TRI Reagent Solution que se usó en
la homogenización). Más tarde se centrifugo a 7500 rpm por 5 min a 4 °C. Finalmente se eliminó el
etanol y se secó el pellet en una campana de aire estéril, se dejó ahí de 10 a 15 min. Por último se
resuspende en 100 µl con agua inyectable y se ve el ARN en un gel de agarosa al 1.2% (Fig. 15).
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Fig. 15. Proceso de extracción de ARN mediante TRI Reagent Solution.
Cuantificación de RNA
Para cuantificar el ARN, se leyó en el equipo Multikan Go de Thermo Scientific, a una
absorbancia de λ 260nm y 280nm, en el cual se le agregó 1µl de muestra y 199 µl de agua libre de
nucleasas en uno de los pocillos de la microplaca. Para medir el ARN se determinó con ayuda de la
siguiente ecuación:
RNA (μg
μl) =
Factor de dilución × 40μg/μl × Abs260
1000
Posteriormente se determinó la pureza del mismo, consecuente a esta ecuación:
RNA =Abs260
Abs280> 1.8
Síntesis de ADNc
La síntesis de ADNc se realizó con ayuda del kit Thermo Scientific RevertAid First Strand
cDNA Synthesis, en el que consiste agregar 5 µg de ARN total, 1 µl de Oligo (dT)18 primer y aforar a
12 µl con agua libre de nucleasas. Inmediatamente se preparó el master Mix para 3 reacciones, el
cual contiene 12 µl de Buffer 5X, 3 µl de RiboLock RNase Inhinitor, 6 µl de Mix dNTP 10 mM y 3 µl
de RevertAid M-MuLV RT (se homogenizo y se centrifugo), a continuación se le agrego a cada
muestra 8 µl del Mix (volviendo a homogenizar y a centrifugar), posteriormente con ayuda del
termociclador se incubaron las muestras a 42 °C por 60 minutos y se finaliza la reacción a 70 °C por
5 min; por último se observó el ADNc en un gel de agarosa al 1% (ver Anexo V), y se almacenaron
las muestras a -20 °C.
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qRT-PCR en LightCycler Nano
Para la realización del PCR, se usó el kit QuantiTecProbe RT-PCR (Qiagen, Alemania); para
cada corrida, se preparó el master mix de acuerdo al protocolo de fabricante obteniendo un
volumen final para cada reacción de 12.5 μL, como se observa en la siguiente tabla:
Tabla 1. Componentes que constituyen el master Mix.
Reactivos ½ Reacción (µl) 20 Reacciones (µl)
H2O MO 6.25 125 Buffer 10X 1.25 25 MgCl2 1.0 20 dNTP´s10 0.25 5 Primer forward 0.5 - Primer reverse 0.5 - Taq 0.25 5 ADNc 5 2.5
Volumen total 12.5 180 (sin ADN)
Los primers que se utilizaron fueron asignados por el Laboratorio de Biología Molecular del
Instituto Tecnológico de Tlajomulco: CuZn-superoxide dismutase (cytosolic)f, Catalasef, 18Sf, que
tienen una temperatura para amplificar de 59 °C; mientras que los oligos PR-1Ag, PR-2ag B-glucanase,
PR-2bg B-glucanase, PR-3ag Chitinase, PALg, B-acting amplifican a una temperatura de 60 °C (para ver
más detalle de los oligos ir Anexo VI).
Para el blanco, se añadió agua inyectable en vez de muestra y como control positivo se
añadió el ADNc de cada ensayo. El programa de corrida en el LightCycler Nano (Roche, Alemania)
tuvo un paso inicial a 95°C por 10 minutos, y para la amplificación se programaron 45 ciclos de 95°C
por 20 segundos; para los primers se programó una corrida a 60 °C por 20 segundo y a 59 °C por 20
segundos, y por últimos a 72 °C por 20 segundos (Fig. 16).
Fig. 16. Equipo y software LightCycler Nano.
Se agregó a cada tubo 9 µl del master mix; 0.5 µl de primer forward y reverse, y 2.5 µl de ADN.
29
RESULTADOS
Para la realización de las pruebas tanto de extracción de ARN como de proteínas, se
utilizaron plantas en la etapa de floración y fruto, tomado en cuenta variables fisiológicas como
altura de planta, grosor de tallo, numero de hojas y obtención de fruto. Con la finalidad de evaluar
si la presencia de micorrizas impacta de manera positiva en esos parámetros. Los resultados
obtenidos son mostrados en la Tabla 2:
Tabla 2. Evaluación de parámetros fisiológicos de plantas de Tomate en presencia de micorrizas a los 90 días posinocilación.
Variables Planta control Planta con micorriza
Altura (cm) 37.75 cm (7.8 ± 0.2) 40.25 cm (2.78 ± 0.2)
Grosor de tallo (mm) 4.12 mm (0.85 ± 0.2) 4.4 mm (0.27 ± 0.1)
# Hoja 9 (2.5 ± 0.2) 10 (0.5 ± 0.2)
Los datos presentados muestran un beneficio al sistema simbiótico de tomate-microrriza
que en lo sucesivo denominaremos SSTM; esto, se ve reflejado principalmente en la altura de la
planta y el tiempo de obtención de fruto. Es decir, el sistema simbiótico presentó 2.5 cm más en
comparación con el control lo cual representa un 6.8 % de incremento en la elongación de la planta
(Fig. 17). Así mismo, SSTM llego a la etapa de producción en comparación al control, dando un
promedio de 2 frutos por planta a los 4 meses de germinación, en tanto que el control aún no dio
frutos.
Fig. 17. Comparativa de los tratamientos.
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En base a lo anterior, los parámetros fisiológicos evaluados muestran que el utilizar un
sistema simbiótico de tomate con micorrizas, permite a la planta llevar a cabo en menor tiempo la
etapa de producción lo cual a nivel económico es un punto clave.
Cuantificación de proteínas
Para cuantificar el total de proteína soluble presente en las plantas, se utilizó el método de
Bradford, para esto se realizó una curva de calibración a partir de estándares de BSA (ver Anexo III).
La cantidad de proteína es un parámetro que nos permite determinar cómo se están llevando a cabo
varias reacciones catalíticas en la planta, desde respuestas a estrés hasta desarrollo de mecanismos
de defensa, por lo que conocer el contenido de estas determina como está reaccionando la planta
antes dichas situaciones. El contenido de proteína soluble para SSTM fue de 0.3685 mg/mL en
comparación con el blanco que fue de 0.252 mg/mL, este resultado nos indica que las plantas con
una concentración alta de proteína acumulada puede proveer un mayor almacenamiento de
nitrógeno parra su defensa así como lograr un ajuste osmótico entre otras reacciones, otorgando la
simbiosis un mayor rendimiento en este parámetro.
SDS-PAGE
La determinación de las proteínas por el método de SDS-PAGE, permite determinar
mediante el comparativo de los pesos moleculares de proteínas estándar, la presencia de ellas en
las muestras de SSTM y control. En la Fig. 18 se muestra el gel de poliacrilamida obtenido. Las
enzimas con importancia en este trabajo, fueron 1,3 b-glucanasa (20 kDa), quitinasa (25 y 35 kDa),
superoxido dismutasa (32 kDa), peroxidasa (40 kDa), y catalasa (60 y 80 kDa). Estás enzimas son
importantes porque permiten generar mecanismos de defensa contra el estrés oxidativo producido
por los radicales libres, lo anterior provee a la planta de i) mecanismos preventivos, ii) mecanismos
de reparación, iii) defensa física y iv) defensa contra antioxidantes. El gel (Fig. 18), muestra la
ausencia de superoxido dismutasa, contrario a catalasa, peroxidasa, quitina, 1,3 b-glucanasa y
podría sugerirse la presencia de fenilalanina amonioliasa (75 kDa). Un incremento en la actividad
inducida por estas enzimas puede ser producida por diversos factores tanto ambientales como
moleculares. Ejemplo de ello, en tomate bajo altas concentraciones salinas presenta mayor
actividad antioxidante por la peroxidasa y catalasa. Otros estudios han demostrado que en tomate
inoculado con micorrizas arbusculares, el incremento en la actividad enzimática puede ser
producida por la disminución del peróxido de hidrogeno presente durante el crecimiento de las
31
raíces micorrizicas. Por lo anterior, la identificación de la presencia de dichas proteínas en SSTM y
control, es importante para evaluar las condiciones de estrés oxidativo que impacta en el
crecimiento y desarrollo de las plantas de tomate.
Fig. 18. Gel de poliacrilamida con tinción de nitrato de plata, en el cual M es el marcador; C1 y C2 son controles; M1 y M2 son de micorriza.
En la Fig. 19, se muestra el gel de extracción de proteína. En él se puede observar que a nivel
molecular la expresión de genes no muestra una diferencia palpable entre ambas SSTM y control.
Esto, es atribuido a que la expresión de proteínas fue similar en ambos, sin embargo al momento de
utilizar el programa GelAnalyzer se diferencia la intensidad de cada banda en cada tratamiento. Lo
que indica que se está expresando una mayor cantidad de proteínas PR en las plantas que están
tratadas con micorriza; esto atribuido a la simbiosis entre planta y hongo, favoreciéndola; esto, se
traduce a que al llevar a cabo la infección por un patógeno, causara un daño importante a la planta,
ya que la expresión inmediata de dichas enzimas permitirá una liberación rápida de nutrientes y
otros reacciones químicas que inducirán una señal de respuesta contra el ataque del patógeno o
inducir de igual manera una muerte celular al ser infectadas evitando la propagación del mismo. En
las plantas control al ser estresadas se pudo observar cambios físicos tales como necrosis, falta de
M C1 C2 M1 M2
200 150 120 100 85 70 60 50 40 30 25 20 15
32
pigmentación y desnutrición, mientras que en las micorrizas, si resistieron a este estrés,
observándose solo algunas manchas en hojas
Fig. 19. Grosor, intensidad e identificación de la bandas mediante el software GelAnalyzer.
Determinación de catalasa
Como se observa en la Tabla 3, mostraron una similitud de la actividad de catalasa en los
dos ensayos, ya que la mayor cantidad corresponde a las de control seguida por las de micorrizas.
Tabla 3. Resultados de Catalasa
Muestra Abs Concentración (nM de H2O2 mg-1s-1)
C1 3.7755 2.6227
C2 3.7724 2.6245
M1 3.7927 2.6033
M2 3.7830 2.5512
Estos resultados solo fueron pruebas para establecer un protocolo definido y poder
cuantificar la actividad de catalasa.
33
Extracción de ARN
De acuerdo a la siguiente figura, al contemplar en el trasluminador el gel de agarosa, se
puede distinguir el ARN en cada muestra, ya que se observan las subunidades 28S y 18S, el cual nos
servirá en la realización de la síntesis de ADNc. También se percibe que no se encuentra
contaminado con ADN, esto quiere decir que se efectuó correctamente la extracción, tomando en
cuenta las medidas de inocuidad y esterilización.
Fig. 20. Verificación de ARN en gel de agarosa al 1.2%.
Síntesis de ADNc
Para poder verificar que se realizó correctamente la síntesis de ADNc a partir del kit, se
preparó un gel de agarosa al 1%, observándose en el transluminador y logrando presenciar el ADNc
de cada muestra. La imagen muestra que nuevamente, las plantas simbióticas presentan una mayor
expresión génica del ADNc en comparación con el control. Esto indica que las plantas al sufrir el
estrés producido por el patógeno expresó las enzimas como mecanismo de defensa, estando más
protegidas las SSTM que las del control. Nuevamente podemos sugerir que el estar en un estado
simbiótico produce mayor respuesta de protección a la planta en comparación con una planta libre.
28S ARNr
18S ARNr
C1 C2 M1 M2
34
Fig. 21. ADNc de las plantas control y micorrizicas.
qRT-PCR
Los datos obtenidos del RT-PCR en tiempo real fueron automáticamente procesados por
software del equipo LightCycler Nano (Roche, Alemania), el cual envió los datos de Ciclo de
Cuantificación (Cq), para poder determinar la cuantificación relativa de cada actividad enzimática
en las muestras.
Tabla 4. Resultados del RT-PCR en tiempo real para las plantas de Micorrizas y Control.
Muestras Cq
PAL2
Muestra (micorriza)
33.851 Positivo
CAT2 33.955 Positivo
BACT 2 35.013 Positivo
PR1a 2 29.806 Positivo
PR2a2 Negativo
PR2b2 32.013 Positivo
PR3b2 33.189 Positivo
SOD2 26.319 Positivo
18s2 27.21 Positivo
PR3a2 33.108 Positivo
PAL3
Muestra (control)
Negativo
CAT3 Negativo
BACT 3 35.25 Positivo
PR1a 3 35.024 Positivo
PR2a3 Negativo
PR2b3 36.384 Positivo
PR3b3 34.217 Positivo
SOD3 16.113 Positivo
18S3 9.131 Positivo
PR3a3 21.905 Positivo
C M
ADNc
ADNc
Genes de
referencia
35
Como se puede observar en la Tabla 3, las plantas que fueron micorrizadas tienen un mayor
número de copias de los genes PR, también se puede observar que las muestras que no amplificaron
no indican una expresión negativa, en todo caso puede significar algún problema en la muestra, en
la reacción, en los oligos, etc.
Para poder calcular la expresión relativa (R) con una eficiencia del 100% (E=2), se determinó
mediante la siguiente ecuación:
𝑅 = 2−(∆𝐶𝑞𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎−∆𝐶𝑞𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎)
Donde:
R = expresión génica relativa (ratio)
ΔCqmuestras = expresión Gen de interés - expresión 18S (Muestra con Micorrizas)
ΔCqreferencia = expresión Gen de interés - expresión 18S (Muestra Control, sin Micorrizas)
PAL, 1.78712E-05
CAT, 1.66283E-05
PR1a, 10306134.57
PR2a, 276898.939
PR2b, 2535783.244
PR3B, 564651.0332
SOD, 234.4278237
PR3a, 117.4579049
-1000000
1000000
3000000
5000000
7000000
9000000
11000000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Exp
resi
ón
re
lati
va
Gen enzimatico
Resultados de cuantificación relativa
Series1
36
Fig. 22. Graficas de muestras positivas en RT-PCR en tiempo real de oligos a 60 °C. A) Curva de Ciclos de cuantificación. B) Curva de Disociación. C) Muestras.
A)
B)
C)
B) A)
B)
37
Fig. 23. Graficas de muestras positivas en RT-PCR en tiempo real de oligos a 60 °C. A) Curva de Ciclos de cuantificación. B) Curva de Disociación. C) Muestras.
De acuerdo a las gráficas de cuantificación o amplificación, muestran que los genes que
amplifican primero son las que contienen mayor número de copias de nuestro gen interés, por lo
que indica que es mayor la expresión; mientras que las curvas de disociación nos expresan el perfil
de los productos amplificados, si un producto presenta un perfil de desnaturalización diferente, es
decir valores de temperatura diferente, significa que son otros productos no específicos de
amplificación, en el cual pueden ser dimeros. Por eso se utilizó un blanco, para comparar que se
estén expresando esos genes. Por ultimo para ver si se expresaron estos genes se observaron en un
gel de agarosa al 1% como se muestra en la Fig. 24:
Fig. 24. Verificación de oligos después de realizar el PCR en tiempo real (muestra de micorriza).
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conforme a los resultados obtenidos, se observó que las micorrizas pueden ser utilizados
como biofertilizante natural, puesto que esto ayuda al crecimiento de la planta y a la vez le genera
resistencia, debido al sistema de simbiosis entre el hongo-planta, es decir, como la planta se siente
atacada, al mismo tiempo expresa estas proteínas en pequeñas cantidades, que actúan como
mecanismo de defensa que la pueden proteger de alguna enfermedad o patógeno. También se
C)
38
observó la diferencia en el crecimiento en platas sometidas a estrés biótico, observándose que las
que fueron infectadas con micorrizas sobrevivieron e incluso crecieron de una mejor forma, que las
plantas control.
Para los ensayos de actividades enzimáticas solamente se adaptaron a microplaca, para
aplicarlos en el lector de ELISA, y a la vez se estandarizaron los protocolos para obtener una buena
eficiencia en las pruebas. De igual manera se estandarizo en el RT-qPCR para poder obtener lecturas
de resultados con cifras y concentraciones adecuadas; por ende se recomienda seguir con la
investigación y poder observar la expresión de las proteínas PR en ciertas etapas de crecimiento de
las plantas, ya que por mi corto tiempo de residencia solo me permitió investigar una etapa la cual
fue la de floración y fruto.
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS
Especifica:
Capacidad de poner en práctica la teoría en el ámbito de trabajo del laboratorio de biología
molecular.
Habilidad para el desarrollo de técnicas de biología molecular, tales como extracción de ARN
para la creación de ADN complementario. Esto gracias al método de TRIZOL.
Adquirir conocimientos de Química orgánica e inorgánica, Biología molecular, Genética,
Calculo, Estadística.
Genérica:
Adquirir conocimientos para el análisis de datos, por medio del programa Exel.
Habilidad para buscar, procesar, desarrollar y analizar información de distintas fuentes.
Habilidad de buscar información en inglés y elaborar proyectos.
REFERENCIAS
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ANEXOS
Anexo I. Desinfección de semillas
Se realizó la desinfección de semillas con una solución de cloro al 30% más una gota de
detergente. Para la solución de cloro al 30% se midió 15 ml de cloro, en el cual se disolvieron en 3.5
ml de agua destilada; se metieron en un tubo las semillas, donde se les dio un lavado con agitación
(este procesos de dio por triplicado), después se llevó a sonicar por 1 min; por último se dejaron
secar en la campana con aire estéril.
Anexo II. Solución Steiner al 100% con 20 ppm de K3PO4
Reactivo Pesos (g)
Ca(NO)2 1.062
Mg(NO)3 0.513
K3PO4 0.0384
K2SO4 0.522
Se disolvió en
un 1 lt de agua
41
Anexo III. Cuantificación de proteínas
Mediante el programa de Excel, se calcularon las concentraciones a partir de las
absorbancias obtenidas por microplaca; para esto se aplicó la siguiente formula:
Concentraciónmg
ml=
(Abs − Bco) − 0.0451
1.2734
Muestras Abs Abs-Bco Concentración mg/ml
C1 0.8136 0.4497 0.31773206
C2 0.9442 0.5803 0.42029213
M1 0.7479 0.3840 0.2661379
M2 0.7205 0.3566 0.2446207
Blanco 0.3557
Anexo IV. Soluciones para la tinción de nitrato de plata
Solución fijadora de formaldehído
Compuesto Cantidad para preparar
50 ml 100 ml
Metanol 20 ml 40 ml
Formaldehído 37% 25 µl 50 µl
Agua Aforar Aforar
y = 1.2734x - 0.0451R² = 0.992
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Ab
sorv
anci
a
Concentración mg/ml
Curva de calibración típica
Series1 Lineal (Series1)
42
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3) 0.2 g/lt.
Compuesto Cantidad para preparar
100 ml
Tiosulfato de sodio pentahidratado 0.0315 g
Agua Aforar
Nitrato de plata
Compuesto Cantidad para preparar
50 ml 100 ml
Nitrato de plata 0.05 g 0.1 g
Agua Aforar Aforar
Solución reveladora de tiosulfato
Disolver todos los reactivos menos el formaldehido. Este se adiciona justo antes de utilizar
la solución, se añade y se afora.
Compuesto Cantidad para preparar
50 ml 100 ml
Carbonato de sodio 1.5 g 3 g
Solución de tiosulfato 1 ml 2 ml
Formaldehído 37% 25 µl 50 µl
Agua Aforar Aforar
Ácido acético 2.4 M
Compuesto Cantidad para preparar
50 ml 100 ml
Ácido acético glacial 0.33 ml 0.66 ml
Agua Aforar Aforar
Solución secadora*
Compuesto Cantidad para preparar
50 ml 100 ml
Etanol 5.26 ml 10.53 ml
Glicerol 2 ml 4 ml
Agua Aforar Aforar
*Esta solución no se utilizó.
43
Anexo V. Gel de agarosa al 1.0%
Para una cámara de electroforesis de 65 ml, se pesaron 0.65 g de agarosa, en el cual fueron
disueltos en 65 ml de solución TBE 1X y se calentó hasta lograr la disolución total del agarosa.
Una vez disuelto la agarosa, se deja enfriar hasta que se obtuvo una temperatura de 55 °C,
y se agregaron 0.5 ml de bromuro de etidio por cada 10 ml para agarosa. Se vacía en el molde con
los peines y se deja enfriar.
Un vez que el gel e ha formado, se retiran con cuidado los peines y lo extremos de la cámara,
colocando con cuidado el gel, y se agregó suficiente solución de TBE 1X (hasta cubrir el gel). Por
ultimo de deja corriendo a 80 V por 60 min. Una vez transcurrido el tiempo, se observa en el
transluinador.
Anexo VI. Oligos para la realización del qRT-PCR
Tabla 3. Oligos para qPCR de Solanum lycopersicum.
Gene Codigo Secuencia (5´-3´) Tm (°C)
Amp. (bp)
Número de Accession
Interés
CuZn-superoxide dismutase (cytosolic)f
CuZnSOD Solanum-F
TGTGGTTCATGAGCTTGAGG 59 153 X14040
CuZnSOD Solanum-R
TTGGAGTCAAACCAACCACA
Catalasef CAT Solanum-F
GATGAGCACACTTTGGAGCA 59 145 AF112368
CAT Solanum-R
TGCCCTTCTATTGTGGTTCC
PR-1Ag PR1a Solanum-F
TCAAGTAGTCTGGCGCAACTC 60 AJ011520
PR1a Solanum-R
CCAGTTGCCTACAGGATCGTA
PR-2ag
B-glucanase PR2a Solanum-F
AAACAAGCAGCCAAAATACAAC 60 M80608
PR2a Solanum-R
CCAGAATGACAAACAAAAGGAA
PR-2bg
B-glucanase PR2b Solanum-F
GTTGGAAACGAAGTTGATCCAG 60 M80604
PR2b Solanum-R
TGCAACCCTGCTGATGATAAC
PR-3ag
Chitinase PR3aChi Solanum-F
GTTTTGGTACTGCTGGTGATG 60 Z15141
PR3aChi Solanum-R
GCTCGTTCGTAGTTAGATTGG
PR-3bg
Endochitinase PR3b Solanum-F
CCCATGAAACTACTGGAGGATG 60 Z15140
44
PR3b Solanum-R
TGGTGTACAGTAATCGCCAGG
PALg PAL Solanum-F
CTTTGATGCAGAAGCTGAGACA 60 M90692
PAL Solanum-R
TCGTCCTCGAAAGCTACAATCT
Control
18Sf 18S-Solanum-F
AAACGGCTACCACATCCAAG 59 110 AY552528
18S-Solanum-R
CCTCCAATGGATCCTCGTTA
B-acting Act Solanum-F
ACATTGTGCTCAGTGGTGGTACT 60 U60480
Act Solanum-R
CCACCTTAATCTTCATGCTGCT
Anexo VI.
PREPARACIÓN DE STOCK DE N-acetil-D-glucosamida PARA DILUCIONES REQUERIDAS PARA
FORMAR CURVA PATRÓN.
TUBO # N-Acetil (μl) H2O (μl) DNS (μl)
1 0 1000 1000
2 10 990 1000
3 20 980 1000
4 40 960 1000
5 60 940 1000
6 100 900 1000
7 150 850 1000
8 250 750 1000
9 500 500 1000
10 1000 0 1000
Preparación de reactivos:
QUITINA COLOIDAL 0.2%.
Se prepararon 50 ml de quitina coloidal al 0.2%, a partir de quitina coloidal al 10%. Se agregó,
en un tubo con tapadera de rosca que contiene 30 ml de agua destilada, 1 ml de quitina coloidal al
10%. Se agita en vortex y se afora a 50 ml.
DNS.
Para preparar el DNS se pesaron 0.5 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico, 15 g de tartrato de Na-K
y 0.8 g de NaOH. Se disolvió el NaOH en 20 ml de agua destilada y se añadió en agitación el tartrato
45
de Na-K lentamente. Se completó con agua hasta 40 ml y se comienza a añadir lentamente el ácido
3,5 dinitrosalicilico. Se dejó en agitación durante la noche, se aforó a 50 ml, se filtró y se almacenó
en un frasco ámbar a 4°C.
Anexo VII.
PREPARACIÓN DE STOCK DE Glucosa PARA DILUCIONES REQUERIDAS PARA FORMAR CURVA PATRÓN.
TUBO # GLUCOSA (μl) H2O (μl) DNS (μl)
1 0 1000 1000
2 10 990 1000
3 20 980 1000
4 40 960 1000
5 60 940 1000
6 100 900 1000
7 150 850 1000
8 250 750 1000
9 500 500 1000
10 1000 0 1000
Preparación de Laminarin 0.5%
Se agregaron, en un tubo que contiene 30 ml de agua destilada, 0.25 g de Laminarin Sigma.
Se agita en vortex y se afora a 50 ml.
y = 0.011x + 0.0562R² = 0.9493
0.062
0.067
0.072
0.077
0.082
0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9 2.1
Ab
sorv
anci
a
Concentración (µg/ml)
Curva de patrón N-acetil-D-glucosamida
Series1 Lineal (Series1)
46
Anexo VIII.
PREPARACIÓN DE STOCK DE Glucosa PARA DILUCIONES REQUERIDAS PARA FORMAR CURVA PATRÓN.
TUBO # GLUCOSA (μl) H2O (μl) DNS (μl)
1 0 1000 1000
2 10 990 1000
3 20 980 1000
4 40 960 1000
5 60 940 1000
6 100 900 1000
7 150 850 1000
8 250 750 1000
9 500 500 1000
10 1000 0 1000
PREPARACIÓN DE STOCK DE Glucosa PARA DILUCIONES REQUERIDAS PARA FORMAR CURVA PATRÓN 2.
TUBO 2ml #
GLUCOSA (1mg/ml)
(μl)
H2O (μl)
DNS (μl)
1 660 1340 500
2 920 1080 500
3 1198 811 500
4 1464 536 500
5 1730 270 500
6 1996 4 500
y = 0.0182x + 0.0549R² = 0.9049
0.065
0.07
0.075
0.08
0.085
0.09
0.095
0.1
0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9 2.1
Ab
sorv
anci
a
Concentración (µg/ml)
Curva patrón de glucosa
Series1 Lineal (Series1)
47
Anexo IX.
PREPARACIÓN DE STOCK DE Glucosa PARA DILUCIONES REQUERIDAS PARA FORMAR CURVA PATRÓN 2.
TUBO 2ml #
GLUCOSA (1mg/ml)
(μl)
H2O (μl)
1 285 1715
2 571 1429
3 857 1143
4 1142 852
5 1428 572
6 1714 286
y = 0.017x + 0.062R² = 0.9059
0.065
0.07
0.075
0.08
0.085
0.09
0.095
0.1
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Lon
gitu
d d
e O
nd
a
Concentración (µg/ml)
Curva patrón 2 de glucosa
Series1 Lineal (Series1)
