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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

Docente a cargo: Mariano GRASSELLI

CEBI_E11_4 : Filtración

FILTRACIÓN

La filtración se puede definir como una

operación unitaria capaz de separar un sólido

de un fluido (líquido o gaseoso) por acción de

un medio filtrante y una diferencia de presión.

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Métodos TRADICIONALES

Métodos MODERNOS

Métodos TRADICIONALES

Por motivos de estudio podemos clasificarla de diferentes maneras:

• Según la fuerza impulsora• Gravedad

• Vacío

• Fuerza centrífuga

• Según el mecanismo• Formación de una torta

• De profundidad

• Según el producto• Retentato (torta)

• Filtrado (clarificado)

• Según el modo de operación• En batch

• En continuo

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Equipos de filtración convencionales

Intermitentes a presión (trabajan en batch)

– Filtro Prensa

– Filtro de Cámara

Rotativos al Vacío (trabajan en continuo)

Filtro Prensa

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Filtro de cámara

Filtro Rotatorio al vacío

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Métodos MODERNOS

En los filtros modernos (de membrana)

la retención ocurre solamente en la

superficie del filtro.

Escala comparativa de tamaños

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Filtración tangencial(la clave del éxito)

Permeato

Retentato

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Parámetros importantes

• Alimentación o Feed– Producto inicial que entra en el modulo de Ultrafiltración

• Retentato– Fracción de producto que no pasa la membrana (rechazada

por la membrana)

• Permeato– Fracción de producto que atraviesa la membrana

Filtración tangencial(la clave del éxito)

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Esquema de un equipo de UF

bomba

Tanque

reservorio

cabezal

Manómetro

Módulo UF

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bomba

Tanque

reservorio

cabezal

Manómetro

Módulo UF

Técnicas de filtración

– Microfiltración

– Ultrafiltración

– Nanofiltración

– Osmosis inversa

– Electrodiálisis

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Microfiltración (MF)

• Rango de tamaños de partículas

– 0,1 µm a 10 µm.

• No retiene macromoléculas o sustancias disueltas.

• AplicacionesEsterilizaciones de líquidos y gases

Recuperación de biomasa

Recuperación de cuerpos de inclusión

Ultrafiltración (UF)

• Discriminan macromoléculas disueltas en solución

• Existen diferentes membranas que tienen un rango de

poros en el orden de 5 kDa a 300 kDa.

• AplicacionesConcentración,

Diafiltración y

Fraccionamiento de proteínas.

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Nanofiltración

• En este nivel de filtración las membranas son capaces de retener iones divalentes y pequeñas moléculas orgánicas (ej.Sacáridos).

• Se utiliza para la purificación de agua para uso farmacéutico y biotecnológico.

• En esta técnica se utilizan presiones más altas que en UF

Osmosis reversa

• En este nivel de filtración las membranas son capaces de retener iones y pequeñas moléculas orgánicas.

• Se utiliza para la purificación de agua para uso farmacéutico y biotecnológico.

• En esta técnica se utilizan presiones más altas que en los casos anteriores ya que hay que vencer la fuerza de la presión osmótica.

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Electrodiálisis

• Membranas especiales, el transporte es por una diferencia de potencial eléctrico (potencial electrocinético).

• Se utiliza para la eliminar amonio y lactato de cultivos celulares (nivel experimental para hidridomas).

50 A/m2

La aplicación de sistemas de membrana (MF y

UF) se esta expandiendo rápidamente en la

industria alimentaria y farmacéutica.

La principal razón para este crecimiento es

– Operación de bajo consumo energético,

– Alta recuperación de producto

– Tecnología limpia (no genera contaminantes).

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Composición del suero de leche

Glóbulos de caseína/lípidos

Proteínas (PM > 10 kDa)

Lactosa (PM aprox 0,34 kDa)

Sales

Agua

UF

NF

OR

MF

Suero

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Etapas de aplicación

Application Membrane SelectionMembrane

Material

Bacculovirus and retrovirus

concentration and washing400 kD, 500 kD, 0.05 µm PS

Clarification of cell lysates to recover

proteins0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES

Concentration and washing of

bacterial and/or mammalian cells500 kD, 0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES

Continuous perfusion of cell culture 0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES

Clarification of viral cultures 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES

Washing uniform latex diagnostic

particles0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES

Washing and concentration of protein

particulates500 kD, 0.2, 0.5 µm CE -PES

Aplicaciones de la MF

(PES) Polyethersulfone

(CE) Cellulose Esters

(PS) Polysulfone

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Application Membrane SelectionMembrane

Material

Concentrate and/or desalt peptides

and small molecules10 kD PS

Depyrogenation 10 kD, 50 kD PS

Concentrate and/or desalt proteins,

enzymes50 kD, 100 kD, 400 kD CE -PS

Concentrate and diafilter albumin,

(~MW 67,000)50 kD PS

Concentration of monoclonal

antibodies and other macromolecules100 kD, 400 kD, 500 kD CE -PS

Aplicaciones de la UF

(PES) Polyethersulfone

(CE) Cellulose Esters

(PS) Polysulfone

Parámetros importantes

• Flujo (de filtración)– Volumen de eluato / (superficie membrana * tiempo)

• Lmh: litros metro cuadrado de membrana por hora

• Gfd: galones por pies cuadrados por día

• Flujo de recirculación (Cross-flow rate)– Caudal de alimentación del producto

• Factor de concentración (CF)– Volumen (o caudal) alimentación / volumen (o caudal)

concentrado

• % rechazo (% rejection)– 100 * (1 – [permeato] / [retentato] )

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Parámetros importantes

• Caída de presión (Pressure drop)– Diferencia de presión entre la entrada y salida de la

alimentación

• Presión transmembránica (TMP)– Diferencial de presión de filtración

• Presión osmótica (Π)– Depende del MW y concentración del componente

Presión transmembránica (TMP)

∆TMP = Psup – Pinf

Psup no se puede medir =>Psup= (Pin + Pout)/2

∆TMP = (Pin+Pout)/2– Pinf

En gral Pinf = 0

(Psup)

Pinf

Pin Pout

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• Test del punto burbuja (Bubble point test [BP])

– Es un procedimiento utilizado para caracterizar una membrana y monitorear la consistencia y calidad.

– Se basa en la determinación de la presión mínima en el cual el líquido que moja a la membrana es eliminado por presión formando una burbuja (también determina el tamaño max de poro).

• Taponamiento (Fouling)

– Deposición de sustancias sólidas sobre la superficie de la membrana.

– Produce la disminución del filtrado y su calidad. Los procedimiento de limpieza lo eliminan o minimizan.

Definiciones importantes

• Hidrofobicidad– las membranas hidrofóbicas repelen el agua y/o no absorben agua

• Hidrofilicidad– las membranas hidrofílicas tienen alta afinidad por el agua y se

humectan espontáneamente.

• Tamaño de poro (Pore Size)– usualmente determinado en micrones (µm) y refiere al diámetro de

las partículas que una membrana es capaz de retener con un definido grado de eficiencia.

• Through-put– Una caracterización práctica de las membranas de micro filtración.

Evalúa la capacidad de filtración durante la vida de un filtro. ej. el vol total de un líquido específico que pasa a través de la membrana antes de reemplazarla.

Definiciones importantes

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Flujo de filtración en diferentes las diferentes técnicas

Por que ?

Existen diferentes Resistencias a la filtración...

Flujo

R adsorción

R membrana

R taponamiento

R gelR concentración

Memb porosa

MICROFILTRACION

MICROFILTRACION

ULTRAFILTRACION

ULTRAFILTRACION

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Flujo de filtración en diferentes las diferentes técnicas

• Celulosa modificada

– acetatos, nitratos, etc. derivados de celulosa

• Polímeros sintéticos

– Polisulfona (PES), Polietersulfona (PS),

Polipropileno (PP) , Polietileno (PE) , PVDF, etc.

• Minerales

– óxidos de Al y/o Zr (zirconio)

• Composites

– dos o tres capas de diferentes materiales

Materiales de construcción de membranas

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Formato de módulos

Tubular

Fibra hueca

Plano

Espiral

Figuras de www.geafiltration.com

Módulo fibra hueca

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Módulo platos

Módulo espiral

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Comparación entre diferentes módulos

Morfología de la microestructura de la membrana

Dos tipos principales de membrana:

• asimétricas

– Monofásica

– bifásica

• simétricas

Mayor flujo

Mayor eficiencia

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Flujo

Poro más

pequeño

Espesor aprox.:

0,25 mm!!

Membranas asimétricas

Retro flujo (de limpieza)

Estructura

macroporosa

homogénea

Diám. Aprox. 1,5

mm

Membranas simétricas

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Esta técnica es la normalmente reemplaza a la diálisis en el escalado de un proceso.

Podemos definir el parámetro

MWCO (molecular weight cut off).

Las membranas de UF más comunes son – 5 kDa MWCO

– 30 kDa MWCO

– 100 kDa MWCO

– 300 kDa MWCO.

Ultrafiltración (UF)

El coeficiente de rechazo corresponde al % de moléculas de

determinado PM que son retenidas respecto de la cantidad inicial.

MWCO(rechazo de moléculas de PM determinado)

% rechazo (% rejection) = 100 * (1 – [permeato] / [retentato] )

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http://www.spectrapor.com

Retención de cartuchos Sartocond

descartables

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Flujo de filtración vs Recirculación (UF)

Concentración Diafiltración contínua

Procesos Industriales de Ultrafiltración

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Funcionamiento de un sistema de Fibra hueca

Concentración

Objetivos del proceso

Selección del tipo de

membrana

Selección del MWCO

Selección del área de

filtración, config y modulo

p/ estudios de lab

•Tiempo max y volúmenes de proceso

•Objetivos:

Factor de concentración

Volúmenes de diafiltración

MWCO debe ser :

•3-6 veces > MW proteína pasa al

permeato

•3-6 veces < MW proteína retenida

•De acuerdo al tiempo y vol de proceso

Estrategia de escalado de TFF

Pall USD 2390 Upscale products and services

Optimización de los

parámetros del proceso

Escalado

•Incrementar proporcionalmente el área

con el vol de muestra

•De acuerdo al tipo de muestra seleccionar el

tipo de cartucho

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Nuevos sistemas reducir el taponamiento

Sistema de fibras huecas helicoidales

HPTFF

(High Performance Tangencial Flow

Filtration)

• Agrega la interacción electrostática al efecto

estérico

– Modificando el pH y la fuerza iónica de la solución

se modifica el tamaño real de las proteínas.

– Membranas de UF con carga electrostática

Nuevas técnicas para mejorar la separación

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Membranas vibrantes

Vibratory Shear Enhanced Processing

(VSEP)

• Oscilación de la membrana para

disminuir la formación de la torta

• Frecuencia: 50- 60 Hz

• Amplitud: 2-3 cm

• Dirección: tangente a la superficie

• de la membrana

• Genera una fuerza de aprox 200 G

Nuevos sistemas reducir el taponamiento

Membranas vibrantes

Fundamento

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Diferencias con la centrifugación

Evitan la formación de aerosoles (manejo de

microorganismos patógenos o sustancias tóxicas)

Existe taponamiento (fouling) de las membranas

– Ciertas proteínas se adsorben a la superficie de la

membrana

– Desechos celulares forman una fina capa sobre la

membrana

– Compuestos químicos utilizados normalmente como

antiespumantes

Centrifugación vs Filtración

Tamaño de partícula a separar – A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el

costo de separación por centrifugación cae, mientras que para la filtración no se ven afectados.

– El punto de intersección están en los 1-2 µm (tamaño de la E. coli).

– La UF no tiene competencia con la centrifugación ya que esta última no permite separar componentes solubles.

Otras consideraciones– Facilidades existentes en la planta

– Compatibilidad para un proceso continuo

– Requerimientos de pureza del producto

– Nivel de impurezas o partículas permitidos

– Volumen de material a tratar

– La centrifugación requiere un mayor capital inicial y poco de mantenimiento

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Micro y Micro y NanoNano poros perfectosporos perfectos

Obtenidos por bombardeo con iones pesados acelerados

Colaboración con

Laboratorie des Polymeres Irradies

CEA- Saclay. Ecole Polytechnique. France

β-PVDF

112Sn53+ 112Sn53+ 112Sn53+ 112Sn53+

Proceso de preparación de membranas

112Sn53+

β-PVDF

112Sn53+ 112Sn53+ 112Sn53+

PVDF

Irradiación con as de

partículas

Ataque químico

β-PVDF

β-PVDF 25µ

m

2.85 MeV/uma

Fuencia:

9.5 x 108 to 9.5 x 109

En vacio.

GANIL laboratory (Caen, France)

Permanganato de K 0.25 mol. L-1 en

KOH a temperatura y tiempo

establecido

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55 °C 65 °C

75 °C 85 °C

No-cylindricalpore entrance

55 °C 65 °C

75 °C 85 °C

No-cylindricalpore entrance