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Bioindicación: Gestión y Control de Proceso en EDAR. ► UNIDAD 3 Prohibida toda reproducción parcial o total de este documento sin autorización

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Los microorganismos filamentosos del fango activo son asociaciones de bacterias que presentan un determinado morfotipo y que son parte de la macroestructura del flóculo. En ocasiones están en directa competencia con las bacterias formadoras de flóculo.

Los morfotipos filamentosos que podemos encontrar en un fango activo vienen descritos entre otros por Eikelboom (2000), Eikelboom y Van Buijsen (1983) y Jenkins et al. (2000 y 2004).

La concentración de bacterias filamentosas que se encuentran en el flóculo es fundamental ya que forman el esqueleto sobre el que se asientan el resto de componentes del flóculo.



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Un descenso en la concentración filamentosa puede ocasionar un debilitamiento de la estructura flocular y producirse la rotura de los flóculos. Esto llevaría a que escapasen estos microflóculos por el decantador.

Una concentración elevada de filamentosas ocasiona dificultades en la decantación debido a que la superficie flocular aumenta provocando que se liberen sólidos en el efluente.

Las operaciones de control en planta tienen como uno de sus objetivos el conseguir un equilibrio entre bacterias filamentosas y bacterias floculantes para la obtención de flóculos con las mejores características depuradoras.

Por lo tanto es necesario conocer el tipo de filamentosas y su concentración en el fango para poder evaluar la situación y determinar si pudiera existir un problema potencial o uno real debido a estos microorganismos filamentosos.

La caracterización e identificación de los microorganismos filamentosos (MOF) debe realizarse en base a características morfológicas y estructurales bajo microscopia con contraste de fases y a 1000 aumentos para minimizar el número de identificaciones erróneas.



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Las principales características por las que se diferencian los microorganismos filamentosos son:

Forma del filamento: Existe una elevada variedad morfológica: • Rectos: el tricoma presenta forma recta. • Ligeramente curvados: existen tramos

curvados. • Torcidos: existen punto de inflexión donde se

curva pronunciadamente. • Cadenas irregulares de células: son una

sucesión de células individuales dispuestas de forma aleatoria

• Enrollados: con formas muy curvas, enrolladas.

• Micelial: presentan ramificaciones verdaderas de forma aleatoria.

Dimensiones del filamento: Tanto la anchura como la longitud se pueden medir con un micrómetro ocular. Es importante discernir si la anchura es mayor o menor a 1µm.

Color del filamento: Se puede distinguir mediante contraste de fases: • Oscuro • Medio • Transparente

Ramificaciones : Presencia de filamentos adheridos en posición perpendicular al filamento principal: • Verdaderas: hay continuidad citoplasmática

entre los tricomas ramificados. Es característico de hongos y de los géneros Nocardia/Gordona (NALO/GALO).

• Falsas: no existe continuidad y el extremo ramificado queda “adherido” en posición central y no terminal. Es característico de Sphaerotilus natans.



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Crecimiento de células : Existe un crecimiento de bacterias sobre la superficie del filamento utilizándolo como soporte o sustrato: • Ausencia • Presencia • Abundancia

Motilidad: movimiento propio de muy pocos microorganismos filamentosos: • Por flexión: Flexibacter • Por deslizamiento: Beggiatoa y

Cyanophyceae.

Localización del filamento: su situación en el flóculo: • Intraflocular: se localiza dentro del flóculo. • Extendido: se proyecta desde la superficie del

flóculo hacia el exterior. • Libre: está fuera del flóculo.

Vaina: Es una estructura tubular que presentan algunas filamentosas que recubre a las células individuales. En ocasiones es difícil de apreciar.

Forma celular: Las células individuales de cada filamento deben englobarse en una de estas categorías: • Cuadradas • Rectangulares • Ovales • Discoidales • Bacilares • Cocos • En tonel



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Septos celulares: Son los tabiques de separación entre células contiguas del filamento.

Constricciones celulares: Se trata de una discontinuidad en los bordes del filamento coincidiendo con los septos.

Dimensiones celulares: Se realizan mediciones con un micrómetro ocular del ancho y largo celular.

Tinciones diferenciales: La principal tinción que se realiza habitualmente es la de Gram (por el método de Hücker modificado) que está basada en el grado de permeabilidad que presentan las paredes celulares de las bacterias a un disolvente empleado. El resultado de la tinción podrá ser positiva, negativa o variable. Existen otros tipos de tinciones encaminadas a detectar una característica morfológica en particular que nos permita identificar el tipo de filamentosa en estudio.

Gránulos de azufre: Algunas bacterias son capaces de almacenar gránulos de azufre en el interior de sus células que les sirve como sustancia de reserva. Se comprueba “in situ” la presencia o ausencia de azufre o se realiza la prueba del azufre. Los gránulos aparecen brillantes bajo microscopia de contraste de fases.



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Otros gránulos: Determinadas filamentosas almacenan intracelularmente otro tipo de gránulos de reserva compuestos por polifosfatos, detectables mediante la tinción de Neisser , o por gránulos lipídicos de poli-β-hidroxibutirato, detectables mediante la tinción PHB .

Rosetas y Gonidios: su situación en el flóculo: • Intraflocular: se localiza dentro del flóculo. • Extendido: se proyecta desde la superficie del

flóculo hacia el exterior. • Libre: está fuera del flóculo.

La identificación de MOF debe realizarse de manera rutinaria en las EDAR para conocer el estado del reactor biológico y poder tomar decisiones en el caso de detectar anomalías. Sin embargo la identificación y cuantificación puede resultar en ocasiones una labor muy tediosa y el empleo de personal muy cualificado.



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En la mayoría de las ocasiones la identificación de los filamentos en una muestra en fresco puede resultar confusa por lo que se debe recurrir a las identificaciones por tinciones específicas bien en esa misma muestra fresca o en un frotis fijo.

Las principales tinciones que se realizan en las muestras para la identificación de MOF son:

Tinción de Gram (método de Hücker modificado): Permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: “Gram positivas” y “Gram negativas” debido al grado de permeabilidad que presentan las paredes celulares al disolvente empleado en la tinción. La mayoría de la población de los MOF son “Gram negativos”. Es necesario diferenciar entre tinción positiva, negativa o variable (aquellos MOF que se tiñen levemente).

Tinción de Neisser: Permite observar los gránulos de polifosfatos (gránulos de reserva) que almacenan algunos MOF. Esta tinción se puede valorar como positiva, negativa o negativa con gránulos Neisser positivos. Cabe destacar que en reactores muy cargados de nutrientes los gránulos son relativamente pequeños.

Tinción de PHB (poli- β-hidroxibutirato): Permite observar los gránulos lipídicos de poli-B-hidroxibutirato (gránulos de reserva) que almacenan algunos MOF.



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Tinción de vainas: Permite comprobar la existencia de vaina o cubierta.

Tinción inversa con tinta china : La existencia de elevadas cantidades de material polimérico extracelular en los flóculos puede indicar una falta de nutrientes (N y P). La aparición de zonas claras puede indicar la existencia de un problema de decantación del fango por esponjamiento denominado "bulking" no filamentoso o crecimiento zoogleal.

Tinción de gránulos de azufre: Pone de manifiesto la capacidad de determinados MOF de oxidar los sulfuros a azufre elemental.

La técnica de hibridación in situ (FISH, Fluorescence In Situ Hybridization) es una técnica molecular de caracterización y secuenciación del gen 16S rDNA que permite conocer la posición taxonómica de los diferentes morfotipos de bacterias filamentosas.

Debido a que las técnicas de identificación convencionales en ocasiones son erróneas o imprecisas se ha desarrollado esta técnica muy específica que permite mejorar la gestión y el control de los procesos al conocer con certeza el causante del problema.



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El procedimiento de realización de la técnica FISH es el siguiente: 1. Se procesan las muestras de fango mediante

técnicas de filtración. 2. Se realiza el montaje en soporte agar con

enzimas específicas para la desnaturalización del material genético.

3. Se realiza la hibridación con sondas

4. Se procede a la ampliación de la señal con fluorocromos específicos.

5. Se procede a la visualización con un microscopio de fluorescencia.

6. Se realiza la captura y el procesamiento de las imágenes.

Las características más destacables de la Técnica FISH son: 1. Necesita poca cantidad de muestra. 2. El tiempo de procesamiento es relativamente

bajo. 3. Permite trabajar con varias sondas de

diferente color. 4. Tiene alta sensibilidad. 5. Tiene alta especificidad: baja cantidad de

falsos positivos y negativos.

Las desventajas e inconvenientes de esta técnica son: 1. Se necesita un amplio abanico de sondas ya

que solo se obtiene información de la sonda empleada.

2. Es necesario una instrumentación muy específica (microscopio de fluorescencia, sondas de hibridación, reactivos, etc.)

3. Necesita personal muy cualificado. 4. Tiene un coste muy superior al de las

técnicas convencionales. 5. Es menos práctica para el día a día en una

EDAR que las técnicas convencionales.



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Generalmente, en un reactor biológico que funciona correctamente, se suelen encontrar entre 3 y 5 tipos diferentes de microorganismos filamentosos siendo una de ellas la filamentosa mayoritaria o dominante. En fangos con problemas de sedimentación la responsable del fenómeno producido será la filamentosa dominante siempre y cuando su concentración sea elevada, llegando a ser la única presente en casos extremos. Aquellas filamentosas en menor cantidad serán consideradas como secundarias y no serán responsables directas de los problemas de sedimentación.

La detección e identificación convencional de los microorganismos filamentosos se basa en la descripción de las características morfológicas y en tinciones diferenciales de estructuras.

Sin embargo, según Van der Waader (2002), estas identificaciones pueden llegar a inducir errores debido a que: • Una misma especie puede presentar

polimorfismos. • Diferentes especies pueden presentar el

mismo morfotipo. • Los microorganismos que se encuentran

dentro del flóculo pueden pasar desapercibidos.

• El método en ocasiones es subjetivo.

La identificación de los principales microorganismos filamentosos se realiza siguiendo las instrucciones de Jenkins et al. (2004) y Eikelboom (2000). Los diferentes tipos de microorganismos filamentosos que nos podemos encontrar en un fango activo son unos 23 y la mayoría de ellos están asociados a unas determinadas características del sistema depurador en base a numerosas observaciones realizadas.



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Los MOF pueden clasificarse en función de características morfológicas, de movilidad, de acumulación de compuestos de reserva, de su potencial peligrosidad para el funcionamiento normal de la planta, etc.

Los MOF más habituales que podremos encontrar en los reactores biológicos y que veremos más detalladamente son: Haliscomenobacter hydrossis, Microthrix parvicella, NALO/GALO, Nostocoida limícola (I,II y III), Sphaerotilus natans, Tipo0041, Tipo 0092, Tipo 021N, Tipo 0675, Tipo 0918, Tipo 1701, Tipo 1851, Tipo 1863, Thiothrix (I y II).

Otros tipos de filamentosas que podemos encontrar son: Beggiatoa spp., Flexibacter spp., Tipo 0211, Tipo 0581, Tipo 0803, Tipo 0961, Tipo 1702, Tipo 1852.

En función de características comunes se han asociado los MOF en tablas para una mejor identificación. Se han agrupado por: • Movilidad • Creadoras de turbidez • Tricoma superior a 1 µm • Tricoma inferior a 1 µm • Gránulos de azufre • Ramificaciones



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Movilidad: Flexibacter, Beggiatoa, Cyanophyceae.

Creadoras de turbidez: Tipo1863, Tipo0211, Tipo1852, Tipo 0411, Streptococcus y Bacillus.

Tricoma superior a 1 µm: Tipo021N, Tipo0041, Tipo0961, Nostocoida limicola II y Nostocoida limicola III.

Tricoma inferior a 1 µm: Nostocoida limicola I, Haliscomenobacter hydrossis, Microthrix parvicella, Tipo0675, Tipo0092, Tipo1701, Tipo0803, Tipo1702, Tipo1851 y Tipo0581.

Gránulos de azufre: Tipo0914, Thiothrix I y Thiothrix II. (Beggiatoa se ha incluído en las de movilidad).

Ramificaciones: Sphaerotilus natans y NALO/GALO.



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Los problemas más frecuentes que se presentan en los fangos activos están relacionados con la presencia excesiva de filamentos en el licor mezcla.

Las consecuencias del exceso de filamentos son principalmente la aparición de los fenómenos de esponjamiento (bulking) y de espumas (foaming) que repercutirán en la decantabilidad del fango.

La observación microscópica en estos casos es una herramienta fundamental para anticiparse a estos fenómenos y conocer la abundancia de filamentos para poder actuar eficientemente y si llegase el caso a optimizar en la dosificación de un biocida.

La principal cuestión es conocer cuando existe una excesiva cantidad de filamentos o a partir de qué cantidad existe un problema potencial y conocer qué estrategia hay que seguir en cada caso.



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Existen numerosas técnicas de medición de filamentos más o menos complejas, si bien un recuento fiable requiere numerosas mediciones y mucha dosis de paciencia.

La tecnología ha aportado nuevas técnicas de recuento por análisis de imagen que requieren el procesamiento informatizado de dichas imágenes.

Entre las principales técnicas de recuento destacan:

Técnica de intersección en cuadrícula (Estévez et al.): Consiste en el recuento del número de filamentos que interseccionan con los cuadrados de la diagonal de la cuadrícula central de la cámara de Neubauer. Esta técnica es útil para seguimientos rutinarios ya que además de ser rápida establece un criterio subjetivo de abundancia y nos permite obtener la densidad total de microorganismos filamentosos.

Técnica de intersección en el ocular ( Humbert Salvadó): Consiste en el recuento de las veces que los filamentos interseccionan con el círculo del ocular al observar un determinado número de campos. Es una técnica sencilla y rápida. Si comprobamos que el valor obtenido es superior a 300 m/ml será necesario realizar una dilución de la muestra y volver a realizar el recuento.



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Longitud total de filamentos extendidos (Sezgin et al., 1978): Consiste en contar el número de filamentos existentes en una muestra diluida de fango activo clasificándolos según unos determinados tamaños.

Método simplificado de conteo de filamentos SJ/SC PCP (Jenkins et al., 1986): Consiste en determinar el número de veces que interceptan los filamentos una línea grabada en el ocular.

Técnica de recuento de Nocardia (Pitt and Jenkins, 1990): Consiste en el conteo del número intersecciones de los filamentos ramificados Gram-positivo de longitud>1 µm con una cuadrícula en una muestra teñida con tinción Gram.

Para la determinación de la longitud relativa de filamentos emplearemos generalmente por su rapidez y eficacia los métodos de intersección en cuadrícula y en ocular. En ambos casos el valor obtenido se expresa en metros de filamentos/ml .

En los casos en los que se detecte la presencia de microorganismos nocardiformes (NALO/GALO) se empleará el método de recuento de Nocardia. El valor obtenido se expresa en intersecciones/SSV.



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Veamos un ejemplo mediante la técnica de intersección en cuadrícula.

Veamos un ejemplo con la técnica de intersección en el ocular.

En ocasiones debido a la falta de tiempo o de personal cualificado la determinación de la longitud total de filamentos puede resultar dificultosa. Es por ello que se ha propuesto un criterio de abundancia relativa.

Este método se basa en la observación de numerosos flóculos y en la determinación la cantidad de filamentos por flóculo para obtener una densidad global de los filamentos por flóculo.

La concentración de filamentos observada queda definida dentro una categoría numérica que hace referencia a un determinado criterio de abundancia. El valor de la categoría va desde 0 (no se aprecian filamentos) a 6 (excesivos filamentos).



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Como los MOF son la columna vertebral del flóculo su concentración provoca un efecto en la estructura flocular. Cada morfotipo de MOF por sus características está asociado a un determinado efecto en la estructura flocular que debemos dejar reflejado.

Solo se anota el efecto que puede causar en el flóculo aquellas MOF que tengan una categoría de 4 o superior con un criterio de abundancia de “muy comunes”, salvo que nos encontremos el caso de que no haya una dominancia notable.

En función del efecto producido por el tipo de MOF nos podemos encontrar con cuatro situaciones diferentes: 1. Flóculo en punta de alfiler: Muy pocos o

ningún filamento. La estructura es muy débil. Existe riesgo de escape de sólidos en el efluente.

2. Flóculo ideal: Equilibrio entre bacterias filamentosas y formadoras de flóculo. No aparece ningún efecto indeseable.

3. Disgregación flocular: Abundancia de filamentos en el interior del flóculo, disgregando su estructura. Existe riesgo de escape de sólidos en el efluente.

4. Puentes interfloculares: Abundancia de filamentos que crecen proyectándose desde la superficie del flóculo hacia el exterior manteniendo a los flóculos separados e impidiendo su agregación. Existe riesgo de escape de sólidos en el efluente.



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Puede darse el caso de que un mismo MOF pueda producir un efecto de disgregación o uno de enlaces por puentes interfloculares dependiendo de su localización en el flóculo, como por ejemplo el producido por la filamentosa Tipo0675.

En un mismo fango activo es frecuente encontrar diferentes microorganismos filamentosos. Sin embargo, sólo uno o dos tipos son los que suelen aparecer en mayor cantidad.

Por tanto hay que establecer cuál o cuáles son los microorganismos filamentosos “dominantes” y los “secundarios” según su categoría numérica.

Microorganismo filamentoso dominante : aquel que por su abundancia predomina sobre los demás. Normalmente se clasificará en una categoría de “muy común” (Categoría 4) o superior y probablemente será el responsable de los problemas de esponjamiento que pudiesen existir.

Microorganismo filamentoso secundario : aquel que por su abundancia quede englobado en la categoría de “común” (Categoría 3) o inferior. Normalmente no será directamente responsable de los problemas de esponjamiento que pudiesen existir.



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Puede darse el caso de que no exista una clara dominancia de un solo microorganismos debido a su baja densidad o a la diversidad de filamentos pudiendo existir un equilibrio entre diferentes tipos de filamentos.

Veamos un caso para determinar MOF dominantes y secundarios.

FIN DE LA UNIDAD

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