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Centro de Investigación y Tecnología del Agua

Bioindicación: Gestión y Control de Proceso en EDAR. ► UNIDAD 4 Prohibida toda reproducción parcial o total de este documento sin autorización

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En 1975, Curds, identificó en aguas residuales más de 200 especies de protozoos entre los que encontró 33 tipos de flagelados, 25 de rizópodos, 6 de actinópodos y 160 de ciliados.

Se estima que la densidad de población de los protozoos en los fangos activos es de 500.000 individuos/ml representando entre el 5 y 12% del peso seco de la balsa de aireación (Pike y Curds, 1971).

Esta amplia diversidad permite que los protozoos sean el grupo principal de la bioindicación ya que contribuyen mayoritariamente al consumo de materia orgánica y de bacterias libres, consiguiendo enormes reducciones de la DBO5 y de la concentración de E. coli en un 50%.



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Las principales funciones de los protozoos en la depuración de aguas residuales son: el favorecer la estabilidad flocular, contribuir a la obtención de un efluente clarificado, contribuir al mantenimiento de los niveles tróficos e indicar la presencia de tóxicos en el agua residual.

La estabilidad del flóculo se ve favorecida gracias a la presencia de compuestos mucilaginosos secretados por los protozoos que permiten aglutinar los componentes floculares y evitar su dispersión. Esto contribuye a mantener al flóculo estructuralmente como una unidad funcional.

El consumo de materia orgánica y de poblaciones bacterianas contribuye a la clarificación del efluente. Curds, en 1973, estimó que en presencia de protozoos la vida media de E. coli era de casi 2 horas mientras que en su ausencia aumentaba hasta las 16 horas.

Los protozoos contribuyen en la cadena alimentaria al mantenimiento de los niveles tróficos. Esta es la función más importante de los protozoos dentro de su papel en los fangos activos siendo el grupo de los ciliados el de mayor actividad en la depredación.

El hecho de ser buenos indicadores directos de toxicidad debido a que son sensibles a los tóxicos y a los cambios de oxígeno permite que se les emplee como herramienta bioindicadora para el conocimiento del nivel depurador del fango y de la calidad del efluente. En un fango activo en el que se aprecia un cambio en los grupos colonizadores en un período muy corto de tiempo o una disminución brusca en la concentración de protozoos indica probablemente la presencia de algún toxico que actúa de forma directa o que provoca una disminución del oxígeno disuelto disponible.



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Es por ello necesario seguir una serie de pasos para obtener una evaluación del estado del fango activo y del sistema depurador por medio de la identificación y cuantificación de la microfauna presente y conocer si dicho estado se mantendrá en un futuro inmediato o será necesario realizar cambios operacionales que contribuyan devolver el equilibrio al sistema.

La metodología a seguir para la evaluación de la microfauna presente en un fango activo exige una serie de pautas, un grado de preparación y conocimiento de la fauna y una visión general de todo el proceso de fangos activos para eviten conclusiones precipitadas y erróneas.

1) Identificar y cuantificar los protozoos y metazoos presentes en el fango activo para determinar que especie o grupo es el mayoritario.

2) Valorar la diversidad de la microfauna mediante el Índice Biótico del fango (SBI) establecido por Madoni (1994) para conocer cuál es el estado del sistema depurador.

3) Evaluar la biodiversidad del sistema acuático mediante el Índice de Shannon que está apoyado en la Teoría de los sistemas ecológicos de Margalef (1992) para determinar la robustez del sistema ante los cambios medioambientales.



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Dentro de los fangos activos se pueden observar unos grupos básicos que desempeñan una función determinada dentro del sistema y su aparición y abundancia reflejan las distintas condiciones físico-químicas existentes dentro del reactor biológico.

Para determinar el estado del sistema depurador no es necesario realizar identificaciones hasta nivel de especie. Simplemente es más que suficiente en muchos casos reconocerlos hasta grupos. Esto supone que tengamos una visión general del estado del sistema de una forma rápida.

Los principales grupos que nos podemos encontrar son: Flagelados, Amebas, Ciliados y Metazoos.

Los flagelados podemos dividirlos en dos grupos en función de su tamaño: • Pequeños flagelados : flagelados con un

tamaño inferior a 20 µm. • Grandes flagelados : flagelados con un

tamaño igual o superior a 20 µm.



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Los rizópodos o amebas de interés en los fangos activos se clasifican en dos grupos: • Amebas desnudas : presentan un cuerpo

muy versátil sin envoltura consistente • Amebas con teca o Tecameboides :

presentan una envoltura rígida de quitina. Los pseudópodos se emiten desde una zona abierta en la teca.

En el grupo de los ciliados podemos diferenciar tres subgrupos en función de su ubicación en el flóculo:

• Nadadores : se localizan libres entre los espacios interfloculares.

• Reptantes : se desplazan reptando sobre la superficie del flóculo.

• Sésiles : se localizan en la superficie del flóculo y se encuentran anclados a él.

Los grupos de metazoos que se pueden encontrar en los fangos activos son:

• Rotíferos • Nematodos • Gastrotricos • Oligoquetos • Artrópodos • Tardígrados



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La determinación de protozoos se realiza mediante la observación con el microscopio de sus estructuras, formas y tamaños, y mediante su localización dentro del fango activo.

Si la determinación resultase complicada existen determinadas tinciones que nos permiten observar una o varias características de la estructura de los microorganismos para poder diferenciar entre las especies.

Entre las principales técnicas o tinciones que se emplean para la determinación de los protozoos destacan:

Tinción de Noland : permite observar si existen flagelos.



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Tinción con Rosa de Bengala : permite comprobar qué amebas testáceas tienen actividad y por tanto saber si están vivas.

Tinción con verde metilo : se trata de una tinción diferencial de los núcleos de los protozoos.

Tinción de Fernández-Galiano : permite observar el patrón de ciliación.

Inmovilización tóxica : no es una tinción propiamente dicha. Se trata de una técnica que permite reducir la movilidad de los organismos para favorecer su observación.

Fijación con líquido de Boüin: permite la conservación de las estructuras de los protozoos cuando se prevé que el análisis se retrasará un cierto tiempo.



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Estos pequeños protozoos flagelados, debido a su tamaño (5-20 µm), son difíciles de detectar siendo muy útil en este caso la observación por contaste de fases.

Normalmente aparecen en las puestas en marcha de los reactores, en las fases iniciales de colonización de un fango activo.

Sin embargo, si aparecen en fangos con una determinada madurez indicarán que existe un empeoramiento del sistema depurador debido a entrada de cargas elevadas o al aporte de sustancias fermentadas.

Entre los principales pequeños flagelados que podemos encontrar destacan los bodónidos (Bodo sp.) y los coanoflagelados.

La evaluación de pequeños flagelados se realiza independientemente de la evaluación de otros protozoos. Todos ellos serán considerados en un mismo grupo, como pequeños flagelados, aunque podremos resaltar en el informe la presencia diferenciada de ellos.



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Lo importante es conocer si existen o no pequeños flagelados, en qué cantidad se encuentran y en qué momento han aparecido ya que nos aportará información sobre la calidad y el estado del sistema depurador.

Se consideran grandes flagelados aquellos que tienen un tamaño superior a 20 µm. Generalmente son alargados u ovalados y son muy activos respecto a su movilidad ya que poseen uno o varios flagelos.

Su presencia indica generalmente elevados niveles de DBO5 soluble por lo que aparecen cuando el sistema depurador funciona deficientemente y no suelen aparecer cuando el sistema depurador funciona correctamente.

Los principales flagelados que podemos encontrar son: Peranema sp., Euglena sp. y Entosiphon sp.

Los rizopoides o amebas presentan diferentes formas y tamaños (10-200 µm) y se caracterizan porque se desplazan mediante pseudópodos.



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Se pueden dividir en dos grupos en función de si poseen o no un caparazón o teca: amebas desnudas y amebas con teca.

Las amebas desnudas suelen estar relacionadas con elevadas cargas de entrada y vertidos difícilmente degradables. Son indicativas de bajos rendimientos en depuración y efluente turbios.

Las amebas con teca o tecameboides suelen aparecer en reactores con buena nitrificación y baja carga orgánica por lo que son indicativas de reactores con buena calidad de depuración y efluentes con baja o muy baja turbidez. La concentración de tecameboides aumenta con la temperatura y con IVF bajos. Los tecameboides que presentan actividad son aquellos que poseen transparencia en sus tecas aunque casi siempre las testas aglutinadas son oscuras debido a la utilización de material extracelular. La actividad de los tecameboides se comprueba mediante la tinción con Rosa de Bengala.

Los principales tecameboides que nos podemos encontrar son: Arcella sp., Pyxidicula sp., Centropyxis sp. y Euglipha sp.



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Los protozoos ciliados son los principales responsables de la clarificación del efluente en el proceso de depuración mediante fangos activos debido a que tienen una directa participación en los procesos de floculación y depredación.

Se caracterizan por poseer cilios que les permiten desplazarse y alimentarse y en función de su ubicación los podemos agrupar en espirotricos (los cilios están en la zona adoral), holotricos (distribuidos uniformemente) y peritricos (los cilios rodean una zona).

Los ciliados presentes en el licor mezcla pueden clasificarse en dos grandes categorías en función de su asociación con el flóculo y nos servirá para asociarlos a unas determinadas características del sistema depurador: • Ciliados no asociados al flóculo :

nadadores. • Ciliados asociados al flóculo : reptantes y

sésiles.

Los ciliados nadadores se caracterizan porque se desplazan entre los flóculos mediante los cilios. Poseen diferentes formas y un tamaño comprendido entre 20 y 400 µm. Su presencia se asocia a procesos de formación de los flóculos debido a la existencia de bacterias libres y materia orgánica o a procesos de degradación y desestabilización por exceso de carga o falta de oxígeno si aparecen en fangos bien formados.



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De entre los principales ciliados nadadores que podemos encontrar destacan: Prorodon teres, Paramecium sp. Uronema sp., Litonotus sp., Coleps hirtus, Tetrahymena sp., Colpidium sp. y Glaucoma sp.

Los ciliados reptantes poseen estructuras de movimiento que les permiten moverse en el entorno del flóculo donde se alimentan de bacterias. Son abundantes cuando el tratamiento funciona correctamente.

De entre los ciliados reptantes que podemos encontrar en los fangos activos destacan: Aspidisca sp., Euplotes sp., Chilodonella sp. y Acineria uncinata.

Los ciliados sésiles están anclados al fango mediante un pedúnculo que puede ser fijo o contráctil. Pueden aparecer de forma individual o formando colonias. Generalmente están asociados a un tratamiento depurador correcto aunque determinadas especies aparecen en situaciones de bajos rendimientos.

De entre los ciliados sésiles que podemos encontrar destacamos: Vorticella convallaria, Vorticella microstoma, Epistilys sp., Campanella umbellaria, Carchesium sp., Zoothamnium sp., y Opercularia sp.

Dentro del grupo de ciliados sésiles existe un grupo característico denominado suctores que poseen tentáculos que les permite alimentarse por aspiración del citoplasma de otros ciliados.



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Entre los suctores que podemos encontrar destacan: Podophrya sp., Tokophrya sp. y Acineta sp.

Los metazoos tienen una estructura más compleja y se encuentran en menor cantidad que los protozoos. Son característicos de sistemas estabilizados y con elevada edad del fango. Los principales metazoos que podemos encontrar son los rotíferos y los nematodos .

Los principales metazoos que podemos encontrar son los rotíferos y los nematodos . Dentro de los rotíferos destacan:

Rotíferos : Tienen diferentes formas y tamaños y la mayoría son móviles. Contribuyen a la clarificación de efluente ya que metabolizan partículas sólidas y se alimentan de protozoos y bacterias. Las principales especies que podemos encontrar son: Rotaria sp., Phillodina sp. y Lecane sp.

Nematodos : Se les denomina comúnmente gusanos redondos y son predadores de bacterias dispersas, protozoos y en ocasiones de materia orgánica. Generalmente aparecen en reactores con tiempos de retención altos y son muy frecuentes en filtros percoladores.



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Debido a su pequeño tamaño y relativamente alta densidad el recuento de estos pequeños protozoos requiere una técnica apropiada. El recuento se realiza mediante una cámara de Fusch-Rosenthal.

Las dimensiones de esta cámara son 4 mm x 4 mm x 0,2 mm. Está dividida en 16 cuadrados grandes de 1 mm de lado y subdividida en 256 cuadrados, cada uno de ellos con un tamaño de 0,25 mm de lado.

Los pasos a seguir para la determinación de pequeños flagelados son: 1) Se deposita fango activo bien

homogeneizado en la cámara de recuento. 2) El recuento se realiza por triplicado y a 200

aumentos como mínimo. 3) Se cuentan los pequeños flagelados que se

encuentren dentro de los 16 cuadrados que forman la diagonal completa.

4) Se halla el valor medio del recuento y se calcula la densidad total aproximada de pequeños flagelados.



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Es importante realizar un seguimiento periódico a la concentración de pequeños flagelados porque un aumento significativo indicaría un deterioro del sistema y de su eficiencia depuradora.

En función del número de pequeños flagelados se establecen tres densidades: 1) < 10 individuos : La densidad de pequeños

flagelados es < 50.000 individuos/ml. 2) Entre 10 y 100 individuos : La densidad de

pequeños flagelados se encuentra entre 50.000 y 5·108 individuos/ml.

3) 100 individuos : La densidad de pequeños flagelados será como mínimo de 5·108 individuos/ml.

Veamos un ejemplo de cuantificación de pequeños flagelados.

La diversidad de la microfauna se entiende como el número de unidades taxonómicas diferentes identificadas de los microorganismos considerados para el estudio del Índice Biótico del Fango (SBI) o Índice de Madoni .



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De todos los microorganismos que se localizan en el fango biológico solo se consideran para el estudio del SBI los siguientes: • Pequeños flagelados • Grandes flagelados • Tecameboides • Ciliados • Metazoos (Rotíferos y nematodos)

Los microorganismos que no se consideran para el cálculo del SBI son: • Amebas desnudas • Microorganismos de arrastre (algas, insectos,

crustáceos, etc.)

Deberemos tener en cuenta las siguientes reglas para el estudio del fango : 1) Todas las especies de protozoos ciliados y

tecamebas contribuyen a la determinación de la diversidad total de la microfauna.

2) Los flagelados y metazoos, debido a la complejidad en su identificación a nivel de especie, contribuyen cada uno a una sola unidad sistemática.

3) Las amebas testáceas solo deberán contabilizarse cuando estén vivas. En el caso de un fango con abundancia de amebas testáceas deberá realizarse la tinción con Rosa de Bengala.

4) Los ciliados carnívoros, ya sean nadadores o suctores, solo contribuyen a la densidad y diversidad total.

5) Hay que tener en cuenta en el recuento de organismos aquellos que se encuentran en el rebose del cubreobjetos.



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6) Las colonias muy numerosas de ciliados

peritricos falsean los resultados finales de los recuentos por lo que si aparecen se excluyen y se hace un recuento aparte de estos organismos coloniales por duplicado que se incluirá en el resultado final.

7) La lista de especies observadas debe realizarse con al menos dos organismos observados de la misma especie.

El procedimiento a seguir para la determinación del número de unidades taxonómicas es: 1) Realizar un visu preliminar para una

valoración cualitativa. 2) Depositar en un portaobjetos una cantidad

conocida de muestra, generalmente 25 µl.

3) Cubrir con un cubreobjetos preferiblemente de 18x18 mm para prevenir la evaporación rápida de la muestra.

4) Proceder al recuento de especies existentes teniendo en cuenta las reglas establecidas.

5) Realizar este recuento por duplicado.

Veamos un ejemplo de determinación del número de unidades taxonómicas.

La densidad total de la microbiota y en particular de las especies predominantes es primordial para el cálculo del SBI ya que en función de su valor.



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Aquellas especies cuya densidad sea superior a 106 individuos/l van a tener especial importancia ya que serán las que nos indiquen el estado del sistema y de la calidad del efluente.

Una vez realizado el recuento de microorganismos que se van a considerar en el SBI deberemos calcular: 1) Densidad de cada especie en individuos/ml. 2) Densidad de cada grupo (ind./ml) y el

porcentaje de abundancia. 3) Densidad total de cada gran grupo. 4) Densidad total de la microbiota.

Para determinar la densidad de cada especie calcularemos la media del recuento realizado por duplicado. El valor de la densidad total de la microbiota (ind./l) será la suma de las densidades de cada especie.

Veamos un ejemplo de determinación de la densidad total de la microbiota.

Para la determinación del Índice Biótico del Fango (SBI) es necesario determinar cuál es el grupo funcional dominante.



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Madoni establece 6 grupos funcionales que están asociados a unas determinadas características del entorno depurador.

1) Ciliados reptantes + sésiles (Opercularia spp y V. microstoma no abundantes) y/o tecamebas

2) Ciliados sésiles>80% (Opercullaria spp y V. microstoma no abundantes)

3) Opercularia spp. 4) Vorticella microstoma 5) Bacteriófagos ciliados nadadores 6) Pequeños flagelados nadadores (>100)

(Cámara Fuchs-Rosenthal)

Agrupamos las especies encontradas en función de los grupos establecidos por Madoni y hallamos las densidades de cada grupo. Aquel que tenga la mayor densidad será el grupo funcional dominante.

Veamos un ejemplo de determinación del grupo funcional dominante.



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El Índice Biótico del Fango o Sludge Biotic Index (SBI) es un índice numérico, con valores enteros comprendidos entre 0 y 10, que resulta del estudio de la estructuración que presenta la microfauna existente del fango activo.

Este método fue desarrollado por Madoni en 1994 para aplicarlo en todo tipo de plantas depuradoras de fangos activos para el conocimiento del estado del sistema depurador y poder aplicar las acciones convenientes para el control del tratamiento biológico.

El SBI permite obtener una excelente estimación de la calidad de un fango activo y conocer su nivel de actividad biológica, que nos reflejará su eficiencia en el proceso depuración biológica.



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Este método tiene en cuenta: 1) La diversidad de la población de protozoos

ciliados como principales especies en el tratamiento de fangos activos.

2) La abundancia de diversas especies y grupos de organismos relacionados con diversas condiciones ambientales.

3) La abundancia de pequeños flagelados.

Sin embargo, debido a sus características, con este método no podremos: 1) Obtener información directa sobre la

decantación y compactación del fango como partes implicadas en el proceso de clarificación del licor mezcla.

2) Conocer el desarrollo de las bacterias filamentosas.

3) Conocer la evolución en el proceso de formación de flóculos.

Para el cálculo del SBI hay que considerar una serie de reglas: 1) Los ciliados carnívoros solo contribuyen a la

densidad y diversidad total de la microfauna pero no al SBI. Por tanto, los ciliados nadadores predadores y los suctores deben ser excluidos para el cálculo.

2) Si existe una presencia masiva de grandes

flagelados o de rotíferos y nematodos no se puede aplicar el SBI, solo se calcula la densidad.

3) Las larvas telotrocas no se tienen en cuenta para el cálculo del SBI pero sí se puede reflejar su abundancia en el informe.

4) Vorticella microstoma y Vorticella infusionum están incluidas en el mismo grupo para el SBI, no así para el cálculo del Índice de Shannon.



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El valor del SBI es obtenido mediante una tabla de doble entrada horizontal y vertical elaborada a partir de los coeficientes de correlación hallados entre las distintas poblaciones de protozoos y algunos de los más importantes parámetros operacionales.

Veamos un ejemplo del cálculo del SBI.

En función del valor del Índice Biótico del Fango (SBI) se han establecido cuatro clases de calidad del fango activo.

Estas clases nos permiten situar a nuestro fango y diagnosticar cuál es su estado y su funcionamiento en líneas generales.

Clase I: Fango estable y muy bien colonizado con excelente actividad biológica y muy buen funcionamiento depurador. Esta clase corresponde a un valor de SBI comprendido entre 8 y 10.



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Clase II: Fango estable y bien colonizado con actividad biológica en descenso y buen funcionamiento depurador. Esta clase corresponde a un valor de SBI de 6 ó 7.

Clase III: Depuración biológica insuficiente en la balsa de aireación con un funcionamiento depurador mediocre. Esta clase corresponde a un valor de SBI de 4 ó 5.

Clase IV: Depuración biológica escasa en la balsa de aireación con un bajo rendimiento depurador. Esta clase corresponde a un valor de SBI comprendido entre 0 y 3.

Veamos un ejemplo para la determinación de la clase de calidad de un fango.

Suponiendo que en un ecosistema existe un número finito de especies y un número finito de individuos, la complejidad de ese ecosistema depende del número de relaciones tróficas establecidas en él.



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Para poder conocer la estabilidad y resistencia de un sistema a los cambios ambientales deberemos estudiar su biodiversidad. De esta forma podremos definir el grado de complejidad de ese sistema.

De entre todos los índices de biodiversidad existentes el de Shannon-Weaver (H) es el que mejor indica las interacciones del ecosistema y en aquellas situaciones anómalas en las que no se puede aplicar el SBI es el que mejor aporta una información de control.

Debido a que en las depuradoras existe una contaminación forzada es necesario estudiar comparativamente los índices de Madoni y Shannon para obtener información complementaria coherente sobre el estado del sistema.

El Índice de Biodiversidad de Shannon-Weaver (H) se basa en la Teoría de la Información y por tanto en la probabilidad de encontrar un determinado individuo en un ecosistema.

Se expresa como: H = - Σ (Pi·(log 2 Pi))

donde, pi = nº de organismos de la especie ni = número de individuos en el sistema de la especie determinada i N = número total de individuos



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La incertidumbre aumenta con la riqueza del ecosistema, es decir el número de especies y disminuye cuando la mayoría de los individuos pertenecen a una misma especie. Por tanto, a mayor complejidad mayor será el valor del índice.

Normalmente, en sistemas naturales el valor máximo obtenido es 5 bits/individuo aunque puede haber ecosistemas excepcionalmente ricos que pueden superar este valor. Es el índice de diversidad más empleado en sistemas acuáticos.

En función del valor de H podemos determinar la biodiversidad del ecosistema de fangos activos:

• H<1: Biodiversidad baja • 1≤H≤2: Biodiversidad media • H>2: Biodiversidad alta

Según unos estudios realizados por Salvadó y Gracia (1993) el valor del Índice de Shannon disminuye a medida que aumenta el valor de la carga másica.

Veamos un ejemplo de determinación del Índice de Shannon-Weaver.

FIN DE LA UNIDAD

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