CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS...

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIN

DEPARTAMENTO DE GRADUADOS E INVESTIGACIN EN

ALIMENTOS

CARACTERIZACIN DE COMPUESTOS FENLICOS

PRESENTES EN LA SEMILLA Y ACEITE DE CHA (Salvia hispanica L.), MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR.

T E S I S

PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRO EN CIENCIAS EN ALIMENTOS

PRESENTA:

FRANCISCO ERIK GONZLEZ JIMNEZ

DIRECTORES DE TESIS:

M. EN C. MARA DEL CARMEN BELTRN OROZCO

DRA. MARA GABRIELA VARGAS MARTNEZ

MXICO, D. F. DICIEMBRE 2010.

RESUMEN

Actualmente el estudio de alimentos con propiedades antioxidantes ha aumentado

considerablemente debido al inters que se tiene sobre los efectos benficos a la

salud que previenen dichos compuestos, tales como la prevencin de cncer,

enfermedades cardiovasculares y otras patologas de carcter inflamatorio. Adems

de que el consumo frecuente de antioxidantes se relaciona con la disminucin de

otras enfermedades como diabetes y enfermedades coronarias. En esta

investigacin se estudiaron 4 tipos de semilla de cha de los estados de Puebla y

Colima y el aceite extrado de la misma, determinando la capacidad antioxidante de

cada muestra por el mtodo del ABTS y la cantidad de fenoles totales con el reactivo

de Folin-Ciocalteu e identificacin de los compuestos fenlicos mediante la tcnica

de electroforesis capilar la cual es una herramienta muy til en el anlisis de

alimentos ya que disminuye la generacin de contaminantes, el tiempo de anlisis y

costo de los mismos. Los resultados obtenidos mostraron que la fraccin

desengrasada de la semilla de cha contiene una elevada capacidad antioxidante

(98.73 mol Trolox/g muestra) comparada con frutos como la frambuesa (84 mol

Trolox/g muestra) y la manzana roja (40 mol Trolox/g muestra) que se distinguen

por su alto contenido de antioxidantes. Mientras que el aceite de cha muestra

valores de fenoles totales comparables (12 mg acido glico/100 g muestra) en

relacin al aceite de olivo (13.36 mg acido glico/100 g muestra), en lo que respecta

al anlisis mediante electroforesis capilar se lograron identificar hasta 9 compuestos

fenlicos en el caso de la semilla desgrasada; cido ferlico, cido vainillinico, cido

trans-cinmico, cido glico, cido cafeico, cido clorognico, miricetina, quercetina,

kaempferol. En el caso del aceite se logr identificar hasta 4 compuestos fenlicos

(dependiendo del tipo de aceite); cido trans-cinmico, cido clorognico, cido p-

cumrico y Quercetina. En general se puede considerar la semilla de cha como un

alimento con potente capacidad antioxidante que incluyndola en la dieta diaria

ayudara a satisfacer los requerimientos diarios de antioxidantes y prevenir ciertas

enfermedades de patologa inflamatoria, adems de los beneficios que se obtendran

por los dems nutrientes que contiene como es el caso de la protena, fibra, y cidos

grasos omega 3 y 6.

ABSTRACT

Currently the study of food with antioxidants has increased considerably due to the

interest that has beneficial efects on health from such compounds, such as cancer

prevention, cardiovascular and other inflammatory cancer diseases.

In addition to the frequent consumption of antioxidants is related to the reduction of

other diseases such as diabetes and heart disease. In this work we have studied 4

types of chia seeds from the states of Puebla and Colima and the oil extracted from it,

determining the antioxidant capacity of each sample by the ABTS method and the

amount of total phenolics with the FolinCiocalteu reagent, and identification of

phenolic compounds by capillary electrophoresis which is a very useful tool in food

analysis because it reduces the generation of pollutants, the analysis time and cost of

them.

The results showed that the fraction defatted chia seeds contains a high antioxidant

capacity (98.73 mmol Trolox / g sample) compared with fruits such as raspberries (84

mmol Trolox / g sample) and red apple (40 mmol Trolox / g shown) that are

distinguished by their high antioxidant content. While chia oil shows comparable

values of total phenols (12 mg acid gallic/100 g sample) compared to olive oil (13.36

mg acid gallic/100 g sample), with respect to analysis by capillary electrophoresis was

achieved identify up to 9 phenolic compounds in the case of seed defatted; ferulic

acid, vanillin, trans-cinnamic acid, gallic acid, caffeic acid, chlorogenic acid, myricetin,

quercetin and kaempferol. In the case of oils were identified up to 4 phenolic

compounds (depending on the type of oil), trans-cinnamic acid, chlorogenic acid, p-

coumaric acid and quercetin.

In general we can consider chia seed as a food with powerful antioxidant that

including it in the daily diet would help meet the daily requirement of antioxidants and

prevent certain inflammatory disease pathology, in addition to the benefits to be

gained by the other nutrients it contains such as protein, fiber, omega 3 and 6.

II

INDICE GENERAL Pgina

NDICE GENERAL i

NDICE DE CUADROS iii

NDICE DE FIGURAS v

1. INTRODUCCIN

1.1 Caractersticas de la semilla de cha.

1.1.2 Cultivo.

1.1.3 Usos y aplicaciones.

1.1.4 Composicin de las semillas de cha.

1.1.5 La cha como fuente de cidos grasos indispensables en la nutricin humana. 1.2 Antioxidantes.

1.3 Compuestos polifenlicos.

1.3.1 Biosntesis de compuestos fenlicos.

1.3.2 Actividad antioxidante de los compuestos fenlicos.

1.3.3 Anlisis de compuestos fenlicos.

1.4 Electroforesis capilar.

1.4.1 Tipos de electroforesis.

1.4.2 Flujo electroosmtico. 19

1.4.3 Inyeccin de la muestra.

1.5 Aplicaciones de la electroforesis capilar al anlisis de alimentos.

1.6 Anlisis de compuestos fenlicos en alimentos mediante E.C.

JUSTIFICACIN.

OBJETIVOS.

Objetivo general.

Objetivos especficos.

2. MATERIALES Y MTODOS.

2.1 Materia prima.

2.2 Reactivos y materiales. 32

1

1

2

3

5

7

8

10

11

14

15

16

17

23

25

25

30

31

31

31

32 32

i

ii

2.3 Desarrollo experimental.

2.4 Equipo.

3. MTODOS.

3.1 Determinacin de protenas.

3.2 Determinacin de humedad.

3.3 Determinacin de fibra. .

3.4 Determinacin de cenizas.

3.5 Determinacin de lpidos.

3.6 Determinacin de carbohidratos

3.7 Extraccin del aceite de cha.

3.8 Extraccin de compuestos fenlicos de la semilla de cha

3.9 Extraccin de compuestos fenlicos presentes en el aceite de cha.

3.10 Determinacin de fenoles totales.

3.11 Capacidad antioxidante de los extractos de semilla y aceite de cha por el mtodo del radical ABTS.

3.12 Anlisis de compuestos polifenlicos mediante 38 electroforesis capilar

4. RESULTADOS Y DISCUSIN.

4.1 Anlisis proximal

4.2 Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha.

4.3 Determinacin de la capacidad antioxidante por el mtodo del ABTS.

4.4 Identificacin de compuestos fenlicos mediante 47 electroforesis capilar. 4.4.1 Eleccin de las condiciones ptimas de anlisis 47

4.4.2 anlisis de los extractos de aceite de cha 65 5. CONCLUSIONES 92

6. BIBLIOGRAFA 94

33

34

34

34

35

35

35

35

36

36

36

36

37

38

40

40

41

45

iii

NDICE DE CUADROS

Cuadro No. Pgina

1. Concentracin de antioxidantes en extractos de semilla de cha.

6

2. Concentracin relativa de compuestos fenlicos en tejidos vegetales

10

3. Las principales clases de compuestos fenlicos en

frutos.

11

4. Mtodos para el anlisis de compuestos fenlicos mediante E.C.

27

5. Anlisis proximal de la semilla de cha 40

6. Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha. 42

7. Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de cha y aceite

45

8 Condiciones de anlisis en electroforesis capilar.

48

9 Condiciones utilizadas en el anlisis electrofortico.

50


51


51


52


56

14 Condiciones ptimas encontradas experimentalmente en electroforesis capilar.

57

15. Tiempos de migracin de cada estndar. 58

iv

16 Condiciones ptimas de anlisis halladas experimentalmente.

62

17 Tiempos de migracin de cada estndar.

64

18 Contenido de fenoles totales, capacidad antioxidante y fenoles detectados mediante electroforesis capilar.

78

19 Condiciones utilizadas en el anlisis de extractos frescos de semilla y aceite de cha.

79

20 Comparacin de polifenoles identificados en extractos frescos y almacenados durante 120 das

88

20 Contenido de compuestos fenlicos en extractos frescos.

89

v

NDICE DE FIGURAS

Figura No. Pgina

1. Cultivo de cha y clasificacin botanica 1

2. Biosntesis de los compuestos fenlicos a partir de la va del shikimato y fenilalanina

12

3. Formacin de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas, suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL: Fenilalanina amonio liasa.

13

4. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles

14

5. Electroferograma. 18

6. Distribucin de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmtico resultante.

19

7. Formacin de la doble capa elctrica. 20

8. Perfiles de flujo para lquidos: (a) por presin electroosmtica EC, y (b) por presin hidrodinmica HPLC.

21

9. Deteccin de molculas con distinta carga. 22

10. Inyeccin electrocintica. 24

11. Inyeccin por vaco. 24

12. Semilla 094 32

13. Semilla 125 32

14. Semilla 287 32

15. Semilla 301 32

16 Desarrollo experimental 33

17. Curva tipo de cido glico 41

18. Fenoles totales en el aceite de cha y aceite de olivo. 43

vi

19. Contenido de fenoles totales de la semilla de cha desgrasada con otros frutos.

44

20. Curva tipo Trolox expresada como M Trolox

45

21. Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de cha.

47

22. Electroferograma de la mezcla de 8 estndares. 49

23. Electroferograma de la mezcla de 8 estandares. 53

24. Electroferogramas de cada par de estandares. 54

25. Electroferograma de comparacin de 8 estndares. 54

26. Electroferograma de extracto de aceite de chia comercial. 55

27. Espectros de absorcin de cada estndar. 60

28. Electroferograma de 11 estndares a distintas concentraciones de buffer.

61

29. Electroferograma obtenido del ensayo para separar y determinar el tiempo de migracin de los 11 estndares.

63

30. Espectros de absorcin obtenidos mediante detector de arreglo de diodos.

64

31. Electroferograma del aceite comercial de cha. 65

32. Electroferograma del aceite 094. 66

33. Electroferograma del aceite 094 aadiendo estndares. 66


35. Electroferograma del aceite 125 ms estndares aadidos.

67

36. Electroferograma del aceite 287 68

37. Electroferograma del aceite 287 ms estndares aadidos.

68

vii


39. Electroferograma de la semilla 094 70

40. Electroferograma de la semilla 125 70

41. Electroferograma de la semilla 287. 71

42. Electroferograma de la semilla 301. 73

43. Electroferograma de semilla 094 con estndares aadidos.

73


74


75


76

47. Electroferograma del aceite fresco 094. 79




51. Electroferograma de las 4 muestras de aceite de cha. 83

52. Electroferograma del extracto de la semilla 094 fresco. 84



55. Electroferograma del extracto de la semilla 301 fresco.

87

1

1 INTRODUCCIN

La cha (Salvia hispnica L.) es una planta herbcea de la familia de las Lamiceas;

junto con el lino (Linum usitatissimum), es una de las especies vegetales con la

mayor concentracin de cido graso alfa-linolnico omega 3 conocidas hasta 2006.

Se cultiva por ello para aprovechar sus semillas, que se utilizan molidas como

ingrediente alimenticio (Cahill, 2003).

1.1 CARACTERSTICAS DE LA SEMILLA DE CHA Es una hierba anual, de hasta 1 m de altura; presenta hojas opuestas, de 4 a 8 cm

de largo y 3 a 5 cm de ancho. Las flores son hermafroditas, prpuras a blancas, y

aparecen en ramilletes terminales; florece entre julio y agosto en el hemisferio norte.

Al cabo del verano, las flores dan lugar a un fruto en forma de aquenio indehiscente

(Figura 1). La semilla es rica en muclago, fcula y aceite; tiene unos 2 mm de largo

por 1,5 mm de ancho, y es ovalada, lustrosa, y de color pardo grisceo a rojizo

(Cahill, 2003).

Figura 1. Cultivo de cha y clasificacin botnica

Reino: Plantae

Subreino: Tracheobionta

Divisin: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Asteridae

Orden: Lmiales

Familia: Lamiceas

Subfamilia: Nepetoideae

Tribu: Mentheae

Gnero: Salvia

Especie: S. hispanica L.

Nombre binomial S. hispanica L.
http://es.wikipedia.org/wiki/Reino_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Plantaehttp://es.wikipedia.org/wiki/Tracheobiontahttp://es.wikipedia.org/wiki/Divisi%C3%B3n_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Magnoliophytahttp://es.wikipedia.org/wiki/Clase_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Magnoliopsidahttp://es.wikipedia.org/wiki/Asteridaehttp://es.wikipedia.org/wiki/Orden_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Lamialeshttp://es.wikipedia.org/wiki/Familia_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Lamiaceaehttp://es.wikipedia.org/wiki/Nepetoideaehttp://es.wikipedia.org/wiki/Tribu_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Mentheaehttp://es.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9nero_(biolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Salviahttp://es.wikipedia.org/wiki/Especie

2

1.1.2 CULTIVO

La cha prefiere suelos ligeros a medios, bien drenados, no demasiado hmedos;

como la mayora de las salvias, es tolerante respecto a la acidez y a la sequa, pero

no soporta las heladas. Requiere abundante sol, y no fructifica en la sombra. Antes

de la conquista de Amrica, la cha era un alimentos bsico para las civilizaciones de

Amrica Central y Mxico; su cultivo era probablemente el tercero en importancia

econmica, superado slo por el maz (Zea mays) y el frijol (Phaseolus vulgaris). Los

aztecas imponan a sus pueblos tributarios una contribucin de hasta 15,000

toneladas anuales (Cahill, 2003).

Desplazada por los cereales aportados por los espaoles, el cultivo de cha

desapareci durante la colonia; sobrevivi slo en reas montaosas aisladas de

Mxico (donde se cultiva comercialmente desde hace siglos y hasta la fecha) y

Guatemala. El mayor centro productor de Mxico est en Acatic, Jalisco, de donde

se exportan cantidades crecientes a Japn, Estados Unidos y Europa.

Un proyecto comercial desarrollado conjuntamente por varios pases de Amrica

Latina comenz en la dcada de 1990 a replantar experimentalmente la cha en el

norte de Argentina, para proporcionar a los agricultores cultivos alternativos, con

resultados excelentes (Ayerza, 1996).

Los rendimientos del proyecto alcanzaron los 1.6 t/ha, con contenidos de aceite de

hasta el 38,6%. Se han suscrito contratos para la produccin comercial de cha en

las provincias de Catamarca, Salta y Tucumn (Argentina), exportando el producto

sobre todo a los Estados Unidos. La viabilidad en los estudios piloto se estimaba

entre el 78% y el 87% (Coates, 1996).

3

1.1.3 USOS Y APLICACIONES

Hay evidencia cientfica que muestra que la semilla de cha comenz a usarse en la

alimentacin humana hace 3,500 aos A.C. y se convirti en uno de los cultivos

bsicos en el centro de Mxico entre 1,500 y 900 A.C junto con el amaranto, frjol y

maz. Por siglos, la semilla de cha fue utilizada como alimento por los indgenas del

oeste y del sur de Mxico. Los aztecas, entre otros usos, ofrecan la cha a los dioses

como parte de las ofrendas en las ceremonias religiosas. Conocida como el alimento

de caminatas, su uso como un alimento de resistencia y alta energa ha sido

registrado desde los tiempos remotos de los antiguos Aztecas, cuyos guerreros

subsistan con la semilla durante sus conquistas. Los indgenas del suroeste ingeran

muy poco, no ms de una cucharada llena cuando salan de marchas forzadas

durante 24 horas (Ayerza, 1996).

Hacia el ao 1600 D.C. se registraron 101 usos importantes de los cuales el 41%

correspondan a los medicinales y el resto eran culinarios, artsticos y religiosos,

entre otros. Las partes de la planta que se utilizaban como ingrediente en la

formulacin de medicamentos eran en su mayora las semillas y en menor medida

los tallos, hojas y races, las cuales se utilizaban principalmente para combatir las

infecciones respiratorias. Entre los usos medicinales de la semilla destacaban el

tratamiento contra fiebres, diarreas, estreimiento, regulacin de la secrecin biliar,

infecciones y obstrucciones en el ojo e infecciones respiratorias, tambin serva

como estimulante y para proteger la piel. Como alimento, las semillas de cha se

tostaban y molan hasta obtener una harina conocida con el nombre de Chianpinolli.

La harina se incorporaba en las tortillas, tamales y en varias bebidas de los aztecas

llamadas Chianatoles. Los usos artsticos se restringieron al aceite de la semilla para

pinturas, barnices, cosmticos (como emoliente) y para dar acabados brillosos a las

vasijas y platos. Adicionalmente, el aceite sirvi como componente bsico en la

pintura para el cuerpo y rostro (Cahill, 2003).

4

En rituales religiosos, las semillas le servan a los aztecas como ofrenda al dios

Chiomecoatl relacionado con la fertilidad (Cahill, 2003).

Si se mezcla una cuchara llena de cha dentro de un vaso de agua y se deja durante

aproximadamente 30 minutos se forma una gelatina casi slida. La reaccin que

genera el gel se debe a la fibra soluble presente. El gel que se forma en el estmago

crea una barrera fsica entre los carbohidratos y las enzimas digestivas que los

disuelven, de manera tal que disminuye la conversin de carbohidratos en azcar

(Ayerza, 2002).

En adicin a los obvios beneficios para los diabticos, esta demora en la conversin

de los carbohidratos en azcar genera la habilidad de crear resistencias. Los

carbohidratos son la gasolina en nuestros cuerpos. La prolongacin de su conversin

a azcar estabiliza los cambios metablicos, creando as una mayor duracin en sus

efectos de generacin de energa. Adems, una de las cualidades excepcionales de

estas semillas son sus propiedades hidroflicas, teniendo la habilidad de absorber

ms de 12 veces su peso en agua, dicha habilidad de mantener el agua ofrece la

posibilidad de prolongar la hidratacin los fluidos y electrolitos que proveen el entorno

que da vida a las clulas del cuerpo humano. Con semillas de cha, se puede retener

la humedad, regulando la absorcin corporal de nutrientes y fluidos corporales.

Debido a que hay una gran eficiencia en la utilizacin de los fluidos corporales, el

balance electroltico se mantiene (Ayerza, 2002).

En la actualidad, mucha gente utiliza las semillas de cha en la preparacin de una

bebida refrescante y popular llamada cha fresca, tambin se puede preparar un

muclago dejando reposar la semilla en agua, para utilizarla como fibra diettica o

para aadirla y dar espesor a mermeladas, jaleas, yogures, mostazas, salsa trtara;

igualmente es til en la industria cosmetolgica y otras aplicaciones. En el pan se

puede utilizar el gel como un imitador de grasa, as como para resaltar su sabor,

asimismo si se cubre la masa para pan con este gel antes de hornear es posible

aumentar su vida de anaquel (Beltrn y Romero, 2003).

5

La cha es un nuevo cultivo que tiene gran potencial para ser explotado y puede

servir para reemplazar cultivos tradicionales no rentables en el pas, que los hay y

son muchos. Es ideal para enriquecer gran cantidad de productos como frmulas

para bebs, alimento para animales, barras nutritivas, entre otros. (Beltrn y Romero,

2003).

Cuando se utiliza como alimento animal se pueden obtener productos enriquecidos

con -3 como huevos, pollos, carne vacuna, jamn, leche, quesos, etc. Utilizada

como una fuente de cidos grasos -3, no requiere el uso de antioxidantes

artificiales como las vitaminas sintticas. El aceite esencial encontrado en las hojas

tiene un gran valor potencial como insecticida puesto que impide el ataque de

algunos insectos a la planta (Craig, 1997).

1.1.4 COMPOSICIN DE LAS SEMILLAS DE CHA

La ciencia moderna ha determinado que la semilla de cha contiene un 32% de aceite

y ste ofrece el contenido natural conocido ms elevado de cido -linolnico que es

aproximadamente de 58.7%, la siguen el crtamo y el girasol. Asimismo, entre sus

componentes principales se encuentra tambin el cido linolico que vara de 17 a

26%. El cido graso -linolnico es un cido graso insaturado -3, es muy

importante para la nutricin humana, se denomina indispensable ya que debe de

suministrarse en los alimentos puesto que el organismo es incapaz de sintetizarlo. Se

ha demostrado que el aceite que contiene altos porcentajes de cidos grasos -3,

reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares y parece estar relacionado

con la reduccin de casos de arteriopata coronaria. Otras de sus funciones son que

ayudan al mantenimiento de la piel, del pelo y del sistema reproductivo, mejoran el

desempeo mental y visual, as como el de la regulacin del metabolismo del

colesterol. Consumiendo 25 g de semilla de cha, se alcanza la cantidad diaria de

cido graso -3 recomendada por las organizaciones de nutricin (Tosco, 2004).

6

Una vez que el aceite se ha extrado de la semilla de cha, el material remanente

contiene un 40% de fibra, de la cual un 5% es fibra soluble o diettica. Los extractos

de agua y metanol de la semilla de cha una vez que se ha prensado y extrado el

aceite, han demostrado una fuerte actividad antioxidante (Beltrn y Romero, 2003).

La semilla de cha contiene una cantidad de compuestos con potente actividad

antioxidante, entre los ms importantes se encuentran el y - tocoferol y

antioxidantes fenlicos tales como cidos clorognico y cafeico y flavonoles

(miricetina, quecetina y kaempferol). La importancia de los mismos radica en su

proteccin frente a la oxidacin lipdica que afecta tanto la calidad de los alimentos

como la salud de los consumidores, con el posible deterioro de las caractersticas

organolpticas, funcionales y nutricionales (Taga et al. 1984).

En el Cuadro 1 se muestra la concentracin de compuestos antioxidantes presentes

en la semilla de cha de los estados de Jalisco y Sinaloa en un estudio realizado por

Taga et al en 1984.

Cuadro 1. Concentracin de antioxidantes en extractos de semilla de cha.

Compuesto Concentracin (mol/kg de semilla de cha)

cido cafeico 6.6 x 10-3

cido clorognico 7.1 x 10-3

Miricetina 3.1 x 10-3

Quercetina 0.2 x 10-3

Kaempferol 1.1 x 10-3

cido cafeico 13.5 x 10-3

Fuente: Taga et al. 1984.

La oxidacin de los alimentos constituye un grave problema, tanto para los

consumidores como para los fabricantes de alimentos. Si no se controla, la oxidacin

puede producir no slo sabores extraos, sino tambin promover el envejecimiento y

las enfermedades degenerativas de la edad como el cncer, las enfermedades

cardiovasculares, cataratas, declinacin del sistema inmunolgico y disfuncin

cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir cidos

grasos -3 y antioxidantes (Okuyama et al. 1997).

7

1.1.5 LA CHA COMO FUENTE DE CIDOS GRASOS INDISPENSABLES EN LA NUTRICIN HUMANA.

Existe un grupo de cidos grasos poli-insaturados que se denominan cidos grasos

indispensables (AGE), los cuales son muy importantes para la nutricin humana pero

no pueden sintetizarse en el organismo humano y deben ser incorporados a partir de

la dieta. Los AGE para el hombre son: los cidos grasos Omega-3 (cido a-linolnico

y sus derivados de cadena larga) y los cidos grasos Omega-6, cuyo precursor es el

cido linolico. La evidencia sugiere que los cidos grasos Omega-3 juegan un papel

importante en la membrana celular. La funcin de stos cidos grasos, es aportar

mayor flexibilidad a las membranas celulares, permitiendo el movimiento de

protenas en su superficie y dentro de la bicapa lipdica (Lauritzen et al. 2001).

Las cantidades necesarias de cidos grasos Omega-3 van a depender del ciclo de

vida de cada persona y de su estado fisiolgico o patolgico que pueden llevar a un

aumento en las necesidades de cidos grasos. Se estima en promedio que es

necesaria una ingesta del 1 % de la energa total de cidos grasos Omega-3 y un 4%

de la energa total para los Omega-6. El problema radica en que el contenido de

cidos grasos Omega-3 en nuestra alimentacin es muy bajo, por lo que el consumo

diario no alcanza a superar el 0,5 % de la energa total (Harper et al. 2006).

De todas las fuentes de cido grasos Omega-3, slo el lino (Linum usitatissimum L.)

y la cha tienen su origen en cultivos agrcolas. Ambas son especies vegetales con la

mayor concentracin de cido graso a-linolnico conocida hasta la fecha. Estas

semillas, fuentes de Omega-3 a menudo se utilizan molidas como ingrediente

alimenticio, o en forma natural como suplemento diettico. Las otras dos fuentes

disponibles son de origen marino: las algas y el aceite de pescado (Ayerza, 1995).

La oxidacin de los alimentos constituye un grave problema, tanto para los

consumidores como para los fabricantes de alimentos. Si no se controla, la oxidacin

puede producir no slo sabores extraos, sino tambin promover el envejecimiento y

las enfermedades degenerativas de la edad como el cncer, las enfermedades

8

cardiovasculares, cataratas, declinacin del sistema inmunolgico y disfuncin

cerebral, de las cuales se quiere estar protegido precisamente al ingerir cidos

grasos -3 y antioxidantes (Okuyama et al. 1997).

1.2 ANTIOXIDANTES

Los antioxidantes son componentes protectores que consisten en un arreglo

enzimtico y nutrientes esenciales (como vitaminas, pigmentos) cuya funcin

principal es prevenir la formacin de radicales libres e interceptar los que ya se han

generado (Shi, 2001).

Existen muchas fuentes de antioxidantes naturales: avena, soya, t, granos de caf,

especias, arroz, aceites vegetales, papas, frutas, productos microbianos. Los

antioxidantes contenidos en frutas y vegetales son efectivos en la prevencin de

enfermedades relacionadas con el estrs oxidativo.

Existen antioxidantes naturales contenidos en los alimentos y tambin sintticos,

elaborados por la industria y adicionados a los alimentos. En particular, los

antioxidantes naturales que pueden ser hidrosolubles y liposolubles, pueden

funcionar como compuestos reductores, interrumpen la cadena de formacin de

radicales libres, inhiben o impiden la formacin de oxgenos libres e inactivan los

metales pro-oxidativos. Los radicales libres se forman en el organismo mediante la

respiracin aerbica y existen en diferentes formas como: anin superxido,

hidroxilos, perxidos, y alcxilos. Son dainos ya que pueden reaccionar con

componentes celulares importantes como el ADN o las membranas (Shi, 2001).

El dao oxidativo se relaciona con el origen y desarrollo de enfermedades crnicas,

como la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL), enfermedades

cardiovasculares, dao oxidativo al ADN, cncer y alteracin de la visin (Serrano et

al. 2007).

9

Los principales compuestos que tienen actividad antioxidante son: carotenoides,

fosfolpidos, tocoferoles (vitamina E), vitamina C, compuestos fenlicos, pigmentos, y

sistemas enzimticos como la superxido dismutasa, catalasa y glutatin peroxidasa.

Las vitaminas E, C, carotenos y los cofactores (Cu, Zn, Mn, Fe y Se) son importantes

antioxidantes que funcionan de manera sinrgica inhibiendo la formacin de

radicales libres. Los compuestos fenlicos interfieren con el proceso de oxidacin al

reaccionar con radicales libres, quelan metales catalticos y capturan el oxgeno.

Estos compuestos se dividen en dos grupos: flavonoides y no flavonoides (Cedillo,

2006).

Los polifenoles o compuestos fenlicos ayudan a prevenir el riesgo de enfermedades

crnicas como cncer, degeneracin neuronal relacionada con la edad y

enfermedades cardiovasculares. Las plantas contienen una gran variedad de

compuestos fenlicos como fenilpropanoides, derivados del cido benzoico, taninos y

ligninas (Macheix et al. 1990).

Los flavonoides que incluyen flavonas, flavonoles y taninos condensados, funcionan

como quelantes de metales, atrapan radicales libres, inhiben la xantina-oxidasa

asociada a la formacin de especies reactivas del oxgeno y la proliferacin de

clulas cancergenas en pulmones, estmago y colon, adems, previenen

enfermedades coronarias. En general, la actividad antioxidante aumenta cuando

existen grupos hidroxilo o grupos donadores de hidrgeno en la estructura molecular

del compuesto (Wang et al. 1996).

10

1.3 COMPUESTOS POLIFENLICOS

Los compuestos fenlicos o polifenoles, son las sustancias que poseen un anillo

aromtico, unidos a uno o ms grupos hidroxilo, incluyendo derivados funcionales

(esteres, glucsidos, etc.) (Macheix et al. 1990)

En el Cuadro 2, se muestra la concentracin relativa en tejidos vegetales de estos

compuestos fenlicos presentes en la naturaleza, se conocen aproximadamente

4000, siendo los flavonoides el grupo ms importante. Un nmero considerable de

fenoles monocclicos simples, quinonas fenlicas, lignanos, xantonas se incluyen en

esta clasificacin, al igual que materiales polimricos tales como ligninas, lignanos,

melaninas y taninos (Lee, 1992).

Cuadro 2. Concentracin relativa de compuestos fenlicos en tejidos vegetales.

Tejido Concentraciones relativas

Fruto cidos cinmicos > catequinas

leucoantocianinas (flavan-3,4-dioles) > flavonoles

Hojas flavonoles cidos cinmicos >

catequinas leucoantocianinas

Tronco catequinas leucoantocianinas > flavanoles >

cidos cinmicos

Corteza Al igual que en el tronco pero en altas concentraciones

Fuente: Robards et al. 1999.

Se pueden clasificar estructuralmente estos compuestos de acuerdo al Cuadro 3, la

mayora de los cuales se pueden encontrar en las frutas, siendo estos una excelente

fuente de polifenoles mayor a las verduras (Macheix et al. 1990), siendo la mejor

fuente algunas bebidas como el vino tinto, caf y t (Scalbert y Williamson, 2000).

11

Cuadro 3. Las principales clases de compuestos fenlicos en frutos.

tomos de carbono

Estructura Bsica

Clase Ejemplo Fruto (Ejemplo)

7 C6 C1 cido hidroxibenzoico p hidroxibenzico Fresa

9 C6 C3 cido hidroxicinmico Cumarinas

cafeico scopolina

Manzana Ctricos

10 C6 C4 Naftoquinonas Juglona Nuez

13 C6 C1 C6 Xantonas Mangiferina Mango

14 C6 C2 C6 Estilbenos Resveratrol Uva

15 C6 C3 C6 Flavonoides Isoflavonoides Ligninas Taninos

quercetina, cianidina daidzena

Cereza Frijol de soya Frutos con hueso.

Fuente: Macheix et al. 1990.

Slo algunos polifenoles se consideran importantes en los alimentos y en la misma

alimentacin, estos compuestos son el cido glico, sinptico, ferlico, cafeico, p

cumrico, y sus derivados as como los flavonoides y sus glucsidos. Las

antocianinas y flavonoles son pigmentos importantes en una gran variedad de frutas

y verduras. Mientras que la mayora de los polifenoles no son pigmentos, son de

igual importantes pues son responsables de la prdida de color, principalmente el

oscurecimiento, que se desarrolla durante el almacenamiento y procesamiento de

frutas y verduras, formando parte de las reacciones de oscurecimiento enzimtico y

no enzimtico (Lee, 1992).

1.3.1 BIOSNTESIS DE COMPUESTOS FENLICOS. Estos compuestos se sintetizan a partir de dos principales rutas metablicas: la ruta

del shikimato la cual origina directamente fenilpropanoides como los cidos

hidroxicinmicos (Figura 2 y Figura 3); y la ruta del acetato, la cual produce fenoles

simples y algunas quinonas (Decker, 1997).

12

Figura 2. Biosntesis de los compuestos fenlicos a partir de la va del shikimato y fenilalanina

Fuente; Harborne, 1989. El grupo ms importante de los compuestos fenlicos son los flavonoides, incluyendo

flavonas, isoflavonas y antocianidinas, las que se forman va condensacin del

fenilpropano (C6 C3), con la participacin de 3 molculas de malonil coenzima A,

la cual permite la formacin de chalconas, que posteriormente se ciclan en

condiciones cidas. Por lo que los flavonoides tienen la estructura bsica de los

difenilpropanoides (C6 C3 C6) que consiste en dos anillos aromticos unidos a 3

carbonos que forman un anillo heterocclico oxigenado. El estado oxidativo de esta

cadena de 3 carbonos, determinan las diferentes clases de flavonoides.

Los flavonoides incluyen antocianinas (glucsidos acilglucsidos de las

antocianidinas), flavanoles (catequinas), flavonoles, flavonas, isoflavonas,

flavononoles y sus derivados.

13

Figura 3. Formacin de fenilpropanoides, estilbenos, lignanos, ligninas, suberinas, cutinas, flavonoides y taninos a partir de la fenilalanina. FAL: Fenilalanina amonio liasa.

Fuente; Shahidi y Naczk 2004.

14

1.3.2 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS COMPUESTOS FENLICOS

A lo largo de los aos, algunos beneficios han sido atribuidos a los compuestos

fenlicos, y un gran nmero de estudios han sugerido que el consumo de frutas y

verduras pueden reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y de cncer,

potencialmente a travs de la actividad biolgica de los compuestos fenlicos as

como de las vitaminas como antioxidantes (Proteggente et al. 2003). Por lo que los

polifenoles pueden prevenir a la oxidacin lipdica, la mutacin del DNA y el dao del

tejido (Figura 4).

Figura 4. Consecuencias de las ERO en enfermedades y el papel preventivo de los polifenoles Fuente; Shahidi y Naczk, 2004.

15

El comportamiento antioxidante de los compuestos fenlicos parece estar

relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la lipoxigenasa y captar

radicales libres, aunque en ocasiones tambin pueden promover reacciones de

oxidacin in vitro. (Decker, 1997).

Para que un compuesto fenlico sea clasificado como antioxidante debe cumplir dos

condiciones bsicas:

1) Cuando se encuentre en una concentracin baja con relacin al sustrato que va a

ser oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidacin o la oxidacin mediada por un

radical libre.

2) El radical formado tras el secuestro sea estable y no pueda actuar en oxidaciones

posteriores.

1.3.3 ANLISIS DE COMPUESTOS FENLICOS.

Actualmente el, inters en los compuestos antioxidantes (fenlicos) ha aumentado

debido a la evidencia con respecto al papel importante de estos compuestos

antioxidantes en la salud humana. Especficamente se han encontrado varios efectos

preventivos en diferentes enfermedades como la prevencin de cncer, las

enfermedades coronarias del corazn, los desrdenes inflamatorios, la degeneracin

neurolgica, envejecimiento, etc (Madhavi et al. 1996).

Este inters ha hecho necesario el desarrollo de nuevos procedimientos analticos

capaz de manejar matrices ms complejos en que estos compuestos se descubren.

En este contexto, las tcnicas de electroforesis capilar han surgido como las

herramientas poderosas, permitiendo la separacin e identificacin de compuestos

que no pueden separarse fcilmente por los mtodos de HPLC tradicionales, adems

de proporcionar informacin complementaria, y permitiendo el anlisis simultneo de

diferentes tipos de analitos en un la sola corrida (Simo et al. 2002).

Adems, los mtodos de electroforesis capilar generalmente proporcionan tiempos

de anlisis ms cortos y eficacias superiores comparadas con otras tcnicas,

requiriendo volmenes de muestra y reactivos mnimos (Herrero et al. 2005).

16

1.4 ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis es un mtodo de separacin que se basa en las diferencias de

movilidades de los analitos generadas cuando estos estn bajo la influencia de un

campo elctrico. Los analitos, se encuentran en un medio conductor (electrolito

soporte o buffer) y el campo elctrico es generado en el medio conductor al aplicar

una diferencia de potencial entre los electrodos situados cada uno en el extremo del

tubo capilar. El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a

migrar hacia uno u otro de los electrodos: las molculas con una carga neta negativa

se desplazarn hacia el nodo (electrodo positivo) y las molculas con una carga

neta positiva migrarn hacia el ctodo (electrodo negativo). La velocidad de

migracin de un in, v, en el seno de un campo elctrico, medida en cm s-1, es

(Curtis et al. 1994).

v = e E

Siendo e la movilidad electrofortica del in, medida en cm2V-1s-1, y E la intensidad

del campo elctrico medida en Vcm-1.

La movilidad electrofortica de un in es directamente proporcional a la fuerza

elctrica del in Fe e inversamente proporcional a los factores de retardo por

rozamiento Ff. La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un in a partir

de su tamao o radio del in solvatado ri y de la viscosidad del medio en el que

migra , siendo Q la carga inica de la sustancia.

Fe= -Ff

Si Fe = EQ y Ff = 6 rivi

Por lo tanto: Er

Qv

i

i6

i

er

Q

6

17

Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacin carga-tamao

entre los diferentes analitos presentes en la muestra; cuanto mayor sea esta relacin

ms rpido migrar el in en el seno del campo elctrico. Para iones del mismo

tamao, el de mayor carga elctrica migrar ms rpidamente. Para iones con la

misma carga migrar ms aquel de menor tamao, ya que tendr una fuerza de

retardo por rozamiento de menor valor. La resistencia del medio al paso del in

tambin influir en su movilidad electrofortica, siendo sta mayor cuanto mayor sea

la viscosidad del medio. Para hacer una separacin efectiva es necesario mantener

constantes las cargas de cada especie de iones, de manera que la relacin carga-

tamao (y por tanto la velocidad de migracin) permanezcan en el intervalo ms

estrecho posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier cido o

base quiere decir que las separaciones electroforticas requieren disoluciones

tampn (Castanon, 2006).

1.4.1 TIPOS DE ELECTROFORESIS

Existen principalmente dos mtodos electroforticos ampliamente utilizados: la

electroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva a cabo

sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. La

disolucin tampn, que ser el medio conductivo, cubre la placa de papel o de gel.

Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a travs de la placa.

Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso

de la corriente y, si es necesario, las muestras se tien para visualizarlas. En la

segunda que es la electroforesis capilar las separaciones se llevan a cabo en tubos

capilares de dimetros internos menores a 100 m, donde se disipa mejor el calor y

no es necesario el uso de geles (aunque es posible). Esto permite la aplicacin de

voltajes de hasta 30 mil volts, acelerando la separacin.

18

Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas

pueden detectarse directamente al aplicar el mtodo, es decir la tcnica se puede

automatizar. Se obtiene una grfica de la respuesta en funcin del tiempo, llamada

electroferograma (Figura 5), en la que cada pico representa una especie qumica

separada (Albarrn, 2000).

Figura 5. Electroferograma.

Por resolucin se puede entender la capacidad de una tcnica o mtodo para

separar dos componentes en una mezcla. En la electroforesis capilar se define de

forma anloga a la cromatografa:

Resolucin = Separacin del pico / Anchura media del pico

La separacin entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades

electroforticas de las especies, y por tanto ser la anchura de la banda la que

determine la mayor o menor resolucin del mtodo.

El flujo electroosmtico, es el responsable de la disminucin de anchura de las

bandas. Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los

cromatogramas, por ello, la nomenclatura utilizada para describir la separacin de los

picos o bandas en cromatografa se usa tambin para la electroforesis capilar. Sin

embargo, la mayor diferencia es que la posicin de los picos se determina por las

movilidades electroforticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones

19

con la fase estacionaria. De manera que la eficacia (o nmero de platos N) en

electroforesis capilar vendra dada por:

N = eV / 2D

Dnde: D es el coeficiente de difusin del soluto. Por tanto, para aumentar la eficacia

N, y por tanto la resolucin, es necesario aumentar lo mximo posible el potencial

elctrico V (Curtis et al. 1994).

1.4.2 FLUJO ELECTROOSMTICO (FE)

Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene

un lquido (electrolito), el lquido se mueve, este movimiento se denomina flujo

electroosmtico (Figura 6).

Figura 6. Distribucin de las cargas en la interfaz del capilar y el flujo electroosmtico resultante.

La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del

regulador y depende de la carga en la superficie del capilar. La causa de la aparicin

del flujo electroosmtico es la formacin de la doble capa elctrica (Figura 7).

20

Figura 7. Formacin de la doble capa elctrica.

Bsicamente es una separacin de la carga inica, una segregacin de capas de

iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la

disolucin. Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de slice fundida.

A pH por encima de 3, la pared interna del capilar de slice presenta carga negativa

debido a la desprotonacin de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie. Los

cationes de la disolucin formarn cerca de la superficie del capilar una primera capa

interna, fija, en la que los cationes, inmviles, estn unidos fuertemente a la

superficie del capilar. Una segunda capa, denominada capa mvil o difusa, formada

tambin por cationes aunque unidos de manera ms dbil a la superficie del capilar,

migrar hacia el ctodo (electrodo negativo) en presencia de un campo elctrico.

El resto de la disolucin, mediante capilaridad, migrar a la misma velocidad y en la

misma direccin, lo que producir un perfil de flujo plano, a diferencia de la

cromatografa, que produce perfiles de flujo laminar (Figura 8) (Chicharro 2006).

21

(a) (b)

Figura 8. Perfiles de flujo para lquidos: (a) por presin electroosmtica EC, y (b) por presin hidrodinmica HPLC.

La segregacin de las capas de iones produce un potencial en la superficie que

disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie. Este potencial es

grande en la capa fija, y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa

difusa. El punto clave es que donde termina la capa fija an existe un cierto

potencial, llamado potencial zeta , que permitir el movimiento del fluido.

La velocidad del flujo electroosmtico es proporcional a la diferencia de potencial e

inversamente proporcional a la viscosidad del regulador . La velocidad del FE y

por consiguiente la movilidad de FE FE va a variar en funcin de los cambios que

se produzcan en el regulador; por ejemplo, una variacin del pH del tampn origina

un cambio en la ionizacin del capilar y un aumento de la concentracin del

regulador da lugar a una disminucin del flujo electroosmtico, as como cambios en

la constante dielctrica del disolvente (Castanon, 2006).

FE

22

En general, cualquier alteracin en la disolucin que modifique la carga en la

superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampn o requiera un cambio en el

potencial, altera la velocidad del FE. Como se ha comentado, el flujo electroosmtico

da lugar a un perfil de flujo plano, lo que reduce significativamente el

ensanchamiento de banda y por tanto, mejora la resolucin. Adems, la gran ventaja

que presenta el FE es que la separacin electrofortica y la deteccin pueden

realizarse a la vez para cationes y aniones. Sin el FE, o slo aniones, o slo cationes

migraran hacia el detector. El in de carga opuesta migrara retrocediendo al final de

la inyeccin, y los compuestos neutros se quedaran al final y se dispersaran por

difusin. Con FE todas las especies pasan por el detector (Figura 9) (Chicharro,

2006).

Figura 9. Deteccin de molculas con distinta carga.

Finalmente, la velocidad de un in en la electroforesis capilar vendr determinada por

su velocidad electrofortica y por su velocidad de flujo electroosmtico:

Dnde:

v = (e + feo) E

V= Velocidad del in e = Velocidad electrofortica feo= Velocidad del flujo electroosmtico

E= Campo elctrico

23

En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el ctodo, los iones

negativos tendrn una movilidad electrofortica e negativa, y por tanto estos iones

migrarn ms lentamente que los positivos. El resultado final en el electroferograma

ser una serie de picos que indican el siguiente orden de elucin: primero los

cationes ms rpidos, seguidos sucesivamente de los cationes ms lentos, todas las

especies neutras en una nica zona, y finalmente los aniones ms lentos seguidos

de los aniones ms rpidos (Pais y Knize, 2000).

1.4.3 INYECCIN DE LA MUESTRA

Debido a que el volumen de lquido que cabe en el capilar es de 4-5 L, el volumen

de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros: esto implica una serie de

dificultades al inyectar las muestras en el capilar. Existen varios mtodos:

Inyeccin electrocintica: se retira del depsito del regulador uno de los extremos

del capilar junto con el electrodo, y se colocan en un pequeo recipiente que

contiene la muestra. Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo, por lo que

la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmtico y a la migracin

inica. Despus el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el

recipiente con la disolucin regulador (Figura 10). Inconvenientes: la muestra no es

del todo representativa, ya que se introduce en el capilar ms cantidad de los iones

ms mviles respecto a los ms lentos (Castaeda et al. 2005).

24

Figura 10. Inyeccin electrocintica.

Inyeccin por presin: el extremo del capilar se coloca momentneamente en un

pequeo recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presin

para conducir la muestra al interior del capilar.

Esta diferencia de presin proviene de aplicar vaco en el extremo del detector o de

la aplicacin de presin en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue

por elevacin del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo (Figura

11). La inyeccin por presin no diferencia los iones segn su movilidad, por lo que

no es discriminativa (Castaeda et al. 2005).

Figura 11. Inyeccin por vaco.

25

1.5 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR AL ANLISIS DE ALIMENTOS.

La utilidad y la importancia de la electroforesis capilar (EC) en el anlisis de

alimentos es bien reconocido y establecido actualmente. Esto se confirma con las

aplicaciones en el estudio de sustancias de inters de alimentos, que van desde

compuestos naturales que contienen dichos alimentos hasta los contaminantes que

afectan a dichos alimentos. Este hecho es corroborado por los ms de 650 trabajos

publicados en los ltimos 10 aos (Castaeda et al. 2005) y manuales para el

desarrollo de mtodos de anlisis de alimentos (Frazier et al. 2000).

El alcance de las aplicaciones es muy amplia en trminos de tamao molecular de

los componentes de los alimentos, ya que pueden analizarse desde pequeas

molculas como cidos orgnicos o aminocidos hasta el anlisis de biomolculas

de gran tamao, como protenas, hidratos de carbono o ADN (Castaeda et al.

2005).

1.6 ANLISIS DE COMPUESTOS FENLICOS EN ALIMENTOS MEDIANTE E.C.

Los compuestos fenlicos son metabolitos secundarios presentes en las plantas, los

cuales poseen una caracterstica comn de las estructuras; una fraccin de fenol, y

se comportan como antioxidantes excelentes debido a la reactividad de este grupo.

Los compuestos fenlicos son de inters debido a su posible contribucin al gusto

(astringencia, la amargura, y acidez) y la formacin de los sabores desagradables en

los alimentos, incluidos el t, caf y jugos de diferentes frutas, durante el

almacenamiento (Vallejo y Vargas 2007).

Algunas aplicaciones recientes de la EC al anlisis de compuestos fenlicos en ts,

vinos y otros alimentos se resumen en el Cuadro 4. Cabe sealar que

no hay necesidad de derivatizar muestras de compuestos fenlicos debido a que

son aromticas y, por tanto, presentan la absorcin intensa en la regin UV.

26

Varios anlisis han sido publicados, que puede ser utilizado como una gua para el

anlisis de estos compuestos en los alimentos EC (Da Costa et al. 2000) (Herrero et

al. 2005).

En una revisin reciente, se discutieron las estrategias que se han utilizado durante

la optimizacin de los mtodos de E.C. para el anlisis fitoqumico de los compuestos

bioactivos, y se propuso el uso de mltiples variables diseos experimentales para

simplificar esta tarea (Li et al. 2006).

Recientemente se ha propuesto una nueva ruta atractiva para la deteccin rpida y

simultnea de importantes antioxidantes naturales, incluidos los fenoles y

antioxidantes no fenlicos, utilizando EC con un microchip con deteccin

electroqumica a travs de un electrodo de carbn vtreo (Blasco et al. 2005).

27

Cuadro 4. Mtodos para el anlisis de compuestos fenlicos mediante E.C.

APLICACIN METODO DE DETECCIN

MODO

E.C.

BUFFER

UTILIZADO

REFERENCIA

Fraccin polifenlico de aceite de olivo extra virgen UV CZE 45 mM tetraborato de sodio pH 9.3

Blasco et al. 2005.

Polifenoles en aceite de olivo UV CZE 60 mM acetato de amonio pH 9.5

Carrasco et al 2006

Polifenoles en queso (Bromus inermis L.) UV CZE 20 mM tetraborato de sodio pH 9.2

Strerbova et al 2006

Rutina y quercetina in plantas ELECTROQUMICA MECK 20 mM boratos pH 8.8 Li et al. 2002

Quercetina, rutina, kaempferol, catequina, en plantas UV CZE 100 mM boratos pH 10 Suntornsuk et al.2003.

Procianidinas despus tilisis UV MECK 50 mM fosfatos pH 7 Herrero et al. 2005

Catequinas in t verde UV MECK 20 mM fosfatos pH 7 Bonoli et al. 2003

Resveratrol en vinos, hierbas, y en alimentos saludables ELECTROQUMICA CZE 100 mM borato pH 9.24 Gao et al. 2002.

Resveratrol y piceid en vino tinto DAD MEKC 20 mM tetraborato de sodio

Brandolini et al 2002.

Antocianinas en vino tinto VISIBLE CZE 50 mM boratos pH 8.4 Saenz et al. 2003.

cidos fenlicos (derivados de cido benzoico y cinmico) CONDUCTIMETRIA CZE 150 mM 2-amino-2-metilpropanol

Kuban et al. 2006.

Flavonoides y compuestos fenlicos (cido ferlico, apigenina, luteolina,cido rosmarinico y cido cafeico) en Perilla frutescens L.

ELECTROQUMICA

CZE

100 mM boratos pH 8.7

Peng et al 2005.

Flavonoides e isoflavonoides en cerveza UV MECK 25 mM tetraborato de

sodio pH10.5

Cortacero et al. 2005.

DAD; detector de arreglo de diodos, CZE: electroforesis capilar de zona, MECK; Electroforesis micelar electrocintica.

28

Otras aplicaciones de la EC en el anlisis de alimentos son mencionados por Vallejo y

Vargas en 2007 y entre los principales se encuentran ;

Determinacin de protenas de la leche (casenas, -lactoalbminas, -

lactoglobulinas).

Anlisis de protenas del trigo.

Determinacin de carbohidratos por CZE con deteccin amperomtrica

mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola).

Determinacin de oligosacridos mediante CZE (rafinosa, estaquiosa y

verbascosa de semillas de leguminosas).

Anlisis del color/sabor de los alimentos.

Anlisis de los flavonoides de la caa de azcar mediante CZE.

Separacin de los cidos del lpulo que dan amargor mediante CZE y MEKC

(cidos y de extracto de lpulo comercial).

Anlisis de compuestos orgnicos en alimentos:

Determinacin del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de

zumo de naranja).

Comparacin cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacin de

aditivos en alimentos (cafena, aspartamo y cido benzoico en refrescos).

Determinacin cuantitativa de propionato en pan mediante CZE. Anlisis de

iones inorgnicos.

Anlisis cualitativo de aniones presentes en cerveza, salsa de soja, t y caf.

Determinacin semicuantitativa de calcio, sodio, cloruros, fosfatos y citratos en

muestras de leche.

29

La versatilidad de la electroforesis capilar en el anlisis de alimentos se demuestra

claramente por los numerosos y amplios mtodos presentados anteriormente. Por otra

parte, la eficiencia y la rapidez de la E.C. en las separaciones fueron las principales

ventajas que hacen de esta tcnica una alternativa atractiva en los laboratorios de

anlisis de alimentos. La E.C an est lejos de ser tan bien establecida como las

tcnicas cromatogrficas, aunque ciertamente ha ganado popularidad como una

alternativa a la electroforesis convencional en gel para el anlisis de protenas de los

alimentos, muy probablemente debido a la naturaleza cuantitativa de la CE, gran poder

de resolucin y velocidad de anlisis. Tal vez el mayor potencial de la EC fue

encontrado en la industria alimentaria para garantizar la calidad y autenticidad de los

alimentos (Vallejo et al. 2007).

30

JUSTIFICACIN

Actualmente existe un inters por el estudio de alimentos con un alto contenido en

antioxidantes naturales, como son los compuestos fenlicos los cuales estn

ampliamente distribuidos en la naturaleza y cuyo consumo se ha asociado con una

disminucin en la aparicin de enfermedades cardiovasculares as como el cncer y

otras enfermedades crnico-degenerativas que actualmente estn en crecimiento.

El inters que se tiene por estudiar cultivos marginados de origen Mexicano es el

investigar sus propiedades nutricias que aporten beneficios a nuestra salud y que se

retomen en nuestra dieta diaria dichos alimentos, por lo cual hace que la semilla de cha

sea un alimento idneo para este estudio.

Esta investigacin tiene por objetivo caracterizar la semilla de cha cultivada en los

estados de Puebla y Colima, con relacin a los compuestos polifenlicos presentes en

la misma y en el aceite extrado de dicha semilla, mediante la tcnica de electroforesis

capilar debido a que es una tcnica actual y muy eficiente en cuanto al anlisis qumico

se refiere, las cantidades de muestra y reactivos que se utilizan son en cantidad mnima

comparndolas con otras tcnicas que son costosas, tardadas y con menor eficiencia.

31

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Identificar los compuestos fenlicos presentes en la semilla de cha y en el aceite

extrado de la misma, procedente de los estados de Colima y de Puebla, utilizando la

tcnica de electroforesis capilar, as como la medicin de la capacidad antioxidante de

los mismos.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

Cuantificacin del contenido de fenoles totales, en semilla y aceite de cha.

Evaluar la capacidad antioxidante total de la semilla de cha y del aceite de cha

mediante el mtodo ABTS.

Establecer una metodologa para la identificacin y cuantificacin de compuestos

fenlicos mediante electroforesis capilar.

Identificar mediante el mtodo de electroforesis capilar los compuestos fenlicos

presentes en la semilla y el aceite de cha.

32

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1 Materia Prima.

Semilla de cha (Salvia hispnica L.) asignndoles la numeracin de tres dgitos simplemente para evitar confusiones (094, 125 y 287) proveniente del Estado de Puebla, cultivadas en la misma temporada del ao y en el mismo suelo.

Figura 12. Semilla 094 Figura 13. Semilla 125 Figura 14. Semilla 287 Aumento 10x Aumento 10x Aumento 10x

Semilla 301 de cha (Salvia hispnica L.) proveniente del Estado de Colima

Figura 15. Semilla 301. Aumento 10x

2.2 Reactivos y materiales.

Estndares de polifenoles grado HPLC: cido ferlico, cido vainillinico, cido trans-cinmico, cido p-cumrico, cido glico, cido cafeico, cido clorognico, Miricetina, Quercetina, Kaempferol (Sigma-aldrich).

Solucin reguladora Na2B4O7 (Merck) Persulfato de potasio (Sigma-aldrich) 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Diammonium salt (ABTS)

(Sigma-aldrich) N2 (gaseoso) (Praxair) Reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-aldrich) cido 6-hidroxi-2, 3, 7,8-tetrametilcroman-2-carboxlico (TROLOX) (Sigma-

aldrich).

33

2.3 DESARROLLO EXPERIMENTAL.

En la Figura 16, se muestra el diseo experimental que se seguir para el desarrollo de

esta investigacin.

II).- ELECTROFORESIS CAPILAR.

Figura 16. Desarrollo experimental.

34

2.4 Equipo

Balanza analtica, marca Sartorius, modelo H110.

Balanza analtica, marca Mettler-Toledo, modelo PB5001.

Bomba de vaco, marca Welch, Modelo GEM 1.0,

Cartuchos Diol SEP-PACK, marca Waters.

Espectrofotmetro con longitud de onda visible, marca Perkin Elmer.

Evaporador rotatorio, marca Yamato modelo BM100.

Sonicador, marca Sonic modelo 200.

Sistema de electroforesis capilar P/ACE marca MDQ Beckman-Coulter.

3. MTODOS

3.1 DETERMINACIN DE PROTENAS: Se determina por el mtodo Kjeldahl, la

muestra se digiri en cido sulfrico concentrado con un catalizador, el nitrgeno se

convierte en sulfato de amonio. Se agrega hidrxido de sodio concentrado para

liberar amonaco, que se destila en cido estandarizado para su cuantificacin por

titulacin. (AOAC 2.057, 1990).

El contenido de protena se calcul de acuerdo a la siguiente ecuacin:

)100()(

))(014.0)()((%

w

fNVproteina

Dnde:

V = Volumen gastado de HCl en la titulacin.

N = Normalidad del HCl.

14 = Equivalente-gramo del nitrgeno.

w = Peso de muestra en gramos.

f = Factor proteico (6.25).

El contenido de protena puede representarse en gramos por 100g de muestra,

g/100g.

35

3.2 DETERMINACIN DE HUMEDAD: (A.O.A.C. 14.003, 1990). El contenido de

humedad, se cuantifica de la diferencia entre el peso inicial y final, de una muestra

representativa sometida a una temperatura de 130 C.

3.3 DETERMINACIN DE FIBRA: se determin el contenido de fibra cruda de

acuerdo al mtodo oficial de la A.O.A.C 962.09 el cual se basa en la prdida de masa

que corresponde a la incineracin del residuo orgnico que queda despus de la

digestin con soluciones de cido sulfrico e hidrxido de sodio en condiciones

especficas.

3.4 DETERMINACIN DE CENIZAS: Se utiliz el mtodo de calcinacin en mufla a

500 C (A.O.A.C. 14.006, 1990). El contenido de cenizas se calcul de acuerdo a la

siguiente ecuacin:

)100(%w

CCCcenizas

Dnde;

CC = peso inicial de la muestra.

C = peso final de la muestra.

w = peso de la muestra.

3.5 DETERMINACIN DE LPIDOS: Se emplea el mtodo de Soxhlet (A.O.A.C.

7.062), utilizando ter de petrleo anhidro como disolvente.

Se emplea la siguiente ecuacin para el clculo de grasa:

% lpidosB.S.

= ( a b) X 100

m

Dnde:

a = Peso del cartucho a peso constante conteniendo la muestra deshidratada

envuelta en papel filtro.

b = peso del cartucho del inciso anterior llevado a peso constante.

m = peso de la muestra seca en gramos.

36

3.6 DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS: Los carbohidratos totales se calculan

por diferencia de porcentaje de humedad, protena, lpidos, cenizas y fibra (Blanco-

Metzler et al. 2009). El contenido de carbohidratos totales se calcul de acuerdo a la

siguiente ecuacin:

%carbohidratos totales = 100- (% humedad + % protena + % grasa + % cenizas + % fibra)

3.7 EXTRACCIN DEL ACEITE DE CHA (Garca et al. 2003).

Se procesaron 50 g de cada muestra de semilla de cha mediante equipo Soxhlet,

empleando como disolvente n-hexano durante un tiempo de 6 horas. Los parmetros

de extraccin fueron: temperatura 45 2C y flujo de disolvente de 30 gotas por

minuto. La mezcla hexano-aceite se destil a presin reducida en un evaporador

rotatorio a 45 C, para obtener el aceite crudo, el cual se envas en frascos de vidrio

mbar con rosca y se almacen a 0 C bajo atmsfera de nitrgeno hasta su

posterior evaluacin.

3.8 EXTRACCIN DE COMPUESTOS FENLICOS DE LA SEMILLA DE CHA

(Reyes et al. 2007).

Una masa de 10 g de harina de cha desengrasada se mezcl con 100 mL de etanol

a temperatura ambiente durante 48 h bajo agitacin mecnica. La mezcla fue

centrifugada a 2500 g durante 15 min. El sobrenadante se evapor a

40 C en un evaporador rotatorio de vaco. El residuo seco se redisolvi con 15 mL

de etanol.

3.9 EXTRACCIN DE COMPUESTOS FENLICOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CHA. (Carrasco-Pancorbo et al. 2006). Cada muestra de aceite (10 g) se disolvi en 10 mL de hexano y se hicieron pasar

sobre un cartucho diol (previamente acondicionado) a un flujo aproximado de

1mL/min, posteriormente se hicieron pasar 3 porciones de 5 mL cada una de hexano

37

azulVMoeamarilloVIMo

OMoWfenolNaMoOWONa4

401142

OHMoOWOOPOH

OHMoOWOOPOH

233522

233522

104143

105133

para eluir la fraccin no polar del aceite, finalmente se eluy la fraccin polar

(polifenoles) haciendo pasar sobre el cartucho 8 porciones de 5 mL cada una de

metanol y posteriormente se llev a sequedad en evaporador rotatorio al vaco a

45C y el residuo seco se redisolvi en 2 mL de metanol.

3.10 DETERMINACIN DE FENOLES TOTALES (Singleton y Rossi, 1965).

El mtodo original de Folin Ciocalteau se desarroll en 1927, en la cual la oxidacin

de los fenoles por los reactivos de molibdotungstanato permite una reaccin

coloreada a mx a 745 750 nm:

Este mtodo es simple, sensible y preciso. Sin embargo, la reaccin es lenta a un pH

cido, por lo que pierde especificidad. Singleton y Rossi (1965) mejoraron el mtodo

con un reactivo heteropolianinico molibdotungstofosfrico que reduce los fenoles de

forma ms especfica; la mx para el producto es 765 nm:

Obtencin de la curva tipo.

Se prepararon soluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 mg/L de cido glico o tnico.

En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de cada una de las soluciones

anteriores, 100L de agua desionizada, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteu y 0.8 mL

de una de solucin de carbonato de sodio al 7.5 %.

Los tubos se agitaron y se dejan reposar durante 30 minutos en la oscuridad antes

de tomar la lectura en el espectrofotmetro a 760 nm.

38

Tratamiento de la muestra.

En los tubos de ensaye se adicionaron 100 L de agua desionizada, 100 L de

muestra, 1 mL del reactivo de Folin Ciocalteau y 0.8 mL de una solucin de

carbonato de sodio al 7.5%. Los tubos se agitaron y se dejaron reposar durante 30

minutos en la oscuridad antes de leer en el espectrofotmetro, se interpol en la

curva tipo y se expres el contenido de fenoles totales como equivalente de cido

glico (GAE) en mg por g de muestra.

3.11 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE SEMILLA Y ACEITE DE CHA: MTODO DEL RADICAL ABTS (Pastrana-Bonilla et al. 2003).

La actividad antioxidante se determin usando el radical ABTS la generacin del

ABTS+, se llev a cabo con la produccin del cromforo azul/verde ABTS+, a travs

de la reaccin entre el ABTS y persulfato de amonio. El ABTS se disolvi en agua

desionizada a una concentracin 7 mM. El catin del radical ABTS (ABTS+) se

produjo haciendo reaccionar la solucin stock de ABTS con persulfato de amonio

2.45 mM en una relacin 1:1 y permitiendo que la mezcla estuviera en la oscuridad a

temperatura ambiente (20C) 16 horas antes de su uso. Posteriormente se realiz

una dilucin del ABTS+ con etanol, para obtener una absorbancia de 0.700 0.020 a

734 nm, la cual fue de 1:60. Para la reaccin con las soluciones estndar Trolox y

los extractos de polifenoles se hicieron reaccionar 20 L de muestra con 1980 L de

ABTS+ y se tom la absorbancia despus de 6 minutos.

3.12 ANLISIS DE COMPUESTOS POLIFENLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR.

Todos los experimentos se realizaron con un sistema de electroforesis capilar

equipado con un detector UV-Vis. El software 32 Karat se utiliz para el control

instrumental y anlisis de datos. Las separaciones se realizaron con un capilar de

slice fundida con una longitud total de 51.9 cm (41.7 cm al detector) de 50 m de

dimetro interno.

39

Los capilares fueron acondicionados antes de cada separacin lavndolos con

hidrxido de sodio 0.1 M durante 2 min, agua desionizada durante 2 min, y luego con

el regulador de pH elegido durante 10 min para equilibrar el capilar.

Despus del ltimo anlisis de cada da, los capilares se lavaron con hidrxido de

sodio 0.1 M durante 2 min, y finalmente con agua desionizada (10 min).

Los estndares se disolvieron en etanol al 80 % a excepcin de la miricetina,

quercetina y kaempferol que fueron disueltos en dimetilsulfoxido al 10 % en etanol.

Todos los estndares fueron preparados a una concentracin de 1000 ppm.

Los extractos de las muestras de aceite de cha y fraccin desgrasada de semilla de

cha fueron analizadas bajo las siguientes condiciones ptimas de anlisis

encontradas experimentalmente.

Concentracin de regulador de pH: 50mM de Na2B4O7.10H2O

pH: 9.4 (ajustado con NaOH 0.1N)

Voltaje: 28 kV.

Inyeccin de muestra: 0.5 psi durante 5 s.

Temperatura de anlisis: 22C.

Longitud total de capilar: 51.9 cm.

Longitud efectiva: 41.7 cm

Dimetro interno: 50 m.

Longitud de onda: 200 nm.

40

4. RESULTADOS Y DISCUSIN.

4.1 ANLISIS PROXIMAL

El anlisis proximal de las diferentes muestras de semilla de cha se presentan en el

Cuadro 5, se observa su alto contenido de fibra el cual es variable dependiendo el

tipo de semilla, sin embargo, en las 4 muestras se obtuvo un alto contenido de fibra,

siendo 20.71 % el valor ms bajo lo cual la convierte en un alimento con alto

contenido de fibra.

Cuadro 5. Anlisis proximal de la semilla de cha. MUESTRA HUMEDAD

% LPIDOS

%a

PROTENA %

a CARBOHIDRATOS

%a

FIBRA %

a CENIZA

%a

SEMILLA 094 5.840.1 30.361.6 21.981.91 16.400.5 20.710.4 4.090.1

SEMILLA 125 5.560.1 30.201.4 19.842.13 15.000.9 24.550.8 4.450.1

SEMILLA 287* 5.680.1 30.511.0 22.962.01 12.000.6 24.450.3 4.200.1

SEMILLA 301 6.560.1 32.410.7 20.830.98 10.501.6 25.510.7 3.920.1

a Valores expresados en base hmeda por triplicado con desviacin estndar.

De igual manera, el elevado contenido de lpidos 30-32 % la convierte en una de las

semillas con ms contenido de lpidos y segn estudios realizados por Ayerza, la

semilla de cha es la fuente natural ms rica en cidos grasos omega-3 comparada

con el aceite de menhaden (especie de rbalo) y de algas; al mismo tiempo el aceite

obtenido de la semilla de cha no tiene ni produce olor a pescado por lo que el

consumo de los productos obtenidos o realizados con la semilla de cha no necesitan

un empaque y condiciones de almacenamiento especiales ni enmascarantes de

sabor como sucede en los productos ricos en omega 3, provenientes de pescado,

para prevenir incluso, los menores cambios ocasionados por el medio ambiente.

Su contenido elevado de protenas 19-23 % la convierten en una opcin viable para

satisfacer la dieta diaria y pudiendo disminuir el costo por gramo de protena en

comparacin con productos crnicos como la carne de res la cual a pesar de tener

aproximadamente el mismo contenido protenico que la cha, es de mayor valor

econmico.

41

Respecto al contenido de carbohidratos se han hecho estudios en los cuales se ha

determinado que la mayora de estos forman muclagos, los cuales se sugiere que

pueden aprovecharse al momento de ser ingeridos ya que en el estmago se forma

un gel el cual disminuye la conversin de azcares y esto produce una sensacin de

saciedad durante ms tiempo.

4.2 CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN ACEITE Y SEMILLA DE CHA.

En la Figura 17, se presenta la curva tipo que se utiliz para la cuantificacin de

compuestos fenlicos totales, o polifenoles totales presentes en los extractos de las 4

muestras de semilla desgrasada y extractos de aceite de cha, tomando como

referencia cido glico.

Figura 17. Curva tipo de cido glico.

Los resultados de la cuantificacin de compuestos fenlicos de los extractos de

semilla y aceite de cha estudiadas se muestran en el Cuadro 6 expresados como

mg equivalentes de cido glico (GAE) por 100 gramos de muestra.

y = 0.0033x + 0.1116 R = 0.9966

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 100 200 300 400 500 600

A 7

65

nm

cido glico mg/L.

42

Cuadro 6. Contenido de fenoles totales en aceite y semilla de cha.

Fraccin de semilla desengrasada

mg cido glico/100 g muestraa

Aceite de cha extrado de la semilla

mg cido glico/100 g muestraa

Aceite de cha prensado en fro

5.920.42

Semilla 094* 1104.716.05 Aceite 094* 11.490.53

Semilla125* 854.295.82 Aceite 125* 2.470.13

Semilla287* 1052.613.36 Aceite 287* 3.800.23

Semilla301* 1091.3413.33 Aceite 301* 5.210.23

a Valores expresados en base hmeda. * Anlisis realizado por triplicado.

Se observa una clara diferencia entre la cantidad de compuestos fenlicos que

contiene el aceite extrado de la semilla de cha y la fraccin desengrasada de la

misma semilla, esto se pens en un principio que era posiblemente causado por el

mtodo de extraccin del aceite con hexano y debido a que los compuestos fenlicos

no son solubles en disolventes no-polares se consider que la cantidad que pudiera

existir de polifenoles en la semilla se quedaran en la fraccin desengrasada y no en

el aceite debido a la naturaleza polar de ambas muestras.

Sin embargo, para descartar o comprobar lo anterior, se adquiri aceite comercial de

cha el cual se obtiene por prensado en fro de acuerdo a especificaciones del

fabricante, y los resultados obtenidos mostraron que el mtodo de extraccin del

aceite no influye en esta determinacin de fenoles totales y que todas las muestras

de aceite de cha obtenido por extraccin con disolvente estn en el mismo orden de

contenido de fenoles totales en comparacin con el aceite de cha obtenido por

prensado en frio.

Independientemente de qu cantidad de compuestos fenlicos existen en el aceite y

la semilla de cha desengrasada, s se puede observar que existen valores desde

854.29 GAE hasta los 1104.71 GAE entre los diferentes tipos de semillas de cha lo

cual indica que posiblemente y de ser necesario se podra distinguir una variedad de

otra de acuerdo al contenido de fenoles totales debido a que cada variedad de

semilla contiene distinta cantidad de fenoles totales.

43

En promedio la cantidad de fenoles totales contenidos en el aceite de olivo de

diferentes regiones de Italia como se muestra en un estudio realizado por Baiano et

al en 2009 y su comparacin con las diferentes muestras de aceite de cha, es

aproximadamente 3 veces mayor a la del aceite de cha (Figura 18), a excepcin de

una de las muestras de aceite estudiadas en el presente trabajo (aceite 094) la cual

es comparable con el contenido de fenoles del aceite de olivo, esta diferencia es

probablemente debido al tipo de la semilla y no por el mtodo de obtencin del

aceite.

Figura 18. Fenoles totales en el aceite de cha y aceite de olivo.

Respecto a la cantidad de compuestos fenlicos presentes en la semilla de cha

desengrasada puede observarse que, al ser comparados estos resultados con

diferentes muestras de cereales (quinua, kaiwa) y amaranto se pone en evidencia la

cantidad de polifenoles que contiene la cha, que va desde los 904.01 hasta 1172.72

GAE/100 g, mientras que los cereales de origen andino slo llegan a alcanzar los

159.02 mg GAE/100 g en el caso de la quinua (Figura 19).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

mg

cid

o g

lic

o/1

00 g

mu

estr

a

44

Al ser comparada la semilla de cha con frutos que se sabe que tienen un alto

contenido de compuestos antioxidantes y los cuales fueron estudiados por Garca-

Alonso (2003), se observa que de igual forma que con los cereales, la semilla de cha

tiene una cantidad superior de compuestos fenlicos, a excepcin de la muestra 125

que se encuentra en el mismo orden (900 mg cido glico/100 g muestra).

Figura 19. Contenido de fenoles totales de la semilla de cha desgrasada con otros frutos. Fuente: Garca-Alonso et al. 2003.

159.02 97.39

34.55

910

985.33

1172.72

904.01

1116.23 1167.2

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

mg

cid

o g

lic

o/1

00 g

mu

estr

a h

um

ed

a

45

4.3 DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MTODO DEL ABTS.

Previamente se realiz una curva tipo de Trolox como compuesto estndar, debido a

su analoga con la vitamina E, las unidades en las que se realiz la curva tipo fueron:

Absorbancia vs M Trolox (Figura 20).

Figura 19. Curva tipo Trolox expresada como M Trolox

Una vez realizada la curva tipo de Trolox se sustituyeron las absorbancias y los

resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7.

Cuadro 7. Capacidad antioxidante de los distintos tipos de semilla de cha y aceite. Semilla desengrasada

(M Trolox/g muestra)

a (mol Trolox/g muestra)

a Aceite extrado

de la semilla (M Trolox/g muestra)

a (mol Trolox/g muestra)

a

Semilla094 283.2835.31 56.657.06 Aceite 094 9.670.79 1.930.16

Semilla125 493.6751.12 98.7310.22 Aceite 125 7.390.39 1.480.08

Semilla287 227.8120.37 45.564.07 Aceite 287 6.590.20 1.320.04

Semilla301 361.5419.57 72.303.92 Aceite 301 22.910.91 4.580.18

Aceite comercial de cha prensado

10.700.52 2.14.10

a Valores expresados en base hmeda, por triplicado.

y = -0.0292x + 0.6899 R = 0.9904

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16

AB

SO

RB

AN

CIA

734nm

M TROLOX

46

La capacidad antioxidante que poseen los aceites de cha del presente estudio y la

fraccin desengrasada de la misma semilla, muestran una relacin directa con el

contenido total de fenoles, es decir las muestras de aceite incluyendo el comercial de

cha muestran una actividad antioxidante del orden de 50 veces menor que la

fraccin desengrasada, estos resultados corroboran que en el aceite de cha la

cantidad de compuestos fenlicos es mnima en relacin con la fraccin

desengrasada la cual muestra una fuerte actividad antioxidante, sin embargo, al igual

que en la determinacin de fenoles totales existen diferencias importantes de

actividad antioxidante entre los diferentes tipos de semilla de cha, lo cual es de

inters debido a que cada tipo parece tener un perfil diferente de compuestos

fenlicos que actan como antioxidantes. En el Figura 21 se hace la comparacin de la actividad antioxidante de las semillas

de cha estudiadas en el presente trabajo con la actividad antioxidante de otros frutos

en un estudio realizado por Garca-Alonso et al (2003) bajo el mismo mtodo (ABTS).

Puede observarse que la muestra de cha 125 presenta una mayor capacidad

antioxidante que el resto de las muestras de cha e incluso de frutos que

comnmente se relacionan con un alto contenido en antioxidantes como la cereza,

frambuesa, manzana, granada y kiwi. Esto nos indica que al igual que en el aceite de

cha, la muestra 125 proveniente del estado de Puebla, contiene un mayor poder

antioxidante que el resto de las muestras analizadas en el presente trabajo, lo cual

indica que efectivamente cada muestra de semilla de cha contiene un perfil

polifenlicos diferente al resto.

Independientemente del distinto perfil de compuestos fenlicos que contiene cada

tipo de semilla de cha analizada en el presente estudio, se puede observar que

todas las muestras analizadas muestran una capacidad antioxidante comparable y

en algunos casos superiores a ciertos alimentos catalogados como ricos en

antioxidantes como la frambuesa, cereza, manzana roja, granada y kiwi (Figura 21)

lo cual convierte a la semilla de cha en un alimento viable para complementar la

dieta diaria en antioxidantes.

47

Figura 21. Actividad antioxidante de diferentes frutos y semilla de cha. Fuente: Garca-Alonso et al. 2003.

4.4 IDENTIFICACIN DE COMPUESTOS FENLICOS MEDIANTE ELECTROFORESIS CAPILAR. 4.4.1 ELECCIN DE LAS CONDICIONES PTIMAS DE ANLISIS.

Con el objetivo de identificar los compuestos fenlicos presentes en las muestras de

semilla y aceite de cha se realiz una base de datos en el equipo de electroforesis

capilar en la cual se analizaron inicialmente 8 estndares incluyendo vainillina como

estndar interno:

Vainillina

cido tnico

cido clorognico

cido ferlico

cido p-cumrico

cido vainillinico

cido cafeico

cido glico

84 82

69

40 38

56.65

98.73

45.56

72.3

0

20

40

60

80

100

120

m

ol T

rolo

x/g

mu

est

ra

48

Todos los estndares utilizados fueron grado HPLC, para garantizar su pureza.

El primer procedimiento fue obtener las condiciones ptimas para que el mtodo

fuera reproducible y confiable para el posterior anlisis de los extractos de las

muestras de aceite y de semilla de cha desgrasada.

Se procedi a hacer una mezcla de todos los estndares mencionados anteriormente

para lo cual se tom 0.5 mL de una solucin de 1000 mg/L de cada estndar disuelto

en etanol al 80 % y se mezcl en un bao sonicador con el objetivo de mejorar la

disolucin de la mezcla. Las condiciones utilizadas para este anlisis se muestran en

el Cuadro 8.

Cuadro 8. Condiciones de anlisis en electroforesis capilar.

Tiempo de inyeccin 8 segundos Temperatura 25C

Presin de inyeccin 0.5 psi Dimetro del capilar 75 m

Voltaje 24 kV Longitud del capilar 50 cm

Tiempo de anlisis 30 min. Regulador de Na2B4O7 Na2B4O7 40 mM

Posteriormente se tom un vial y se le coloc una alcuota de la mezcla de los

estndares mencionados anteriormente, sin embargo, en 3 ocasiones la corriente

dentro del capilar no se mantuvo por lo cual no se logr finalizar el anlisis bajo esas

condiciones, esta cada de corriente pudo ser provocada debido a la concentracin

de metanol que contena la mezcla proveniente de la disolucin de los estndares en

dicho disolvente, por lo anterior se procedi a diluir la mezcla de estndares antes

de colocarla en el vial, esta dilucin se realiz con agua desionizada as como todas

las diluciones que se manejan en estos procedimientos de electroforesis capilar, la

dilucin de la mezcla es en relacin 1:1, para que de esta forma el metanol se

redujera un 25% y no se tuvieran problemas con elevada corriente (Figura 22).

49

Tambin se disminuy el tiempo de inyeccin de la muestra a 5 segundos en lugar

de 8 segundos que tena anteriormente, de este modo se redujo el volumen de

muestra y consecuentemente de disolvente dentro del capilar. Bajo estas

condiciones se logr obtener el electroferograma de los estndares que se muestran

en la Figura 22.

Figura 22. Electroferograma de la mezcla de 8 estndares.

Se observ que a pesar de que slo se inyectaba una mezcla de 8 estndares, en el

electroferograma se detectaban nueve seales (picos), lo cual haca dudar de la

pureza de algn estndar y por consiguiente la posibilidad de tener seales

ocasionadas por dichas impurezas, para corroborar dicha hiptesis se realiz el

anlisis de cada estndar por separado, y efectivamente se observ que el cido

tnico era el compuesto del cual se obtena ms de una seal y en muchas

ocasiones no era reproducible ni

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