Caracterización morfoanatómica de semillas de anón ( Annona squamosa L.)

y evaluación de algunos parámetros fisiológicos del proceso de germinación

y latenciaTesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrarias, Área Fisiología de Cultivos

Fabio Ernesto Martínez Maldonado

Director:Ph.D. Diego Miranda Lasprilla

Codirector:Ph.D. Stanislav Magnitskiy

INTRODUCCIÓN• Árbol semicaducifolio de porte bajo

o arbusto de 3 a 7 m de altura• Globosos-oviformes, acorazonada,

5 a 12 cm diámetro, peso de 200 a800 g

• Semillas negro-lustrosas o café-oscuras, de 1,25 cm de longitud yconstituyen entre el 31% y 41% deltotal del fruto

• Diminuto y poco desarrolladoembrión. Incrustado en unabundante endospermo

(CABALLERO, 1779)

El anón en Colombia

• Plantas en estado silvestre.

• Cultivos poco desarrollados.

• Desaparición paulatina de la especie.

• Dificultades en procesos de propagaciónsexual.

• 30, 50 y 90 días. PG = 1 - 3,8% en unperíodo de 63 días.Fuente: (Cruz, 2002), (Guerrero y Fisher, 2007).

• Tolerante a estrés (investigación, patrones).

• Alta demanda en mercado nacional ($4.000/kg).

• Potencial de mercado en el exterior.

• Interés de la Corporación Colombia Internacional yexportadoras.

• Frutos exóticos de origen tropical.

• Subexplotadas en Colombia.

• Ventajas comparativas.

• Desarrollo de Técnicas de producción.

• Mejorar potencial germinativo de la especie.

• Conservación: almacenamiento de semillas a largoplazo.

• Progresiva eliminación de individuos (Guerrero yFisher, 2007).

OBJETIVOSDescribir las características morfoanatómica de semillas de anón (Annonasquamosa L.) y evaluar algunos parámetros fisiológicos del proceso degerminación y latencia.

Específicos:

• Realizar una descripción anatómica de las semillas de Annona squamosa L.

• Describir los cambios morfoanatómicos y en el contenido de carbohidratos,proteínas y actividad peroxidasa durante la germinación de semillas de anón(Annona squamosa L.).

• Caracterizar el fenómeno de latencia en semillas de anón (Annona squamosaL.) mediante la aplicación de diferentes tratamientos pregerminativos.

• Evaluar el efecto del almacenamiento sobre la germinación, contenido deproteína y carbohidratos solubles en semillas de anón (Annona squamosa L.).

Anatomía de semillas de Annona squamosa L.

(Annonaceae )

INTRODUCCIÓN: Semillas de anonáceas

• Sésiles, albuminosas, elipsoides, macizas y su longitudvaría entre 5 y 30 mm.

• “El carácter ruminado de las semillas y sus embrionesdiminutos son caracteres de identificación de la familia”Barroso et al. (1999).

• Estudios Filogenéticos y ecológicos.

• Pocos estudios germinación de semillas.

• Estudios anatómicos de semillas son muy escasos: Corner(1949).

• Características anatómicas ayudan a comprenderfenómenos de latencia y germinación en anón.– Tegumento resistente e impermeable– Embriones rudimentarios

• Realizar una descripción anatómica de las semillas deAnnona squamosa L.

Fuente: Garwood (1995).

METODOLOGÍA

• Proyecto del Banco Colombiano deGermoplasma de Anón

• Semillas de A. squamosa L. obtenidasde frutos colectados de las accesionesC2AS224, C2AS225 y C2AS226.

• Protocolo de Sandoval (2005) adaptado y modificado.

Etanol al 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96% y terbutanolx 24h

Embriones, testas y endospermo fénol 50% x 24h, S. Bouin x 48h

25% de parafina – 75% Ter-butanol, b). 50% de parafina – 50% Ter-butanol, c). 75% de parafina – 25% Ter-butanol y d). 100% parafina.

Bloques, diamantadoácido clorhídrico al 50%

7 µm en el micrótomobaño de flotación a 50°CDesparafinado 60°C durante 24 horas

safranina 24 horas, OH pícrico, amoniacal, etanol al 96%, FastGreen 10 seg, clavo, isopropanol, xilol

RESULTADOS

1

4

RESULTADOS

Cubierta seminal

� Mesotesta: dos capas.� Pericalaza� hipodermis

Ex exotesta; Mt mesotesta; Etendotesta; Hyp hipodermis; Epepidermis; Fl fibras longitudinales; Ftfibras transversales; Ei epidermisinterna. Pc pericalaza; Tv tejidovascular.

� Endotesta y Tegmen: Ruminación.

Rm ruminación, Et endotesta, Mt mesotesta, Ext exotesta F fibras, Ft fibras transversales, Endendospermo, Hyp hipodermis, Tgtegmen

Tg

Et

Et

En

Id

20 µm 50 µm

20 µm

A B

C

Tg

Tg

� Tegmen colapsado� Idioblastos

Tg tegmen, Et endotesta, En endospermo, Id idioblasto.

Edt

Et

Aer

Edt

Pm

Lf

300 µm

200 µm

300 µm

50 µm

A B

C D

Pm

Cn

Cn capa nucelar, Edt endostoma, Et endotesta, Lf línea de fractura, Aer aerénquima, Pm plugmicropilar.

Endospermo

Em endospermo micropilar,Rm ruminaciones, Id

idioblastos, Nu nucela, Os

oleosoma.

� Ruminado

Embrión

Rd radicula, Hc hipocotilo, Ep epicotilo, Ct cotiledones, Pc procambium, Mac meristemo apical caulinar.

CONCLUSIONES• Las características anatómicas de la cubierta seminal, el endospermo y el

embrión corroboran los datos reportados en la literatura para la familiaAnnonaceae.

• Integumento externo: exotesta, mesotesta (dos capas ) y endotesta.

• Pericalaza: asociación de células parenquimatosas y vasculares.

• Plug micropilár: tejido endotestal menos empaquetado, línea de fractura

• Endotesta: mayor participación en la formación y constitución de losórganos de la semilla, apariencia ruminada del endospermo.

• Endospermo ruminado, células de diferentes formas y contenidos,voluminosas e isoradiométricas, idioblastos.

• Embrión subdesarrollado.

Cambios morfoanatómicos y en el contenido de carbohidratos,

proteínas y actividad peroxidasadurante la germinación de semillas

de anón ( Annona squamosa L.) (Annonaceae )

INTRODUCCIÓN• Inexistencia de información sobre aspectos fisiológicos y

bioquímicos del proceso de germinación de A. squamosa L.

– Germinación en 1 o 2 etapas.

– Recursos emplea para germinar (metabolismo de azucares)

– Cambios morfológicos.

• Entender el rol de azucares y proteínas en las etapas degerminación. Metabolismo de la semillas de anón.

• Describir los cambios morfoanatómicos y en elcontenido de carbohidratos, proteínas durante lagerminación de semillas de anón (Annona squamosaL.).

Preparación del material

Análisis morfológico y determinación de sacarosa, glucosa, fructosa, proteína y actividad enzimática peroxidasa

1. 4.

2. 5.

3. 6.

Azúcares solubles totales: dos diferentes estados de crecimiento de radícula: longitud > 3 mm, y > 10 mm

Germinación

� turba rubia sin nutrientes

� profundidad doble de su longitud

� fitotrón 30 días a una temperatura de 35 °C,

� ausencia total de luz (Ferreira et al., 1997).

Métodos empleados

• Análisis anatómico : Sandoval (2005) modificado. Laboratorio deMicrobiologia, Facultad de Agronomía. UNAL.

• Laboratorio de Fisiología y Bioquímica, Departamento de Biología.UNAL.– Carbohidratos solubles totales: Colorimetría. Método fenol-

sulfúrico (Dubois et al. 1956).

– Sacarosa, glucosa y fructosa: Análisis por HPLC. HPLC WATERScolumna Phenomenex Ca++ Monosacharide de 30cm X 8mm,autosampler, horno y detector de índice de refracción. fase móvil fueagua tipo I.

– Proteína: Método de Bradford (1976) y Zor y Selinger (1996).

A – D = 3 mm; E- F= 4 mm; G= 2 mm; H=7 mm.

10 y 15 días de incubación

15 y 20 de incubación

Arabidopsis thaliana L., Lepidium sp., Chenopodium sp., Nicotiana y Petunia, Trollius sp.

RESULTADOS: ETAPAS DE GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS DE A. squamosa L.

Sección longitudinal de embrión, endospermo micropilar y p lug micropilar enel proceso de germinación.

Semilla madura y primera etapa de germinación.

Formación de raíces laterales en semillas con protrusión deradícula.

Cambios morfológicos en el endospermo

Cambio en forma y volumen en imbibición y ruptura de la testa, endospermo pronunciado.

Cambios en la concentración (ug/mg de materia fresca) deazúcares solubles en embrión y endospermo de A. squamosa L.

Cambios en la concentración (ug/mg materia fresca) de sacarosa (A), Glucosa (B) y Fructosa (C) en embrión y endospermo

0

2

4

6

8

10

12

14

No germinada Sem. imbibida Rup. de testa Protr. de radicula

Pro

tein

a (

mg

/g m

ate

ria

fre

sca)

Cambios en los contenidos (ug/mg materia fresca)de proteína en semillas de A. squamosa L.

Durante el proceso de germinación se observa que:

Semillas sin germinar Imbibición Ruptura de testa Ruptura de endospermo

Disminuye concentraciónIncrementa concentración

Estable

Embrión

Endospermo

CONCLUSIONES• La semilla de anón presenta germinación en dos etapas

consecutivas: rompimiento de testas y protrusión de la radícula.

• El marcado uso de azúcares solubles, sacarosa y proteína indicansu rol clave en el crecimiento del embrión. El endospermo mantieneniveles estables azc totales.

• Crecimiento post germinativo no se presenta mayor variación en losniveles de azúcares solubles totales en el embrión ni en elendospermo.

• En la post-germinación se presenta la formación e inducción deraíces laterales. Estas se producen en la raíz primaria de formaendógena a partir del periciclo.

• El cambio visual en forma, se inicia en la ruptura de la testa y en elcomienzo de la segunda etapa de germinación.

Caracterización del fenómeno de latencia en semillas de anón

(Annona squamosa L.) (Annonaceae ) mediante la

aplicación de diferentes tratamientos pregerminativos

INTRODUCCIÓN• Latencia morfológica.

• Latencia física.

• Tegumento resistente e impermeable.

• Efecto positivo de GA.

• Latencia no se debe a la impermeabilidad alagua.

• Escarificación con lija aumenta el porcentajede germinación (75%) y la velocidad deemergencia en semillas.

Fuente: Colauto et al. (2003), Lobo et al., (2007), Sousa et al.,(2008),

Tratamientos pregerminativos• Promoción química: GA, Citoquininas, Etileno,

auxinas, etileno, H2O2, KNO3,

• Estratificación

– Cálida (22 a 30 °C)

– Fría (0 a 10 °C)

• Escarificación: Mecánica, química, agua.

• Preimbibición

• Germinación pobre, impredecible y altamente variable.

• Largos periodos de germinación.

• Exhiben algún tipo de latencia.

• Estudio realizados en otras latitudes.

• Limitaciones para establecimiento de cultivo de la especievía sexual.

• Caracterizar el fenómeno de latencia en semillas deanón (Annona squamosa L.) mediante la aplicaciónde diferentes tratamientos pregerminativos.

METODOLOGIA

• Proyecto: “Establecimiento del banco de germoplasmaColombiano de Anón (Annona squamosa L.)” MADR.

• Material vegetal:– Apulo, Cundinamarca: 670 msnm, 25°C, HR 85%– Castilla, Coyaima, Tolima: 341 msnm, 29°C, HR 70%

• Extracción y desinfección de semillas

T° amb.:media: 18,7; máxima: 22,9; mínima: 17,3

Tratamientos

Análisis de datosT° de germinación y efecto de tratamientos

ni = número de semillas germinadas en la iésima toma de datosti = tiempo (en días) de la iésima toma de datosK = Tiempo (en días) de duración de la prueba de germinaciónN = número de semillas germinadasNs = número de semillas totalesfi = frecuencia relativa de germinación

� Supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas SAS®� Función arcosen √(PG/100), (Wagner et al., 2006). � ANAVA y Tukey (P<0,05).

Modelo logístico:� �

�

�������

K máximo valor que alcanza la variable, A productoentre el valor inicial “a” por el máximo “K”, B es unparámetro de escala sobre el tiempo t que influenciala tasa de crecimiento.

Curvas de imbibición, temperatura y aplicación de ácido giberélico

RESULTADOS: Temperatura de germinación

Efecto de testa y temperatura sobre absorción de agua

Efecto de la escarificación mecánica

Efecto del GA3 sobre los patrones de germinación

GA3 0 mg/kg �70,348

1 − 14,05e�−0,14X� R2=0,99272 GA3 200 mg/kg �

87.6346

1 − 2.273e�−0.21X� R2=0.9756

GA3 50 mg/kg �78.7976

1 − 7.220e�−0.25X� R2=0,97243 GA3 400 mg/kg �

100.423

1 − 1.412e�−0.10X� R2=0.99292

GA3 100 mg/kg �103.45

1 − 1.508e�−0.09X� R2=0.98739 GA3 600 mg/kg �

95.138

1 − 2.389e�−0.25X� R2=0.98012

GA3 800 mg/kg �88.4138

1 − 1.202e�−0.15X� R2=0.97761

PG Max= 95% a los 24 díasPG (5dias) = 57%

PG Max= 59,3% % a los 30 díasPG (5dias) = 9,6%%

Efecto del GA3

B

D

Efecto de la estratificación caliente

CONCLUSIONES• Las semillas dependientes de la temperatura para su

germinación. 35°C puede considerarse temperatura optima.

• Las testas de A. squamosa L. no presentan un impedimento ala absorción de agua.

• La eliminación completa de testa incrementó el potencial degerminación.

• GA3 exógeno, efectivo para el rompimiento de latencia de lassemillas de A. squamosa L.

• Las semillas de A. squamosa L. presentan latencia detipo endógena (fisiológico y morfológica) y exógena(mecánica).

Efecto del almacenamiento sobre la germinación, contenido de proteína

y carbohidratos solubles en semillas de anón ( Annona squamosa L.)

(Annonaceae )

INTRODUCCIÓN• Comportamiento ortodoxo.

• Respuestas positivas al almacenamiento a temperaturaambiente.

• No influencia del almacenamiento sobre la germinación.

• Latencia inducida por la inmadurez embrionaria puede sersuperada con el almacenamiento.

Fuente: Pulécio (2012), Pinto et al. (2005).Dornelles et al. (2002).

• Desconocimiento del efecto de la condición dealmacenamiento sobre calidad fisiológica e las semillas.

• Inexistentes recomendaciones o pautas paraalmacenamiento comercial o establecimiento de bancosde germoplasma.

• Importante determinar las condiciones óptimas.

• Evaluar el efecto del almacenamiento sobre lagerminación, contenido de proteína ycarbohidratos solubles en semillas de anón .

METODOLOGIA• Extracción y desinfección de semillas.

• Apulo, Cundinamarca: humedad inicial 10 -12%.

• Castilla, Tolima: humedad inicial 12 -14%

• 30, 60 y 120 días en bolsas de papel craft:– Cuarto frio (CF) a 4°C y HR= 79 - 90%– Refrigerador (R) a 10 °C y HR= 79 - 90%– Condición ambiental (CA) a 18,7°C y HR= 59,5 %

• PG, VMG y TMG.

Determinaciones Bioquímicas

– Sacarosa, glucosa y fructosa:• Solo en semillas del Tolima, (0 y 120

días).

– Proteína: En cada periodo y condición dealmacenamiento.

• Método de Bradford (1976) y Zor ySelinger (1996).

RESULTADOS: Humedad de las semillas durante el almacenamiento

Germinación y contenido de proteína durante el almacenamiento de las semillas

A B

C D

Cambios en el contenido de azúcares (ug/mg materia fresca)durante el almacenamiento de las semillas

CONCLUSIONES

• El almacenamiento a condiciones ambientales durante 60 y120 DIAS mejora la respuesta de germinación y presentalas mayores concentraciones de sacarosa y fructosa.

• Durante almacenamiento en condición ambiental sepresentó una superación de forma natural de la latenciapresente.

• El almacenamiento en CF y en R no afecta, no hay efecto elpotencial germinativo de las semillas. Limita la superaciónde la latencia presente.

CONCLUSIONES GENERALES

• Annona squamosa L. presenta semillas con latenciaexógena y endógena, la cual puede ser superada conla eliminación de testas, GA exógeno y con elalmacenamiento a corto plazo en condiciónambiental.

• La germinación se presenta en dos etapas en lascuales sacarosa, glucosa, fructosa y proteína sonrequeridas para el crecimiento del embrión.

• Las semillas presentan embriones subdesarrollados,testas en tres capas permeables al agua yendospermo ruminado.

AGRADECIMIENTOS• A mi familia: Por llenarme de momentos felices, por apoyar cada uno de mis

movimientos e ideas. • A mi director de tesis, Diego Miranda Lasprilla por todo su apoyo, paciencia y

dedicación y por contribuir en mi formación profesional.• A la profesora Luz Marina Melgarejo, por su apoyo y confianza.• Al profeso Stanislav Magnitskiy, por su orientación.• A María Fernanda Díaz y hermana y amiga, por su amistad y apoyo incondicional en

este trabajo• A Miguel Romero, hermano y amigo eterno, por su abnegada amistad y apoyo

incondicional en este trabajo.• A Jennifer Blanco, por sus aportes a mi vida. Por compartir su vida conmigo.• A Diana Obregón, Liliana Castañeda, Julián Cárdenas, Carlos Carranza, Enrique

Balaguera, Natalia Moreno, Lina Pulécio, Mafe Patiño, Edward Martínez, Sandra crespo por su amistad, confianza y apoyo.

• A los profesionales y amigos del laboratorio de Fisiología y Bioquímica, Biología.• A mi Alma Mater, la Universidad Nacional, sus trabajadores, docentes y estudiantes

por haberme dado la oportunidad de construirme, por su maternalismo y por enseñarme a ser quien debo ser.

Gracias!

Las ciencias naturales son una de las armas del

hombre en la lucha por su libertad.

Mao Tse Tung

METODOLOGIA (Anexo 1)

Etanol al 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96% y terbutanolx 24h

Embriones, testas y endospermo fénol 50% x 24h, S. Bouin x 48h

25% de parafina – 75% Ter-butanol, b). 50% de parafina – 50% Ter-butanol, c). 75% de parafina – 25% Ter-butanol y d). 100% parafina.

Bloques, diamantadoácido clorhídrico al 50%

7 µm en el micrótomobaño de flotación a 50°CDesparafinado 60°C durante 24 horas

safranina 24 horas, OH pícrico, amoniacal, etanol al 96%, FastGreen 10 seg, clavo, isopropanol, xilol

Semillas de anonáceas (Anexo 2)

• Ovulo anátropo• Pericálaza• Nucela ruminada transversalmente

(pliegues de los integumentos), lasruminaciones son en su mayoríatransversales

• Micrópilo formado por el endostoma.• Endospermo ruminado (Corner, 1949;

Garwood, 1995; Judd et al. 1999)

• Testa es fibrosa y consiste de fibrasoblicuas y longitudinales

RESULTADOS: Determinación de viabilidad

A B

C

D

A

B C

nv

Figura 3-2. Cortes evaluados en la prueba deviabilidad de semillas de anón. A, semilla sin cubiertaseminal. B, corte transversal. C, corte longitudinalventral. D, corte longitudinal dorsal.

Figura 3-3. Patrones de tinción delembrión en la prueba de viabilidad desemillas de anón. A, embriones viables.B, tinción incompleta, embrión viable. C,comparación embrión viable y noviable. nv no viable.

RESULTADOS: Curva de secado

Figura 3-4. Curva de secado de semillas de anón, para las localidades de Apulo, Cundinamarca y Castilla, Tolima

0,00000

0,01000

0,02000

0,03000

0,04000

0,05000

0,06000

No germinada Sem. imbibida Rup. de testa Protr. de radicula

UA

E P

OD

(Δ

A4

60

/Δm

in*m

g p

rot)

Figura 2-9. Cambios en la actividad enzimática peroxidasa (Δ A460/Δmin*mg prot.) en semillas de A. squamosa L. en: semillas sin germinar (No germinada); imbibición por 72 horas (sem. Imbibida); Etapa I de germinación: ruptura de testa (Rup. de testa); Etapa II de germinación: protrusión de radícula (Protr. de radicula). Imbibición en agua por 72 horas y posterior incubación para germinación a 35°C y HR de 60% en turba húmeda. Barras verticales indican error estándar (±); n=4.