CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA ......2017/11/06 · Es adecuado para enzimas aisladas,...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI

Materia de Articulación CEBI-E5

BIOCATÁLISIS APLICADA

Docente a cargo: Dra. Cristina dos Santos [email protected]

CEBI- E5-4 :Métodos de estabilización/Biocatalizadores en medio no convencionales.

mailto:[email protected]

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES


Se pueden estabilizar biocatalizadoresEn solución : Soluciones concentradas de enzimas Pureza no muy alta Con presencia de cofactores metálicos o en

soluciones reguladoras Con agentes cosmotrópicos

En fase sólida Liofilización Secado por aspersión


Se pueden estabilizar biocatalizadoresMétodos químicos Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas Inmovilización químicas

Métodos Físicos Inmovilización Física Solventes diferentes agua Encapsulación

Métodos de ingeniería genética Diseño racional Evolución dirigida Expresión de enzimas de organismos termófilos

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculas

¿Por qué se modifican enzimas?• Para estudios estudios estructurales, conformacionales, mecanismos enzimáticos. Analizarcorrelaciones estructura- función •Para mejoramiento y aumento de la estabilidad en diferentes condiciones de reacción y almacenamiento

¿Cómo se modifica químicamente enzimas?

Modificando grupos funcionales superficiales sin entrecruzamiento Provocando entrecruzamientos inter o intramoleculares


Grupos funcional modificado

Reacción o reactivo Enzima modificada

N terminal de Lisina Acilación Quimotripsina

Carboxilo de ácidos aspártico o glutámico

Carbodiimida Beta-glucosidasa

Imidazol Histidina Bromoacético Beta-glucosidasa

CarboiimidasActivan ácidos… dan ésteres o amidas

Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas

Modificación estabilidad de Tripsina

Aumenta estabilidad térmicade la tripsina de 45 a 60 °C. In

mayor resistencia a la degradación a pH 9

.

Utilizando una proteasa de Streptoverticillum

Sp. Grupo amino reacciona con residuos glutámico de tripsina

AMINA: propilen, butilen o etilediaminaCiclodextrina tosilada +

Ots =

Proteasa (tosil-asa

TRIPSINA BOVINA


Modificaciones con PEG

Se utiliza en enzimasterapeúticas ,

disminuyendo la inmunogenicidad y

aumentando la vida útil en el organismo

.

Aumenta la solubilidad por la hidrofilicidad de PEG

Disminuye el acceso de enzimas proteolítica o anticuerpos

Aumenta tamaño y reduce la filtración en riñon

ENZIMA

PEG 10000 n=195-265


Modificación con PEG

La modificación química con PEG es el primer paso para otras modificaciones de la

enzima que afectan la solubilidad en agua o en

solventes orgánicos.

Es importante el grado de sustitución ya que afecta la

entrada de gruposfuncionales más voluminosos

.

ACTIVACIÓN

SUSTITUCIÓN CON OTROS GRUPOS


APLICACIÓN: Modificación con PEG en enzimas terapeúticas

Sustitución con PEG importantes en el

aumento del tiempo de retención, protección

contra la degradación en células y y tejidos de enzimas, proteínas y pequeñas moléculas,

liposomas y nanopartículas utilizadas

en terapia.

.

Se utilizan enzimas que degradan aminoácidos específicos, queasi. La Arginina no es ncial en humanos pero el deficit de Arginhibe crecimiento de células. La arginina deiminasa (ADI) and ii)arginasa (ARG),se utilizan como antitumorales.



Métodos Físicos Inmovilización Física Encapsulación Solventes diferentes agua


BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS



VENTAJAS Recuperación del biocatalizador del medio de

reacción Reducción de la inhibición por el medio o por

productos Aumento de la concentración del

biocatalizador y de la productividad enzimática

Facilidad de recuperación y purificación de los productos.

La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación del biocatalizador inmovilizado.

Se puede elegir entre una gran variedad de diseños.

Ideal en procesos continuos!!

DESVENTAJASo Puede perderse actividad enzimática con la

inmovilización.o Sistema enzima soporte es heterogéneo,

pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferentes uniones al soporte.

o A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína indeseados.

o Puede aumentase costo del proceso comparado con la enzima nativa.

o El intervalo de pH, afinidad por sustrato, actividad enzimática de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo.

o Puede haber problemas difusivos es un sistema heterogéneo, enzima fase sólida y sustrato/medio fase líquida

MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES

Unión COVALENTE ADSORCIÓNADSORCIÓN

ENTRECRUZAMIENTO

ATRAPAMIENTO

ENCAPSULACIÓN

INMOVILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES


1. Inmovilización química por enlaces covalentes

La interacción entre el biocatalizador y el soporte es mediante enlaces covalentes pero NO entre

moléculas de enzima.

El tipo soporte determina tipo inmovilización.

IMPORTANTE centro activo no afectado x los reactivos e la inmovilización.Protección el CA con un análogo del sustrato.

MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES1.Inmovilización química por enlaces covalentes. Método azogrupos básicos en soporte

1. Se activan los grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las

proteínas.

2. Después se utiliza grupos reactivos superficiales de la enzima (N-terminal y aminos de

Lys, SH de Cys, OH de Tyr, imidazol de Hys)

Es adecuado para enzimas aisladas, es una inmovilización selectiva (Tyr, en ej. ).

Se evita la agregación de proteínas. Aumenta la resistencia a cambios pH y temperatura

MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES1.Inmovilización química por enlaces covalentes. Método acil-azida (Soporte con grupos ácidos)

1. Se activan los grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las

proteínas en dos etapas

2. Idém antes se utiliza grupos reactivos superficiales de la enzima (N-terminal y aminos de

Lys, SH de Cys, OH de Tyr, imidazol de Hys)


2. Inmovilización química por entrecruzamiento

Formación de enlaces covalentes INTERMOLECULARES (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte.

VENTAJA :Cantidades altas de ENZIMA inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura

DESVENTAJA: pérdida de actividad por problemas estéricos y difusionales del sustrato


2. Inmovilización química por entrecruzamiento con glutaraldehído MÉTODO DE CO-

RETICULADOPara evitar pérdida deActividad EnzimáticaEntrecruzar agregando unaproteína sin actividad y ricaen lisina.Ej. Albúmina bovina

MÉTODO ENTRECRUZAMIENTO

CON CRISTALIZACIÓN (CLECs)Cristalizan enzimas y luego sereticulan cono glutaraldehído


3. Inmovilización Física por atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa.

Formación de polímero altamente entrecruzado en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en la matriz polimérica formada.

Importante control de condiciones de la polimerización para que NO se altere la enzima.

Ventaja: Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas. Aplicación general

Nanoencapsulación en medios mesoporosos

Desventaja: Pérdidas de enzima con el régimen de trabajo.


4. Inmovilización por encapsulación

MICROENCAPSULACIÓN (1-100µm) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos y no de proteína. Desventaja : elevadas concentraciones iniciales de enzima (10mg/L)

ENCAPSULACIÓN POR GELACIÓN IÓNICA: cápsulas de alginato en soluciones de Ca (II)

Con bicapas lipídicas se puede obtener:MISCELAS REVERSAS fase continua : ORG/fase dispersa agua

LIPOSOMAS fase continua : agua/fase dispersa ORG

Catalasasoxidoreductasas


5. Inmovilización por Adsorción

Interacción física NO ESPECÍFICA ientre la ENZIMA y el SOPORTE ( interacciones de van der Waals, puente H, hidrofóbicas, iónicas)

Ventaja: método muy sencillo, general, costo moderado.

Desventaja: estabilidad limitada, control riguroso de condiciones de trabajo para evitar desorción de la Enzima


5. Inmovilización por Adsorción-Resinas

LIPOZYME CAL-B( Novozymes) lipasa de Candida antárctica producida en Aspergillus oryzae inmovilizada en resinas intercambio iónico

Lewatit 2431 (Bayer-Resina macroporosa ácida). No gel, esferas grandes muchos espacio. Alquilación fenol y olefinas, esteficación , eterificación condensación de moléculas grandes.


EFECTOS SOBRE LA ESTABILIDAD de la ENZIMA

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas diferentes a E en solución Cambios conformacionales: puede rigidizarse la estructura por las uniones al soporte,

mayor resistencia a la desactivación térmica o química.

Mayor protección de ataque de proteasas

Efectos material de soporte, mayor fuerza iónica ( menor efecto oxígeno) Menor agregación molecular

Efecto soporte, mayor control de pH enmicroentorno de la enzima Mayor estabilidad en solventes no acuosospor el carácter hidrofílico del soporte


EFECTOS SOBRE LA CINÉTICA DE LA ENZIMA

Las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas son diferentes a las de las enzimas en solución porque:

La inmovilización puede inactivar la enzima si se afectan los AA del sitio activo, si existen impedimentos estéricos

Cambios en la afinidad por el sustrato

Problemas difusionales

Cambios pH. Por ejemplo, enzima unida a un soporte con q negativa (v.g. CM-sephadex) será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-sephadex). Entonces AE DEPENDE DE SOPORTE!!!

INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES

Problemas difusionalesaparentan MENOR

AFINIDAD !!!

INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES

QUIMOTRIPSINA EN SOPORTE CATIÓNICO O ANIÓNICO


APLICACIONES



APLICACIONES ANALÍTICAS

BIOSENSORES

BIORREACTORES

APLICACIONES INDUSTRIALES

-ALIMENTOS

-QUÍMICA

FARMACEÚTICA

APLICACIONES MÉDICAS

Tratamientos con enzimas inmovilizadas


ALIMENTOS : PRODUCCIÓN LECHE SIN LACTOSA

ALGINATO El alginato está formado por dos tipos de monosacáridos, el ácido gulurónicoy el ácido manurónicoEn presencia de Ca2+ forma geles irreversibles a pH maor a 3,5.

LECHE con lactosa

La enzima lactasa inmovilizada convierte lactosa a glucosa y galactosa en un proceso continuo

Cápsulas de alginatocon lactasa inmovilizada

LECHE sin lactosa

Aplicaciones inmovilización de enzimas

ALIMENTOS: PRODUCCIÓN JARABES ALTA FRUCTOSA

Amilasasinmovilizadas

Glucosa isomerasainmovilizada


PRODUCCIÓN DE AROMAS: ÉSTERES

pH óptimo 6.5 tanto para la lipasainmovilizada como la libre, pero la inmovilizada retiene actividad máxima a más alta temperatura 55 – 60°C

LIPASA CATALIZA LA FORMACIÓN DE ÉSTERES , butirato de etilo

Lipasa de Candida rugosa inmovilizada en Eupergit®C85% eficiencia


PRODUCCIÓN DE AROMAS: ÉSTERES, TERPENOIDES

Microorganismos pueden sintetizar alcoholes, ésteres, lactonasy terpenosGeotrichum candidum y las levaduras Hansenula y Pichiaproducen alcoholes y ésteres; la Trichoderma viride produce la lactona gentil-6-alfa pirina, que tiene un olor a coco; algunas especies de Ceratocystis, Penicillium, Aspergillus, Sacharomices y Pseudomonas sintetizan terpenos volátiles.

Ventaja de que estas biotrasformaciones son estereoespecíficas.


APLICACIONES: BIOSENSORES

ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO ESPECÍFICO

TRANSDUCTOR

ELECTRÓNICA

BIOSENSORES ENZIMÁTICOS


APLICACIONES: BIOSENSORES

BIOSENSORES ENZIMÁTICOS

Para cuantificación de sustratos Glucosa usando biosensor de glucosa oxidasa

Para cuantificación de inhibidores Para pesticidas carbámicos con acetilcolinesterasa



Métodos Físicos Inmovilización Física Encapsulación Solventes diferentes agua


ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESINGENIERÍA GENÉTICA

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESBIOCATALIZADORES MODIFICADOS

INGENIERÍA GENÉTICA

CLONACIÓN

PCR amplifica un gen determinado

MUTAGÉNESIS

Producir un ADN con diferencias en las bases del original.

Puede hacerse con agentes químicos o radiación.

OMG organismos modificados

Aplicaciones de la ingeniería genética

Fármacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano, en bacterias

recombinantes y animales transgénicos, aumentando la velocidad y el rendimiento en la producción de los mismos

Enzimas más activas para disolver manchas, como las que se usan en los detergentes en polvo, mayormente por medio de microorganismos recombinantes (transgénicos) que crecen en biorreactores.

Aumenta la velocidad de producción de enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la elaboración del queso y en la obtención de jugos de fruta, entre otras.

En biocatálisis, la obtención de diferentes isoenzimas puras con diferentes selectividades y enzimas con diferentes características deseadas

BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOS


Bacillus, como p. ej. B. subtilis y B. licheniformis.

Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería).

Aspergillus niger y A. oryzae.

Lactobacillus y estreptococos lácticos.

Para usar un microorganismo que produzca enzimas de consumohumano se debe usar un microorganismo “GRAS” (generallyaknowledged as secure).Existen unos 50 microorganismos GRAS aprobados para la industria

alimentaria por ejemplo


ENZIMAS RECOMBINANTES LIPOLASA® Novoenzyme, es la primera enzima recombinante aprobada para detergentes. El gen de la lipasa fue aislado del hongo filamentoso Humícolay transferido a A.oryzae

Cutinasa de Fusarium que degrada ácidos grasos de expresa en la levadura S.cerevisiae

Quimosina recombinante (rennina,EE.UU y Gran Bretaña, 90% de los quesos duros), sustituyendo a la escasa quimosina de terneros y a la biotecnológica tradicional obtenida de hongos (Rhizomucor, Endothiaparasitica). La quimosina recombinante se obtiene en Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger manipulados.

Otras aplicaciones X mutagénesis dirigida sobre genes clonados ya existentes para generar productos con propiedades nuevas. Algunas moléculas –entre ellas, muchos antibióticos– se sintetizan en células mediante rutas bioquímicas que emplean una serie de enzimas, las cuales pueden ser modificadas genéticamente para producir formas modificadas de antibióticos.


MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

Subtilisina, proteasa de B.

licheniformis que elimina manchasde sangre y de comida, se hamejorado con ingeniería genéticapara que tenga actividad de catalasay resista pH alcalinos y altastemperaturas

BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOSENZIMAS RECOMBINANTES Aplicación en veterinaria

• Se aisla de la vaca el ARNmde la somatotrofina bovina

• Con transcriptasa inversa se transforan en cADN

• Se clona en un vector bacteriano de E. coli

• Se produce en cultivo de células la STB recombinante

Somatotropina bovina recombinante pare estimular la producción de leche de vacas (aprobada por la FDA en 1994 para Monsanto, con el nombre comercial de Prosilac, pero no en la UE).


ENZIMAS RECOMBINANTES: LIPASAS COMERCIALES


ANTICUERPOS CATALÍTICOS

Los anticuerpos o inmunoglobulinas son un tipo de proteínas muy particulares, secretadas por las células

del cuerpo humano llamadas plasmocitos (linfocitos). Los produce el sistema inmune como respuesta para

eliminar, por diversas vías, agentes externos al organismo.

ANTICUERPOS CATALÍTICO tienen ACTIVIDAD CATALÍTICA cuando reaccionan con antígenos

Ventaja altamente específicos!!.

Acción catalítica

Especificidad de Anticuerpos



HAPTENO : molécula pequeña que puede reaccionar específicamente con un anticuerpo pero no puede inducir respuesta inmune salvo que esté unida a una proteína



IgG , es la inmunoglobulina mas común, distribuída en sangre y fluídos extracelulares.Tiene actividad de hidrolizar el VIP (péptido intestinal vasoactivo) en asmáticos.

Procedimiento general para obtener anticuerpos catalíticos:

1. Determinar el estado de transición de la reacción a ser catalizada, se diseña una molécula, de peso molecular inferior a 10.000 daltons (hapteno) que por sí misma no induce la formación de anticuerpos pero que al unirse a una proteína transportadora estimula una respuesta inmunitaria.

2. Este modelo es luego usado como antígeno para obtener anticuerpos

3. Luego la plantilla es removida y el anticuerpo es empleado como catalizador.

4. Este último puede ser entonces química o genéticamente modificado para ser unido a un grupo reactivo o a un cofactor según se necesite




ANTICUERPOS CATALÍTICOS (ABZYME)

ENZIMASPROMISCUIDAD ENZIMATICA

Clase 1: Catálisis de una reacción alternativa a través del mecanismo típico•Proteasas que catalizan hidrólisis de ésteres •Fosfatasas que hidrolizan ésteres de sulfatos •Metaloproteasas hidrolizan enlaces P-O o P-F

Promiscuidad enzimática como la capacidad del sitio activo de una enzima de catalizar más de un tipo de reacción

Clase 2: reacciones con cambios en el mecanismo de catálisis •Uso de iones metálicos alternativos (metaloenzimas) •Cambios generados por mutaciones naturales o inducidas artificialmente en la estructura de la enzima •Generación de un camino catalítico alternativo al natural en enzimas no modificadas

Lipasas: promiscuidad

Reacción de condensación aldólica:

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