Carga Viral

Dr. Juan Carlos Romero

CARGA VIRAL

� Consiste en la detección por medio de la amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos del ARN del VIH.

� Se logra su detección gracias al avance que ha experimentado la biología molecular.

� Su detección ha permitido demostrar la modificación que � Su detección ha permitido demostrar la modificación que realiza la TARV sobre la historia natural de la infección VIH.

� Depende del método empleado y la capacidad de detectar mínimas cantidades de ARN del virus.

� Se expresa en copias de ARNv /ml .

� Posee las principales características se un buen marcados de laboratorio: Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo y reproducibilidad.

PROPIEDADES DE LA CARGA VIRAL

� La CV plasmática es la resultante del equilibrio dinámico entre los distintos compartimientos virales.

� Son reproducibles.

� No existe equivalencia directa entre los diferentes � No existe equivalencia directa entre los diferentes métodos utilizados comercialmente.

INDICACIONES CLINICAS Y USO DE CV

INDICACIÓN CLÍNICA INFORMACIÓN USO

SD. Compatible con infección aguda VIH

Establece el diagnóstico cuando la prueba de anticuerpos es negativa o indeterminada

Diagnóstico

Valoración inicial de una infección VIH recientemente diagnosticada

CV basal Apoya decisión en conjunto con CD4(+) de iniciar o no tratamiento

Control de pacientes VIH(+) sin TARV

Cambios de la carga viral ídem

Luego de 3-6 semanas del inicio o cambio de TARV

Valoración inicial de eficacia de TARV

Decisión de continuar o cambiar esquema

Control c/3-6 meses en pacientes con TARV

Duración del efecto antiretroviral

Decisión de continuar o cambiar TARV

Acontecimientos clínicos o disminución significativa de LTCD4(+)

Asociación con CV variable o inestable

ídem

�Principio General:

– Lisis de la muestra

DIGNOSTICOMOLECULAR

– Extracción del Ácido Nucleíco

– Amplificación del Ácido Nucleíco

– Detección del Ácido Nucleíco

METODOS

� Reacción en Cadena de la Polimerasa -PCR-

� ADN PROVIRALAmplificación basada en la transcripción � Amplificación basada en la transcripción NASBA

PCRReaccion en CCadena de la PPolimerasa

� Aplicación del proceso de Replicación:� Utilizado para amplificar segmentos cortos de

ADN� Específica para identificar genes o segmentos � Específica para identificar genes o segmentos

de genes de cualquier microorganismo� Utiliza una ADN polimerasa resistente al calor� Primers específicos � Reacción controlada� Millones de copias de secuencia objetivo

PCR Amplifica una secuencia espec ífica

Secuencia del Objetivo

Hebra Doble Hélice del DNA

Cromosoma

Transcripción Reversa - Paso 1 – Primer se une a la secuencia objetivo de RNA

Transcripción Reversa - Paso 2 - r Tth DNA Polimerasa Cataliza la extensión de los Primers incorporando Nucleótidos Complementarios

Fin de la Transcripción Reversa - Paso 3 –Resulta una síntesis de un DNA Complementario (cDNA) a la Secuencia Objetivo de RNA

Fin del 1er Ciclo de la PCR – Resulta una Copia de una Doble Cadena de DNA (Amplicon) de la Secuencia Objetivo

PCR – Amplificación Exponencial: Cada Nuevo Ciclo duplica la cantidad del Objetivo, Resultando en un Incremento Exponencial en Amplicones

1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid)

2 cycle = 2

3 cycle = 4

Single strand RNA

4 cycle = 8

5 cycle = 16

6 cycle = 32

7 cycle = 64

ADN PROVIRAL� Al momento de nacer no se distingue entre los

anticuerpos maternos tranferidos por vía placentaria

de los generados por infección del niño.

� Determinación cualitativa de ADN proviral integrado

en células mononucleares de sangre periférica poren células mononucleares de sangre periférica por

PCR.

� Se recomienda a las 24-48 hrs de vida, si es positiva

indica infección intrauterina.

� Si es negativa debe repetirse a los 15 días y a las 6

semanas.

ROCHE

1. AmplliPrep (extracción)

2. Cobas (Amplificacion-

Detección)

3. Cobas Taq-Man 48

NASBASample + Lysis buffer

Nucleic acid

Release of nucleic acid

Stabilization of nucleic acid

Binding of nucleic acid

Proteins

Lipidsetc.

Washes

Elution buffer

Purified Nucleic acid

Purification of nucleic acid,

removal of inhibitors

Recover nucleic acid in

small volume

Binding of nucleic acid

Fluorescencia Norm

alizada

Señal Fluorescente

(real-time)reacción NASBA

Determinación NASBA

0 10 20 30 40 50 60

Fluorescencia Norm

alizada

Tiempo (minutos)

Norm

alized fluorescence

Fluorescent signal

(real-time)

Determinación en el tiempo

0 10 20 30 40 50 60

Time (minutes)

Norm

alized fluorescence

&&

Dos plataformas – Un reactivo

Extracción Magnética

“BOOM®” Manual

Magnética

“BOOM®”

Automatizada

Carga Viral de VIH -1

� La cuantificación de la Carga Viral de VIH de manera

precisa y confiable es esencial para el manejo clínico y

terapéutico del paciente infectado por el VIH

� Los resultados Precisos y Confiables dependen de:

� Integridad de la muestra de Sangre

�Reactivos adecuados y protocolo de procesamiento

� Instrumento con plataforma validada

Recolección de la Muestra� Debe utilizarse plasma con EDTA.

� Las muestras para las pruebas de Carga Viral debenser tomadas en tubos estériles con anticoagulanteEDTA. (Restos de detergentes provenientes de tuboslavados, inhiben la reacción. (1.5 ml de Plasma)

� Mantenga las muestras de sangre total entre 2-25°C� Mantenga las muestras de sangre total entre 2-25°Cpor no más de 6 horas

� Separe el plasma de la sangre total dentro de lasprimeras 6 horas por medio de centrifugación de 800– 1600 rpm por 20 minutos

� Transfiera el plasma a un tubo estéril depolipropileno

Integridad de la Muestra� Consideraciones Críticas

� Uso del Anticoagulante adecuado – K 3EDTA (spray dried) evita el efecto de dilución para un c onteo absoluto adecuado

� Volumen adecuado de colección para lograr la anticuoagulación adecuada

� Mezcle bien el tubo después de recolectar la muestr a para evitar la formación de coagulos

� El tubo debe ser rotulado con el nombre completo de l paciente, cédula, día y hora de toma de muestra

� No utilizar tubos con EDTA y Gel .

Transporte de la Muestra

� La sangre total debe ser mantenida entre 2-25°C y e l plasma debe ser separado por centrifugación en meno s de 6 horas

� El plasma puede ser transportado a temperatura ambi ente � El plasma puede ser transportado a temperatura ambi ente (22°C) hasta por 24 horas

� El plasma puede ser transportado de 2-8°C hasta por 5 dias

� De -20 a -80°C por periodos de tiempo superiores a 5 dias

� Diagnóstico� Pronóstico� Terapia� Contagio� Contagio� Blips

GraciasGracias