Caracterización estructural de enzimas implicadas en la...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

TRABAJO FIN DE MÁSTER

Caracterización estructural de enzimas

implicadas en la reducción de ácidos fenólicos

en L. plantarum WCFS1

Sandra Gómez Sanz

Rosario Muñoz Moreno

Biotecnología Bacteriana (ICTAN-CSIC)

Blanca de las Rivas

Biotecnología Bacteriana (ICTAN-CSIC)

Jose Miguel Mancheño

Dept. de Cristalografía y Biol. Estruc. (Instituto de Química Física Rocasolano-CSIC)

Miguel Arroyo Sánchez Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I (UCM)

https://www.iqfr.csic.es/



https://www.ucm.es/directorio?eid=303




INDICE

Resumen / Abstract………………………………………............................1

I. Introducción………………………………………………………………..3

1. Compuestos fenólicos………………………………………………….3

1.1. Influencia de los compuestos fenólicos en las propiedades sensoriales de los alimentos.

1.2. Efectos de los compuestos fenólicos en la salud del consumidor.

1.3. Compuestos fenólicos en los residuos de la industria alimentaria.

2. Bacterias lácticas (BAL) en alimentos………………………………..5

2.1. Metabolismo de compuestos fenólicos en BAL

2.2. Metabolismo de compuestos fenólicos por Lactobacillus plantarum

2.3. Degradación de ácidos hidroxicinámicos por L. plantarum.

3. Flavoproteínas. ………………………………………………………….8

II. Objetivos…………………………………………………………………….9

III. Materiales y Métodos……………………………………………………10 1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos…………………..10

2. Medios y condiciones de cultivo………………………………………..11

3. Técnicas de AND…………………………………………………………11

3.1. Extracción de ADN plasmídico

3.2. Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR

3.3. Electroforesis de ADN en geles de agarosa.

3.4. Purificación de ADN a partir de geles de agarosa

3.5. Clonación independiente de ligación (LIC)

3.6. Manipulación de DNA con enzimas de uso común en biología molecular

3.7. Transformación genética de cepas bacterianas de E.coli

4. Técnicas de Proteínas…………………………………………………...14

4.1. Hiperproducción de proteínas recombinantes

4.2. Purificación de proteínas recombinantes.

5. Cristalografía de proteínas………………………………………………17

5.1. Ensayos de pre-cristalización

5.2. Ensayos de cristalización de alto rendimiento

6. Otros ensayos……………………………………………………………...19

6.1. Espectrometría de masas

6.2. Identificación de proteínas mediante huella peptídica y fragmentación MALDI TOF/TOF

IV. Resultados y Discusión………………………………………………….20

1. Análisis in silico de las secuencias de los genes lp_1424 y lp_1425.20

2. Clonación del gen lp_1424 y los dominios FMN y FAD del gen lp_1425 e

hiperproducción de las proteínas correspondientes…………………..22

3. Purificación y comportamiento en solución……………………………..24

3.1. Lp_1425FMN 3.2. Lp_1424:Lp_1425FMN 3.3. Lp_1425FAD

4. Cristalización………………………………………………………………..30

V. Conclusiones / Conclusions……………………………………………...32

Bibliografía………………………………………………………………………34

1 Máster en Biotecnología Industrial y Ambiental

RESUMEN / ABSTRACT

Resumen

Lactobacillus plantarum se encuentra presente en una gran variedad de sustratos

vegetales y productos agroalimentarios donde los compuestos fenólicos son

abundantes y tienen gran importancia por su influencia en las características

nutricionales y sensoriales de estos sustratos. Los ácidos hidroxicinámicos (C6‐C3)

son un importante grupo de fenoles de bajo peso molecular, entre los que destacan los

ácidos cumárico, cafeico y ferúlico. Respecto a la capacidad metabólica de L.

plantarum frente a estos fenoles recientemente el grupo de Biotecnología Bacteriana

del ICTAN ha identificado las reductasas implicadas en dicho metabolismo, que

incluyen las enzimas Lp_1424 y Lp_1425. Este trabajo pretende ampliar el

conocimiento estructural de dichas enzimas, Lp_1424 y Lp_1425, de L. plantarum

WCFS1 las cuales son responsables de la reducción del ácido p-cumarico a su

correspondiente ácido fenilpropiónico. Para ello se han estudiado diferentes

construcciones de ambas proteínas, con las que se ha podido determinar que el

módulo Lp_1425FAD es monomérico en solución y une FAD, por lo que

estructuralmente es un dominio, es decir, una unidad de plegamiento independiente.

Además, se ha podido determinar que la asociación entre Lp_1424 y Lp_1425 se

produce a través del módulo amino terminal flavodoxina de ésta última, siendo un

dímero estable en solución.

Abstract

Lactobacillus plantarum is present in a wide variety of plant substrates and agri-food

products where phenolic compounds are abundant and have great importance for their

influence on the nutritional and sensory characteristics of these substrates.

Hydroxycinnamic acids (C6-C3) are an important group of low molecular weight

phenols, including coumaric, caffeic and ferulic acids. Regarding the metabolic capacity

of L. plantarum in relation to these phenols recently, the Bacterial Biotechnology group

of the ICTAN has identified the reductases involved in this metabolism, including the

enzymes Lp_1424 and Lp_1425. This work aims to expand the structural knowledge of

these enzymes, Lp_1424 and Lp_1425, from L. plantarum WCFS1 which are

responsible for the reduction of p-coumaric acid to its corresponding phenylpropionic

acid. In orther to this, different constructions of both proteins have been studied, with

which it has been possible to determine that the Lp_1425FAD module is monomeric in

solution and binds FAD, so that it is structurally a domain, that is, an independent


folding unit. In addition, it has been determined that the association between Lp_1424

and Lp_1425 is produced through the flavodoxine amino terminal module of the latter,

being a solution-stable dimer.

Lista de abreviaturas

o FMN: flavín mononucleótido

o FAD: flavín adenín dinucleótido

o Lp1425FMN: Módulo de unión FMN de Lp_1425

o Lp1425FAD: Módulo de unión FAD de Lp_1425

o Lp_1424:Lp_1425FMN: Proteína Lp_1424 junto con módulo de unión FMN de

Lp_1425 (heterodímero de módulos favodoxina).

o LIC: Clonación independiente de ligación


I. INTRODUCCIÓN

1. Compuestos fenólicos.

Los compuestos fenólicos son un conjunto heterogéneo de moléculas que poseen en

su estructura uno o varios anillos bencénicos con uno o varios grupos hidroxilo

(Croteau et al., 2000). Se encuentran de forma natural en plantas, constituyendo el

principal grupo de metabolitos secundarios del reino vegetal. Fisiológicamente estos

compuestos son esenciales para el crecimiento y reproducción de plantas y actúan

como antipatógenos, antibióticos o pesticidas naturales; también están implicados en

el establecimiento de relaciones simbióticas, en polinización y confieren estabilidad

estructural a la planta. La mayoría de estas moléculas son bioactivas, interactúan con

el medio ambiente y desempeñan un importante papel de protección contra el estrés

abiótico y biótico en las plantas (Tohge et al., 2013). Se localizan principalmente en

frutos y órganos aéreos jóvenes, por lo que entran a formar parte de nuestra dieta

diaria de forma significativa (Harbone and Williams, 2000).

La mayoría de ellos se sintetizan en plantas superiores a partir del aminoácido L-

fenilalanina, a través de la ruta general de los fenilpropanoides (Robbins, 2003). Los

compuestos fenólicos se han clasificado tradicionalmente en flavonoides, ácidos

fenólicos, estilbenos y taninos, en función del número de anillos aromáticos que

contienen y de los elementos estructurales que unen los anillos entre sí (Manach et al.,

2004). Dentro de los ácidos fenólicos se pueden diferenciar dos grupos principales, los

ácidos benzoicos y los ácidos cinámicos. Estos compuestos se encuentran

mayoritariamente como ácidos hidroxibenzoicos e hidroxicinámicos tanto en forma

libre como conjugados. (Garrido y Borges , 2013). Los ácidos benzoicos más

frecuentes son los ácidos gálico, elágico, p-hidroxibenzoico, vanillínico, siríngico y

protocatéquico. Los ácidos cinámicos son los ácidos fenólicos más abundantes,

destacando entre ellos los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico. (Fig. 1)

A. B. C.

Figura 1. Estructura general de los ácidos cinámicos: ácido p-cumárico (A), ácido cafeico (B) y ácido ferúlico (C).

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Coumaric_acid_acsv.svg

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaffees%C3%A4ure.svg

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ferulic_acid_acsv.svg


1.1. Influencia de los compuestos fenólicos en las propiedades sensoriales de

los alimentos.

Algunas de las propiedades organolépticas de los alimentos y bebidas de origen

vegetal como el color, aroma y textura son originadas por los compuestos fenólicos,

influyendo de esta forma en la calidad final de los mismos. El color y el aspecto de un

alimento es la primera característica sensorial que percibe el consumidor. Aparte de

las clorofilas, los compuestos fenólicos son responsables del color de frutas y verduras

y pueden producir colores que varían del rojo brillante al púrpura. Estos efectos

sensoriales pueden ser deseados o no pudiendo disminuir la calidad de los alimentos.

También contribuyen de forma significativa al aroma (Tomás-Barberán and Espín,

2001), amargor y astringencia (Haslam, 2007).

1.2. Efectos de los compuestos fenólicos en la salud del consumidor.

En la actualidad los compuestos fenólicos son de especial interés y estudio debido a

las evidencias que señalan su efecto beneficioso en la salud humana (Selma et al.,

2009). Tradicionalmente a los compuestos fenólicos se les han asociado propiedades

antioxidantes, antiinflamatorias, antiestrogénicas, antiescleróticas, cardio-

neuroprotectoras y contra la carinogénesis y mutagénesis. A pesar de que se han

realizado importantes avances en el conocimiento del destino final de los compuestos

fenólicos una vez ingeridos, tanto en su absorción, distribución, metabolismo y

excreción, como en sus tejidos diana y efectos biológicos (Landete, 2012), todavía se

desconoce el efecto que ejerce la microbiota del tracto gastrointestinal (TGI) sobre

ellos (Van Duynhoven et al., 2011).

1.3. Compuestos fenólicos en los residuos de la industria alimentaria.

La gestión de residuos constituye uno de los problemas medioambientales más

importantes para las industrias alimentarias que utilizan productos vegetales como el

caso de las almazaras y bodegas en donde la mayoría de los residuos generados

poseen un alto contenido orgánico, mayoritariamente fenólico, lo que dificulta su

posterior degradación. Por otro lado los residuos fenólicos dificultan la degradación

biológica de los residuos en los que se encuentran al inhibir a muchos

microorganismos degradadores (Curiel, 2010).

Actualmente es de gran importancia el desarrollo de estrategias para la obtención de

productos de alto valor añadido a partir de estos subproductos, reduciendo así los

problemas medioambientales. Así, por ejemplo, residuos generados por la industria

vitivinícola representan una fuente importante de compuestos antioxidantes que en


algunos casos son explotados en la industria de la cosmética, alimentación animal o

empleados como fertilizantes orgánicos. De forma similar, en la producción de aceite

de oliva se generan muchos residuos altamente contaminantes por lo que se están

diseñando sistemas para recuperar compuestos fenólicos y reducir así el problema

medioambiental (Agalias et al. 2007).

2. Bacterias lácticas (BAL) en alimentos

El término bacterias del ácido láctico o bacterias lácticas (BAL) engloba una gran

diversidad de microorganismos fermentadores y productores de ácido láctico,

asociados a numerosos alimentos, siendo responsables de los cambios en el sabor,

aroma, textura, color y acidez. Las BAL incluyen bacterias de los géneros

Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus,

Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus y Sporolactobacillus, entre otros. Un

grupo importante de estas bacterias participan en la fermentación de sustratos

vegetales o de origen animal, siendo utilizada esta fermentación espontánea para

conservar la vida útil de los alimentos incrementando su nivel de seguridad y calidad

por la inhibición de la microbiota alterante o patógena. Por otro lado, permiten obtener

mejoras en las propiedades nutricionales y sensoriales.

2.1 Metabolismo de compuestos fenólicos en BAL.

Las BAL se encuentran presentes en una gran variedad de sustratos vegetales y

productos agroalimentarios. En estos sustratos los compuestos fenólicos son

abundantes y tienen gran importancia por su influencia en las características

nutricionales y sensoriales. Los primeros estudios sobre el metabolismo de

compuestos fenólicos en BAL fueron descritos por Whiting y Carr (1957). En ellos se

describió que el ácido clorogénico desaparecía durante la fermentación de sidras y,

utilizando extractos de Lactobacillus paracollinoides, se demostró que en una primera

etapa este compuesto se hidrolizaba originando ácido cafeico y ácido quínico que

posteriormente se metabolizan. Más adelante se demostró que el ácido cafeico se

metaboliza a ácido dihidrocafeico y catecol (Whiting y Carr, 1959). Además se observó

que L. paracollinoides reducia distintos ácidos hidroxicinámicos que tras

descarboxilarse daban lugar a etilcatecol y etilfenol (Whiting y Coggins, 1969).

Posteriormente Cavin et al. (1993) realizaron estudios sobre el metabolismo de los

ácidos fenólicos demostrando que Lactobacillus brevis y Pediococcus pentosaceus

eran capaces de descarboxilar los ácidos p-cumarico y ferúlico produciendo vinilfenol y

vinilguayacol respectivamente, los cuales se reducen posteriormente a sus


correspondientes etil derivados. Se estudió la capacidad para producir fenoles

volátiles en 20 especies de bacterias lácticas concluyendo que solo las especies del

género Lactobacillus son capaces de reducir los vinil derivados a sus correspondientes

etil derivados.

2.2 Metabolismo de compuestos fenólicos por Lactobacillus plantarum

Lactobacillus constituye un género de bacterias heterofermentativas que pertenece al

filo Firmicutes, clase Bacilli, orden Lactobacillales y familia Lactobacillaceae. La

especie L. plantarum es una bacteria muy versátil presente en una gran variedad de

nichos ecológicos, encontrándose con frecuencia en fermentaciones de origen vegetal.

Además presenta uno de los genomas más grandes dentro de las BAL (Kleerebezem

et al., 2003) por lo que puede considerarse la bacteria láctica modelo para

fermentaciones de sustratos vegetales y, en general, para conocer los mecanismos

moleculares que determinan la respuesta frente a un ambiente rico en compuestos

fenólicos (Douillard & de Vos, 2014). A pesar de que los compuestos fenólicos

presentes en plantas son tóxicos y bacteriostáticos, L. plantarum ha sido capaz de

adaptarse a su presencia y posee rutas metabólicas que permiten su degradación.

Al tratarse de una bacteria GRAS (Generally Recognized as Safe), L. plantarum es la

especie más utilizada como cultivo iniciador en la fermentación de productos

alimentarios de origen vegetal. La interacción entre L. plantarum y un compuesto

fenólico va a producir cambios en ambos. La transformación del compuesto fenólico

originará nuevos compuestos que conferirán diferentes características sensoriales y

nutritivas a los alimentos, produciendo efectos en la microbiota del TGI y en la salud

del consumidor. Por otro lado, la presencia del compuesto fenólico desencadenará una

respuesta en L. plantarum, que podría estar asociada con mecanismos de

detoxificación, pudiendo llevar a una mejora en su capacidad fermentativa de

alimentos (López de Felipe, et al., 2010; Curiel et al., 2010) o bien a la inducción de

marcadores ligados a su supervivencia en el TGI.

Los primeros estudios realizados sobre el efecto de L. plantarum en los compuestos

fenólicos indicaron que esta especie era capaz de reducir ácido quínico (Whiting,

1975) y de degradar la oleuropeína del olivo (Ciafardini et al. 1994; Marsilio et al.,

1996). Por otro lado, Osawa et al. (1993) aislaron, a partir de alimentos fermentados,

cepas de L. plantarum que poseían actividades tanasa y galato descarboxilasa que

permiten la biotransformación de taninos. Posteriormente, se observó que L.

plantarum fue la única especie entre distintas bacterias enológicas que presentó


actividad tanasa. Finalmente, también se ha estudiado el efecto del crecimiento de

este microorganismo sobre el alpechín (Kachouri y Hamdi, 2004).

2.3 Degradación de ácidos hidroxicinámicos por L. plantarum.

Los ácidos hidroxicinámicos (C6‐C3) son un importante grupo de fenoles de bajo peso

molecular, entre los que destacan los ácidos cumárico, cafeico y ferúlico. Estos últimos

suelen encontrarse como derivados glicosilados, pero también esterificados con ácido

quínico, siquímico o tartárico. El ácido ferúlico suele estar presente de forma libre en

los tomates y la cerveza, siendo el compuesto fenólico más abundante en los granos

de cereales, mayoritariamente conjugado con arabinoxilanos de las paredes celulares

de los vegetales (Kroon y Williamson, 1999).

La descarboxilasa de ácidos hidroxicinámicos (PAD) ha sido la primera enzima

identificada en su metabolismo. Esta enzima decarboxila los ácidos p-cumÁrico,

cafeico y ferúlico formando los correspondientes 4-vinil derivados (Cavin et al. 1997).

Rodríguez et al. (2007) caracterizaron esta molécula y posteriormente determinaron su

estructura y mecanismo catalítico (Rodríguez et al., 2010). Posteriormente, el grupo de

Biotecnología Bacteriana del ICTAN ha identificado, mediante un estudio

transcriptómico de respuesta global de L. plantarum frente a vinil fenol, las enzimas

implicadas en la reducción de estos compuestos a sus correspondientes etil derivados

(datos no publicados). Además, Esteban-Torres et al. (2013) demostraron que los

ésteres de los ácidos hidroxicinamicos también pueden ser hidrolizados por acción de

una feruloil/cinamoil esterasa (Lp_0796) para originar el correspondiente ácido que

posteriormente se descarboxila por acción de la enzima PAD descrita previamente.

Los ácidos hidroxicinámicos también se pueden reducir a los correspondientes ácidos

fenil propiónicos (Rodríguez et al., 2008). (Fig. 2)

Figura 2: Esquema-resumen del metabolismo de ácidos hidroxicinámicos de L. plantarum.

En la actualidad el grupo de Biotecnología Bacteriana del ICTAN ha identificado,

mediante el análisis transcriptómico de la respuesta de L. plantarum frente a ácido p-

cumarico las enzimas implicadas en dicha reducción, Lp_1424 y Lp_1425 (datos no

publicados).


3. Flavoproteínas.

Las flavoproteínas son enzimas que catalizan reacciones de oxidación-reducción

utilizando flavín mononucleótido (FMN) o flavín adenín dinucleótido (FAD) como

cofactores (Fig. 3), los cuales provienen de la vitamina B2 o riboflavina.

El anillo de isoaloxazina de FMN o FAD es capaz de aceptar uno o dos electrones

originándose la forma semiquinona (FMNH, FADH), o las formas totalmente reducidas

(FMNH2, FADH2), respectivamente.

Figura 3: Estructura química de los nucleótidos de flavina.

Con respecto a actividades reductasas en el género Lactobacillus, recientemente

Hertzberger et al. (2014) purificaron una flavoreductasa dependiente de NADH

implicada en la producción de H2O2 en L. johnsonii. Esta enzima resultó ser un

heterodímero, como posteriormente mostraron Valladares et al. (2015), que está

codificada por dos genes contiguos y muy similares (lj_0548 y lj_0549), que codifican

sendas cadenas polipeptídicas de 20 kDa, siendo estas secuencias dominios de unión

de FMN (módulos flavodoxina). De manera similar a lo observado por el grupo de

Biotecnología Bacteriana con los genes lp_1424 y lp_1425 en la reducción de los

ácidos hidroxicinámicos, la interrupción de cada uno de los genes lj_0548 y lj_0549 en

L. johnsonii ocasiona la pérdida de la actividad reductasa lo que identifica a estos

genes como responsables de la actividad enzimática. La hiperexpreesión de cada uno

de estos genes de manera individual (lj_0548 o lj_0549) no permite la producción de la

correspondiente enzima recombinante. Sin embargo, cuando se hiperexpresaron

simultáneamente sí obtuvieron proteína, aunque no pudieron determinar cuál de las

dos era, Lj_0548 o Lj_0549, aspecto que quedó resuelto en el trabajo de Valladares et

al. (2015). Estos resultados son consistentes con el hecho de que estudios de

complementación con los dos genes delecionados lj_0548 y lj_0549 indicaron la

necesidad de los dos para la actividad reductasa. Además este último grupo de

https://es.wikipedia.org/wiki/Isoaloxazina

https://es.wikipedia.org/wiki/Electrones

https://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tidos

https://es.wikipedia.org/wiki/Flavina


investigación demostró la necesidad de la formación del heterodímero para la unión

del cofactor FMN.

II. OBJETIVOS

Tanto en la fermentación de sustratos vegetales como en el TGI humano. L. plantarum

está expuesto a la presencia de compuestos fenólicos. La elucidación del metabolismo

de estos compuestos es imprescindible para caracterizar las fermentaciones de

alimentos de origen vegetal así como y para conocer los efectos saludables que

ejercen estos compuestos en el consumidor. L. plantarum es un microorganismo

presente tanto en estas fermentaciones vegetales, siendo el que mayoritariamente se

aísla, como en el TGI humano. A esto se une el hecho de que posee uno de los

mayores genomas entre las BAL por lo que resulta un buen modelo para abordar este

tipo de estudios del metabolismo de compuestos fenólicos. De la capacidad

metabólica que presenta L. plantarum frente a ácidos hidroxicinámicos únicamente

quedaban por identificar genéticamente las reductasas implicadas en el metabolismo

de dichos compuestos. En la actualidad el grupo de Biotecnología Bacteriana ha

identificado estas reductasas. Este trabajo pretende ampliar el conocimiento

estructural de las enzimas responsables de la reducción del ácido p-cumarico a su

correspondiente ácido fenilpropiónico.

El objetivo de este trabajo es abordar las primeras etapas de la caracterización

estructural de las enzimas Lp_1424 y Lp_1425 de L. plantarum WCFS1 lo que

indudablemente contribuirá a avanzar en el estudio de su mecanismo catalítico. Para

conseguirlo se plantean los siguientes objetivos específicos:

1. clonación conjunta del gen lp_1424 y el fragmento del gen lp_1425 que

codifica el módulo N-terminal de unión a FMN de Lp_1425, así como producción

heteróloga de las proteínas correspondientes

2. clonación del fragmento del gen lp_1425 que codifica el módulo N-terminal de

unión FMN de Lp_1425, así como producción heteróloga de la proteína

correspondiente.

3. clonación del fragmento del gen lp_1425 que codifica el módulo C-terminal de

unión a FAD de Lp_1425, así como producción heteróloga de la proteína

correspondiente.

4. purificación de las proteínas producida: Lp_1424:Lp_1425FMN, Lp_1425FMN y

Lp_1425FAD.

5. primeros ensayos de cristalización de alto rendimiento de las proteínas con

características adecuadas de solubilidad.


III. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos.

Para el desarrollo de este trabajo se han utilizado las cepas de Escherichia coli y los

plásmidos indicados en las tablas 1 y 2 respectivamente así como los oligonucleótidos

sintéticos descritos en la Tabla 3.

cepas Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen

DH10B

F– mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74

recA1 endA1 deoR araD139 Δ(ara leu)7697 galU galK rpsL

nupG λ–

Durfee et al., 2008

BL21

(DE3)

fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ΔhsdS λ DE3 = λ

sBamHIo ΔEcoRI B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene 1) i21 Δnin5

T1

Studier et al., 1990/Novagen

Tabla 1. Estirpes bacterianas empleadas en este trabajo

Plásmido Genotipo/Fenotipo relevante Referencia/Origen

pURI3-Cter derivado de pT77, AmpR

Curiel et al., 2011

pURI3-Cter (1424 + 1425) AmpR

Este estudio

pURI3-Cter( 1424+ dominioFMN1425) AmpR

Este estudio

pURI3-Cter domino FMN 1425 AmpR

Este estudio

pURI3-Cter dominio FAD 1425 AmpR

Este estudio

AmpR, resistente a ampicilina

Tabla 2. Plásmidos empleados en este trabajo.

Oligonucleótido Secuencia (5´→3´)

1731 TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATTTGTTGGAATTGTT

1732 GCTATTAATGATGATGATGATGATGCCGCATCTCGGCGACGATGG

1735 GCGACCATCGTCGCCGAGATGCGGCATCATCATCATCATCATTAA

1736 GCTATTAATGATGATGATGATGATGCCGCATCTCGGCGACGATGGTCGC

1793 TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAGGTCGCTCAACCTGCTGTCA

890 GCTATTAATGATGATGATGATGATGGGCCGTCACCGGATCAACGTGCTC

Tabla 3. Oligonucleótidos empleados en este trabajo


2. Medios y condiciones de cultivo.

Las cepas de Escherichia coli se convervaron congeladas a -80ºC en el medio de

cultivo al que se añadió glicerol estéril al 10%. Durante los procesos de clonación y

transformación con los plásmidos de interés, se cultivaron de manera rutinaria en el

medio de Luria-Bertani (LB) tanto en su versión líquida como en sólida (añadiendo

agar al 1,5%), a 37ºC en ambos medios. En el caso que fue necesario se añadió

ampicilina a una concentración final de 100 μg/mL.

3. Técnicas de ADN:

3.1 Extracción de ADN plasmídico

Para obtener ADN plasmídico de alta pureza se realizó la extracción con los sistemas

comerciales High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) y FavorPrep Plasmid Extraction

Mini Kit (FAVORGEN Biotech Corp) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez

extraídos se conservaron a -20ºC hasta su uso.

Por otro lado, se realizó una extracción rápida del plásmido para verificar que las

células de E. coli se habían transformado con los plásmidos recombinantes que

contenían los genes de interés. Para ello, se cogió con una punta estéril la colonia

crecida en medio sólido y se resuspendió en 20 μL de una solución con lisozima 0,5

mg/mL, EDTA 25 mM pH 8,0, Tris HCl 25 mM pH 7,5, RNasa 0,1 mg/mL, azul de

bromofenol 0,02% y glicerol 0,015%. La preparación se incubó a temperatura

ambiente durante 15 minutos y posteriormente se añadieron 5 μL de

fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezcló vigorosamente. La mezcla se

centrifugó a 12500 x g durante 2 minutos para que se separasen las dos fases. De la

fase superior acuosa, que contiene el ADN, se cargaron 10 μL en un gel de agarosa y

se realizó una electroforesis convencional. Las células transformadas con los

plásmidos recombinantes se seleccionaron debido la diferencia de tamaño con

respecto al DNA plasmídico original.

3.2 Amplificación de secuencias de ADN mediante PCR

Para la amplificación de las secuencias se utilizaron los reactivos de las casas

comerciales Applied Biosystems y Takara biotechnology, excepto los oligonucleótidos

que se sintetizaron en MWG Operon Technologies. Las reacciones de amplificación se

realizaron con un volumen final de 25 - 50 μL, y contenían la ADN polimerasa

PrimeSTARTM HS (Takara) 1,25 U/µL, tampón de reacción con MgCl2 5mM,


desoxinucleótidos (dNTPs) 0,2 mM, ADN molde y los oligonucleótidos usados como

cebadores a una concentración final 1 µM.

El proceso de amplificación se llevó a cabo en los termocicladores Personal y

Mastercycler gradient (Eppendorf) siguiendo las siguientes condiciones: 30 ciclos de

tres fases cada uno, una fase de desnaturalización del DNA 95 °C durante 30

segundos para AmpliTaq GoldTM y 98 °C durante 10 segundos para PrimeSTARTM HS,

una fase de hibridación de los oligonucleótidos con el DNA molde cuya temperatura

varía dependiendo del ensayo que se esté realizando, de 30 segundos para AmpliTaq

GoldTM y de 5 segundos para PrimeSTARTM HS, y una fase de elongación o síntesis de

DNA realizada a 72 °C durante un tiempo proporcional al tamaño del fragmento a

amplificar. En la reacción realizada con la DNA polimerasa AmpliTaq GoldTM hubo que

introducir una etapa previa de 95 °C durante 10 minutos para su activación, puesto

que esta enzima se suministra en estado inactivo.

3.3 Electroforesis de ADN en geles de agarosa.

Para resolver las muestras de ADN se utilizaron geles de agarosa al 0,7% ó 2% en

tampón TAE (Tris-HCl 40 mM; ácido acético 20 mM; EDTA 2 mM, pH 8,0). El mismo

tampón se utilizó como electrolito. A las muestras se les añadió un 20% de su volumen

de una solución compuesta por azul de bromofenol 0,25%, xilencianol FF 0,25% y

glicerol 30% en agua. La electroforesis se realizó a 90 V y, una vez finalizada, los

geles se tiñeron con GelRedTM Nucleic acid Gel Stain (Biotium) siguiendo las

indicaciones suministradas por el proveedor. Los fragmentos de ADN se visualizaron

mediante radiación ultravioleta (λ=302 nm) en un sistema de captura y análisis de

imágenes ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Como marcadores de tamaño se utilizaron ADN

del fago Lambda cortado con EcoT14I (Takara) y el marcador 100 bp ladder (Biotools).

3.4 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa

Este proceso se llevó a cabo mediante el kit QIAquick Gel extraction (QIAGEN)

siguiendo las indicaciones suministradas por el proveedor.

3.5 Clonación independiente de ligación (LIC)

En este trabajo se utilizó como vector de expresión pURI3-Cter de la familia pURI

(Curiel et al., 2011) , que deriva del plásmido pT7-7 (De las Rivas et al., 2007). La

clonación de los genes de interés se realizó mediante el método de clonación

independiente de ligación (LIC) descrito por De las Rivas y colaboradores (De las

Rivas et al., 2007). El vector pURI-Cter presenta una secuencia líder que está


constituida por un residuo de metionina en el extremo amino terminal y la cola de

afinidad que codifica seis residuos de histidina se localiza a 280 pb del residuo de

metionina, seguida de cuatro codones de terminación en tándem. De esta forma la

cola de histidinas se inserta en el extremo C-terminal del gen clonado. (Fig.4)

Figura 4. Esquema del plásmido pURI3-Cterminal

El proceso de clonación se llevó a cabo amplificaron los genes de interés con la ADN

polimerasa PrimeSTARTM HS (Takara) utilizando los oligonucleótidos diseñados con

extremos 5’ complementarios a regiones presentes en los vectores de expresión

(Tabla 3). De esta manera, en una segunda amplificación utilizando el vector como

molde y el gen amplificado como cebador, los extremos 5’ hibridan en el plásmido,

permitiendo a la enzima ADN polimerasa copiar el resto del plásmido y la consiguiente

inserción del gen de interés en el mismo.

Para seleccionar los plásmidos que contienen el gen de interés, se realizó una

digestión de la mezcla anterior con la enzima DpnI (Roche) durante 10 horas a 37 °C,

ya que estos no presentan secuencias metiladas y, por lo tanto, no van a ser digeridos

por dicha enzima. En algunos clonajes se llevó a cabo una segunda digestión con NotI

(Takara) durante 4 horas a 37 °C en tampón H (Takara), ya que esta diana de

restricción se encuentra en la región intergénica no codificante presente sólo en el

plásmido original y no en los plásmidos que han incorporado el inserto.

Posteriormente, ambas enzimas se inactivaron mediante una incubación a 65°C

durante 25 min y una vez inactivadas, las células competentes de E. coli DH10B se

transformaron con el producto de la digestión (ver apartado 3.4). Como medio de

selección se utilizaron placas de LB suplementadas con ampicilina a 100 μg/mL.

3.6 Manipulación de DNA con enzimas de uso común en biología molecular

Las enzimas utilizadas fueron DpnI (Roche) y NotI (Takara). Las enzimas y sus

correspondientes tampones se utilizaron siguiendo las indicaciones recomendadas por

cada proveedor.


3.7 Transformación genética de cepas bacterianas de E.coli

Para la transformación genética de E. coli, se prepararon células competentes

obtenidas mediante el método de cloruro de rubidio (Hanahan, 1983). Las células

competentes se obtuvieron cultivando células de E. coli DH10B o BL21 (DE3) en 100

mL de LB hasta una DO600 de 0,48, posteriormente se mantuvieron en hielo durante 30

min y el cultivo se centrifugó a 3800 x g durante 7 min a 4°C. El sedimento celular se

resuspendió en 30 mL de la solución TFBI (RbCl 100 mM, MnCl2 50 mM, KOAc 30

mM, CaCl2 10 mM y glicerol 15%) durante 90 min a 4°C. Pasado ese tiempo, la

suspensión celular se centrifugó a 3800 x g durante 7 min a 4°C y el sedimento se

resuspendió suavemente en 4 mL de la solución TFBII (MOPS 10 mM, RbCl 10 mM,

CaCl2 75 mM y glicerol 15%) hasta obtener una suspensión homogénea de células

competentes. La suspensión se repartió en alícuotas de 200 μL y éstas se

conservaron a -80°C.

La transformación de las células obtenidas se realizó incubándolas con el plásmido

(100 ng) durante 15 min en hielo, seguido de 3 min a 37°C y de 5 min en hielo.

Posteriormente, se añadió 1 mL de LB a las células y se incubaron a 37°C durante una

hora. Terminada la incubación las células transformadas se seleccionaron en placas

de LB conteniendo el antibiótico correspondiente y se incubaron a 37°C hasta la

aparición de colonias.

4. Técnicas de Proteínas:

4.1 Hiperproducción de proteínas recombinantes

Para la obtención de las proteínas analizadas en este trabajo, los genes que las

codifican se clonaron, como se ha indicado antes, en el vector de expresión pURI3-

Cter (Curiel et al., 2011) mediante el sistema de clonación LIC (de las Rivas et al.,

2007). Estos vectores de expresión presentan promotores inducibles por IPTG y una

secuencia líder que codifica una cola de afinidad de seis histidinas (His6), con objeto

de hiperproducir y purificar las proteínas recombinantes en un único paso.

Inicialmente el plásmido se propagó y amplificó en células de E. coli DH10B, pero para

la hiperexpresión se utilizó la cepa E. coli BL21 (DE3) puesto que es necesario que

contenga la RNA-polimerasa T7 del fago defectivo DE3. Las células de E. coli

transformadas con los plásmidos recombinantes se incubaron a 37 °C con agitación en

medio LB con ampicilina a una concentración final de 100 μg/mL. Una vez que el

cultivó alcanzó una densidad óptica a 600 nanómetros (DO600nm) entre 0,4 y 0,6, se

indujo con IPTG a una concentración final 0,4 mM. Después de añadir el inductor se


incubaron 24 horas a 22 °C con agitación. En algunos casos en los que el medio

contenía sorbitol -para mejorar la producción- se indujo con IPTG y se mantuvo el

cultivo 5 días en agitación a 22 °C. La concentración de proteínas se determinó

midiendo la absorbancia a 280 nm y utilizando el coeficiente de extinción molar teórico

de cada proteína.

4.2 Purificación de proteínas recombinantes.

Finalizado el periodo de inducción las células se recogieron mediante centrifugación a

7000 × g durante 15 min. El sedimento se sometió a tres lavados en solución salina

para eliminar restos del medio y, posteriormente, se resuspendió en tampón fosfato

sódico 50 mM, pH 7,0. Esta suspensión celular se rompió mediante tres pases por una

prensa de French (Amicon French pressure cell, SLM Instruments) a una presión de

1100 psi y posteriormente el lisado se centrifugó a 17400×g durante 40 min para

eliminar las células completas y los restos celulares. El sobrenadante obtenido se filtró

en un tamaño de poro de 0,2 µm (Millipore) obteniendo así los extractos proteicos

libres de células.

Tras obtener los extractos proteicos libres de las distintas proteínas sobreexpresadas

se purificaron mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC)

haciendo uso de la cola de poli-histidinas que éstas poseen. En función de los ensayos

a realizar la purificación se realizó bien mediante TALON® (Clontech), o bien mediante

columna de HisTrap de 5 mL (GE Healthcare Life Sciences) seguida de una etapa

cromatográfica de exclusión molecular con una columna Superdex 200 prep grade

HiLoad 16/600 (GE Healthcare Life Sciences).

Cromatografía IMAC con TALON® (cobalto inmovilizado)

La cromatografía de afinidad de unión a metales (IMAC) empleando TALON®

(Clontech) se realizó de este modo: el extracto celular se puso en contacto durante 20

min a temperatura ambiente con 1 mL de la resina con cobalto previamente

equilibrada con tampón fosfato sódico 50 mM, pH 7,0 conteniendo 300 mM NaCl. Una

vez unida la proteína a la resina, se realizó un lavado con el mismo tampón

conteniendo 10 mM imidazol. La elución de la proteína se realizó aplicando el mismo

tampón con 150 mM imidazol.

Cromatografía IMAC con HisTrap (níquel inmovilizado)

Para esta cromatografía se empleó una columna HisTrap de 5 mL (GE Healthcare Life

Sciences) acoplada a un sistema cromatográfico ÄKTAprime Plus (GE Healthcare Life

Sciences). El protocolo empleado fue el siguiente: el homogeneizado celular se aplicó


a la columna previamente cargada de Ni2+ y equilibrada en tampón 20 mM Tris, pH 8.0

con 100 mM NaCl con una bomba peristáltica P-1 (GE Healthcare Life Sciences) con

un flujo de 5 mL/min. Una vez cargada la muestra, la columna se acopló al sistema

ÄKTAprime Plus. Tras un exhaustivo lavado de la columna con tampón 20 mM Tris,

pH 8.0 con 100 mM NaCl y 10 mM imidazol, se aplicó un gradiente lineal de imidazol

(10-500 mM) con un volumen final de 150 mL y un flujo de 5 mL/min. El perfil de

elución se analizó midiendo la absorbancia a 254 nm, recogiéndose fracciones de 3

mL.

Cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 200 HiLoad 16/600 prep grade)

Tras recoger las fracciones que contienen la proteína de interés y concentrarlas

mediante ultrafiltración hasta un volumen final de 3 mL se llevó a cabo una

cromatografía de exclusión por tamaño con Superdex 200 HiLoad 16/600 prep grade.

El objeto es doble: por un lado, eliminar el imidazol de la etapa cromatográfica anterior,

así como los posibles agregados solubles y, por otro, tener una idea real de la

polidispersión de la muestra en solución así como una estimación del estado

oligomérico de la proteína. Como en el caso anterior, el perfil de elución se analizó

midiendo la absorbancia a 254 nm, recogiéndose fracciones de 2 mL. Las fracciones

conteniendo la proteína se juntaron, procediéndose a concentrar la proteína mediante

ultrafiltración (5000g; ciclos de 10 min) con filtros Millipore (10 kDa cutoff) hasta una

concentración final aproximada de 10 mg/mL. La concentración de proteína se estimó

mediante medidas espectroscópicas con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000

(NanoDrop), empleando un coeficiente E0.1% (280nm, 1cm) teórico de acuerdo a ProtParam

de ExPASy.

Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-

PAGE)

La electroforesis de proteínas se realizó en condiciones desnaturalizantes en

presencia de dodecilsulfato sódico (SDS). La técnica utilizada fue la descrita por

Laemmli (Laemmli, 1970) utilizando geles de poliacrilamida a una concentración de

acrilamida del 10%. Las muestras que contenían la proteína a resolver se llevaron a

80°C durante 10 min en presencia de un tampón Tris-HCl 6,5 mM pH 6,8; SDS 2%; β-

mercaptoetanol 5%; glicerol 10% y azul de bromofenol 0,005%. La electroforesis se

realizó a temperatura ambiente, utilizando como electrolito el tampón Tris-HCl 25 mM;

glicina 192 mM; SDS 0.1%. Las proteínas presentes en los geles se tiñeron con azul

brillante de Coomassie R-250 (Sigma). Como marcador de masa molecular se empleó

SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range (BioRad).


5. Cristalografía de proteínas

5.1 Ensayos de pre-cristalización

Una vez obtenida una muestra de proteína pura (> 98% de pureza) y homogénea, se

procedió a determinar la concentración óptima de la misma para llevar a cabo

experimentos de cristalización de alto rendimiento. Para ello se empleó el producto

comercial PCT (PreCrystallization Test) de Hampton Research®. La concentración de

partida de cada proteína fue por defecto 10 mg/mL. Los ensayos se realizaron a 18 °C

con placas 48-well Maxi Plate, empleando un volumen de 150 μL en cada reservorio y

gotas de 2 μL (1 μL solución de precristalización más 1 μL de proteína). Este ensayo

considera cuatro disoluciones precipitantes diferentes, dos basadas en sulfato

amónico (Tris-HCl, pH 8.5 2 M sulfato amónico y Tris-HCl, pH 8.5 1 M sulfato amónico)

y dos en polietilénglicol 4K (Tris-HCl, pH 8.5, 200 mM cloruro de magnesio y PEG 4K

30% (w/v) y Tris-HCl, pH 8.5, 200 mM cloruro de magnesio y PEG 4K 15% (w/v)). Tras

alcanzarse el equilibrio mediante difusión de vapor se analizó el aspecto de las gotas

bajo un microscopio. Esencialmente, gotas claras indican una concentración baja de

proteínas mientras que la presencia de precipitados masivos indican concentraciones

demasiado altas.

Figura 5: Esquema estructura de placas Innovaplate SD2 y ampliación de pocillo para resaltar la relación de volumen.

5.2 Ensayos de cristalización de alto rendimiento

Screening de condiciones de cristalización

Con la concentración adecuada de cada proteína, se llevaron a cabo experimentos de

cristalización de alto rendimiento con un robot Innovadyne Nanodrop ExtY (Solve


Scientific). Se emplearon placas Innovaplate SD2 de 96 pocillos (Fig.5 ) previamente

preparadas conteniendo 96 disoluciones distintas procedentes de kits comerciales de

Hampton Research®, Qiagen y Jena Bioscience (Tabla 4.). El volumen final de las

gotas se ajustó a 500 nL, resultado de mezclar 250 nL de solución de proteína con 250

nL de solución de cristalización, y se equilibró frente a 65 μL de solución de

cristalización presente en cada uno de los pocillos. De esta manera, se pueden probar

rápidamente cientos de soluciones diferentes.

Kits comerciales

JBS Classic 1-4 (Jena Bioscience)

Crystal Screen 1 y 2 (Hampton Research)

Index (Hampton Research)

PACT (Qiagen)

JCSG (Qiagen)

Tabla 4 : Screening microplacas.

Optimización de Condiciones de cristalización

Tras determinar las condiciones preliminares de cristalización se procedió a la

optimización de las mismas. Para ello, en primer lugar, se procede a replicar

manualmente los experimentos a una escala de volúmenes de microlitros usando

disoluciones preparadas en el laboratorio. Estos experimentos se realizan en placas

Linbro de 24 pocillos (Hampton Research) con volúmenes del reservorio de 150 µL y

gotas de entre 2 y 5 µL (se prueban diferentes relaciones de volumen de

proteina:precipitante). Estas placas permiten realizar experimentos de cristalización

mediante difusión de vapor con gota sentada.

Una vez escalados los experimentos, se procede a realizar un análisis

multidimensional, preparando disoluciones en las que se varía la concentración de los

diferentes componentes de la solución de cristalización (Tabla 5.) Finalmente, en caso

de ser necesario, se procede a etapas posteriores de optimización de la mejor

condición de cristalización mediante el empleo de kits de aditivos y/o detergentes.


Relación de volúmenes

(Prec:Prot)

%

PEG

%

Isopropanol Tampón

1:1

2:1

1:2

2:2

10%

12,5%

15%

17,5%

20%

6%

8%

10%

12%

15%

20%

Citrato sódico 0,1M pH 4

Citrato sódico 0,1M pH 4,6 Citrato

sódico 0,1M pH 5 Citrato sódico

0,1M pH 5,6

Citrato sódico 0,1M pH 6,2

BisTris 0,1 M pH 6,5

BisTrisPropano 0,1M pH 7,5

BisTrisPropano 0,1M pH 8

BisTrisPropano 0,1M pH 9,5

[Proteína]

25 mg/ml

20 mg/ml

Tabla 5 : Condiciones de optimización.

6. Otros ensayos:

6.1 Espectrometría de masas

La masa molecular y la homogeneidad de las proteínas se analizó mediante

espectrometría de masas en el Servicio de Espectrometría de Masas del Instituto de

Química Física “Rocasolano” (IQFR, CSIC). Se empleó un espectrómetro Voyager DE

PRO (Applied Biosystems) equipado con un láser de nitrógeno (λ= 337 nm, anchura

de pulso 10 ns y frecuencia de 3 Hz) y una fuente iónica con extracción retardada. La

ionización de las muestras se lleva a cabo por MALDI (ionización por láser asistida por

matriz).

6.2 Identificación de proteínas mediante huella peptídica y fragmentación

MALDI TOF/TOF

Con objeto de identificar algunas de las proteínas hiperproducidas de forma soluble o

las que se encontraban en la fracción insoluble, las bandas correspondientes del gel

SDS-PAGE se cortaron y analizaron mediante MALDI TOF/TOF. Dicha identificación

se llevó a cabo en el Servicio de Proteómica del Centro de Investigaciones Biológicas

(CIB), CSIC, Madrid.

Brevemente, se realizó una digestión de las muestras con la proteasa tripsina y,

posteriormente, ésta se analizó en el espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF

Autoflex III (Bruker). El espectro de masas resultante presentó una serie de masas

(m/z) que correspondían a los péptidos trípticos característicos de las proteínas

presentes en la muestra. Esas masas y sus fragmentaciones se combinaron y


enfrentaron a una base de datos de proteínas (NCBInr). Empleando el motor de

búsqueda Mascot se compararon todas las masas trípticas teóricas de las proteínas

contenidas en la base de datos frente a las masas experimentales obtenidas a partir

de la muestra. El resultado fue una lista de candidatos estadísticamente validados con

una determinada puntuación (score) para un determinado p-valor (p <0,05).

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Análisis in silico de las secuencias de las proteínas Lp_1424 y Lp_1425

Tal y como se ha comentado anteriormente, el grupo de Biotecnología Bacteriana

determinó que las enzimas involucradas en la reducción de los ácidos fenil propiónicos

eran Lp_1424 y Lp_1425. Un primer análisis de las secuencias de ambas proteínas

mediante la herramienta Standard Protein BLAST®, revela para el caso de Lp_1424

un alto grado de similitud con flavodoxinas, es decir, reductasas dependientes del

cofactor flavín mononucleótido (FMN; Fig. 6), en tanto que para la secuencia de

Lp_1425 revela la presencia de dos módulos: un módulo N-terminal de unión a FMN,

similar a Lp_1424 (Fig. 7), y otro C-terminal de unión a flavín adenín dinucleótido

(FAD) (Fig. 8). Estos resultados son coherentes con la función biológica determinada

para Lp_1424 y Lp_1425. En particular, en la figura 6 aparece el alineamiento de la

secuencia de Lp_1424 con la de la flavodoxina de Pseudomonas aeruginosa, en tanto

que en la figura 7 aparece la comparación entre las secuencias de Lp_1424 y la región

N-terminal de Lp_1425. Por otro lado, la asignación de la región C-terminal de

Lp_1425 como un módulo de unión de FAD se puede deducir de la elevada similitud

de secuencia con la secuencia del dominio homólogo de la fumarato reductasa de

Shewanella oneidensis (Fig. 8). En la figura 9 se muestra la secuencia completa de

Lp_1425 resaltando las dos regiones funcionales deducidas anteriormente.

Figura 6. Comparación de la secuencia de la proteína Lp_1424 con la flavodoxina de P. aeruginosa (código PBD: 1rtt). Los residuos con fondo rojo indican posiciones idénticas y los que aparecen con fondo azul son posiciones altamente conservadas.

1rtt MSLSDDIKVLGISGSLRSGSYNSAALQEAIGLVPPGMSIELADISGIPLYNEDVYALGFP

Lp_1424 ------MKFVGIVGTNATKSTNRQLLQYMQRHFQQQATIEICEIKDLPAFNEPED-RTAP

1rtt PAVERFREQIRAADALLFATPEYNYSMAGVLKNAIDWASRPPEQPFSGKPAAILGASAGR

Lp_1424 VAIQQLSDKITAADGVIFATPEYDHSIPAVLKSAIEWLSYT-TRPLINKPVMIVGASNGS

1rtt FGTARAQYHLRQTLVFLDVHPLNKPEV--MISSAQNAFDAQGRLLDDKARELIQQQLQAL

Lp_1424 LGTSRAQAHLRQILEAPELKALVMPNIEYLLGRSLQAFDDQGDLTYPDKVQELDNAFGEF

1rtt QLWVREG-------------------------

Lp_1424 IDFVDLTNKIMPSSQFFEKSKQFSWRQVTGEE


Figura 7. Comparación de la secuencia de la proteína Lp_1424 con la región N-terminal de Lp_1425. Los residuos con fondo rojo indican posiciones idénticas y los que aparecen con fondo azul son posiciones altamente conservadas. En gris aparece parte de la secuencia de Lp_1425 no homóloga a Lp_1424.

Figura 8: Comparación de la región C-terminal de la proteína Lp_1425 con la región homóloga de la fumarato reductasa de Shewanella oneidensis (código PDB: 1d4c). Los residuos con fondo rojo indican posiciones idénticas y los que aparecen con fondo azul son posiciones altamente conservadas. En gris aparecen zonas N-terminales no homólogas.

Una observación importante realizada en nuestros trabajos previos de producción y

purificación de la proteína Lp_1425 es que ésta se hidrolizaba, originando un solo

fragmento peptídico de unos 55 kDa de acuerdo a los resultados electroforéticos (Fig.

10). De hecho, el análisis de esta banda mediante espectrometría de masas y huella

peptídica revela que su masa es 56065 Da. Teniendo en cuenta este dato junto con

los péptidos identificados (Fig. 9), pudimos identificar la secuencia específica de este

fragmento, que se corresponde con los 523 últimos residuos. Esta región, por lo tanto,

correspondería al módulo de unión a FAD, que va a ser analizado en este trabajo.

Lp_1424 MKFVGIVGTNATKSTNRQLLQYMQRHFQQQATIEICEIKDLPAFNEPEDRTAPVAIQQLS

Lp_1425 MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFA

Lp_1424 DKITAADGVIFATPEYDHSIPAVLKSAIEWLSYTTRPLINKPVMIVGASNGSLGTSRAQA

Lp_1425 TKIATADGVIIASPEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQL

Lp_1424 HLRQILEAPELKALVMPNIEYLLGRSLQAFDDQGDLTYPDKVQELDNAFGEFIDFVDLTN

Lp_1425 HLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRAQTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVA

Lp_1424 KIMPSSQFFEKSKQFSWRQVTGEE

Lp_1425 EMRAPEALSFAPGTYQVTATGHNGELPMRVTLSADRIENIEIDTSSETQGIADV

Lp_1425 RIPKEIIAGQTLAVDAISGASITSHGVIDGVARAVKEAGANPDDLKKRRATKQVAQPAVK

1d4c SCH----KGHEKSVAYCD--ACHSFGFDMPFG-GKWERKFVPVDAD--KAAQDKAIAAGV

Lp_1425 EVTTDVVVVGAGGAGMTAAAKVLQAGHQAVVLEKFPAVGGNTVRAGGPMNAADPDWQRQF

1d4c KETTDVVIIGSGGAGLAAAVSARDAGAKVILLEKEPIPGGNTKLAAGGMNAAETKPQAKL

Lp_1425 AALPGEKQTLKDLSERDESTIAPEYRADFRKLKQQIDAYLTANTNQKGTLFDSTLLHRIQ

1d4c GIEDK-KQ----------------------------------------IMIDD-------

Lp_1425 TYLGGQRTDLNGQEIHGQYDLVKELTDNALDSVKWLQSIGVKFDESQVTMPVGAIWRRGH

1d4c --------TMKGGRNINDPELVKVLANNSSDSIDWLTSMGADMTDV--GRMGGASVNRSH

Lp_1425 KPMGDLGFAYIKTL--RAFVEQQGGTIM-TETPVKELLVTDGQVRGVIATNAAHEKVIVH

1d4c RPTGGAGVGAHVAQVLWDNAVKRGTDIRLNSRVVRILEDASGKVTGVLVKGEYTGYYVIK

Lp_1425 ADAVILASGGFAANTKMLQKYNTYWTAIDDDVKTTNSPAMTGDGIRLGTSVGAALVGMGF

1d4c ADAVVIAAGGFAKNNERVSKYDPKLK----GFKATNHPGATGDGLDVALQAGAATRDLEY

Lp_1425 SQMMPVSDPETGELFSGLQVPPANFVMVNQQGKRFVNEYGSRDELTQAAID-NGSLFYLI

1d4c IQAHPTYSPAGGVMITE-AVRGNGAIVVNREGNRFMNEITTRDKASAAILQQKGESAYLV

Lp_1425 ADDEIKKTAYNTTQAKIDQQVANGTLFRADTLTDLAQQIGMDPAALTKTIADYNRYVDAG

1d4c FDDSIRKSLKA-----IEGYVHLNIVKEGKTIEELAKQIDVPAAELAKTVTAYNGFVKSG

Lp_1425 EDPEFHKTAFDLKVAVAPFYATPRKPATHHTMGGLKIDSDAHVL-NTDGQVIDGLYAAGE

1d4c KDAQFERPDLPRELVVAPFYALEIAPAVHHTMGGLVIDTKAEVKSEKTGKPITGLYAAGE

Lp_1425 VAGGIHAGNRLGGNSLSDIFTFGRIAAAHAVAEHVDPVTA

1d4c VTGGVHGANRLGGNAISDIVTYGRIAGASAAKFAKDN---


Figura 9. Secuencia de Lp_1425 mostrando sus módulos funcionales. Con fondo rojo aparece señalado el dominio flavodoxina implicado en la unión de FMN y en azul el módulo de unión a FAD. Asimismo, se indican péptidos encontrados experimentalmente en el análisis de huella peptídica (subrayado en negro; ver texto para detalles).

2. Clonación de Lp_1424 y los dominios FMN y FAD de Lp_1425 e

hiperproducción de las proteínas correspondientes

Basándonos en los resultados observados in silico y tras el análisis proteómico, para

desarrollar el estudio estructural de Lp_1424 y Lp_1425 se hicieron las siguientes

construcciones:

o pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425): para la producción heteróloga el

heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN

o pURI3-Cter dominio FMN1425: para la produción heteróloga de Lp_1425FMN

o pURI3-Cter dominio FAD1425: para la producción heteróloga de Lp_1425FAD

Todas las construcciones se llevaron a cabo utilizando un método de clonación en

ausencia de ligación (LIC) tal y como se describe en el apartado 3.5 de Materiales y

Métodos.

Para obtener la construcción pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425) se utilizaron los oligonucleótidos 1735 y 1736 (Tabla 3.) y como molde la construcción pURI3-Cter (1424+1425) de la cual ya se disponía previamente en el laboratorio. En el caso de la construcción pURI3-Cter dominio FMN1425 en primer lugar se amplificó el fragmento de lp_1425 correspondiente al dominio FMN mediante PCR utilizando como molde DNA de L. plantarum WCFS1 y los oligonucleótidos 1731 y 1732 (Tabla 3.) tal y como

Figura 10. Análisis electroforético de la proteína Lp_1425 recombinante de L. plantarum WCFS1. 1, proteína congelada 7 días a -20ºC tras su elución; 2, proteína dializada durante 16 h a 4ºC.

MKFVGIVGTNAQHSYNRMLLEFMQRHFATQAEIEILELTDVPMFDESNDQTDSTIIQNFATKIATADGVIIAS

PEHNHSVPSALKSIIEWLSFKIHPLDGQAVMIVGASYSVQGSSRAQLHLRQILDAPGVNASVMPGSEFLLGRA

QTAFDDQGNLKVQGTVDFLDSCFAKFQKFATIVAEMRAPEALSFAPGTYQVTATGHNGELPMRVTLSADRIEN

IEIDTSSETQGIADVAFERIPKEIIAGQTLAVDAISGASITSHGVIDGVARAVKEAGANPDDLKKRRATKQVA

QPAVKEVTTDVVVVGAGGAGMTAAAKVLQAGHQAVVLEKFPAVGGNTVRAGGPMNAADPDWQRQFAALPGEKQ

TLKDLSERDESTIAPEYRADFRKLKQQIDAYLTANTNQKGTLFDSTLLHRIQTYLGGQRTDLNGQEIHGQYDL

VKELTDNALDSVKWLQSIGVKFDESQVTMPVGAIWRRGHKPMGDLGFAYIKTLRAFVEQQGGTIMTETPVKEL

LVTDGQVRGVIATNAAHEKVIVHADAVILASGGFAANTKMLQKYNTYWTAIDDDVKTTNSPAMTGDGIRLGTS

VGAALVGMGFSQMMPVSDPETGELFSGLQVPPANFVMVNQQGKRFVNEYGSRDELTQAAIDNGSLFYLIADDE

IKKTAYNTTQAKIDQQVANGTLFRADTLTDLAQQIGMDPAALTKTIADYNRYVDAGEDPEFHKTAFDLKVAVA

PFYATPRKPATHHTMGGLKIDSDAHVLNTDGQVIDGLYAAGEVAGGIHAGNRLGGNSLSDIFTFGRIAAAHAV

AEHVDPVTA


muestra la figura 11 A. Una vez amplificado dicho fragmento se purificó siguiendo el protocolo descrito en el apartado 4.2 de Materiales y Métodos. Con el fragmento purificado se llevó a cabo la clonación mediante el método LIC descrito previamente (Apartado 3.5 de Materiales y Métodos) utilizando como plásmido molde pURI3-Cter. En el caso de la construcción pURI3-Cter domino FAD1425 el abordaje fue el mismo amplificándose en este caso el fragmento correspondiente al dominio C-ter de 1425, dominio FAD, con los oligonucleótidos 1793 y 890 (Fig. 11B) para posteriormente, con este fragmento amplificado y purificado, llevar a cabo la clonación del dominio FAD en el plásmido pURI3Cter.

Figura 11. Amplificación mediante PCR del fragmento del gen que codifica (A): el dominio N-terminal de Lp_1425 (dominio FMN) utilizando los oligonucleótidos 1731 y 1732; (B): el dominio C-terminal de Lp_1425 (dominio FAD) utilizando los oligonucleótidos 1793 y 890

Para seleccionar los plásmidos recombinantes que contenían los genes o fragmentos

de genes de interés se realizó una digestión con la enzima DpnI (tal y como se

describe en el Apartado 3.6 de Materiales y Métodos, con estas digestiones se

transformó la cepa de E. coli DH10B (ver Apartado 3.7 de Materiales y Métodos). De

las colonias obtenidas se hizo una extracción rápida de plásmido (ver Apartado 3.1 de

Materiales y Métodos) y se seleccionó por tamaño la construcción buscada que se

confirmó posteriormente mediante secuenciación (Fig.12)

Figura 12: chequeo de las construcciones (A) pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425); (B) pURI3-Cter domino FMN 1425 y (C) pURI3-Cter dominio FAD1425 mediante el método de extracción rápida de plásmidos. (A): línea 1,marcador de peso molecular λ T14I (Takara); línea 2, control (pURI3-Cter (1424+1425)) , líneas 3, 4, 5, 7 y 8 pURI3-Cter (1424+dominio FMN1425), línea 6 pURI3-Cter (1424+1425). (B): línea 1,marcador de peso molecular λ T14I (Takara); línea 2 control pURI3-Cter; líneas 3,4,5 ,7 y 8 pURI3-Cter dominio FMN1425; línea 6 pURI3-Cter.(C): línea 1,marcador de peso molecular λ T14I (Takara); línea 2, control pURI3-Cter; líneas 3 y 7 pURI3-Cter; líneas 4, 5, 6 y 8 pURI3-Cter dominio FAD1425.

Una vez seleccionadas las distintas construcciones, con el fin de hiperproducir las

proteínas correspondientes se transformó con cada una de ellas la cepa E.coli

BL21(DE3) de la misma forma que en el caso de la cepa E.coli DH10B descrito


previamente. Esta cepa posee la polimerasa del fago T7 necesaria para la expresión

de los genes clonados en el plásmido pURI3-Cter. Las condiciones de inducción que

se utilizaron fueron 22ºC durante 16 horas, excepto en los casos en los que se

necesitó aumentar la producción y se añadió sorbitol, se indujo con IPTG y se

mantuvo el cultivo 5 días en agitación a 22ºC.

3. Purificación y comportamiento en solución

La estrategia de purificación de las proteínas con las que se ha trabajado con fines

estructurales implica una primera etapa de cromatografía de afinidad a metales

inmovilizados (IMAC) usando una columna de Ni2+-NTA, seguida de una cromatografía

de exclusión molecular con una columna Superdex® 200 prep grade (16/60). Para

poder llevar a cabo la primera etapa cromatográfica se incluyó en las secuencias de

las proteínas recombinantes una etiqueta de 6 histidinas (ver Apartado 4.1 de

Materiales y Métodos). La segunda cromatografía resulta muy eficaz no solo en

términos de purificación sino que también nos permite deducir cómo de homogénea es

la muestra así como estimar la masa molecular de la proteína en solución y, por lo

tanto, su posible carácter oligomérico y finalmente, nos permite separarla del imidazol

empleado para su elución en la primera cromatografía.

3.1. Lp_1425FMN

Este estudio parte del conocimiento previo de la producción y purificación de Lp_1424,

que resultó ser una proteína muy soluble y homogénea, con una masa molecular en

solución consistente con la de un homodímero en solución (47 kDa; resultados no

mostrados). Teniendo en cuenta estos resultados positivos y el alto grado de similitud

de secuencia con el módulo N-terminal de Lp_1425 predicho como módulo de unión

de FMN (Lp_1425FMN) se procedió a producir y purificar esta última construcción que

como puede verse en la figura 9 posee 182 residuos.

A diferencia de lo observado con Lp_1424, el comportamiento de Lp_1425FMN en la

cromatografía de exclusión molecular (Fig. 13) revela la presencia de agregados

solubles masivos, presentes en el volumen de exclusión, así como diferentes especies

de alta masa molecular, desde alrededor de 80 kDa hasta más de 400 kDa. La

conclusión, por lo tanto, es que la muestra es heterogénea en solución, lo cual es

debido a fenómenos de agregación. Esta polidispersión en solución de Lp_1425FMN

no desaparece cuando se añade al medio glicerol (10% v/v), agente frecuentemente

usado con objeto de solubilizar/estabilizar proteínas en estudios estructurales

(Benvenuti & Mangani, 2007). Interesantemente, el volumen del pico de la especie con


menor tamaño presente en el perfil de elución es consistente con una especie

molecular con una masa en solución alrededor de los 43 kDa, lo que indicaría que

Lp_1425FMN formaría especies diméricas en solución, de modo similar a Lp_1424.

El comportamiento mostrado por Lp_1425FMN impidió, en esta etapa preliminar de su

análisis, continuar su estudio mediante cristalografía de proteínas.

Figura 13. Perfil de elución de una muestra de Lp_1425FMN empleando una columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60). Se indican las masas moleculares aproximadas de las especies correspondientes a los distintos picos.

3.2. Lp_1424:Lp_1425FMN

La segunda proteína que se ha analizado en este trabajo ha sido el heterodímero

Lp_1424:Lp_1425FMN. La hipótesis de partida de su existencia se basa en resultados

previos de nuestro grupo que demostraron la formación en solución del heterodímero

Lp_1424:Lp_1425. Teniendo en cuenta que ambas proteínas poseen un módulo

flavodoxina (Lp_1424 es, de hecho, un módulo flavodoxina) y que Lp_1424 es un

dímero en solución, lo más razonable es pensar en que el heterodímero

Lp_1424:Lp_1425 se formaría mediante la asociación entre estos dominios

flavodoxina. A su vez, la producción de esta proteína nos hablaría acerca de la posible

estabilización de Lp_1425FMN una vez se asocia con Lp_1424.

De un modo similar al caso anterior, partiendo de homogenizados celulares de cultivos

de E. coli BL21 (DE3) conteniendo pURI3-Cter(1424-1425FMN), la primera etapa

cromatográfica fue una cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC)

usando una columna de Ni2+-NTA. Es de destacar, que la construcción empleada se

diseñó específicamente de manera que solo Lp_1425FMN posee cola de histidinas,

por lo que la presencia de Lp_1424 en el eluido de la columna solo puede explicarse

por su asociación a Lp_1425FMN.


Tal y como puede verse en la figura 14.A, el perfil de elución de esta cromatografía de

afinidad revela un pico en el gradiente de imidazol que, a diferencia de lo observado

con Lp_1425FMN, poseía un fuerte color amarillo indicativo de que la especie o

especies eluidas llevaban unido FMN oxidado. Una vez recogidas las fracciones y

concentradas, la muestra fue aplicada en la columna de Superdex® 200. El perfil de

elución (Fig. 14B) muestra la presencia de un único pico de proteína, con una masa

estimada aproximada de 50 kDa, lo cual es coherente con la existencia del esperado

heterodímero (masa esperada 44 kDa).

Figura 14. Comportamiento cromatográfico del heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN a lo largo de su purificación. (A) Perfil de elución de la columna de Ni2+-NTA; (B) perfil de elución de la columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60). Se indica la masa molecular estimada del heterodímero.

Las fracciones correspondientes al pico se juntaron y la muestra resultante se

concentró, no apareciendo en ningún momento agregación de proteína; de hecho, el

espectro de absorción de la muestra en la región UV-VIS no mostró ningún indicio de

dispersión. En la figura 15 se muestra el espectro de absorción, destacando la

absorbancia en el amarillo.


Figura 15. Espectro de absorción en la región del UV-VIS de Lp_1424:Lp_1425FMN. Se puede observar el máximo local en la región del amarillo (λ= 455 nm). Los máximos a 376 y 455 nm son característicos del cofactor FMN.

De esta muestra concentrada, se tomó una alícuota y se diluyó en agua bidestilada

para realizar una medida de espectrometría de masas (ver Apartado 6.1 de Materiales

y Métodos). Los resultados revelaron la existencia de dos especies moleculares con

masas de 20953 Da y 22924 Da, las cuales se corresponden con la masa de

Lp_1425FMN (masa por secuencia: 20954 Da) y Lp_1424 (masa por secuencia:

22925 Da).

En su conjunto, estos resultados indican que efectivamente, se ha podido purificar el

heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN, el cual es soluble y estable en solución. Se

podría incluso sugerir que la asociación de Lp_1424 con Lp_1425FMN conlleva una

estabilización de esta última cadena polipeptídica. La proteína, al mostrar un

comportamiento las anteriores características, fue posteriormente empleada para

realizar experimentos de cristalización.

3.3. Lp_1425FAD

La siguiente proteína que se ha analizado en este trabajo ha sido el dominio C-

terminal de Lp_1425, responsable de la unión del cofactor FAD (Fig. 8 y 9). En

realidad, estrictamente, habría que hablar del módulo de unión de FAD de Lp_1425

(Lp_1425FAD). Tal y como se ha descrito anteriormente, el vector de expresión de

Lp_1425FAD se diseñó de acuerdo con los resultados observados con Lp_1425, que

demostraron su degradación para formar una sola especie, posteriormente identificada

mediante espectrometría de masas y huella peptídica. Esta especie tendría 523

aminoácidos y su secuencia aparece en la figura 9.

El protocolo empleado para su purificación es el descrito anteriormente para las otras

proteínas. La cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) usando una

columna de Ni2+-NTA, reveló la presencia de un pico en el eluido (Fig. 16.A), cuyas

longitud de onda (nm)


fracciones mostraban un evidente color amarillo que a priori puede asignarse a la

presencia de FAD oxidado. Esto es ya muy importante pues es una evidencia de que

el módulo Lp_1425FAD tiene el sitio de unión del cofactor funcional, coherente con

que el módulo se encuentre bien plegado. Tras concentrar la muestra, ésta se aplicó a

la columna de Superdex® 200, cuyo perfil de elución mostró unas características

similares a lo visto con Lp_1425FMN: presencia de agregados masivos en el volumen

de exclusión y diferentes especies de masas moleculares elevadas (Fig. 16.B). Esto es

indicativo de que el módulo es inestable en solución, formando agregados.

Figura 17. Comportamiento cromatográfico del módulo Lp_1425FAD a lo largo de su purificación con tampones sin glicerol. (A) Perfil de elución de la columna de Ni2+-NTA; (B) perfil de elución de la columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60). Se indica la masa molecular estimada de las distintas especies observadas.

Este mismo protocolo se empleó con tampones conteniendo glicerol 10% (v/v) con

objeto de comprobar su efecto en la solubilidad de la proteína. Mientras que el

comportamiento en la primera etapa cromatográfica fue similar al anterior caso (Fig.

18.A), lo observado en la cromatografía de exclusión molecular indicó un marcado

afecto estabilizador del glicerol (Fig. 18.B): en este caso, se observa el predominio de

un pico que se correspondería con una especie de aproximadamente 60 kDa, es decir,

una masa que correspondiente a un monómero de Lp_1425FAD. Las fracciones

correspondientes a este pico se juntaron y la muestra se concentró, no observándose

síntomas de agregación.


Figura 18. Comportamiento cromatográfico del módulo Lp_1425FAD a lo largo de su purificación con tampones con glicerol (10 %, v/v). (A) Perfil de elución de la columna de Ni2+-NTA; (B) perfil de elución de la columna de exclusión molecular en Superdex® 200 prep grade (16/60).

El espectro de absorción de esta muestra, como era de esperar por su color amarillo,

mostró máximos en esta región del espectro, propios del cofactor FAD (Fig. 19).

Figura 19. Espectro de absorción en la región del UV-VIS de Lp_1425FAD. Se puede observar el máximo local en la región del amarillo (λ= 460 nm). Los máximos a 375 y 460 nm son característicos del cofactor FAD.

De la misma manera que antes, se tomó una alícuota de esta muestra para realizar

análisis de espectrometría de masas, que proporcionó un valor de 56894 Da (valor

teórico considerando la cola de 6 histidinas: 56888 Da).


Estos resultados junto con los obtenidos con el heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN y

permiten proponer la idea de que el heterodímero Lp_1424:Lp_1425 se formaría

mediante la asociación de Lp_1424 con el módulo N-terminal flavodoxina de Lp_1425.

El buen comportamiento observado con Lp_1425FAD en presencia de glicerol (10%,

v/v) ha permitido llevar a cabo experimentos preliminares de cristalización.

4. Cristalización

Con objeto de caracterizar la estructura tridimensional del heterodímero

Lp_1424:Lp_1425FMN y del módulo Lp_1425FAD se han realizado los primeros

experimentos de cristalización de ambas proteínas en el Grupo de Cristalografía y

Biología Estructural del Instituto Rocasolano (CSIC). Brevemente, la estrategia general

que se ha seguido conlleva dos etapas: una primera de determinación de condiciones

de cristalización mediante técnicas de alto rendimiento empleando sistemas

automáticos (robots de cristalización), y una segunda de optimización de esas

condiciones preliminares, mediante técnicas manuales

Los resultados de la precristalización (Apartado 5.1 de Materiales y Métodos)

mostraron que con una concentración de 10 mg/mL para ambas proteínas se

observaron precipitaciones cuya magnitud respondía a las concentraciones de los

agentes precipitantes. Por ello, se usó inicialmente esta concentración para las dos

proteínas.

Una vez concluido este primer test inicial, se procedió al uso del robot Innovadyne

Nanodrop ExtY (Solve Scientific). El volumen final de las gotas se ajustó a 500 nL,

resultado de mezclar 250 nL de solución de proteína con 250 nL de solución de

cristalización, y se equilibró frente a 60 μL de solución de cristalización presente en

cada uno de los pocillos. Estos experimentos se realizaron a 18 ºC. (Apartado 5.2 de

Materiales y Métodos) Las placas empleadas contenían diferentes disoluciones de

cristalización derivadas de productos comerciales (Tabla. 4). Una vez realizadas las

mezclas, las placas se sellan con cinta adhesiva para impedir la desecación y se

mantienen a 18ºC.

Después de 24 horas de haber puesto las placas se pudo comprobar para el caso del

heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN la presencia de cristales en una condición del kit

Crystal Screen I y II de Hampton Research ® conteniendo 20% isopropanol, 20%

PEG 4K y 0,1 M citrato sódico, pH 5,6 (Fig. 19).


Figura 19. Cristales del heterodímero Lp1424:Lp_1425FMN obtenidos en 20% isopropanol, 20% PEG 4K y 0,1 M citrato sódico, pH 5,6.

Los resultados obtenidos con Lp_1425FAD, al contrario que los anteriores, fueron

negativos, e indicaron como resultado mayoritario la presencia de precipitados de

proteína desnaturalizada. Por este motivo, nos concentramos en la optimización de las

condiciones determinadas para el heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN. En primer

lugar, lo que se realizó fue la preparación manual de las mismas mezclas, pero con

volúmenes en la escala de microlitros (1 μL proteína más 1 μL condición de

cristalización). Los resultados fueron positivos y aparecieron cristales a los dos días.

Una vez comprobada la repetitividad de la cristalización en la escala de microlitros, se

llevó a cabo un refinamiento de las condiciones de cristalización, variando

sistemáticamente las concentraciones de sus diferentes componentes. (Tabla 5.) De

esta manera, pudimos llegar a unas condiciones optimizadas: 8% Isopropanol, 17,5%

PEG 4K y 0,1 M citrato sódico, pH 5,6. Es de destacar, que los cristales obtenidos son

amarillos, lo cual es una evidencia de que son cristales de proteína (que contienen

FMN oxidado). Esta es una observación importante por cuanto un aspecto que ha de

considerarse en estos experimentos, es que en numerosos casos, se obtienen

cristales de sal. Finalmente, los cristales optimizados eran una barras con tenían unas

dimensiones aproximadas de 0,1 x 0,2 x 0,3 mm3.

Los resultados alcanzados en este trabajo han supuesto un notable avance en el

proyecto de caracterización estructural del heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN, y de

hecho en la actualidad estamos en la fase de preparación de cristales para hacer

experimentos de difracción de rayos X en fuentes de radiación sincrotrón.

Previsiblemente, los resultados van a permitir resolver su estructura lo cual supondría

alcanzar resultados importantes en el modo mediante el cual las dos principales

proteínas implicadas en la reducción de ácidos hidroxicinámicos llevan a cabo esta

función.


V. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS

Conclusiones

Los resultados obtenidos en este trabajo permiten llegar a las siguientes conclusiones:

o Se ha podido producir y purificar satisfactoriamente el heterodímero

Lp_1424:Lp_1425FMN y el módulo Lp_1425FAD, en tanto que ambas proteínas son

estables en solución.

o El módulo Lp_1425FAD es monomérico en solución y une FAD, por lo que

estructuralmente es un dominio, esto es, una unidad de plegamiento independiente.

Teniendo en cuenta esto, junto con la evidencia previa de que existe el heterodímero

Lp_1424:Lp_1425 (resultados previos), se puede inferir que la asociación entre

Lp_1424 y Lp_1425 se produce a través del módulo amino terminal flavodoxina de

ésta última. La relevancia funcional de este hecho aún no la comprendemos y se está

investigando.

o El módulo Lp_1425FMN es inestable en solución, evolucionando a agregados

masivos. Los resultados cromatográficos indican no obstante la presencia de un

dímero en solución como unidad de menor tamaño molecular. Puesto que el

heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN es estable en solución, parece evidente que

deben existir elementos estructurales específicos que hacen que la asociación entre

monómeros de Lp_1425FMN sea energéticamente desfavorable. Es indudable que la

estructura del heterodímero Lp_1424:Lp_1425FMN ofrecerá claves para comprender

este hecho.

Conclusions

The results obtained in this work lead to the following conclusions:

o The Lp_1424: Lp_1425FMN heterodimer and the Lp_1425FAD module have

been satisfactorily produced and purified; both proteins are stable in solution.

o The Lp_1425FAD module is monomeric in solution and binds FAD, so it can be

defined as a domain, that is, as an independent folding unit. Taking this into account,

together with the evidence that the Lp_1424: Lp_1425 heterodimer exists (previous

results), it can be inferred that the association between Lp_1424 and Lp_1425 occurs

through the flavodoxin amino terminal module of the latter. The functional relevance of

this fact is not yet understood and is being investigated.

o The Lp_1425FMN module is unstable in solution, evolving into massive

aggregates. The chromatographic results indicate, however, the presence of a dimer in


solution as the smallest molecular unit. Since the Lp_1424: Lp_1425FMN heterodimer

in solution, it seems clear that there must be specific structural elements which make

the association between Lp_1425FMN monomers energetically unfavorable. There is

no doubt that the structure of the Lp_1424: Lp_1425FMN heterodimer will provide

clues to understanding this fact.


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http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)1097-0010






Caracterización estructural de enzimas implicadas en la...

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