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INFORME DE PRACTICA: Genero BRUCELLAS

CURSO:

MICROBIOLOGIA

SEMESTRE ACADÉMICO:

2015-II(VI CICLO)

UNIDAD: I

ALUMNA:

VERA CARBAJAL, ANGELA YOHANA COD. 20112005

DOCENTES:

Dra Celinda Usquiano Marquez

Dra Yolanda Soto Caceres

Dra Jessica Perleche García

Lic. Blga. Sonia Fiestas Purizaca

Lic. Blgo. Oscar Curo Fanning

FECHA DE PRESENTACION:

PIMENTEL, 27 DE OCTUBRE DEL 2015

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materia orgánica a

partir de elementos inorgánicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medio en que se

encuentren, y de ahí que en el interior de estos ocurran una serie de reacciones de

síntesis y de descomposición de sustancias orgánicas, las cuales reciben el

nombre de metabolismo. A partir de estas características metabólicas se realizan pruebas

obtenidas para la identificación de microorganismos y productos obtenidos de la relación

microorganismo-medio. Otro de los aspectos importantes de la realización de estas pruebas,

es que a partir de estas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminación de los

alimentos por medio de microorganismos patógenos. Las técnicas de bioquímica han

proporcionado una herramienta útil para la detección directa de los microorganismos

contaminantes. La identificación bacteriana se puede realizar por medio de una serie de

análisis que necesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las

especies bacterianas que contaminan los alimentos o las aguas. A continuación, se

desarrollan diferentes técnicas para la identificación de algunos microorganismos y

productos obtenidos en la relación ya mencionada, microorganismo-medio.

 

MICROBIOLOGÍA

OBJETIVOS

-Realizar y analizar las diferentes técnicas de identificación bacteriana.

-Observar e interpretar el mewtabolismo de bacteriano

 

MICROBIOLOGÍA

 CONCLUSIONES

-Las pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividades una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

-A partir de las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana, mediante estándares establecidos, podemos conocer que bacteria tenemos en una muestra problema basándonos en sus reacciones metabólicas las cuales son características de cada microorganismo.

Son funciones específicas del metabolismo:

Obtención de energía para los procesos celulares.

Conversión de los compuestos nutritivos en precursores de los componentescelulares.

Organización de esas macromoléculas en polímeros.

Formación y degradación de las biomoléculas necesarias para las funcionesespecializadas de la célula

MICROBIOLOGÍA

PROCEDIMIENTO

A. DEGRADACIÓN DE GLUCOSA, LACTOSA, SACAROSA, PRODUCCIÓN DE GAS E

H2S en medio Agar TSI: (Triple Azúcar,

Hierro)

Medio empleado para la diferenciación de enterobacterias en base a la

fermentación de los hidratos de

Carbono glucosa, sacarosa y lactosa y a la producción de ácido sulfídrico

Muestra: Cultivos Bacterianos

Medio de Cultivo: TSI

Procedimiento:

Rotular los tubos con medio de TSI

Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger un cultivo bacteriano y sembrar por picadura en el fondo y estría

en la superficie del medio TSI flameando la boca del tubo.

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e interpretación del TSI:

a) La degradación de los azúcares con formación de ácido (acidez positiva)

se manifiesta por un cambio de color del indicador Rojo de fenol que hace

virar

- el color del medio de anaranjado rojizo a amarillo, en caso de acidez

y se simboliza con la letra A,

- o por un viraje del medio de anaranjado rojizo a rojo intenso en caso

de alcalinización (alcalinidad positiva) y se simboliza con la letra K.

b) La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio

(Gas positivo). Se simboliza según su intensidad de 1+ a 3+.

MICROBIOLOGÍA

c) Producción de H2S: El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a

ácido sulfhidríco, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de

hierro que se manifiesta por un precipitado negro en el medio (H2S positivo).

Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 3+.

d) Lectura:

- Pico alcalino/fondo alcalino (NN): No hay fermentación de azúcares.

Característica de bacterias no fermentadoras.

- Pico alcalino/fondo Amarillo (K/A) : Glucosa fermentada, Ni lactosa ni

sacarosa fermentadas.

- Pico alcalino/fondo Amarillo y negro (K/A/H 2S +): Glucosa fermentada, Ni

lactosa, ni sacarosa fermentadas,

producción de ácido sulfhídrico.

- Pico Amarillo/fondo Amarillo ( A/A/H2S - ): Glucosa y lactosa y/o sacarosa

fermentadas. H2S : Negativo.

B. DESCARBOXILACION DE LA LISINA en medio agar LIA:

Esta prueba permite diferenciar los microorganismos que producen

descarboxilación o desaminación de la lisina. Se puede detectar además

la producción de H2S y es más sensible que el TSI para la detección H2S

Es muy utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Muestra: Cultivos Bacterianos

Medio de Cultivo: LIA

Procedimiento:

Rotular los tubos con medio de LIA

Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar

MICROBIOLOGÍA

Coger un cultivo bacteriano sembrar tanto por por picadura central

en el taco como por estría sobre la superficie inclinada.

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e interpretación del Agar LIA:

La Lisina puede ser descarboxilada (Descarboxilación) por

microorganismos LD positivas, que la transforman en la amina

cadaverina, esto produce un viraje del indicador Púrpura de bromocresol

a un color violeta intenso.

Se simboliza con la letra K.

Puesto que la descarboxilación solo tiene lugar en un medio ácido (pH

inferior a 6) es necesario que se produzca previamente la acidificación del

medio de cultivo por fermentación de la glucosa.

Los microorganismo LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,

producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. Se

simboliza con la letra A. La incubación prolongada puede ocasionar una

alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en

consecuencia, se produce un viraje al violeta. La producción de H2S

produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.

C. DESAMINACIÓN DE LA LISINA en medio Agar LIA:

Las cepas del grupo Proteus y Providencia, con excepción de algunas

cepas de Proteus morganii, desaminan la Lisina a ácido alfa-cetocarbónico

formando compuestos pardorojizos en la superficie del medio con la sal de

hierro y bajo la influencia del oxígeno. Se simboliza con la letra R.

MICROBIOLOGÍA

D. PRUEBA DE MOVILIDAD, HIDROGENO SULFURADO Y PRODUCCIÓN DE

INDOL en Medio de cultivo: Agar SIM

El medio SIM es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad,

producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil

para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Procedimiento:

Rotular los tubos con medio SIM

Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger un cultivo bacteriano sembrar por picadura central en la

columna vertical del medio

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e Interpretación:

La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de

cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se

caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de

dicho canal.

La formación de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de

crecimiento.

La producción de Indol pone de manifiesto la presencia de la Enzima

Triptofanasa que degradará el triptofano y liberará al medio Indol que

se combina con el aldehido (paradimetilbenzaldehido) presente en el

reactivo de Kovacs, si hay indol se formará un anillo rojo en la

superficie.

E. DEGRADACIÓN DEL CITRATO en medio Agar Citrato de Simons

MICROBIOLOGÍA

Algunas enterobacterias tienen la capacidad de usar citrato como única

fuente de carbono y energía

Finalidad: Determinar la utilización del citrato por bacterias como la única

fuente de carbono.

Medio de cultivo: Agar Citrato de Simons

Procedimiento:

Rotular los tubos con medio CITRATO

Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger un cultivo bacteriano sembrar por estría en la superficie del

medio

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e interpreatción

La degradación del citrato como única fuente de carbono origina la

alcalinización del medio.

Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol

que vira a azul oscuro, dando una reacción positiva (Citrato +) si el

crecimiento es visible; y como reacción negativa (citrato -) si no cambia

de color

F. DEGRADACION DE LA UREA

Evalúa en las bacterias la capacidad de utilizar la urea como fuente de

nitrógeno, mediante la enzima ureasa, que degrada la urea en dióxido de

carbono y amoniaco. El amoniaco actúa como fuente de nitrógeno y capta

protones, transformándose en amonio y alcalinizando el medio. Contiene

rojo fenol como indicador de pH, el cual vira el medio a fucsia cuando el pH

MICROBIOLOGÍA

se torna alcalino.

Finalidad: Determinar la hidrólisis de la Urea por bacterias.

Medio de cultivo: Agar Urea de Christensen

Procedimiento:

Rotular los tubos con medio Urea

Coger una asa de siembra en punta y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger un cultivo bacteriano sembrar por estría en la superficie del

medio

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e Interpretación de los resultados.

La positividad viene dada por una coloración rosada o fucsia en el medio.

Ejm Proteus sp es positivo para la prueba

G. AGAR Mc CONKEY :

El Agar Mc Conkey es un medio Sólido, Diferencial y Selectivo para el

aislamiento de Enterobacterias

Permite diferenciar bacterias que fermentan o no, la lactosa en muestras

clínicas, de agua y alimentos.

Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo

bacteriano,

Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de gran parte de

la flora Gram positiva.

Procedimiento:

Rotular las placas

MICROBIOLOGÍA

Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la

superficie del medio

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Fundamento:

Por fermentación de la lactosa, se producirá ácido lo que disminuye el

pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador

de pH (rojo neutro), y darán al medio un aspecto rosáceo con un halo

turbio debido al descenso del pH provocados por los ácidos biliares en las

colonias. Si por el contrario son Lactosa (-) el medio se alcalinizará por el

uso de la peptona y se tornará amarillo o incoloro

Lectura e Interpretación

Las colonias lactosa positivas son rojas o rosadas con un halo turbio

debido al descenso de pH

Las colonias Lactosa negativas son incoloras

H. Agar XLD :

El Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato) es un medio selectivo y de

diferenciación, utilizado para el aislamiento y diferenciación de

enterobacterias patógenas especialmente del género Salmonella, Shigella

y Providencia.

- La xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan

prácticamente todos los entéricos, excepto Shigella, y esta propiedad

hace posible la diferenciación de dicha especie

- La lisina se incluye para permitir la diferenciación del grupo

Salmonella de los organismos no patógenos, dado que, sin lisina,

Salmonella fermentaría rápidamente la xilosa y no se distinguiría de

las especies no patógenas. Cuando la Salmonella agota el suministro

MICROBIOLOGÍA

de xilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo

que genera un cambio a un pH alcalino que imita la reacción de

Shigella.

- Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por

consiguiente, inhibe los microorganismos gram positivos

- El tiosulfato y la sal de hierro revelan la formación de ácido sulfídrico

por la precipitación de sulfuro de hierro produciendo un color negro

en las colonias.

Procedimiento:

Rotular las placas

Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la

superficie del medio

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e interpretación:

La degradación de la xilosa, lactosa y sacarosa a ácido produce un

viraje al color amarillo alrededor de las colonias por su indicador rojo de

fenol (Xilosas +)

Las bacterias que descarboxilan la lisina, produciendo cadaverina, se

reconocen por la presencia de un color rojo púrpura, debido al aumento

de pH, alrededor de sus colonias (Xilosas -)

I. AGAR SS (SALMONELLA Y SHIGELLA) Empleo e Interpretación:

MICROBIOLOGÍA

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de

especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas, heces y de

alimentos

El verde brillante, la bilis de buey y la elevada concentración de tiosulfato

y de citrato inhiben considerablemente la flora acompañante, bacterias

Gram positivas, la mayoría de bacterias Gram negativas

Con el tiosufato e iones de hierro se pone de manifiesto la formación de

sulfuro por el ennegrecimiento de las correspondientes colonias. Las

colonias de coliformes quedan señaladas por la demostración de la

degradación de lactosa a ácido, a cargo del indicador de pH Rojo de fenol

Procedimiento:

Rotular las placas

Coger una asa de siembra en aro y flamear al rojo vivo deja enfriar

Coger con el asa un cultivo bacteriano sembrar por agotamiento en la

superficie del medio

Incubar a 37ºC por 24 hrs.

Realizar la lectura

Lectura e interpretación:

Las colonias de gérmenes Lactosa + son rosadas hasta rojas

Las colonias de gérmenes lactosa – negativas son incoloras

Las colonias de microorganismos formadoras de H2S presentan un

centro negro.

CUESTIONARIO

MICROBIOLOGÍA

¿Por qué es necesario ajustar el pH del medio?

El pH de los medios se ajusta en el momento de la fabricación, sin embargo, la

calidad del agua utilizada para la hidratación o la utilización de medios no

recientes pueden modificar este parámetro por lo que es aconsejable verificarlo

y reajustarlo si fuera necesario. Para la verificación del pH, se debe medir una

muestra extraída del volumen total del medio preparado a 25ºC, tanto en

medios líquidos como sólidos. En los casos donde se deba reajustar el pH, se

puede utilizar una solución estéril de ácido clorhídrico (para acidificar el medio)

o hidróxido sódico (para basificar el medio). En medios sólidos, el reajuste de pH

debe ser realizado antes de la solidificación, por lo que será necesario utilizar

una muestra del volumen total para la medición a 25ºC y otra muestra a 45ºC

para conocer el volumen de ácido clorhídrico o hidróxido sódico que hay que

añadir en un volumen conocido.

¿Para qué se añade el agar-agar? ¿Qué cualidades tiene esta sustancia?

Se añaden para preparar medios de cultivo sólidos y semisólidos. El agar-agar es

el agente solidificante más común. El agar-agar es un polisacarido de galactosa y

galactomanano que se obtiene de las algas rojas (Echema, Gelidium, Gracilaria).

Contiene un 70% de agarosa y un 30% de agaropectina. El agar-agar es el agente

solidificante más utilizado. Su composición química es indefinida y solidifica con

mayor dificultad a medida que desciende el pH. Es insoluble en agua fría, pero

se funde y solubiliza en agua hirviendo y solidifica a 45°C. Forma geles

transparentes muy estables y es degradado por muy pocas bacterias.

MICROBIOLOGÍA

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

-METABOLISMO BACTERIANO. Consultada el 11/09/2015 Hora: 3:00 pm.

URL disponible en archivo PDF:

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/

procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf

-FISIOLOGÍA Y METABOLISMO BACTERIANO. Consultada el 11/09/2015

Hora: 3:00 pm. URL disponible en archivo PDF:

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/FisiologiayMetabolismoBacteriano.pdf

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