CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS … · por esos momentos de alegría que pasamos. A todos...

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PL ANTAS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

Identificación y cuantificación de metabolitos secundarios

en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) transformadas con sistemina

y prosistemina de jitomate en respuesta a daño mecánico, herbivoría con

Manduca sexta e infestación con mosquita blanca (Bemisia tabaci).

T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS

CON ESPECIALIDAD EN:

BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

PRESENTA:

I.B. Flor Citlally Alcántar Aguirre

DIRECTOR DE TESIS:

DR. JOHN PAUL DÉLANO FRIER

IRAPUATO, GUANAJUATO DICIEMBRE DE 2005

DEDICATORIAS

A mi nana Lolita: por recordarme su gran fortaleza de lucha y amor a la vida, por tus

cuidados, atención, amor tierno y sonrisa que me regalabas en cada regreso.

A ti madre: por darme lo mejor de ti, por otorgarme tu apoyo y confianza, por estar

siempre conmigo.

A mis hermanos, David, América Anahí y Daryl Ivan: por sus grandes cualidades y

enseñanzas.

A mis pequeños sobrinos, Sebastián y Carlos: por mantener con gran alegría la

casa de la abuela.

A Humberto Valenzuela Soto, por su apoyo incondicional en todo momento.

A mis queridas tías y primas, que me han alentado en este camino.

A mis amigas de la infancia: por encontrarnos siempre con gusto y cariño a pesar

de la distancia.

AGRADECIMIENTOS

A Dios: por permitirme alcanzar este anhelo, por ser el único y verdadero camino de

vida.

A mi asesor, Dr. John Paúl Délano Frier: por su aceptación en su laboratorio,

paciencia, constante dedicación y consejos otorgados durante mi estancia; gracias.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT): por el apoyo económico

otorgado a través de la beca con número de registro 174677.

A los doctores Jorge Molina Torres y Neftalí Ochoa Alejo: por formar parte del

comité evaluador, como por su crítica constructiva y sugerencias que aportaron al

presente trabajo de tesis.

A la Q.F.B. Norma Martínez Gallardo: por su experiencia e invaluable apoyo para

concluir este trabajo; mil gracias.

Al Q.F.B. Enrique Ramírez Chávez: por sus consejos y aporte metodológico en la

identificación de metabolitos secundarios.

A la Dra. Ma. Del Carmen Rocha Granados: por su buena disponibilidad en el

trayecto de este trabajo.

A la Q. Yolanda Rodríguez Aza y María Isabel Cristina Elizarraraz Anaya: por su

atención y tiempo recibido.

Al I.A. Javier Luevano Borroel: por su buena disponibilidad y consejos en el manejo

de M. sexta.

A mis amigos y compañeros de laboratorio: Carla, Humberto, Gloria, Hamlet y

Miriam, por su gran solidaridad, apoyo y palabras alentadoras en tiempos difíciles;

por esos momentos de alegría que pasamos.

A todos mis compañeros de generación: Victor, Pedro, Frank, Marco, Alfredo,

Javier, Gloria, Amparo y Cecilia.

A Nancy Barojas Pérez: por la amistad que se formó entre nosotras, por

escucharme y aconsejarme después de un mal momento.

A mi amigo Carlos Montoya: por compartirme su experiencia y apoyo en momentos

difíciles.

El presente trabajo de tesis fue realizado en el

Laboratorio de Fisiología de la Defensa, del

Departamento de Biotecnología y Bioquímica

de Plantas del CINVESTAV- IPN, Unidad de

Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas,

bajo la asesoría del Doctor John Paúl Délano Frier.

ÍNDICE GENERAL

Pág.

ABREVIATURAS i

ÍNDICE DE FIGURAS iii

RESUMEN X

1. INTRODUCCIÓN 1

2. ANTECEDENTES 4

2.1. Mecanismos de defensa 4

2.1.1. Tipos de respuestas de defensa en planta 5

2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta específica, gen por gen. 6

2.1.1.2. Respuesta local 8

2.1.1.3. Respuesta sistémica 9

2.2. Mecanismos de defensa en tabaco 10

2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas 13

2.3.1. Inhibidores de proteasas 13

2.3.2. Polifenol oxidasas 14

2.3.3. Oligosacáridos 15

2.4. Sistemina 16

2.4.1. Actividad y translocación de sistemina 17

2.4.2. Modelo de la ruta de señalización activada por sistemina 20

2.4.3.Glicopéptidos ricos en hidroxiprolina (“sisteminas”) de tabaco

(TobHypSys)

22

2.5. Prosistemina 25

2.5.1. Expresión y supresión de la actividad de la prosistemina 26

2.5.2. Homología de la prosistemina de jitomate en plantas solanáceas 28

2.6. Metabolitos secundarios en tabaco 30

2.6.1. Alcaloides (nicotina, nornicotina) 31

2.6.2. Compuestos fenólicos 33

2.6.3. Terpenos 34

2.7. Modelo de estudio 37

2.7.1. Plantas de tabaco transformadas con prosistemina y sistemina

de jitomate Nt -LePS 08, Nt -LeSYS 03 y la cruza WT X Nt -LeSYS 03

37

2.7.2. Alteraciones morfológicas y fisiológicas en la línea Nt -LeSYS

03

39

2.7.3. Resistencia a herbivoría por larvas de Manduca sexta en plantas

Nt-LePS y Nt -LeSYS

43

3. HIPÓTESIS 46

4. OBJETIVOS 47

4.1. Objetivo general 47

4.2. Objetivos específicos 47

5. MATERIALES Y MÉTODOS 48

5.1. Cultivo de plantas 48

5.2. Cultivo in vitro de la línea Nt -LeSYS 03 48

5.3. Preparación de X-Gluc 49

5.4. Ensayos de daño mecánico 50

5.5. Bioensayos 51

5.5.1. Condiciones del experimento de herbivoría con Manduca sexta 51

5.5.2. Infestación con mosquita blanca (Bemisia tabaci) 52

5.6. Preparación de extractos 52

5.7. Análisis de fenoles totales 53

5.8. Condiciones para cuantificar e identificar metabolitos secundarios por

GC/MS

53

5.8.1. Derivatización 53

5.8.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

(GC/MS)

54

5.9. Curvas de calibración 54

5.10. Análisis estadístico 55

6. RESULTADOS 56

6.1. Identificación de metabolitos secundarios de interés por GC/MS, en

plantas jóvenes y adultas.

56

6.2. Cuantificación de nicotina en plantas jóvenes y/o adultas 67

6.2.1. Tratamiento: daño mecánico 67

6.2.2. Tratamiento: herbivoría por larvas de M. sexta (plantas adultas) 68

6.2.3. Tratamiento: infestación por mosquita blanca (plantas adultas) 70

6.3. Cuantificación de ácido clorogénico en plantas jóvenes y/o adultas 72




6.4. Cuantificación de dihidrocapsenona en plantas jóvenes y/o adultas 80




6.5. Cuantificación de ácido nornicotina en plantas jóvenes y/o adultas 88


6.6. Cuantificación de fenoles totales en plantas jóvenes y/o adultas 92




7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 98

8. CONCLUSIONES 113

9. PERSPECTIVAS 114

10. BIBLIOGRAFÍA 116

11. APÉNDICE 132

ABREVIATURAS

aa Aminoácidos

ABA Ácido abscísico

ACG Ácido clorogénico

AJ Ácido jasmónico

AMPC Adenosina Monofosfato Cíclica

AOC Ciclasa de óxido de aleno

AS Ácido salicílico

Avr Gen de Avirulencia

C-F Consumidor - Fuente

cm Centímetro

FAL Fenilalanina amonio liasa

EAS 5-epi-aristoloqueno sintasa

Et Etileno

g Gramo

GC/MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de

masas

GRHP Glicoproteínas ricas en hidroxiprolina

GTP Guanidina trifosfato

FPP Farnesil bifosfato

HDJ Hoja distal joven (apical)

HDV Hoja distal vieja (basal)

HL Hoja local (dañada)

h Hora

HS Hoja sistémica

IP Inhibidor de proteasa

JA Jasmonato

L Litro

LOX Lipooxigenasa i

MB Mosquita blanca

MeJA Éster metílico del ácido jasmónico

mg Miligramo

ml Mililitro

ng Nanogramo

NN Nornicotina

OGA Oligosacáridos

PF Peso fresco

PFO Polifenol oxidasa

PG Poligalacturonasa

Pin II Inhibidor de proteasa II

R Gen de Resistencia

RH Respuesta hipersensible

RP Relacionadas a patogénesis

rpm Revoluciones por minuto

RSA Resistencia sistémica adquirida

RSI Resistencia sistémica inducida

µg Microgramo

µl Microlitro

ii

LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Reconocimiento del ataque de M. sexta por N. attenuata;

incremento de los niveles de AJ y etileno (Et), e inducción de defensas

directas e indirectas (modificado de Baldwin et al., 2003).

12

Figura 2. Estructura primaria de la sistemina de jitomate.

17

Figura 3. Efecto de la sustitución de cada uno de los 18 aminoácidos de

la sistemina de jitomate, por alanina, sobre la inducción de la síntesis de

inhibidores de proteasa tipo I en hojas de jitomate.

18

Figura 4. Modelo hipotético de la ruta de transducción de señales en

células de jitomate activada por sistemina.

21

Figura 5 . Estructura primaria de la sistemina de jitomate y de los

glicopéptidos ricos en hidroxiprolina presentes en jitomate (TomSys y

TomHypSys I, II y III) y tabaco (TobHypSys I y II), respectivamente.

23

Figura 6 . Actividad de TobHypSys I y TobHypSys II sintéticas, carentes

de modificaciones con cadenas de oligosacáridos y con sustituciones de

alanina en cada uno de sus aminoácidos.

25

Figura 7. Niveles de inhibidores de proteasas I y II en plantas de jitomate

sin transformar (1) y transformadas (2) con el transgen de la prosistemina

en orientación “sentido”.

27

Figura 8. A) Acumulación de inhibidores de proteasas en hojas de

jitomate tratadas con distintas concentraciones de prosisteminas

recombinantes. B) supresión de inhibidores de proteasas en hojas de

29

iii

jitomate tratadas con distintas concentraciones de prosisteminas

recombinantes (Dombrowski et al., 1999).

Figura 9. Estructura de la nicotina y nornicotina.

32

Figura 10. Estructuras de compuestos fenólicos involucrados en defensa.

34

Figura 11. Estuctura del capsidiol y su producto de degradación,

dihidrocapsenona, y otros terpenos involucrados en defensa.

36

Figura 12. Niveles de inhibidores de tripsina (IT), PFO y

poligalacturonasas (PG), inducibles por daño en hoja local (HL) y hoja

sistemica (HS) en hojas de tabaco silvestres (Wt), y en plantas

transformadas con LePS y LeSYS.

38

Figura 13 . I. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con

sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).

40

Figura 14 . II. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con

sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).

41

Figura 15. III. I. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas

con sistemina de jitomate (Nt-LeSYS).

42

Figura 16. Larvas de Manduca sexta antes y 6 días después de haber

sido alimentadas con plantas de tabaco sin transformar y con plantas Nt-

LePS y Nt-LeSYS.

44

Figura 17 . Análisis del crecimiento de larvas de M. sexta alimentadas con

plantas sin transformar y plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS.

44

iv

Figura 18. Vista general de la magnitud del daño causado por larvas de

M. sexta en plantas de tabaco sin transformar (control) y transformadas

(Nt-LePS y Nt-LeSYS).

45

Figura 19. Cromatograma típico obtenido al separar extractos

metanólicos derivatizados de hoja de Nicotiana tabacum por GC/MS. La

nicotina emergió después de 15.83 min (*); timol después de 15.71 min

(*); nornicotina después de 20.05 min (*); el posible producto de

degradación del capsidiol (capsenona) después de 32.78 min (*), y el

ácido clorogénico después de 48.83 min (*).

57

Figura 20. a) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de nicotina,

con un tiempo de retención de 15.80 min (*), y b) su correspondiente

espectro de masas.

58

Figura 21. a) Cromatograma típico de GC/MS de un extracto de hojas de

Nicotiana tabacum, identificando a nicotina con un tiempo de retención de

15.83 min (*), y b) su correspondiente espectro de masas.

59

Figura 22. a) Cromatograma de GC/MS del estándar puro del ácido

clorogénico, con un tiempo de retención de 48.90 min (*), y b) su

espectro de masas.

60


Nicotiana tabacum, identificando al ácido clorogénico con un tiempo de

retención de 48.83 min (*), y b) su correspondiente espectro de masas.

61

Figura 24. a) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de capsidiol

[32.35 min (*)] derivatizado y un producto de degradación estable

posiblemente dihidrocapsenona, con un tiempo de retención de 32.18

min (*), y b) el espectro de masas correspondiente al pico surgido a los

62

v

32.18 min.

Figura 25. a) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de capsidiol

[32.35 min (*)] derivatizado y un producto de degradación estable

posiblemente dihidrocapsenona, con un tiempo de retención de de 32.18

min (*), y b) el espectro de masas correspondiente al pico surgido a los

32.35 min.

63


Nicotiana tabacum, identificando a un posible producto de degradación

del capsidiol con un tiempo de retención de 32.78 (*), y b) su

correspondiente espectro de masas.

64

Figura 27. a) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de nornicotina

derivatizado, con un tiempo de retención de 20.54 min (*), y b) su


65

Figura 28. a) Cromatograma típico de GC/MS de un extracto metanólico

derivatizado de hojas de Nicotiana tabacum, identificando a la nornicotina

con un tiempo de retención de 20.57 min (*), y b) su correspondiente

espectro de masas.

66

Figura 29. Niveles de nicotina en plantas (jóvenes y adultas) WT y

transgénicas intactas (0 h) y cinco días después de haber sido sometidas

a daño mecánico (5 día). Los asteriscos indican la diferencia

estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).

69

Figura 30. Comparación entre los niveles de nicotina en plantas WT y

transgénicas adultas, 5 días después de haber sido expuestas a

herbivoría por larvas de M. sexta durante 24 h. Los asteriscos indican la

diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).

71

vi

Figura 31 . Comparación entre los niveles de nicotina en plantas WT y

transgénicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia

tabaci (28 días después de la oviposición). Los asteriscos indican la


73

Figura 32. Niveles de ácido clorogénico en plantas (jóvenes y adultas)

WT y transgénicas intactas (0 h) y cinco días después de haber sido

sometidas a daño mecánico (5 día). Los asteriscos indican la diferencia


77

Figura 33. Comparación entre los niveles de ácido clorogénico en plantas

WT y transgénicas adultas, 5 días después de haber sido expuestas a

herbivoría por larvas de M. sexta durante 24 h. Los asteriscos indican la


79

Figura 34. Comparación entre los niveles de ácido clorogénico en plantas

WT y transgénicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de

Bemisia tabaci (28 días después de la oviposición). Los asteriscos indican

la diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).

81

Figura 35. Niveles de capsidiol (cuantificado indirectamente en forma de

un posible producto de degradación) en plantas (jóvenes y adultas) WT y

transgénicas intactas (0 día) y cinco días después de haber sido

sometidas a daño mecánico (5 día). Los asteriscos indican la diferencia


84

Figura 36. Comparación entre los niveles de capsidiol (cuantificado

indirectamente en forma de un posible producto de degradación), en

plantas WT y transgénicas adultas, 5 días después de haber sido

expuestas a herbivoría por larvas de M. sexta durante 24 h. Los

86

vii

asteriscos indican la diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P

≤ 0.01 **).

Figura 37. Comparación entre los niveles de capsidiol (cuantificado

indirectamente en forma de un posible producto de degradación) en

plantas WT y transgénicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida

de Bemisia tabaci (28 días después de la oviposición). Los asteriscos

indican la diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).

Figura 38 . Niveles de nornicotina en plantas (jóvenes y adultas) WT y




89

91

Figura 39. Fenoles solubles totales en plantas (jóvenes y adultas) WT y




94

Figura 40. Comparación entre los niveles de fenoles totales solubles en

plantas WT y transgénicas adultas, 5 días después de haber sido

expuestas a herbivoría por larvas de M. sexta durante 24 h. Los

asteriscos indican la diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P

≤ 0.01 **).

95

Figura 41. Comparación entre los niveles de fenoles solubles totales en

plantas WT y transgénicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida

de Bemisia tabaci (28 días después de la oviposición). Los asteriscos


97

Figura 42. Curva de calibración de nicotina. 132

viii

Figura 43. Curva de calibración de ác. clorogénico.

Figura 44. Curva de calibración de capsidiol.

Figura 45. Curva de calibración de nornicotina.

133

134

135

ix

RESUMEN

Las plantas de tabaco del género Nicotiana (Solanaceae) contienen diversos

metabolitos secundarios. Los grupos más importantes son los alcaloides, terpenos y

componentes fenólicos. Se sabe que la síntesis de novo de muchos de estos

compuestos se incrementa dramáticamente como respuesta al daño mecánico o

ataque por herbívoros y/o patógenos y que este cambio es inducido en muchos

casos por ácido jasmónico, el cual funciona como una señal mediadora de cambios

en el metabolismo secundario en respuesta a muchos tipos de agobio biótico y

abiótico (Gundlach et al., 1992; Hildman et al., 1992; Reinbothe et al., 1994).

Investigaciones previas demostraron que la transformación de plantas de tabaco (N.

tabacum) con prosistemina (LePS) y sistemina (LeSYS) de jitomate, resultaron ser

altamente resistentes a herbivoría por larvas de Manduca sexta. Se sugirió que la

sobreexpresión LePS y LeSYS induce cambios en las respuestas de defensa contra

estos insectos en tabaco, entre los cuales podría incluirse la acumulación de

metabolitos secundarios considerados como fitoalexinas o fitoanticipinas en esta

especie. Así mismo, una de las líneas analizadas, la Nt-LeSYS 03, presentó un

fenotipo anormal caracterizado por enanismo, floración temprana, presencia de

regiones necróticas similares a una reacción hipersensible en la superficie de la

hoja y una germinación muy lenta, lo cual también podría estar relacionado con

alteraciones en la síntesis de estos metabolitos, en particular compuestos

fenilpropanoides. Para explorar esta posibilidad, se analizaron los niveles

constitutivos e inducibles de metabolitos relacionados con defensa contra

herbívoros y/o patógenos (nicotina, nornicotina, ácido clorogénico, capsidiol y

fenoles solubles totales) en follaje y raíz. Al analizar y cuantificar los niveles de

estos metabolitos por distintos tratamientos (daño mecánico, herbivoría con

Manduca sexta e infestación con mosquita blanca), se detectaron variaciones de

acuerdo a la etapa de desarrollo de la planta, tipo de tratamiento y genotipo.

En el tratamiento con daño mecánico en plantas adultas, los niveles de nicotina y

capsidiol, medido como uno de sus productos de degradación más estables x

(posiblemente capsenona), fueron más altos en las plantas transformadas que las

plantas WT (con algunas excepciones en la línea Nt-LeSYS 03). También se

detectó un aumento significativo de ácido clorogénico (ACG) en todos los tejidos

analizados de las plantas WT. A su vez, la herbivoría por larvas de M. sexta redujo

significativamente, en ocasiones a niveles no detectables, los niveles de nicotina,

nornicotina y ACG. El efecto fue particularmente marcado en las plantas

transformadas con LePS y LeSYS. La nornicotina no se detectó en los diferentes

genotipos de plantas sometidos a herbivoría o infestación por B. tabaci, mientras

que el capsidiol aumentó considerablemente en plantas infestadas con mosquita

blanca principalmente en la línea transgénica Nt-LePS.

Estos resultados sugieren que, de algún modo no identificado aún, la expresión de

LePS o LeSYS modifica las rutas biosintéticas del metabolismo secundario en

plantas de N. tabacum.

xi

1

I. INTRODUCCIÓN

Las plantas están continuamente expuestas a diversos cambios

ambientales, incluyendo el ataque por numerosos insectos herbívoros. El daño

mecánico o por herbívoros y la invasión por patógenos activan sistemas de

defensa de la planta. Para que éstos se activen, las señales provocadas por

tales ataques son transmitidas desde el tejido dañado hacia el resto de la planta

(respuesta sistémica) o son diseminadas sólo localmente, induciendo cambios

en la vecindad del sitio dañado (respuesta local). Estas señales pueden

provocar reacciones de defensa y cambios específicos en la planta que

conduzcan hacia una mayor resistencia contra organismos invasores (Baldwin et

al., 1994, 1997; Walling, 2000).

Las solanáceas constituyen una familia de plantas en las cuales los

diversos mecanismos de defensa empleados contra insectos dañinos y

patógenos han sido estudiados con más detalle. Un ejemplo de ello son los

diversos metabolitos secundarios que se acumulan en diferentes especies de

esta familia, ya sea constitutivamente o en respuesta a un ataque. Entre los tipos

de metabolitos más importantes presentes se encuentran los alcaloides,

terpenos y compuestos fenólicos. Al parecer, la acumulación de estos

metabolitos se encuentra bajo control genético y es dependiente de las

condiciones ambientales (Tso, 1972). Los metabolitos secundarios con función

defensiva actúan de modos tan diversos como sus estructuras. Por ejemplo, la

nicotina y los alcaloides relacionados a esta pueden funcionar como toxinas

defensivas ya que interfieren con el funcionamiento de receptores de acetil colina

en el sistema nervioso de los herbívoros (Shoji et al., 2000; Liu et al., 2005),

mientras que el ácido clorogénico tiene un impacto sobre la calidad nutricia de

las proteínas vegetales ingeridas por insectos herbivoros debido a su capacidad

de reaccionar con aminoácidos alquilatables, como la cisteína, metionina,

histidina y lisina, una vez que ha sido oxidado a su forma quinoide por polifenol

oxidasas (PFO) (Felton et al., 1992; Duffey y Scout, 1996).

Se conoce que diferentes genotipos de tabaco (Nicotiana tabacum) y

especies silvestres de Nicotiana varían en su habilidad para acumular y

2

almacenar nicotina (Saunders y Bush, 1979; Sinclair et al., 2004). Además, se ha

demostrado que el ataque por insectos herbívoros en N. sylvestris y N. attenuata

incrementa dramáticamente la síntesis y acumulación de nicotina (Baldwin et al.,

1998,1999). Ahora se sabe que la acumulación de nicotina inducida por herida

es regulada por el ácido jasmónico (AJ), este último se produce inicialmente en

la hoja y posteriormente transportado hacia la raíz, que es el órgano dónde se

sintetiza la nicotina y de donde se distribuye al resto de la planta (Baldwin et al.,

1997; Zhang y Baldwin, 1997). En N. attenuata, el tratamiento con jasmonato

indujo la acumulación de nicotina en la planta, la cual se relacionó positivamente

con una resistencia durable hacia el herbívoro (Baldwin et al., 1998). Estos

resultados están de acuerdo con la multiplicidad de funciones que se le han

asignado al AJ, considerado como una hormona vegetal capaz de modular, entre

otras respuestas, el metabolismo secundario en respuesta a estrés biótico y

abiótico (Creelman et al., 1997). Esta capacidad fue ampliamente confirmada en

estudios en los cuales se reportó que la aplicación exógena de AJ indujo la

acumulación de una gran variedad de metabolitos secundarios en cultivos

celulares y en plantas de diversas especies, incluyendo alcaloides (Gundlanch

et al., 1992; Aerts et al., 1994) y compuestos fenólicos. (Lee et al., 1997).

Además de la nicotina y ACG, otros reportes han mostrado una estrecha

relación entre la síntesis y acumulación de los diterpenos glicosilados en tabaco,

como los 16-hidroxigeranil linalool A y B, y la resistencia contra Heliothis

virescens. En concordancia con su función defensiva, este metabolito solo ha

sido detectado en genotipos resistentes a este herbívoro (Snook et al., 1997).

En jitomate (Lycopersicon esculentum) se descubrió que la sistemina,

liberada a partir de la prosistemina, su proteína precursora, es un polipéptido

involucrado en la inducción sistémica de proteínas en respuesta al daño, las

cuales se sugiere que confirieren resistencia contra agresores bióticos. Al igual

que la respuesta al daño mecánico y a otros evocadores activos como

oligogalacturónidos derivados de la fragmentación de la pared celular, la actividad

biológica de la sistemina es dependiente de AJ. En un trabajo previo, del cual se

derivó la presente investigación, se generaron plantas transgénicas de tabaco

capaces de sobreexpresar constitutivamente tanto la prosistemina (LePS) como la

sistemina (LeSYS) de jitomate. Estas plantas mostraron diferentes grados de

resistencia a herbivoría por larvas de Manduca sexta, la cual curiosamente no se

3

correlacionó muy claramente con la acumulación de altos niveles de proteínas

defensivas, como polifenoloxidasas (PFO), inhibidores de tripsina (IT) y

quimotripsina (IQT), solo se detectaron niveles altos en una de las líneas

sobreexpresantes de LeSYS. Éstas últimas presentaron, además, un fenotipo

severamente anómalo, caracterizado por enanismo, morfología alterada de las

hojas y flores, floración precoz y esterilidad (Rocha-Granados, 2004). De manera

que en este trabajo se analizó la posibilidad, previamente demostrada en otras

especies de plantas, de que la resistencia diferencial contra larvas de insectos

herbívoros así como las alteraciones morfológicas y fisiológicas observadas en

una de las líneas de N. tabacum sobreexpresantes de LeSYS, pudieran haberse

debido a una modificación en la síntesis y acumulación de metabolitos

secundarios causada por la expresión de LePS y LeSYS. Para ello, se

compararon los patrones de acumulación de nicotina, ACG, nornicotina (NN),

dihidrocapsenona y compuestos fenólicos totales entre plantas no modificadas

(WT) y plantas transformadas en diferentes estadios de desarrollo y en respuesta

a daño mecánico o infestación por insectos. Los resultados obtenidos indican que

la expresión de LePS y LeSYS en N. tabacum modifica el patrón de acumulación

de metabolitos secundarios, lo que podría estar relacionado con la resistencia

diferencial observada contra larvas de insectos herbívoros, e inclusive, con el

fenotipo severo que caracteriza a una de las líneas sobreexpresantes de

sistemina (Nt-LeSYS 03).

4

2. ANTECEDENTES

2.1. Mecanismos de defensa

Las plantas, en su medio natural han desarrollado un gran número de

estrategias defensivas contra una gran variedad de organismos invasores y de

agentes abióticos causantes de una diversidad de agobios ambientales. Las

estrategias defensivas están basadas tanto en la erección de barreras físicas y

químicas preformadas, así como en la síntesis de metabolitos defensivos en

respuesta a estímulos asociados con el organismo invasor (Ebel y Cosio, 1994).

El primer grupo lo constituyen las defensas constitutivas, las cuales se

encuentran presentes durante todo el desarrollo de la planta. Éstas comprenden

barreras tanto de tipo físico como químico incluyendo espinas, tricomas, la

cutícula superficial de la hoja y ceras protectoras de diversos órganos, así como

metabolitos secundarios existentes en plantas sanas, conocidos como

fitoanticipinas. Entre éstos están las saponinas, los glicósidos cianogénicos,

cumarinas y los glucosinolatos, los cuales son tóxicos a atacantes no

especializados (Osbourn, 1996).

Se ha sugerido que los metabolitos secundarios, más que subproductos

metabólicos, tienen una función en la interacción de las plantas con su ambiente

y otros organismos para proveer una defensa contra la infección, depredación o

agobio ambiental (Rhodes, 1994). Cabe mencionar que las defensas químicas

se dividen en dos categorías: los metabolitos secundarios y proteínas (Roberts y

de Bruxelles, 2001).

Un segundo grupo lo comprenden las llamadas defensas inducibles; esto

significa que sólo se producirán como respuesta al reconocimiento del organismo

agresor. Este reconocimiento requiere la interacción entre evocadores o

inductores (compuestos liberados a partir de los organismos agresores o de las

propias plantas a causa del daño que éstos les provocan) y sus receptores

específicos en las plantas (Agrawal et al., 1999). Numerosas proteínas

relacionadas con defensa, cuya acumulación es regulada por AJ y que incluyen

5

enzimas involucradas en la síntesis de alcaloides, inhibidores de proteasas,

enzimas de carácter defensivo como la polifenol oxidasa (PFO) y péptidos

antimicrobianos como las defensinas y tioninas, pertenecen al grupo de defensas

inducibles.

Las respuestas defensivas inducibles pueden activarse de manera

localizada, en el área de daño, o bien tener efecto sistémico al activarse en la

planta completa. La eficiencia de los mecanismos defensivos depende

estrictamente de la velocidad de proliferación del agresor y del tiempo necesario

para el reconocimiento del mismo por el huésped y de la subsiguiente activación

de las defensas (Dong, 1998). Como ejemplo de las defensas inducibles se

encuentra la síntesis y acumulación de especies reactivas de oxígeno,

metabolitos secundarios como compuestos fenólicos, alcaloides, terpenos, etc.

(agrupados bajo el término fitoalexinas), enzimas hidrolíticas como quitinasas y

glucanasas, y la acumulación de proteínas relacionadas con patogénesis,

conocidas como proteínas RP (Osbourn., 1996; Agrawal et al., 1999; Richael y

Gilchrist., 1999).

Estos tipos de mecanismos de defensa se mencionarán más

ampliamente en los siguientes subíndices.

2.1.1. Tipos de respuestas de defensa en planta

Se han identificado diversas respuestas de defensa en varias especies de

plantas empleadas como modelo de estudio. Éstas pueden clasificarse en tres

clases: (1) innata, la cual está involucrada en el reconocimiento y/o generación

de señales internas de la planta, (2) local inducida, que tiene lugar en el sitio de

daño así como en la periferia de éste, teniendo efectos adversos directos sobre

el organismo agresor y (3) sistémica inducida, la cual abarca el tejido distante

y/o un órgano no afectado de la planta (Halbrock et al., 1995).

6

2.1.1.1. Respuesta innata y respuesta específica, gen por gen

La respuesta innata, también conocida como respuesta independiente del

huésped, confiere una protección robusta, principalmente contra patógenos. Esta

se puede expresar durante diferentes etapas del proceso invasivo del patógeno.

La primera línea de defensa la constituyen las barreras físicas preformadas (e.

g., tricomas y espinas) junto con características topograficas y químicas (e. g.,

ceras) de la superficie de los tejidos vegetales, particularmente de hojas. Si estas

barreras son superadas, las plantas activan una serie de cambios de índole

defensivo en respuesta a evocadores ampliamente reconocidos por ellas, los

cuales son liberados durante el proceso invasivo, como fragmentos de la pared

celular de plantas y hongos, y enzimas hidrolíticas (e. g., celulasas, proteasas,

pectinasas). Éstas también son capaces de identificar ciertos patrones

moleculares asociados exclusivamente con patógenos (PMAP), como

glicoproteínas y polipéptidos derivados de éstas (e. g., el péptido PEP-13 que se

genera a partir de una transglutaminasa de Phytophthora sojae), componentes

del flagelo y lipopolisacáridos de bacterias Gram negativas, peptidoglicanos y

ácido lipoteico de bacterias Gram positivas, fragmentos de ADN no metilados,

proteínas bacterianas (e. g., harpinas) y de oomicetos (e. g., elicitinas). Si todo

esto es superado por el invasor y como última opción, la planta activa un

mecanismo de resistencia mediado por la interacción entre los productos de los

genes de avirulencia (Avr) y de resistencia (R) de patógenos y plantas,

respectivamente. En insectos, plantas y vertebrados, la identificación de algunos

PMAP, como por ejemplo la flagelina, está mediada por cinasas similares a

receptores (“Toll-like”), caracterizadas por una estructura en la que abundan

secuencias repetidas ricas en leucina.

La resistencia innata involucra a todo un género o especie de plantas; es

compleja, ancestral, estable y heredable. Por el contrario, la resistencia

específica o del tipo gen por gen, está limitada a ciertos genotipos en una

especie normalmente susceptible, es parásito específica y conferida por un solo

gen R que reconoce a un único gen Avr y, por lo mismo, es menos duradera

(Gómez-Gómez y Boller, 2002; Thordal-Christensen, 2003; Parker, 2003).

Una vez que se establece la unión del evocador o PMAP al receptor, los

cambios más importantes a través de la membrana plasmática son la activación

7

del flujo de iones H+,

K+, Cl- y Ca2+ desde y hacia la célula y la formación de

H2O2 (estallido oxidativo) (Apostol et al., 1989; Nürberger et al., 1994; Roberts y

de Bruxelles, 2001). Después de 5 a 30 minutos, se inicia la fosforilación

dependiente de calcio de algunas proteínas, que inducen una síntesis rápida de

etileno y la activación transcripcional de muchos genes relacionados con la

defensa (Dietrich et al., 1990). De manera temporal, el estallido oxidativo y la

fosforilación/desfosforilación de proteínas, parecen estar controlados por la

activación de canales iónicos, pero su posible relación causal con otros

componentes de la cadena de transducción de señales que conducen a la

activación de respuestas, como por ejemplo proteínas que enlazan GTP, inositol,

AMPc, etc., aún se desconoce. Las células vegetales tienen la capacidad de

reconocer un patógeno potencial y de transmitir esta información dentro de la

célula y células vecinas, para mantener y optimizar las respuestas de defensa

(Basse et al., 1993; Nürberger et al., 1994). La interacción entre evocador-

receptor es el punto de partida para la traducción de señales que activa la

expresión de genes involucrados en la resistencia, ya sea del tipo “no especifico”

que como se indicó anteriormente se induce por diversos evocadores no

específicos reconocidos por numerosas especies, e inclusive géneros, de

plantas resistentes a toda una raza de patógenos, o los de tipo “especifico”,

donde el evocador es el producto de un gen de avirulencia (Avr) del patógeno, y

el receptor, el correspondiente producto del gen de resistencia R, en la planta

(Grant y Loake, 2000).

En la mayoría de los casos, la interacción entre los productos de los

genes R y Avr inicia cascadas de señalización que dan lugar a la reacción

hipersensible (RH) y resistencia sistémica adquirida (RSA). La RH consiste en

una necrosis rápida y localizada en el sitio de daño, actúa directamente contra el

patógeno, mediante la citotoxidad de las especies reactivas de oxígeno, como el

anión superóxido (O2-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2), que participan en el

estallido oxidativo (Apostol et al., 1989). Además, se caracteriza por la

acumulación de compuestos fenólicos alrededor de las células atacadas,

fragmentación del ADN, condensación citoplasmática y muerte celular

programada, procesos similares a la apoptosis que se observa en células

animales (Birch et al., 1999).

8

Junto con la RH, en la planta se pueden presentar diferentes cambios

estructurales, moleculares, bioquímicos y/o fisiológicos que ocurren poco tiempo

después del ataque patogénico y tienen lugar tanto en el sitio de daño como en

la periferia (respuestas locales) o, más tardíamente, en zonas distantes a éste

(respuestas sistémicas).

2.1.1.2. Respuesta local

La respuesta local consiste en una rápida acumulación de enzimas,

proteínas estructurales y/o metabolitos, como consecuencia de una activación

transcripcional que es mediada por el reconocimiento del patógeno. Esta

activación local de genes es restringida a una pequeña área definida alrededor

del sitio de ingreso del patógeno (Bowles, 1990; Geoffroy et al., 1990; Ryan y

Jagendorf, 1995).

Una respuesta típica en este sitio localizado es la síntesis de novo de

enzimas biosintéticas de compuestos tóxicos para el patógeno, tales como las

enzimas del metabolismo de los fenilpropanoides, como la fenilalanina amonio

liasa (FAL), la 4-cumarato: CoA ligasa (4CL) y otras enzimas involucradas en la

síntesis de fitoalexinas y otros metabolitos secundarios (Nicholson y

Hammerschmidt, 1992; Freytag, 1994).

Tambien mediante este mecanismo son sintetizadas otras proteínas,

como las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (GPRH), proteínas ricas en glicina

(PRG), proteínas relacionadas con la patogénesis (RP), intra y extracelulares,

así como quitinasas, β-1,3-glucanasas, peroxidasas, lipoxigenasas, proteasas,

inhibidores de proteasas y amilasas, poligalacturonasas y otras proteínas

antimicrobianas y/o tóxicas a insectos (Geoffroy et al., 1990; Linthorst, 1991;

Stintzi et al., 1993).

Como ya se mencionó, el reconocimiento del evocador ocasiona la

activación de una o más rutas de transducción de señales, y por último la

síntesis de compuestos relacionados con defensa. De manera rápida y local

surgen eventos comunes a distintas rutas de transducción de señales, donde se

incluyen: apertura de canales iónicos y entrada de calcio, alteración del potencial

de membrana (despolarización o hiperpolarización). Estos eventos tempranos

9

son acompañados posteriormente por la síntesis de AS, AJ y/o otros compuestos

que son señales necesarias para la activación génica (Hammond-Kosack y

Jones, 1996).

Los diferentes cambios estructurales, moleculares, bioquímicos y/o

fisiológicos que ocurren poco tiempo después del ataque patogénico, tienen

lugar tanto en el sitio de daño como en su periferia (respuestas locales) o, más

tardíamente, en zonas distantes a éste (respuestas sistémicas).

2.1.1.3. Respuesta sistémica

Uno de los aspectos más elusivos y fascinantes en respuesta a daño es la

habilidad de generar señales en el sitio de herida y que se transmitan a partes

distantes de la planta. La respuesta a patógenos mejor caracterizada es la

resistencia sistémica adquirida (RSA), la cual le confiere resistencia a la planta

contra un amplio rango de patógenos e involucra la inducción de distintas

proteínas RP (Ryals et al., 1996).

El ácido salicílico (AS), un producto de la ruta de los fenilpropanoides, ha

mostrado ser esencial en la inducción de la RSA (Gaffney et al., 1993; Vernooij

et al., 1994; Pallas et al., 1996). Se ha demostrado que un incremento en los

niveles de AS precede a la RSA, y que dicho incremento es necesario y

suficiente para el establecimiento de la misma. Recientes evidencias han

sugerido que también existen rutas independientes de AS (Heo et al., 1999).

Tanto en tabaco como en Arabidopsis, el AS es suficiente y necesario

para la inducción de RSA. Esto ha sido aprovechado en la agricultura, en la cual

se emplean inductores sintéticos como el BTH y el INA, que presentan gran

similitud estructural con AS, para inducir un estado de resistencia contra

patógenos en numerosos cultivos de interés comercial (Lawton et al., 1996;

Friedrich et al., 1996; Gorlach et al., 1996). El papel del AS en la inducción del

RSA se comprobó en plantas de tabaco capaces de expresar el gen nahG, que

codifica una salicilato hidrolasa bacteriana; estas plantas presentaron bajos

niveles de AS, fueron incapaces de expresar RSA y presentaron más

susceptibilidad a una gran variedad de patógenos (Delaney et al., 1997; Gaffney

et al., 1993).

10

Además de la RSA, existe otro tipo de respuesta denominada Resistencia

Sistémica Inducida (RSI) que también provee protección contra una amplia gama

de patógenos. Esta respuesta, que es inducida por rizobacterias promotoras del

crecimiento, no depende de AS, no está asociada a la RH ni a la síntesis de

proteínas RP, está regulada por el ácido jasmónico, el etileno y la proteína

reguladora NPR-1 (Pieterse et al., 1996, 1998; Van Loon et al., 1998; Knoester et

al., 1998).

Se cree que el etileno funciona como inductor en la síntesis de

compuestos, genes o estructuras defensivas como lignina, proteínas RP y

fenilalanina amonio liasa (FAL). Por otra parte, existe una ruta defensiva

comúnmente conocida como la ruta octadecanoica que involucra AJ o su éster

metílico (MeJA) para inducir, principalmente, la síntesis de inhibidores de

proteasas (IP) en respuesta a herbivoría (Peña-Cortés et al., 1989; Farmer y

Ryan, 1992).

Existen varios ejemplos de la inhibición de una vía por la otra. Por

ejemplo, en plantas heridas tratadas simultáneamente con AS, se inhibe la

acumulación de IP y PFO, que son respuestas típicas producidas por herbivoría,

y reguladas por AJ (Stout et al., 1999). A su vez, también se ha observado la

interferencia del AJ en la resistencia mediada por AS contra ciertos patógenos,

manifestándose como la disminución de la síntesis de algunas proteínas RP

(Sano y Ohashi, 1995; Niki et al., 1998).

2.2. Mecanismos de defensa en tabaco

El tabaco es atacado en cualquier etapa de su desarrollo y en todas los

órganos de la planta por diversos agresores incluyendo hongos, bacterias, virus,

nemátodos, afidos (Myzus nicotianiae; M. persicae) y otros insectos chupadores

e insectos masticadores, entre los que se encuentra Manduca sexta, que es una

especie tolerante a la nicotina y Heliothis virescens (Johnson et al., 1992; Snook

et al., 1997).

Como ya se ha descrito, la resistencia o tolerancia de las plantas hacía los

insectos herbívoros y patógenos está mediada por mecanismos de defensa

inducidos o constitutivos (Mauricio et al., 1997; Buell, 1998). En tabaco, como en

11

otras plantas, las defensas inducibles pueden clasificarse como directas e

indirectas. Dentro del primer tipo se incluyen los inhibidores de proteasas, (van

Dam et al., 2001; Glawe et al., 2003) diterpenos glicosilados (Keinänen et al.,

2001) y metabolitos secundarios como la nicotina (Winz y Baldwin, 2001;

Steppuhn et al., 2004) capsidiol (Guedes et al., 1982; Bohlmann et al., 2002) y

ácido clorogénico (Tanguy y Martin, 1972; Lou y Baldwin, 2003).

A su vez, la defensa indirecta se considera como aquella que depende de

un tercer nivel trófico, representado por insectos depredadores o parásitos de los

insectos herbívoros, los cuales son atraídos hacia la planta atacada mediante la

emisión inducida de compuestos volátiles (Halitschke et al., 2000). En N.

attenuata, el daño mecánico y el ataque por M. sexta ocasiona un incremento de

los niveles de AJ, el cual está relacionado con la acumulación de metabolitos

secundarios, inhibidores de proteasas y la síntesis de novo de volátiles. En esta

especie, la inducción de defensas se presenta tanto a nivel local como sistémico,

particularmente en las hojas conectadas filotácticamente, mientras que los

volátiles se inducen en toda la planta. Sin embargo, el ataque a N. attenuata por

M. sexta no origina un aumento de nicotina ya que el incremento simultáneo de

etileno inhibe la expresión de putrescina N-metiltransferasa, que es una de las

enzimas clave en la biosíntesis de nicotina. Este patrón de expresión de

respuestas defensivas ha sido estudiado con particular detalle en especies

silvestres de Nicotiana (e.g., N. sylvestris y N. attenuata) (McCloud y Baldwin,

1997; Lou y Baldwin, 2003; Qu et al., 2004), (Ver Figura 1).

12

DEFENSAS EN TABACODEFENSAS EN TABACO

ATAQUE CON

Manduca sexta

Baldwin y col., 2003

nicotina

Defensas indirectas

Defensas directas

Metabolitos secundarios

Diterpenosglicosilados,etc.

VolatilesMeJA

AJ

Et

daño

regurgitante

Putrescina PMT

IPs

Figura 1. Reconocimiento del ataque de M. sexta por N. attenuata, incremento

de los niveles de AJ y etileno e inducción de defensas directas e indirectas

(modificado de Baldwin et al., 2003).

13

2.3. Respuestas de resistencia en plantas contra el ataque de plagas

El daño implicado por herbívoros requiere de múltiples estrategias de

defensa en la planta. El sitio de daño debe protegerse y la respuesta de defensa

aumentar contra el herbívoro y patógenos oportunistas (Roberts y de Bruxelles,

2001). En el caso específico de los insectos herbívoros, se ha observado que

éstos inducen una serie de defensas en las plantas tanto a nivel local como a

nivel sistémico (Gatehouse, 2000). Por ejemplo, se ha demostrado que el daño

causado por el ataque de insectos masticadores activa respuestas de defensa

típicas en ciertas especies de plantas. Entre estas respuestas, se encuentran la

activación de genes que codifican para inhibidores de proteasas y polifenol

oxidasas, así como de proteínas asociadas a proteólisis controlada, como son

las proteínas tipo ubiquitina (Bowles, 1990; Ryan, 1990).

2.3.1. Inhibidores de proteasas

Los IP son proteínas con gran afinidad por enzimas proteolíticas, capaces

de inhibir fuerte y específicamente su actividad enzimática (Richardson, 1991).

Los inhibidores de proteasas se acumulan de manera constitutiva, pueden ser

inducibles por daño causado mecánicamente, por insectos o por patógenos. Las

evidencias experimentales indican que su efecto protector radica en la inhibición

de enzimas que son esenciales para la digestión de proteínas (Ryan, 1981; de

Bruxelles y Roberts, 2001). Éstos fueron primeramente descritos con detalle en

plantas solanáceas. Sin embargo, hoy en día se ha encontrado que los IP son

expresados en semillas, tubérculos y tejidos vegetativos de más de 100 especies

diferentes de plantas, muchos de los cuales se acumulan después de sufrir algún

tipo de daño (Kessler et al., 2002).

La clasificación de los IP se basa en el tipo de proteasa (o proteasas) que

son capaces de inhibir: serina, cisteína, aspártico y las metalo proteasas. Los

inhibidores de estas enzimas producidas por plantas afectan el crecimiento y

desarrollo de plagas al interferir en la degradación de proteínas de origen foliar.

El argumento más aceptado es que el efecto defensivo se produce como

consecuencia de los efectos antinutricios que se presentaran en los insectos

14

alimentados con plantas que sintetizan altas concentraciones de IP, los cuales

están relacionados con la pérdida de la asimilación de algunos aminoácidos

esenciales, especialmente los sulfurados, debido a una secreción excesiva de

tripsina (Ryan, 1990).

La síntesis de estas enzimas se inicia con la liberación de evocadores,

inducidos por algún tipo de daño; la respuesta se lleva a cabo de manera local y

al mismo tiempo se inicia la activación de mecanismos de transducción de

señales para iniciar la respuesta sistémica (Schaller y Ryan, 1995).

Se considera que la amplia distribución de los IP en tejidos de

almacenamiento y en distintas familias de plantas, su inducibilidad por daño

mecánico y herbivoría, así como su efecto protector en plantas transgénicas, son

criterio suficiente para atribuirles una función como proteínas de defensa contra

herbívoros.

2.3.2. Polifenol oxidasas

Las polifenol oxidasas son un grupo de enzimas inducibles que oxidan un

amplio rango de compuestos fenólicos en plantas (Vaughn et al., 1988). La

enzima polifenol oxidasa (PFO) se clasifica como proteína antinutricional dentro

de las llamadas SWRPs (de sus siglas en inglés, “Systemic Wound Response

Proteins”) o proteínas en respuesta a daño que son proteínas que se expresan

como respuesta al ataque por herbívoros (Ryan, 2000).

La enzima PFO, al ser ingerida por los herbívoros, junto con compuestos

fenólicos y la combinación de inhibidores de proteasas, forman una barrera muy

efectiva para la digestión de proteínas por insectos (Graham et al., 1986; Felton

et al., 1992; Bergey et al., 1996). El efecto antinutritivo se basa en la capacidad

que poseen para destruir nutrientes esenciales en las dietas de los insectos. La

eficiencia de las enzimas oxidativas, fenol oxidasas, peroxidasas y

lipooxigenasas (LOX), depende del ambiente químico existente en el intestino

del insecto, del potencial Redox y de los niveles de antioxidantes. Además, la

calidad y cantidad de proteína presente en la dieta ejercen influencia sobre los

efectos oxidativos en las enzimas de los herbívoros (Stout y Duffey, 1996).

15

Durante el proceso de alimentación del insecto, las PFO tienen acceso a

sus sustratos y generan orto-quinonas a partir de compuestos fenólicos

presentes en la dieta. Estas tienen un efecto nocivo en el huésped ya que

pueden formar enlaces covalentes con grupos sulfhídrilo de aminoácidos

sulfurados y con aminoácidos básicos, como la lisina. La modificación química

de estos aminoácidos provoca eventualmente precipitación de las proteínas, lo

cual altera de manera significativa la digestión y la asimilación de nitrógeno en el

insecto (Felton et al., 1992).

2.3.3. Oligosacáridos

La mayor parte de los patógenos y herbívoros que atacan plantas,

secretan numerosas enzimas degradativas, cuya acción provoca la generación

de fragmentos de componentes celulares (como de la pared celular), que actúan

como evocadores bióticos (Stout y Bostock, 1999). Se ha observado que tanto

los oligogalacturónidos (OGA), provenientes de los fragmentos de la pared

celular, como los fragmentos de quitina y quitosanas, derivados de las paredes

celulares de patógenos, pueden activar a los genes IP. En algunos bioensayos

realizados con diferentes OGA, se observó que moléculas con un grado de

polimerización de 2 unidades de ácido galacturónico fueron capaces de inducir a

los genes IP. Se ha sugerido que los OGA actúan como inductores en la

expresión de los genes IP solamente a nivel local. Esto se atribuye a su poca

movilidad, relacionada con su alta afinidad por la pared celular, y al hecho de

que sólo pueden ser liberados en el sitio donde el daño ha sido inflingido en las

plantas por insectos o por patógenos y donde se generan las enzimas

necesarias para hidrolizar fragmentos activos de la pared celular (Bowles, 1998).

La aplicación de OGA da como resultado una rápida despolarización de la

membrana plasmática, flujo de iones de calcio dentro del citoplasma (Thain et

al., 1990; Mathieu et al., 1991; Messiaen y van Cutsem, 1994), la generación de

especies reactivas de oxigeno (Orozco-Cárdenas y Ryan, 1999) y la inducción

de AJ (Doares et al., 1995a) y etileno (O’Donnell et al., 1996).

16

2.4. Sistemina

La sistemina es un polipéptido de señalización que fue descubierto

durante investigaciones enfocadas a detectar la señal sistémica que regula la

expresión de genes de defensa en respuesta al ataque de insectos y daño

mecánico en hojas de jitomate (Lycopersicon esculentum). Este polipéptido

consta de 18 aminoácidos y no está modificado por cadenas laterales de

oligosacáridos. Se encontró que induce la actividad de inhibidores de proteasas

al ser aplicado en concentraciones muy bajas, del rango picomolar a fentomolar,

a plantas jóvenes de jitomate (Figura 2). El polipéptido fue purificado por medio

de una laboriosa secuencia de separación, la última de las cuales se hizo por

cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC, por sus

siglas en inglés). La actividad del polipéptido fue ensayada aplicando fracciones

eluídas directamente de las columnas a plantas jóvenes a través de soluciones

acuosas absorbidas directamente por la corriente de transpiración de las

plántulas cuyos tallos habían sido cortados previamente por debajo del

hipócotilo. Una vez purificado, se detectó que el polipéptido sintético, de

secuencia idéntica al aislado y marcado radiactivamente con 14C, era

transportado de las hojas heridas a tejidos distales (Pearce et al., 1991).

Además, su movimiento a través del floema correlacionó con la velocidad de la

señal sistémica que se produce en respuesta a daño, que se estimó como de

aproximadamente de 3 cm/h (Nelson et al., 1983; Pearce et al., 1991; Narváez-

Vasquez et al., 1995). Debido precisamente a la movilidad sistémica de este

polipéptido a través del floema se le llamó “sistemina”. La sistemina no solo

induce la expresión de inhibidores de proteasa sino que también incrementa la

actividad de PFO, que también puede ser inducida por MeJA, además de un

amplio espectro de proteínas relacionadas a defensa, como lo son las SWRP.

Este polipéptido es muy polar y posee numerosos aminoácidos cargados

en su estructura primaria; posee, además, un enlace dibásico entre los

aminoácidos 9 y 10 que podría ser reconocido por proteasas tipo subtilisina para

su degradación y/o procesamiento (Schaller et al., 1999) y dos pares de prolinas

en las posiciónes 6 y 7, y 12 y 13. Por medio de estudios de dicroismo circular se

detectó una leve estructura secundaria en la región central del polipéptido

(Toumadje y Jonhson, 1995). Se estima que la conformación enrollada (“coil-

17

coiled”) es debido a estos dos pares de residuos de prolina presentes en su

secuencia. Se sabe, también, que las poliprolinas son motivos estructurales

empleados para la unión con otras proteínas (Ferris et al., 2001); se especula

que esta característica podría ser importante para el reconocimiento de

sistemina por su receptor.

+H3N-AVQSKPPSKRDPPKMQTD-COO-

1 5 10 15 18

Figura 2. Estructura primaria de la sistemina de jitomate.

2.4.1. Actividad y translocación de sistemina

Mediante la sustitución con alanina y deleciones en la secuencia de

sistemina, Pearce y colaboradores (1993), demostraron que se requería la

secuencia completa de sistemina para permitir la inducción máxima de los genes

de inhibidores de proteasas. Deleciones en el extremo carboxilo terminal de la

secuencia de sistemina causaron una disminución o pérdida total de la actividad

del polipéptido, principalmente al eliminar el ácido aspártico presente en la última

posición desde el extremo carboxilo terminal. Se demostró trambién que son

necesarios por lo menos los cuatro últimos aminoácidos (Met-Gln-Thr-Asp) para

que se manifieste una mínima actividad de sistemina. Al ser deletados estos

cuatro aminoácidos en orden progresivo se inactivó por completo la actividad

inductora de inhibidores de proteasas. Asimismo, la deleción de la alanina del

extremo amino-terminal redujo hasta 300 veces su actividad, y deleciones

progresivas de esta región causaron incrementos en la pérdida de actividad. Sin

embargo, se observó que podían ser eliminados hasta 14 aminoácidos de la

región NH2-terminal sin que se perdiera por completo la actividad del polipéptido.

Para determinar si las modificaciones en los aminoácidos de la sistemina

18

afectaban su actividad inductora, se utilizó una sistemina sintética análoga que

contenía una sustitución con Ala en cada aminoácido del polipéptido. Se observó

que las sustituciones por Ala en los residuos 2-6, 8, 9 ,10, 14 y 15 producían

pequeños cambios en la actividad, indicando que estos aa eran relativamente

poco importantes en la actividad de la sistemina, mientras que las sustituciones

en los residuos 12 y 13 correspondientes a uno de los dos pares de prolinas

causó una reducción drástica de la actividad biológica, mientras que la

sustitución en la posición 17 (Thr) abolió completamente la actividad inductora de

la sistemina (Figura 3). De este resultado surgió la hipótesis de que la treonina

es fosforilada como parte del proceso de señalización, la cual no ha podido hasta

el momento ser validada o desechada.

Figura 3. Efecto de la sustitución de cada uno de los 18 aminoácidos de la

sistemina de jitomate por alanina, sobre la inducción de la síntesis de inhibidores

de proteasa tipo I en hojas de jitomate.

19

En experimentos en los que se utilizaron sólo los 14 aa del extremo amino

terminal de una sistemina análoga, se detectó la unión a la membrana celular de

Lycopersicon peruvianum, la cual compitió con la sistemina natural por el sitio de

unión, mientras que la secuencia (Met-Gln-Thr-Asp) del extremo carboxilo no

presentó este comportamiento (Meindl et al., 1998). De este comportamiento

surgió un modelo para explicar el mecanismo de unión ligando-receptor, en el

cual se sugiere que el extremo amino terminal es el que se une inicialmente al

receptor para permitir la generación de los cambios conformacionales que

permitirán la posterior unión del extremo carboxilo terminal y el inicio de las

cascada de señalización (Meindl et al., 1998).

Análisis autorradiográficos y el uso del microscopio de luz, revelaron que

al aplicar sistemina marcada con 14C o 3H en hojas heridas de plantas de

jitomate, ésta se difundía a través de toda la hoja después de 30 min, mientras

que a los 90 min la radioactividad era detectada en las hojas apicales de las

plantas. A su vez, se observó que la aplicación de sistemina marcada con 3H se

concentró en el xilema y el floema de las nervaduras de la hoja herida 15

minutos después de su aplicación. Después de 30 min, la radioactividad se

encontró principalmente en los tejidos vasculares del peciolo, y a los 90 min, la

marca fue encontrada en el floema del tallo principal de las plantas. Los análisis

autorradiográficos, bioquímicos e histológicos, sugerían fuertemente que la

sistemina marcada radioactivamente y aplicada a hojas de jitomate heridas, era

translocada inicialmente al apoplasto o espacio intercelular, posteriormente al

tejido vascular de las nervaduras menores y al simplasto de las células

acompañantes del complejo de tubos cribosos, y finalmente a los tejidos distales

a través del floema. Con estos resultados se obtuvieron fuertes evidencias a

favor del transporte de la sistemina desde el sitio de la herida hacia los tejidos

distales de la planta (Narváez-Vázquez et al., 1995).

20

2.4.2. Modelo de la ruta de señalización activada p or sistemina

El sistema modelo para el estudio de la ruta de señalización activado por

sistemina es el jitomate. En esta especie, el modelo propone la percepción de la

sistemina por un receptor tipo cinasa de repetidos ricos en leucina, de 160-kDa,

localizado en la membrana plasmática de las células de jitomate (Scheer y

Ryan, 2002). La percepción rápida y reversible da como resultado un incremento

en la concentración del Ca2+ libre en el citosol debido a la apertura de canales de

la membrana plasmática y de almacenes internos. El Ca2+ estimula la actividad

de una proteín cinasa (PK) aun no identificada, resultando en la inhibición de la

H+-ATPasa de la membrana plasmática y, por lo tanto, en la despolarización del

potencial de la membrana plasmática y en la alcalinización del medio. El Ca2+

liberado también puede activar una fosfolipasa A2 (PLA2) y mediar la fosforilación

de una MAPK, resultando en la hidrólisis de lípidos y la liberación del ácido

linolénico de la membrana, con la consecuente producción de ácido jasmónico y

la activación de genes defensivos (Schaller, 1999) (Figura 4).

21

MP

Ca2++++

RS-160

Ca2+

Ca2+ H+

MAPK

PLA2

PK

K+, Cl

ActivaciActivaciActivaciActivacióóóónnnnggggéééénicanicanicanica

vacuola

H-ATP

P

Ác. jasmónico

ReducciReducciReducciReduccióóóónnnn

β----OxidaciOxidaciOxidaciOxidacióóóón (3)n (3)n (3)n (3)

COOHCOOHCOOHCOOH

oooo

Ca+

SISTEMINASISTEMINA

ÁÁcc. . linollinol ééniconico

Figura 4. Modelo hipotético de la ruta de transducción de señales en células de

jitomate activada por sistemina. MP: membrana plasmática; PLA2: Fosfolipasa

A2: MAPK: cinasas activadas por mitógenos; RS: receptor de la sistemina de 160

kDa (Schaller, 1999).

22

2.4.3. Glicopéptidos ricos en hidroxiprolina (“sist eminas”) de tabaco

(TobHypSys)

Mediante el empleo de cromatografía en columna se facilitó el aislamiento

de dos polipéptidos de 18 aa de las hojas de tabaco llamados TobHypSys I y

TobHypSys II. El análisis de su estructura reveló que ambos tienen residuos de

prolinas hidroxiladas, los cuales se encuentran glicosilados por cadenas laterales

de oligosacáridos, ricas en pentosas, con un grado de polimerización de 6 a 9

unidades (Pearce et al., 2001). Al igual que la sistemina en jitomate, ambos

mostraron la capacidad de inducir la síntesis de inhibidores de tripsina en plantas

de tabaco y de activar a MAP cinasas asociadas con el daño en cultivos

celulares en suspensión de tabaco (Pearce et al., 2001). Se detectó un tercer

polipéptido en tabaco, pero a muy bajas concentraciones. Este resultó casi

idéntico a TobHypSys II, excepto por la presencia adicional de leucina en la

región C-terminal. La aplicación de sistemina de jitomate a suspensiones

celulares de tabaco no causó la típica alcalinización en el medio del cultivo

celular. Asimismo, cuando se aplicó sistemina exógena a través del tallo de

plantas jóvenes de tabaco, tampoco se activó la síntesis de inhibidores de

tripsina en las hojas de tabaco, confirmándose que la sistemina de jitomate no es

percibida por las células de tabaco. Esto se debe, quizás, a sus marcadas

diferencias estructurales (Figura 5). Sin embargo, experimentos posteriores

indicaron que la sistemina de jitomate resultó capaz de inducir la alcalinización

del medio extracelular de suspensiones celulares de tabaco preparadas a partir

de plantas de tabaco transformadas con el ADNc del receptor de sistemina de

jitomate (SR160) bajo el promotor constitutivo 35S. De manera que posiblemente

existen uno o varios componentes implicados en la señalización intracelular

capaces de interactuar con el receptor SR160 para facilitar la señalización

mediada por sistemina en las células de tabaco (Scheer et al., 2003). Otra

posibilidad es que el motivo de poliprolina conservado en todas las sisteminas, el

cual produce una estructura conocida como PP II, podría ser importante para el

reconocimiento por el receptor SR 160, en forma similar a lo que se propone que

ocurre durante la interacción entre las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y

otras proteínas de la pared celular de plantas (Ferris et al., 2001). Sin embargo,

TobHypSys I y TobHypSys II inducen la alcalinización del medio en

23

suspensiones celulares de jitomate y la síntesis de inhibidores de proteasas en

plantas de jitomate, indicando que los receptores de jitomate puedan reconocer a

las llamadas sisteminas de tabaco (Glicopéptidos ricos en hidroxiprolina),

activando la misma señalización activada por la sistemina de jitomate (LeSYS).

Debido a que el precursor de las sisteminas de tabaco, proTobHypSys, se

encuentra hidroxilado y glicosilado, puede asociarse con la pared celular, como

se demostró para el precursor proTomHypSys en jitomate (Narváez-Vázquez et

al., 2005), y posiblemente puede ser procesado en el sitio de daño para inducir

señales de amplificación en la síntesis de oxilipinas (Ryan y Pearce, 2003).

Recientemente se aislaron de hojas de jitomate tres polipéptidos glicosilados e

hidroxilados de 15, 18 y 20 aa (TomHypSys), similares en la estructura básica a

TobHypSys I y II, los cuales inducen fuertemente la alcalinización cuando se

adicionan a cultivos celulares de jitomate y tabaco. En tabaco, la respuesta a

daño activa sistemicamente la síntesis de inhibidores de tripsina los cuales son

homólogos a los inhibidores II de jitomate (Pearce et al., 1993b).

Figura 5 . Estructura primaria de la sistemina de jitomate y de los glicopéptidos

ricos en hidroxiprolina presentes en jitomate (TomSys y TomHypSys I, II y III) y

tabaco (TobHypSys I y II), respectivamente.

TomSys +H2N- A V Q S K P P S K R D P P K M Q T D- COO-

TomHypSys I +H2N- R T O Y K T O O O O T S S S O T H H -COO-

TomHypSys II +H2N- G R H D Y V A S O O O O K P Q D E Q R Q-COO-

TomHypSys III +H2N- G R H D S V L P O O S O K T D -COO-

TobHypSys I +H2N- R G A N L P O O S O A S S P O O S K E - COO-

TobHypSys II +H2N- N R K P L S O O S O K P A D G O R P- COO-

24

La utilización de dos TobHypSys sintéticas, carentes de carbohidratos,

indujo una débil alcalinización en cultivos celulares de tabaco en suspensión y

una débil inducción de inhibidores de tripsina en hojas de tabaco, indicando que

la modificación con cadenas laterales de carbohidratos favorece la actividad

biológica de los glicopéptidos ricos en hidroxiprolina. Al sustituir con alanina la

arginina (R) en la región amino terminal, ácido glutamico (E) en el extremo C-

terminal y en la hidroxiprolina en posición 15 de TobHypSys I, se eliminó por

completo la inducción de actividad de este polipéptido. Además, sustituciones en

las hidroxiprolinas en posición 10 y 14 redujeron drásticamente la actividad del

glicopéptido. A su vez, las sustituciones con alanina en arginina (R) y asparagina

(N) en la región amino terminal redujeron severamente la actividad de

TobHypSys II sintéticas (medida como la capacidad de causar la alcalinización

del medio extracelular al ser aplicados a cultivos celulares de N. tabacum), así

como también la sustitución en el extremo carboxilo terminal de la arginina en la

posición 17, hidroxiprolina en la posición 10 y prolina posición 18,

respectivamente (Pearce et al., 2001) (Figura 6).

25

Figura 6. Actividad de TobHypSys I y TobHypSys II sintéticas, carentes de

modificaciones con cadena de oligosacáridos y con sustituciones de alanina en

cada uno de sus aminoácidos.

2.5. Prosistemina

La prosistemina, considerada el precursor de la sistemina, es una

proteína hidrofílica de aproximadamente 23 kDa que contiene un alto porcentaje

de aa cargados y pocos aa hidrofóbicos (McGurl et al., 1992). Este polipéptido

de 200 aa, no posee una secuencia señal típica de las proteínas que son

exportadas al exterior de la célula o a diferentes organelos a través del retículo

endoplásmico, ya que no hay evidencia de que esta proteína esté glicosilada

(Deláno-Frier et al., 1999). Se ha determinado que el sitio de síntesis de la

prosistemina se localiza en las células del parénquima del haz vascular de hojas,

pecíolos y tallos; se ha especulado que la localización tan estricta de la síntesis

de prosistemina en el tejido vascular puede representar una ventaja para la

26

planta, al facilitar el procesamiento de la prosistemina en respuesta a heridas y

promover una rápida carga de la sistemina en el floema, donde puede ser

rápidamente transportada a través de la planta (Jacinto et al, 1997; Li et al.,

2002a; Ryan y Moura, 2002; Narváez-Vázquez y Ryan, 2004; Scilmiller y Howe,

2005).

2.5.1. Expresión y supresión de la actividad de la prosistemina

La función de la prosistemina fue demostrada al transformar plantas de

jitomate con el ADNc de la prosistemina en orientación antisentido, la cual causó

una reducción severa de la inducción de inhibidores de proteasas y, por

consiguiente, una mayor susceptibilidad a herbivoría por larvas de Manduca

sexta (McGurl et al., 1992).

A su vez, la expresión del gen de la prosistemina en orientación sentido,

condujo a una sobre-expresión constitutiva de los genes de inhibidores de

proteasas, ya que aun sin ser heridas, las plantas transgénicas presentaron

niveles de alrededor de 87 µg/ml del inhibidor I y 75 µg/ml del inhibidor II,

mientras que las plantas control no mostraron acumulación alguna de los

inhibidores. Además, los niveles de los inhibidores I y II se incrementaron hasta

2.5 veces más en las plantas transgénicas en respuesta a daño mecánico

(Figura 7). La sobre-expresión de la prosistemina en plantas de jitomate no sólo

dió como resultado la acumulación constitutiva de inhibidores de proteasas, sino

también la acumulación de otras proteínas involucradas en mecanismos

defensivos, entre las cuales se identificaron una polifenol oxidasa, inhibidores de

cistein proteasas y de catepsina D, exopeptidasas (serin-carboxipeptidasa y

leucina aminopeptidasa), una aspártico proteasa, e isoformas específicas de

lipoxigenasa, calmodulina y cistatina (Bergey et al., 1996). Como consecuencia

de esta sobre-expresión múltiple de genes relacionados con defensa, estas

plantas resultaron altamente resistentes al daño causado por Manduca sexta y

otros insectos (Li et al., 2002b).

27

Figura 7. Niveles de inhibidores de proteasas I y II en plantas de jitomate sin

transformar (1) y transformadas (2) con el transgen de la prosistemina en

orientación “sentido” (según McGurl et al., 1994).

Dombrowski et al., (1999), estudiaron la inducción de inhibidores de

proteasas en plantas de jitomate tratadas con varias prosisteminas

recombinantes truncadas a lo largo de su secuencia aminoácidica. Éstas tenían

deleciones en los primeros 15 (PS 185) y 87 (PS 113) aa y otra sin la región

codificante para sistemina l78 (PS ∆SYS). Utilizaron como controles a la

sistemina (LeSYS) y prosistemina (LePS) con su secuencia aminoácidica

completa, y a la sistemina (A17) y prosistemina (PS A195) mutadas en la

treonina 17 y prolina 195, respectivamente, que como se ha mencionado es

esencial para su actividad biológica (ver Figuras 8 A y B). Al medir los niveles de

actividad del inhibidor I en hojas de plantas de jitomate tratadas con las

diferentes sisteminas y prosisteminas, observaron que la inducción de la

actividad del Inh I fue similar en las plantas tratadas con sistemina y

prosistemina. Esta actividad se mantuvo cuando se usó la PS 185 y disminuyó

ligeramente en las plantas que fueron tratadas con PS 113. Sin embargo, la

inducción de actividad inhibitoria se abatió por completo al usar PS ∆SYS, SYS

A17 y PS A195. Estos resultados coincidieron con los reportados previamente

por Pearce et al., (1993) y sugerían fuertemente que la actividad biológica de la

020406080

100120140160180200

1 2 1 2

Con

c. d

el in

hibi

dor (

ug/m

l)

Inh I Inh II

28

prosistemina radica básicamente en la región carboxilo terminal, donde está

ubicada la sistemina. Sin embargo, no descartaban la posibilidad de que la

región amino terminal podría estar involucrada en otros procesos de señalización

o bioquímicos, así como en el reconocimiento y anclaje de la prosistemina al

receptor SR 160, localizado en la membrana plasmática de las células de

jitomate.

2.5.2. Homología de la prosistemina de jitomate en plantas

solanáceas

La acumulación de inhibidores de proteasas en respuesta a daño se ha

observado en muchas especies de plantas incluyendo la papa, tabaco, alfalfa,

maíz, álamo y sauce, pero en ninguna de éstas se conocía la naturaleza de la

señal sistémica. Usando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa

en combinación con transcripción reversa (RT-PCR) se aislaron y caracterizaron

secuencias de ADNc que codifican a homólogos de prosistemina en papa

(Solanum tuberosum), papa silvestre (S. nigrum) y chile (Capsicum annuum). El

análisis de la secuencia deducida de las prosisteminas de estas plantas mostró

un alto grado de similitud (de 85 a 94%) e identidad (de 73 a 88%) entre estas

especies, siendo la prosistemina de chile la que presentó la más baja identidad y

similitud en comparación con las otras especies. Las secuencias predichas de la

prosistemina de papa, papa silvestre y chile no mostraron diferencias

significativas con la secuencia de la prosistemina de jitomate. Por tal motivo, se

investigó si las prosisteminas sintéticas homólogas poseían actividad inductora

de inhibidores de proteasas en plantas de jitomate. Los resultados obtenidos

indicaron que la prosistemina de papa silvestre fue 10 veces menos activa que la

de jitomate, mientras que las prosisteminas de papa y chile fueron similares a la

de jitomate. Al utilizar estas prosisteminas en su respectiva especie fue posible

detectar la producción de ARNm de inhibidores I y II en papa y papa silvestre,

mientras que en chile sólo fue detectado el ARNm del inhibidor II (Constabel et

al., 1998).

El tabaco carece de un gen homólogo a la prosistemina de jitomate

(Pearce et al., 2001). Sin embargo, produce una vigorosa respuesta localizada al

29

daño y tiene, además, un sistema bien definido de señalización entre las hojas y

la raíz mediado por ácido jasmónico, el cual es responsable de la acumulación

de nicotina en raíz (Zhang y Baldwin, 1997).

Figura 8. A y B) Acumulación de inhibidores de proteasas en hojas de jitomate

tratadas con distintas concentraciones de prosisteminas recombinantes.

(Dombrowski et al., 1999).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

2.5

pM

250

fM25

fM2.

5 pM

250

fM25

fM25

pM

2.5

pM25

pM

2.5

pM

250

fM H2O

PS 185 PS 113 PS∆SYS PS A195

Inhi

bido

r I

(ug/

ml e

xtra

cto)

A

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

2.5

0.25

0.025 2.

50.

250.0

25 2.5

0.25

0.025 2.

50.

250.0

25 250

Buffer

PS SYS PSA17 SYS A17 A17

Inhi

bido

r I

(ug/

ml e

xtra

cto)

B

30

Como se indicó anteriormente, el análisis de varias genotecas de ADNc

de hojas de tabaco reveló la presencia de dos prosisteminas, denominadas pro-

TobSys-A (165 aa) y pro-TobSys-B (164 aa), a partir de las cuales son liberadas

dos sisteminas mayoritarias (TobSys I y TobSys II) y una minoritaria (TobSys Ia)

(Pearce et al., 2001). En tabaco, el precursor ppTobHS-A se indujo en respuesta

a múltiples estímulos, incluyendo daño mecánico, AJ, ácido abscísico, herbivoría

por M. sexta e infestación con B. tabaci. Su expresión generalmente precedió a

la acumulación de transcritos de inhibidores de proteasa del tipo I y II y otros

genes de indole defensiva en tabaco, como una dioxigenasa inducida por

patógenos, por lo que se sugiere que al igual que LeSYS, TobSys juega un papel

importante en la regulación de respuestas defensivas en N. tabacum, tanto a

nivel local como sistémico (Rocha-Granados et al., 2005).

2.6 Metabolitos secundarios

Los metabolitos secundarios proveen defensas contra la infección,

depredación o agobio ambiental. La producción de metabolitos secundarios

ocurre frecuentemente a concentraciones relativamente bajas en la mayoría de

las familias de plantas. Por eso, parece razonable asumir que éstos pudieran

estar implicados en relaciones de evolución en aquellas especies que los

acumulan. Una característica fundamental del metabolismo secundario, es que

los productos no están uniformemente distribuidos a través de la planta, sino que

frecuentemente están limitados a órganos particulares, células y tejidos

particulares dentro del órgano (Rhodes, 1994).

El órgano en el cual los productos secundarios se acumulan es con

frecuencia diferente de aquel en donde ocurre la biosíntesis. Por ejemplo, la

capacidad de biosíntesis de nicotina está limitada a las raíces de la planta de

tabaco, aunque la nicotina se acumula tanto en hojas como en raíces (Baldwin et

al., 1997).

Las solanáceas contienen diversos metabolitos secundarios, siéndo los

grupos más importantes los alcaloides, terpenos y componentes fenólicos. La

síntesis de estos metabolitos está bajo control genético y depende críticamente

31

de las condiciones ambientales (Saitoh et al., 1985; Snook et al., 1986; Sisson y

Severson, 1990). Como se mencionó líneas arriba, el AJ juega un papel

fundamental en la regulación de la síntesis de novo de numerosos metabolitos

secundarios en cultivos celulares y en plantas de varias especies incluyendo los

alcaloides, terpenos, y compuestos fenólicos (Rickauer et al., 1997; Memelink et

al., 2001).

En N. tabacum y otras especies de Nicotiana, se ha comprobado el papel

fundamental de ciertos metabolitos secundarios en la defensa contra patógenos

e insectos plaga. Un ejemplo muy evidente de esta función se obtuvo de plantas

transgénicas de tabaco capaces de expresar constitutivamente la fitoalexina

resveratol, las cuales exhibieron una marcada resistencia contra el hongo

Botrytis cinerea (Hain et al., 1993).

2.6.1. Alcaloides (nicotina, nornicotina)

Más de 12,000 alcaloides han sido aislados desde el descubrimiento de la

morfina. Alrededor del 20% de las especies de las plantas que florecen producen

alcaloides. Varios alcaloides son tóxicos para insectos o parásitos, aunque

algunas especies de insectos se han adaptado a los alcaloides pirrolizidinos que

se acumulan en las plantas. Para ello han desarrollado mecanismos para

utilizarlos para su propio beneficio, modificandolos como monoesteres por medio

de procesos enzimaticos o acumulándolos en tejidos especializados, llegando

inclusive a utilizarlos como precursores de feromonas para atraer a la hembra,

como es el caso del lepidóptero Creatonotos transiens, o como sustancias de

defensa contra sus depredadores, tal como se ha observado en las larvas de

Tyria jacobaea (Buchanan et al., 2000; Wittstock y Gershenzon, 2002). El ataque

por herbívoros en tabaco silvestre estimula la biosíntesis de nicotina. Se sabe

que diferentes genotipos de tabaco (N. tabacum) varían en su habilidad de

acumular y almacenar nicotina. Además, en las especies nativas N. sylvestris, N.

attenuata, N. quadrivalvis y N. clevelandii se ha encontrado que el ataque por

insectos herbívoros incrementa dramáticamente la síntesis y acumulación de

nicotina. (Baldwin et al., 1998, 1999; Lou y Baldwin, 2003; Qu et al., 2004).

Cuando N. attenuata es atacada por diferentes herbívoros en su habitat natural,

32

la respuesta al ataque es el incremento sistémico en la producción de dos

defensas directas: inhibidores de proteinasa (Glawe et al., 2003; van Dam et al.,

2001; Zavala et al., 2004a, 2004b) y nicotina (Baldwin, 2001). Los inhibidores de

tripsina interfieren en el aprovechamiento de proteinas esenciales durante la

digestión, afectando de igual modo el crecimiento y desarrollo del herbívoro

(Glawe et al., 2003; Zavala et al. 2004b). La nicotina puede actuar como toxina

defensiva, ya que se une a receptores de acetilcolina, interfiriendo así con el

sistema nervioso central (Wink, 1998). Ambas defensas se producen en distintas

partes de la planta: raíz y tallo, respectivamente (Figura 9). La nicotina es

seguida por la nornicotina en cuanto a abundancia, ya que este alcaloide

constituye el 3% y el 6% del total de alcaloides en hojas y raices de N. tabacum,

respectivamente (Saitoh et al., 1985). Se sintetiza a partir de la desmetilación de

nicotina mediante un proceso oxidativo que involucra intermediarios cargados

positivamente (Botte et al., 1997).

N

NCH3

NH

N

Figura 9 . Estructrua de la nicotina y nornicotina (izquierda y derecha,

respectivamente.

33

2.6.2. Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos derivados de la ruta fenilpropanoide,

sintetizados a partir de fenilalanina y tirosina, que a su vez se derivan de la ruta

del ácido shiquímico, son metabolitos áromaticos que tienen uno o más grupos

hidroxilo unidos a un anillo áromatico. El aumento en el contenido de fenoles

inhibe el crecimiento y regeneración de plántulas; además, éstos actuan como

antioxidantes y como sustancias estructurales en los tejidos suberosos,

protegiendo de la desecación y ataque de patógenos.

La formación de suberina en tubérculos de papa dañada, está dada por

un aumento de componentes fenólicos como ACG (Buchanan et al., 2000). Este

compuesto fenólico se encuentra parcialmente en los tricomas glandulares, los

cuales presentan actividad de PFO. Asimismo, el ACG aumenta después de un

tratamiento con MeJA en N. attenuata y N. sylvestris (Keinänen et al., 2001).

La cafeoilputrescina, que es otro metabolito fenólico que se acumula en

hojas apicales, ovarios y flores de plantas de tabaco. Está implicado en

respuestas de resistencia a diversos tipos de estrés. Por ejemplo, los niveles de

este metabolito aumentan después de exponer hojas de tabaco a ozono

(Langebartels et al., 1991); también se ha observado su aumento en cultivos

celulares de papa tratados con evocadores e infecciones fungosas (Keller et al.,

1996).

Sin embargo, otros fenoles, como el AS y su éster acetílico, inhiben la

expresión de los genes IP en L. esculentum debido al antagonismo con la ruta de

transducción de señales dependiente de ácido jasmónico y sistemina (ƠDonnell

et al., 1996).

34

H

OH

OH

NNH2

OO

CO2H

OH

OH

OO

OH OHOH

COOH

HO

Ácid o clorogénico

Figura 10. Estructuras de compuestos fenólicos involucrados en defensa.

2.6.3 Terpenos

Los isoprenoides o terpenos es el grupo de metabolitos secundarios en

plantas con mayor número de estructruras reportadas hasta la fecha, que es de

aproximadamente 24,000 (Gershenzon y Kreis, 1999). Los isoprenoides

clasificados como metabolitos secundarios incluyen monoterpenos,

sesquiterpenos y diterpenos. Son considerados como secundarios porque

aparentemente no son necesarios para las funciones vitales de la célula; sin

embargo, participan en importantes interacciones entre plantas y su medio

ambiente. Ejemplos de esto son la interacción planta-planta (Rocha-Granados et

al., 2005), planta-insecto (Dicke, 1994; Paré y Tumlinson, 1997) y planta-

patógeno (Croft et al., 1993).

Cafeoilputrescina Ácido salicílico

35

Los terpenos poseen un número importante de funciones en las plantas

(Kleining, 1989; Rodríguez-Concepción y Gruissem, 1999). Con respecto a

funciones defensivas en tabaco, varios reportes indican que los diterpenos

glicosilados 16-hidroxigeranilinalool A y B en tabaco implican antibiosis contra

Heliothis virescens F. ya que sólo se encuentran presentes en variedades

resistentes de N. tabacum (Snook et al., 1986).

Un sesquiterpeno de gran importancia en chile (Capsicum annuum),

tabaco y otras plantas solanáceas es el capsidiol. Su acumulación en estas

plantas, la cual es inducida por factores bióticos y abióticos, limita la dispersión

de patógenos en los tejidos infectados. Sin embargo, es un metabolito inestable

ya que sus niveles en plantas decaen rápidamente después de su síntesis

(Lozoya-Gloria, 2004). Numerosos reportes indican que la acumulación de

capsidiol en las hojas de plantas de N. tabacum se debe casi exclusivamente en

respuesta a patógenos (sin embargo consultar Bohlmann et al., 2002).

A su vez, algunos diterpenos (duvanos y labdanos) son componentes de

la capa de cutícula en hojas de tabaco cuya presencia se ha asociado con

resistencia a insectos masticadores (H. virescens) y chupadores (el áfido M.

persicae) (Johnson y Severson, 1982). Recientemente, se descubrió también

que un diterpeno tipo labdano llamado WAF-1, actúa como una señal endógena

durante la activación de respuestas defensivas contra daño mecánico y la

infección por el virus del mosaico del tabaco (Ohashi et al., 2003).

36

O

O

OH

O

OH

OH

Capsidiol Dihidroca psenona

OCH3

OH

OH OH

O

OCH2

OH

OH

O

OH

OCH2OH

O

OH

O

OH

OCH3

OH

OH OH

16-hidroxiger anilinalool

OH

H

WAF-1

Figura 11. Estuctura del capsidiol y su producto de degradación

dihidrocapsenona, y otros terpenos involucrados en defensa

37

2.7. Modelo de estudio

2.7.1. Plantas de tabaco transformadas con prosiste mina y sistemina

de jitomate ( Nt-LePS 08, Nt-LeSYS 03 y WT ×××× Nt-LeSYS 03)

El genero Nicotiana es dividido en tres subgéneros, 14 secciones y 66

especies; pertenece a la sub-tribu Nicotianae de la familia de las solanáceas

(Goodspeed, 1954). Se sabe que a diferencia de varias especies de la sub-tribu

Solaneae, el tabaco no posee homólogos de la prosistemina de L. esculentum

(LePS) (Pearce et al., 2001).

En un trabajo previo (Rocha-Granados, 2004) se generaron varias líneas

de plantas de tabaco sobre-expresantes de prosistemina (LePS) y sistemina

(LeSYS) de jitomate. De éstas, se selecciono una línea sobreexpresantes de

LeSYS: Nt-LeSYS 03 pues el análisis bioquímico mostro los mayores niveles de

actividad de inhibidores de proteasas, PFO y poligalacturonasas basales e

inducidos por daño (Fig. 12). Ademas se selecciono una sola sobreexpresante

de LePS: Nt-LePS, 08, pues presento una acumulación mayor de IT y PG

basales. A su vez, la línea Nt-LeSYS 03 mostró un fenotipo alterado,

caracterizado por anomalías tanto morfológicas como fisiológicas (ver más

adelante), las cuales desaparecieron en la cruza WT × Nt-LeSYS 03. Esta última

cruza también se incluyó en este estudio para ser comparada con la línea Nt-

LeSYS 03.

38

Figura 12. Niveles de inhibidores de tripsina (IT), PFO y

poligalacturonasas (PG) inducibles por daño en hoja local (HL) y hoja sistemica

(HS) en hojas de tabaco silvestres (Wt), y en plantas transformadas con LePS y

LeSYS (Rocha-Granados, resultados no publicados).

IT

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24

Wt S1 S3 CS3 Ps1 Ps8 Ps10

AC

TIV

IDA

D E

SP

EC

IFIC

A.

HL

HS

PFO

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24


D.O

./min

/mg

pro

teín

a

HL

HS

PG

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24 0 16 24


nm

ol/m

in/m

g p

rote

ína

HL

HS

39

2.7.2. Alteraciones morfológicas y fisiológicas en la línea Nt -LeSYS

03.

La línea Nt-LeSYS 03 mostró una acumulación altamente significativa de

actividad inhibitoria contra tripsina (IT), quimotripsina (IQT) y PFO. Además, esta

línea se caracterizó por desarrollar un fenotipo con numerosas alteraciones

morfológicas y fisiológicas, las cuales de describen a continuación: hojas más

pequeñas y lanceoladas (Figura 13, B y D), con numerosas regiones necróticas

sobre la superficie de sus hojas, semejantes a las generadas durante la reacción

hipersensible en una interacción planta-patógeno incompatible; senescencia más

acelerada de sus hojas; desarrollo y crecimiento más rápido de los brotes

laterales, aunque de mucho menor tamaño que la planta sin transformar (Figura

13 A y 14 B); ausencia de un pecíolo bien definido, el cual más bien semeja una

prolongación de la hoja (Figura 15 B) y alteraciones morfológicas en flores, que

fueron más pequeñas y con estambres de talla menor al pistilo, lo cual contrastó

con las flores de plantas de tabaco WT, que normalmente desarrollan estambres

largos que sobresalen del pistilo para permitir la caída del polen maduro sobre

éste y así asegurar la autofecundación (Figura 14 A, Figura 15 D y G a la

derecha, a la izquierda en 15 F y 15 G). Además, los sacos polínicos de las

plantas Nt-LeSYS 03 produjeron muy poco polen. Es muy probable que estas

dos anomalías se combinaron para impedir su autofecundación natural. La

fecundación fue altamente ineficiente, ya que la mayoría de las cápsulas

producidas estaban vacías y solamente en algunas se encontró semilla.

Además, las pocas semillas producidas por las plantas Nt-LeSYS 03 germinaron

mucho más lentamente que las semillas de las plantas no transformadas. De

modo que no se observó emergencia después de un mes de haber sembrado las

semillas de las plantas transformadas, mientras que la germinación de las

semillas de plantas control no tardó más de 3 semanas (Figura 15 A) (Rocha-

Granados, 2004). Por estas características se optó por cultivar esta línea in vitro

para agilizar la generación de las plantas necesarias para los experimentos.

40

CRECIMIENTO

Figura 13 . I. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con

sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). En los paneles A, B, C se pueden observar las

diferencias entre plantas Nt-LeSYS 03 y WT. En el panel (A), se muestran

plantas de la misma estatura pero de diferente edad. Mientras que en los

siguientes páneles se observa clararmente la diferencia en tamaño entre plantas

de la misma edad (B) y en la morfología de las hojas (C y D).

B

C

D

WT Nt-LeSYS 03

WT Nt-LeSYS 03

Nt-LeSYS 03

WT Nt-LeSYS 03

A

41

Figura 14 . II. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con

sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). Observese en el panel (A) hacia la izquierda

que el pístilo sobresale de los estambres. En el panel B se muestra la

generación espontánea en la superficie de las hojas de regiones necróticas

localizadas semejantes a las que se forman durante la reacción hipersensible.

42

GERMINACIÓN FLORACIÓN ANORMAL

DESARROLLO DEL PECIOLO

A

B

D

E

F

G

B C

Figura 15. III. Fenotipo mostrado por plantas de tabaco transformadas con

sistemina de jitomate (Nt-LeSYS). En el panel (A), la semilla de las plantas Nt-

LeSYS 03 presentó un claro retardo en la tasa de germinación, y el desarrollo

subsiguiente de las plántulas fue muy lento con respecto al control, mientras que

en los paneles (B) y (C) las flechas señalan las diferencias en el desarrollo de los

pecíolos de las hojas entre plantas control (B) y las plantas Nt-LeSYS 03 (C). En

los paneles D, E y F, se muestran diferencias morfológicas observadas en las

flores de plantas Nt-LeSYS 03 con respecto al testigo. La fotografía del panel (G)

muestra que las flores de las plantas Nt-LeSYS 03 (derecha) son más pequeñas

que las flores de la planta WT (izquierda). Además, los estambres de las plantas

Nt-LeSYS 03 fueron mas cortos (E, a la Izquierda, F, a la derecha), que los

desarrollados en las plantas control (D, a la derecha, F, a la izquierda) y no

produjeron suficiente polen (tomado de Rocha-Granados, 2004).

43

2.7.3. Resistencia a herbivoría por larvas de Manduca sexta en

plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS

Como se mencionó líneas arriba, estudios previos demostraron que las

plantas de jitomate capaces de expresar el gen de la prosistemina en orientación

antisentido fueron más susceptibles al daño causado por larvas de Manduca

sexta que las plantas control (Orozco-Cárdenas et al., 1993), mientras que

aquellas capaces de expresarlo en orientación sentido presentaron una mayor

resistencia a insectos que se alimentan del contenido celular (Li et al., 2002b).

Tomando en consideración estos antecedentes, era posible esperar que las

plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS presentaran igualmente una mayor resistencia a la

depredación por larvas de Manduca sexta, debido a los altos niveles

constitutivos y/o inducibles de IT, IQT y PFO, que son proteínas involucradas en

las defensas de las plantas contra el ataque de insectos, detectados en algunas

de las líneas (Figura 12). De modo que las plantas Nt-LePS 01, 08, 10 y 32 y Nt-

LeSYS 01, fueron expuestas al ataque continuo de larvas de M. sexta durante 6

días. Los resultados mostrados en las Figuras 16 (A y B) y 17 indican que las

larvas que se alimentaron de las plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS presentaron una

reducción significativa en peso y tamaño en relación a las larvas que se

alimentaron de las plantas control. En la Figura 18 se aprecia también que la

magnitud del daño causado por las larvas en las plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS

fue claramente menor al que se produjo en las plantas control, las cuales fueron

prácticamente defoliadas. Sin embargo, la clara resistencia a la herbivoría por M.

sexta mostrada por todas las líneas de plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS 01 no

coincidió con los resultados obtenidos con la línea LeSYS 03, la cual resultó

altamente susceptible a la herbivoría por larvas de M. sexta (Rocha-Granados,

resultados no publicados) a pesar de que los ensayos bioquímicos mostraron

una acumulación robusta de proteínas relacionadas con defensa en respuesta a

daño mecánico (Figura 12). Esto sugiere que otros factores pudieran estar

involucrados en la resistencia a la herbivoría observada en las plantas

transgénicas; una posibilidad podría ser la acumulación de nicotina y/u otros

metabolitos secundarios asociados con resistencia a insectos, como el ACG y

nornicotina.

44

Figura 16. Larvas de Manduca sexta antes (A) y 6 días después (B) de haber

sido alimentadas con plantas de tabaco sin transformar (B, a la izquierda) o con

plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS (B, a la derecha) (Tomado de Rocha-Granados,

2004).

Figura 17. Análisis del crecimiento de larvas de M. sexta alimentadas con

plantas de tabaco sin transformar y plantas Nt-LePS y Nt-LeSYS. La gráfica

muestra el peso y longitud de las larvas alimentadas en plantas transgénicas y

control, en donde el promedio, error estándar, análisis de varianza y prueba de

significancia se determinaron con una confiabilidad del 95%, usando el paquete

estadístico SPSS 10.0 para Windows. Con un nivel de significancia P≤0.01

(Tomado de Rocha-Granados, 2004).

Control Transformadas

BA

Peso

Longitud

0

2

4

8

6

10

Control Transform adas

Pes

o (

g)

y lo

ng

itu

d (

cm)

a

b

c

d

45

Figura 18. Vista general de la magnitud del daño causado por larvas de M. sexta

en plantas de tabaco sin transformar (control) y transformadas (Nt-LePS y Nt-

LeSYS) (Tomado de Rocha-Granados, 2004).

Control

LePSLePS

46

3. HIPÓTESIS

La resistencia diferencial ante la folivoría por larvas de Manduca sexta y

las alteraciones fenotípicas observadas en plantas transgénicas de Nicotiana

tabacum capaces de sobreexpresar la sistemina o la prosistemina de

Lycopersicon esculentum puede ser el reflejo de modificaciones en la síntesis y

acumulación de metabolitos secundarios relacionados con defensa y/o

desarrollo.

47

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Identificación y cuantificación de metabolitos secundarios en plantas de

tabaco (Nicotiana tabacum) transformadas con sistemina y prosistemina de L.

esculentum en respuesta a daño mecánico, herbivoría por Manduca sexta e

infestación con mosquita blanca (Bemisia tabaci).

4.2. Objetivos específicos

1. Identificación y cuantificación de los niveles basales de metabolitos

secundarios (nicotina, nornicotina, ácido clorogénico y capsidiol),

mediante GC/MS en hoja y raíz de plantas transformadas de tabaco (Nt-

LePS 08, Nt-SYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03) en dos etapas distintas de

desarrollo.

2. Cuantificación de fenoles totales en hoja y raíz de plantas transformadas

de tabaco (Nt-LePS 08, Nt-SYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03) en dos etapas

distintas de desarrollo.

3. Identificación y cuantificación de nicotina, nornicotina, ácido clorogénico y

capsidiol, en hoja y raíz de plantas transformadas de tabaco (Nt-LePS 08,

Nt-SYS 03 y WT x Nt-LeSYS 03) sometidas a daño mecánico, folivoría

por larvas de Manduca sexta e infestación por Bemisia tabaci.

4. Cuantificación de fenoles totales en hoja y raíz de plantas transformadas

de tabaco (Nt-LePS 08, Nt-LeSYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03) sometidas a

daño mecánico, folivoría por larvas de Manduca sexta e infestación por

Bemisia tabaci.

48

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Cultivo de plantas

Las semillas de plantas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03, fueron

germinadas en charolas de germinación y después de 2 semanas se

transplantaron a macetas de 750 ml para plantas jóvenes y macetas de 2.35 l

para plantas adultas con una mezcla general de tierra formada por 3 partes de

Sunshine Mix 3 (SunGro Horticulture, Canada), 1 parte de vermiculita (SunGro

Horticulture, USA) y 1 parte de perlita (Termolita S.A., México). Previamente a la

realización de los experimentos, se realizó la prueba histoquímica de GUS para

la detección de las transformantes (homo y heterocigotas; ver más adelante); las

plántulas que resultaron positivas fueron seleccionadas. Una vez seleccionadas,

se creció una planta por maceta, fertilizandose cada semana con una solución

nutritiva 20-10-20 (N-P-K) (Peters Professional; Scotts-Sierra Horticultural

Products Co, Marysville, OH, EUA).

5.2. Cultivo in vitro de la línea Nt-LeSYS 03

Para el desarrollo de este trabajo se partió de las hojas más jóvenes de

tabaco de la línea Nt-LeSYS 03 las cuales fueron lavadas con jabón comercial y

desinfectadas, por espacio de 10 min en agua destilada estéril + Tween 20 al

0.1% e hipoclorito de sodio (cloro comercial) al 10% (v/v). Posteriormente, fueron

enjuagadas varias veces con agua destilada estéril. Las hojas se fragmentaron

en trozos de 0.5 cm × 0.5 cm; posteriormente se cultivaron in vitro en frascos de

vidrio de 300 ml, con tapa de rosca, que contenían 40 ml de medio MS sólido

(Murashige y Skoog, 1962), el cual contiene lo siguiente:

49

Composición del medio de cultivo Sacarosa o azúcar comercial 30 g Sales de Murashige y Skoog 4.32 g Mioinositol 1 g Vitaminas de Murashige y Skoog 1 ml Bencil amino purina 0.5 mg/l Agar 8 g Nota: ajustar el pH=5.7 ± 1, antes de agregar el agar, cristalizar el medio por 10 minutos en el horno de microondas y esterilizar a 121 ºC por 20 min.

La regeneración a partir de hoja tardó aproximadamente 2 meses y

medio, hasta la obtención de plántulas a una temperatura de 25 ºC, con un

fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad, cambiando una sola vez el tejido a

cultivo nuevo. A partir de tallos de plántulas la regeneración tarda de 15 a 20

días. Después de este lapso de tiempo, las plántulas de esta línea se utilizaron

para posteriores experimentos.

5.3. Preparación de X-Gluc

Para realizar la prueba histoquímica de GUS, se utilizó el método descrito

por Jefferson et al., (1987). El ensayo se realizó cuando las plántulas

presentaban un par de hojas bien desarrolladas. Para ello se tomaron pequeños

segmentos de hoja de plantas transformadas de tabaco Nt-LePS 08, Nt-SYS 03,

así como de la cruza de WT × Nt-LeSYS 03 los cuales fueron sumergidos en la

solución X-Gluc y puestos en la oscuridad a 37 °C durante toda la noche. La

clorofila de los tejidos fue removida lavando varias veces con etanol al 70%.

Finalmente se lavaron con una mezcla de metanol: acetona, 3:1 (v/v), hasta que

pudieron verse claros. Los tejidos ya desteñidos se visualizaron en un

microscopio estereoscópico.

La solución “stock” para la preparación del X-Gluc consistió de los siguientes

reactivos:

50

Solución “stock” Concentración final Mezcla (ml)

NaH2PO4 al 1 M 100 Mm 10.0 EDTA 0.5 M pH 8 10 Mm 20.0 Ferrocianuro de potasio 0.005 M, pH 7

0.5 Mm 10.0

X-Gluc 0.02 M* 1 mM 1.0 Triton X-100 10% 0.1 % 0.1 Agua destilada _ 58.9 *en 50 mg/ml de dimetilformamida o DMSO

Una vez preparada la solución “stock”, se esterilizó por filtración (0.22 µm) y se

almacenó en la oscuridad a 4 °C.

5.4. Ensayos de daño mecánico

Para realizar los experimentos de daño mecánico se utilizaron tres plantas

de tabaco de cada una de las líneas en estudio, Nt-LePS 08, Nt-SYS 03 y WT ×

Nt-LeSYS 03. Como controles se usaron tres plantas WT por cada línea

transformada utilizada.

Plantas jovenes de cuatro semanas que presentaban 4 hojas bien

desarrolladas fueron heridas en su 3ª hoja (considerando como la primera hoja a

la más desarrollada, en la base de la planta) utilizando unas pinzas metálicas de

disección estériles y presionando cuatro veces a lo largo de la hoja y

perpendicularmente a la vena principal. Después del quinto día se colectaron las

hojas dañadas (respuesta local) y la hoja adyacente superior sin dañar

(respuesta sistémica). De igual forma, el ensayo se realizó en plantas adultas de

siete semanas, con 16-20 hojas bien desarrolladas. Para ello, la hoja media (hoja

8, 9 o 10), que representa la transición entre tejido fuente-consumidor en N.

tabacum (Masclaux et al., 2000) fue herida; esta hoja (respuesta local), las hojas

distales intactas, inferior (hacia la base) y superior (hacia el ápice), localizadas

filotácticamente en un ángulo de 0° con respecto a la hoja dañada y la raíz

51

fueron colectadas 5 días después de haber aplicado el daño (respuestas

sistémicas).

5.5. Bioensayos

5.5.1. Condiciones del experimento de herbivoría co n M. sexta

Para este experimento se utilizaron las mismas líneas de plantas

transgénicas de tabaco empleadas anteriormente para los ensayos de daño

mecánico. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento (Conviron,

USA) a una temperatura constante de 28 °C y bajo un fotoperiodo de 16 h luz y

8 h oscuridad. Las larvas de Manduca sexta Linnaeus empleadas se

encontraban en el quinto instar de desarrollo. Estas larvas fueron crecidas en el

insectario del Cinvestav-Unidad Irapuato y alimentadas con una dieta artificial, a

base de germen de trigo, caseína, azúcar, levadura y una mezcla de sales,

suplementada con vitaminas (Yamamoto, 1964). Las larvas permanecieron sin

alimento durante un período de 12 h previo al inicio del experimento. El ensayo

de herbivoría se realizó cuando las plantas alcanzaron una longitud de 40 cm y

tenían entre 16 y 20 hojas bien desarrolladas; este bioensayo se inició colocando

una larva de M. sexta por planta, en la parte media de la planta (hoja de

transición entre tejido fuente-consumidor). Las larvas se alimentaron libremente

por un periodo de 24 horas. Transcurrido este tiempo, las larvas se retiraron de

las plantas; la colección del tejido (hoja dañada, hojas distales en la región apical

y basal y raíz) fue hasta cinco días después.

52

5.5.2. Infestación con mosquita blanca ( Bemisia tabaci)

Para realizar estos ensayos se utilizaron 70 mosquitas (Bemisia tabaci

Gennadius) libres de virus y recién emergidas para infestar 2 hojas por planta

(35 mosquitas/hoja). Las plantas que se utilizaron fueron plantas jóvenes de

cuatro hojas, en las cuales se colocaron 2 pequeñas jaulas (“clip cages”; de 4 cm

de diámetro y 3.5 cm de altura) fabricadas a partir de vasitos de unicel del

número cero, adheridas a las hojas 2 y 3, contando desde la base de la planta.

En éstas se introdujeron las mosquitas para obligarlas a ovipositar en un área

delimitada de la hoja por un período de 24 h. Una vez transcurrido este tiempo,

las mosquitas fueron retiradas y las plantas se mantuvieron por 28 días

adicionales en un cuarto de crecimiento (2.3 m [ancho] × 4.2 m [largo] × 3 m

[alto]), bajo condiciones controladas de luz, temperatura y fotoperíodo (16 h luz a

28°C/8 h oscuridad a 20° C), para permitir la terminación del ciclo de vida de la

mosquita blanca. Una vez cumplidos los 28 días se consideró a las dos hojas

infestadas originalmente como hojas locales, mientras que las hojas distales

localizadas filotácticamnte en un ángulo de 0° (considerado el tejido con la

máxima conección vascular con las hojas infestadas), en la parte basal y apical

de la planta, respectivamente, y la raíz, fueron colectadas para medir la

respuesta sistémica.

5.6. Preparación de extractos

La extracción de metabolitos secundarios, se llevó a cabo a partir de tejido

molido (con N2 líquido) y congelado (a − 80 °C) de hoja y raíz, de las líneas

seleccionadas Nt-LePS 08, Nt-SYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03 sometidas a los

diferentes tratamientos anteriormente descritos. Para ello, se pesaron 200 mg de

tejido fresco en 1 ml de una solución de metanol acuoso (40% metanol v/v)

conteniendo 0.5% (v/v) de ácido acético y 0.1 mg/ml de timol, el cual se empleó

como estandar interno, para el análisis por GC/MS. Las mezclas se agitaron

vigorosamente por 2 horas a 4 °C y se centrifugaron por 15 minutos a 12,000

53

rpm y a la misma temperatura. Los sobrenadantes obtenidos se filtraron y fueron

utilizados inmediatamente para el análisis de los metabolitos de interés.

5.7. Análisis de fenoles totales

La cuantificación de fenoles totales presentes en los extractos

metanólicos se realizó de acuerdo al método de Folin (Swain y Hillis, 1959)

adaptado para su uso en microplacas de 96 pozos. Para ello, se tomaron 10 µl

de muestra y se aforaron a 50 µl con agua desionizada. Se agregarón 50 µl del

reactivo de Folin (diluído en una proporción 1:2) y 100 µl de carbonato de sodio

al 7.5% (w/v). La mezcla se incubó a 45 ºC por 15 minutos y se dejó enfriar a

temperatura ambiente por 10 a 15 min. Las lecturas se hicieron en un lector de

placas (Ultramark; Microplate Imaging System; BioRad Laboratories, Hercules,

CA, EUA) por triplicado a una longitud de onda de 750 nm y se compararon con

una curva patrón preparada con ácido caféico (en un rango de 15 a 500 µg/ml).

5.8. Condiciones para cuantificar e identificar met abolitos secundarios por

GC/MS

5.8.1 Derivatización

Para el análisis de metabolitos secundarios por GC/MS, fue necesario

producir derivados silanizados de menor polaridad con la finalidad de

incrementar su volatilidad y su estabilidad térmica. Para ello, se siguió la

metodología descrita por Fiehn et al., (2000). De modo que los extractos

metanólicos acidificados (250 µl) se evaporaron a sequedad empleando un

sistema de concentración al vacío (Heto Maxi Dri Lyo, Termo Electron

Corporation, Allerød, Dinamarca). Posteriormente, los extractos secos fueron

derivatizados inicialmente en una solución de 50 µl de piridina en 20 µl

metoxiamina, la segunda reacción de derivatización se inició inmediatemente

después de este tiempo mediante la adición directa de 80 µl de metil-trimetil-

54

sililtrifluoracetamina (MSTFA). La nueva mezcla reactiva se incubó a 37 °C por

30 minutos. Las mezclas derivatizadas se dejaron reposar por dos horas a 25 ºC

antes de inyectar la muestra al sistema GC/MS. La metoximación y la

trimetilsilanización están diseñadas para permitir la derivatización y análisis de

hidroxi y amino ácidos, alcoholes, azúcares, poliaminas y ácidos aromáticos,

entre otros (Fiehn et al., 2000).

5.8.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrome tría de masas

(GC/MS).

Los compuestos derivatizados fueron analizados por medio de

cromatografía de gases usando un cromatógrafo de gases (Hewlett-Packard

5890 Series II), equipado con una columna capilar HP-1 de 30 m de largo, 0.25

mm de diámetro interior y 0.25 µm de película fina a base de dimetilpolisiloxano y

acoplado a un detector selectivo de masas (Hewlett-Packard/MSD 5972 series).

Se empleó helio como gas acarreador, a un flujo constante de 1 ml/min. La

temperatura del inyector fue mantenida a 230 °C y a una presión de 8.75 psi.

Para realizar las separaciones, se usó el siguiente perfil de tiempo/temperatura:

la temperatura inicial del horno fue de 70 °C, seguido por un incremento gradual

de la temperatura hasta 310 °C, a una velocidad 1.0 °C/min. El tiempo total de

corrida fue de 54 minutos; cada una se inició después de la inyección de 1 µl de

las muestras derivatizadas. Los picos fueron identificados mediante la

comparación con los espectros de masas y tiempos de retención de estándares

comerciales de referencia.

5.9. Curvas de calibración

Se realizaron curvas de calibración para nicotina, nornicotina, ácido

clorogénico y capsidiol. Las curvas se hicieron usando estandares comerciales

(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) con excepción del capsidiol,

el cual se purificó, por medio de cromatografía fina, a partir de extractos de fruto

55

de chile ancho (Capsicum annuum) tratado con hemicelulasa de Aspergillus

niger (Brooks et al., 1985). Los estándares se derivarizaron igual que las

muestras, a excepción de la nicotina, la cual se diluyó con metanol e inyectó

directamente. Para la derivatización, se tomaron 10 µl de cada una de las

muestras empleadas para generar las curvas tipo, las cuales se evaporaron a

sequedad, para ser posteriormente derivatizadas en las mismas condiciones que

se emplearon para las muestras problema. Cada punto de la curva de calibración

se preparó por duplicado y se evaluó por GC/MS.

Los resultados obtenidos fueron analizados para obtener las curvas de

calibración de cada uno de los metabolitos, incluyendo sus respectivas

pendientes y coeficientes de correlación r (que fueron superiores a 0.95 en todos

los casos). Con estas curvas se obtuvieron las ecuaciones para cuantificar cada

uno de los metabolitos de interés (ver apéndice).

5.10. Análisis estadístico

Se analizaron tres plantas por línea seleccionada para el experimento de

daño mecánico y mosquita blanca, y de tres a cinco plantas por línea para el

experimento de herbivoría. Las lecturas se hicieron por duplicado en todos los

análisis por GC-MS. Para el análisis de fenoles totales, cada extracto se midió

por triplicado. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía

(ANOVA), utilizando para ello el programa JMP, versión 3.1.6.2., para Windows.

Los datos se reportaron como medias. Éstas se compararon entre sí para

detectar diferencias significativas empleando el método de Tukey, que es un

estimador que permite diferenciar valores calculados con un valor tabulado que

se determina en base a los grados de libertad y a una probabilidad de error.

56

6. RESULTADOS

6.1. Identificación de metabolitos secundarios de i nterés por GC/MS, en

plantas jóvenes y adultas

El análisis de los metabolitos de interés se realizó por GC/MS, que resultó

ser una técnica analítica más versátil para el análisis de un elevado número de

muestras que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cuyo uso se

exploró también en este trabajo (resultados no mostrados). La identificación se

hizo por comparación con el tiempo de retención y espectro de masas de

compuestos de referencia disponibles comercialmente (ej., nicotina, nornicotina,

y ácido clorogénico) o bien purificados a partir de tejidos vegetales (e.g.,

capsidiol). Esta estrategia se empleó debido a la relativa complejidad de los

cromatogramas (se muestra un ejemplo típico en la Fig. 19), en los cuales se

podían apreciar numerosos picos cuyos espectros de masa resultaron de difícil

interpretación debido a que muchos de ellos se encontraban aparentemente

modificados, especialmente por oligosacáridos. La comparación entre el tiempo

de retención y espectro de masas de los compuestos de interés presentes en las

soluciones de referencia y en los extractos metanólicos crudos de tabaco

analizados, se muestran a continuación para nicotina (Figs. 20 y 21), ácido

clorogénico (Figs. 22 y 23), capsidiol (Figs. 24 a 26) y nornicotina (Figs. 27 y 28).

En este último caso, sólo se pudo detectar un producto de degradación del

capsidiol en los extractos, lo que coincidió con la conocida inestabilidad de este

compuesto in vivo (Ward et al., 1977; Guedes et al., 1982; Whitehead et al.,

1987; Threlfall y Whitehead, 1988).

C

57

Figura 19. Cromatograma típico obtenido al separar extractos metanólicos

derivatizados de hoja de Nicotiana tabacum por GC/MS. La nicotina emergió

después de 15.83 min (*); timol (T), empleado como estándar interno) después

de 15.71 min (*); nornicotina después de 20.05 min (*); el posible producto de

degradación del capsidiol (dihidrocapsenona) después de 32.78 min (*), y el

ácido clorogénico después de 48.83 min (*).

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

1e+07

1.1e+07

1.2e+07

Time-->

Abundance

TIC: NT193b.D

* T

*

32.78 48.83 20.05 *

* 15.83

58

Figura 20. A) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de nicotina, con un

tiempo de retención de 15.80 min (*), y B) su correspondiente espectro de

masas.

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

2200000

2400000

Time-->

Abundance

TIC: nic102a.D 15.80

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 1700

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

m/z-->

Abundance

Scan 2173 (15.811 min): nic102a.D84

133

161

42119926551 77 105 14530 58 99

A

B

*

59

Figura 21. A) Cromatograma típico de GC/MS de un extracto de hojas de

Nicotiana tabacum, identificando a nicotina con un tiempo de retencion de 15.83

min (*) , y B) su correspondiente espectro de masas.

14.50 15.00 15.50 16.00 16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 19.00

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

Time-->

Abundance

TIC: NT193b.D

14.20

14.84

15.35

15.39

15.70

15.83 16.74

16.82 18.57

19.02

A

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

m/z-->

Abundance

Scan 2360 (15.821 min): NT193b.D84

133

161

42119

65105 145 299207

٭

B

60

Figura 22. A) Cromatograma de GC/MS del estándar puro del ácido

clorogénico, con un tiempo de retención de 48.90 min (*), y B) su espectro de

masas.

38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 52.00

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

6500000

7000000

7500000

8000000

8500000

9000000

9500000

1e+07

1.05e+07

1.1e+07

1.15e+07

1.2e+07

1.25e+07

Time-->

Abundance

TIC: clorogenico30a.D

47.22

48.90

A

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

m/z-->

Abundance

Scan 8289 (48.812 min): clorogenico30a.D345

73

255 307

147

219191

397372

283 419103 16745 462127 491

*

B

61


Nicotiana tabacum, identificando al ácido clorogénico con un tiempo de retencion

de 48.83 min (*), y B) su correspondiente espectro de masas.

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

m/z-->

Abundance

Scan 8479 (48.829 min): NT193b.D345

73

255 307

147

219191397

372283 41916745 103 326 462123

46.50 47.00 47.50 48.00 48.50 49.00 49.50 50.00 50.50 51.00 51.50 52.00

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

650000

700000

750000

800000

Time-->

Abundance

TIC: NT193b.D

48.83*

A

B

62

Figura 24. A) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de capsidiol [32.35

min (*)] derivatizado y un producto de degradación estable [posiblemente

capsenona, con un tiempo de retención de 32.18 min (*),, y B) el espectro de

masas correspondiente al pico surgido a los 32.18 min.

31.8031.9032.0032.1032.2032.3032.4032.5032.6032.7032.8032.9033.0033.100

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

Time-->

Abundance

TIC: estCAP1.D

32.18

32.35

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

22000

24000

26000

28000

30000

32000

m/z-->

Abundance

Scan 5393 (32.187 min): estCAP1.D73

319

147

220

189103 243

45 169 361271 451291

*

A

B

*

63

Figura 25. A) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de capsidiol [32.35

min (*)] derivatizado y un producto de degradación estable [posiblemente

capsenona, con un tiempo de retención de de 32.18 min (*), y B) el espectro de

masas correspondiente al pico surgido a los 32.35 min.

31.8031.9032.0032.1032.2032.3032.4032.5032.6032.7032.8032.9033.0033.100

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000

Time-->

Abundance

TIC: estCAP1.D

32.18

32.35

A

* *

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

16000

17000

18000

19000

20000

21000

22000

23000

24000

25000

m/z-->

Abundance

Scan 5421 (32.338 min): estCAP1.D73

365

275

290

219249

11715791

193133

45380234

319173 337

B

64


Nicotiana tabacum, identificando a un posible producto de degradación del

capsidiol con un tiempo de retencion de 32.78 (*), y B) su correspondiente

espectro de masas.

32.3032.4032.5032.6032.7032.8032.9033.0033.1033.2033.3033.4033.5033.60

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

240000

260000

280000

300000

320000

340000

Time-->

Abundance

TIC: NT193b.D

32.78

50 100 150 200 250 300 350 400 4500

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

22000

24000

26000

28000

30000

32000

34000

36000

38000

40000

42000

44000

46000

48000

m/z-->

Abundance

Scan 5503 (32.775 min): NT193b.D204

73

319

147

10323345 259172 291 466361128

*

A

B

65

Figura 27. A) Cromatograma de GC/MS del estándar puro de nornicotina

derivatizado, con un tiempo de retención de 20.57 min (*), y B) su


30 40 50 60 70 80 90 1001101201301401501601701801902002102200

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

16000

17000

18000

19000

m/z-->

Abundance

Scan 3063 (20.618 min): nornicotinastd3a.D142

73

205220

191

45 5911832 17710688 132

16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

Time-->

Abundance

TIC: nornicotinastd3a.D 20.54A

B

*

66

Figura 28. A) Cromatograma típico de GC/MS de un extracto metanólico

derivatizado de hojas de Nicotiana tabacum, identificando a la nornicotina con un

tiempo de retención de 20.57 min (*), y B) su correspondiente espectro de

masas.

30 40 50 60 70 80 90 1001101201301401501601701801902002102200

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

m/z-->

Abundance

Scan 3055 (20.569 min): NT19b.D142

73

205

220

1914559 8432 117100 177161

20.44 20.46 20.48 20.50 20.52 20.54 20.56 20.58 20.60 20.62 20.64 20.66

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Time-->

Abundance

TIC: NT19b.D

20.57

A

B

*

67

6.2. Cuantificación de nicotina en plantas jóvenes y/o adultas

6.2.1. Tratamiento: daño mecánico

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 29. En plantas WT

adultas (Fig. 29 B), se detectó un aumento altamente significativo en los niveles

de nicotina en la hoja dañada (de 2.2 a 5.9 µg/mg peso freso [PF]), hojas distales

intactas (superior: de 1.4 a 5.2 µg/mg peso freso [PF]; inferior: de 2.0 a 2.7

µg/mg peso freso [PF]) y raíz (de 0.96 a 1.22 µg/mg peso freso [PF]). Aunque

todas las diferencias se produjeron con un nivel de significancia p <0.01, éstas

fueron más marcadas en la hoja dañada y en la hoja distal joven. La inducción

en la hoja distal vieja está de acuerdo con la generación de señales

bidireccionales que podrían ser de diferente naturaleza química, en coincidencia

con los resultados reportados por Schittko y Baldwin (2003).

En plantas de la cruza transgénicas WT × Nt-LeSYS 03, se observó un

patrón de inducción casi idéntico al de plantas WT, excepto por la falta de una

inducción local significativa, quizás como consecuencia de los niveles basales

más altos que los observados en plantas WT. La acumulación de nicotina

inducida por daño en raíces de esta línea de plantas fue la más alta detectada

(de 0.88 a 2.12 µg/mg PF).

En plantas de las líneas Nt-LeSYS 03 y Nt-LePS 08, los niveles basales

también resultaron más altos que en plantas WT. Además, se observó una

acumulación de nicotina inducida por daño más intensa, en particular en la hoja

dañada (respuesta local: de 3.3 y 3.7 a 7.3 y 7.2 µg/mg PF, respectivamente) y

la hoja distal joven (respuesta sistémica en dirección hacia el ápice: de 4.62 y

4.69 a 9 y 8.23 µg/mg PF, respectivamente). No se observó inducción sistémica

de nicotina en respuesta al daño en la hoja distal inferior (en dirección hacia la

base) de plantas Nt-LeSYS 03. En estas plantas se observaron los niveles de

nicotina más bajos en raíz, tanto basales como inducidos por daño (0.6 y 0.85

µg/mg PF, respectivamente).

En resumen, los resultados obtenidos en plantas adultas dañadas indican

que: i) los niveles basales de nicotina en plantas adultas intactas fueron más

altos en plantas transformadas que en plantas WT, excepto en la raíz de plantas

68

Nt-SYS 03, y ii) la inducción local y sistémica (en hojas distales apicales) de

nicotina por daño mecánico fue más intensa en las líneas Nt-LePS 08 y Nt-

LeSYS 03.

Los niveles basales de nicotina en hoja y raíz de plantas WT jóvenes

resultaron similares a los detectados en plantas adultas (2.2 y 0.9 µg/mg PF,

respectivamente) (Fig. 29 A). Sin embargo, el daño mecánico en plantas jóvenes

no indujo una acumulación local de nicotina, mientras que en hojas distales se

detectó una reducción significativa en los niveles de nicotina (de 3 a 2.1 µg/mg

PF).

En general, el efecto causado por daño mecánico en plantas transgénicas

jóvenes fue similar (neutro o negativo) al observado en plantas WT. Sólo se

detectaron niveles superiores a los de las plantas intactas en la respuesta local

en la línea Nt-LeSYS 03 y en la respuesta sistémica en plantas WT × Nt-LeSYS

03. En contraste, los niveles de nicotina, locales y sistémicos (en hoja y raíz),

detectados en las plantas Nt-LePS 08 fueron significativamente inferiores a los

detectados en plantas intactas (1.12 vs 1.21, 1.0 vs 1.6 y 0.73 vs 0.54 µg/mg PF

en hoja dañada, hoja distal y raíz de plantas dañadas e intactas,

respectivamente).

6.2.2. Tratamiento: herbivoría por larvas de M. sexta (plantas adultas)

En plantas WT, el aumento en los niveles de nicotina causado por

herbivoría en la hoja dañada fue similar al observado en plantas dañadas

mecánicamente, mientras que en la raíz, la acumulación de nicotina fue

aproximadamente 5 veces mayor a la inducida por daño mecánico (1.2 vs. 6.2

µg/mg PF). A su vez, no se detectaron diferencias en la acumulación sistémica

de nicotina entre ambos tratamientos (Fig. 30).

En todas las plantas transgénicas dañadas por larvas de M. sexta se

observó una marcada reducción en la acumulación de nicotina en todos los

tejidos analizados, con respecto a niveles basales detectados en plantas

transformadas no dañadas de la misma edad, particularmente en raíz. Este

efecto fue mucho más evidente en las líneas Nt-LePS 08 (Fig. 30 B), y en WT ×

69

PLANTA JÓVEN PLANTA ADULTA

Figura 29. Niveles de nicotina en plantas (jóvenes y adultas) WT y transgénicas

intactas (0 h) y cinco días después de haber sido sometidas a daño mecánico (5

día). En hoja local (HL), hoja sistémica (HS), hoja distal vieja (HDV), hoja distal

jóven (HDJ) y raíz. Los asteriscos indican la diferencia estadísticamente

significativa (P ≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).

WT

0

1

2

3

4

HL HS RAÍZug N

icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día

*

A

WT X Nt-LeSYS 03

0

1

2

HL HS RAÍZug N

icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día **

C

Nt-LePS 08

0

1

2

HL HS RAÍZug N

icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día

**

*****

*

E

Nt-LeSYS 03

0

1

2

3

4

HL HS RAÍZug N

icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día *

G

WT

0

2

4

6

8

HL HDV HDJ RAÍZug N

icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día

**

**

*

**

B

WT X Nt-LeSYS 03

0

2

4

6

8


icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día

****

**

D

Nt-LePS 08

02468

10


icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día

*

****

**

F

Nt-LeSYS 03

02468

10


icot

ina/

mg

PF

0 h

5 día

**

****

H

70

Nt-LeSYS 03 (Fig. 30 A) que en la línea Nt-LeSYS 03 (Fig. 30 C). Esto se reflejó

en la detección de contenidos de nicotina en las plantas transgénicas dañadas

por M. sexta que fueron marginal o significativamente inferiores a los observados

en plantas WT igualmente tratadas.

Los resultados indicaron que la sobreexpresión de LePS y LeSYS en N.

tabacum, causó una represión generalizada de la acumulación de nicotina en

respuesta a herbivoría por M. sexta. Este efecto se observó en todos los tejidos

analizados, particularmente en raíz, y en menor proporción en las hojas dañada

y distal superior. Mientras tanto, la acumulación de nicotina inducida por

herbivoría en plantas WT se detectó únicamente en las hojas dañadas y la raíz.

En raíz, la inducción fue sumamente fuerte: 6.5 × los niveles detectados en raíz

de plantas intactas, y 5.1 × los niveles detectados en raíz de plantas dañadas

mecánicamente.

6.2.3. Tratamiento: infestación por mosquita blanca (plantas

adultas)

Los resultados obtenidos al analizar las plantas en estudio al término del

ciclo de vida de B. tabaci (28 días), en los cuales se compararon los niveles de

nicotina acumulados en plantas WT con cada una de las líneas transgénicas, se

muestran en la Figura 31 (A-C). Los niveles de nicotina detectados en la hoja

infestada y en la raíz de las plantas WT resultaron menores a los niveles basales

de nicotina en plantas intactas de edad similar, especialmente en raíz, donde se

observó una reducción a niveles no detectables. A su vez, se observó un ligero

incremento de nicotina (×1.5) en la hoja distal superior.

En forma similar a lo observado en los ensayos con M. sexta, la

infestación con B. tabaci en las tres líneas de plantas transgénicas redujo

marcadamente los niveles de nicotina en relación a plantas transgénicas intactas

de la misma edad. Este efecto se reflejó más claramente en la hoja infestada y la

raíz. En dos líneas (WT × Nt-LeSYS 03 y Nt-LePS 08), ver Figs. 31 A y B, la

nicotina en raíz se redujo a niveles no detectables, mientras que ésta se

mantuvo sin cambio en la línea Nt-LeSYS 03 (Fig. 31 C).

71


transgénicas adultas, 5 días después de haber sido expuestas a herbivoría por

larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV), hoja

distal jóven (HDJ) y raíz. Los asteriscos indican la diferencia estadísticamente


0

2

4

6

8

HL HDV HDJ RAÍZ

ug N

icot

ina/

mg

PF

WT

Nt-LePS 08

**** **

B

0

2

4

6

8

HL HDV HDJ RAÍZ

ug N

icot

ina/

mg

PF

WT

Nt-LeSYS 03

**

**

C

0

2

4

6

8

HL HDV HDJ RAÍZ

ug N

icot

ina/

mg

PF

WTWT X Nt-LeSYS 03

**

*** **

A

72

Al comparar los niveles de nicotina presentes en plantas infestadas WT y

transgénicas, se observó un incremento significativo en la respuesta local y

sistémica en follaje de plantas Nt-LePS 08 (Fig. 31 B). En las plantas Nt-LeSYS

03 (Fig. 31 C), la acumulación sistémica de nicotina fue significativamente

superior a la observada en plantas WT, particularmente en raíz, mientras que el

efecto represor de la infestación por MB fue muy fuerte en plantas WT × Nt-

LeSYS 03 (Fig. 31 A), cuyos niveles de nicotina en hoja infestada y hoja distal

superior fueron significativamente inferiores a los detectados en plantas WT

infestadas.

Los resultados obtenidos indica que la infestación por B. tabaci no tuvo un

efecto evidente sobre la inducción de la acumulación de nicotina en hojas de

plantas WT (±1.5× los niveles basales detectados en plantas intactas de la

misma edad), pero redujo drásticamente la acumulación de nicotina en raíz (a

niveles no detectables). Curiosamente, la ausencia de nicotina en la raíz de

plantas infestadas no se observó en la línea Nt-LeSYS 03 (Fig. 31 A), mientras

que los niveles de nicotina en las hojas de las plantas transgénicas infestadas

Nt-LePS 08 (respuesta local y sistémica; Fig. 30 B) y Nt-LeSYS 03 (sólo

respuesta sistémica; Fig. 31 C), fueron significativamente superiores a los

detectados en plantas WT, pero menores a los niveles basales detectados en las

plantas transgénicas intactas de la misma edad. Finalmente, en las plantas WT ×

Nt-LeSYS 03 infestadas se observó una represión de la acumulación de nicotina

en hojas, la cual fue significativamente menor a la observada en plantas WT.

6.3. Cuantificación de ácido clorogénico en plantas jóvenes y/o adultas


Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 32 A (plantas

jóvenes) y 32 B (plantas adultas). En general, el contenido de ácido clorogénico

(ACG) detectado tanto en hoja como en raíz fue más alto que el reportado en la

literatura, inclusive al ser comparado con los niveles detectados en plantas de N.

tabacum capaces de altas tasas de síntesis de fenilpropanoides causada po

73


transgénicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia tabaci (28

días después de la oviposición). En hoja local (HL), hoja sistémica (HS) y raíz.

Los asteriscos indican la diferencia estadísticamente significativa (P ≤ 0.05*; P ≤

0.01 **).

0

2

4

6

HL HS RAÍZ

ug N

icot

ina/

mg

PF

WT

Nt-LePS 08

**

**

B

0

1

2

3

HL HS RAÍZ

ug N

icot

ina/

mg

PF

WT

Nt-LeSYS 03**

**

**

C

0

1

2

3

HL HS RAÍZ

ug N

icot

ina/

mg

PF

WT

WT X Nt-LeSYS 03

****

A

74

redireccionamiento de la ruta biosintética de los fenilpropanoides debido a la

sobreexpresión de FAL (Howles et al., 1996), de una enoil-CoA hidratasa

bacteriana (Mayer et al., 2001) o del gen C58-6b de Agrobacterium tumefaciens

(Gális et al., 2002). En estos casos, los niveles máximos reportados fueron de

0.3 a 5 µg/mg PF. Esta discrepancia posiblemente refleje diferencias entre

variedades de N. tabacum, en forma similar a lo que se ha reportado entre

especies de Nicotiana. Por ejemplo, en la especie silvestre N. attenuata los

niveles de ACG son extremadamente bajos, de aproximadamente 27 µg/g PF

(Keinänen et al., 2001). Las diferencias observadas también podrían haberse

debido al empleo de GC/MS, en lugar de otras técnicas como HPLC/MS, para su

aislamiento y cuantificación.

En plantas WT adultas (Fig. 32 B), los niveles basales promedio de ácido

clorogénico (ACG) detectados fueron los siguientes: 9.01 µg/mg PF (hoja de

transición entre tejido consumidor-tejido fuente [C-F], u hoja local), y 4.3 y 4.1

µg/mg PF en las hojas distales vieja y joven, respectivamente. En raíz, los

niveles de ACG fueron más bajos (1.7 µg/mg PF). El daño mecánico indujo un

incremento significativo en los niveles de ACG tanto local como sistémico y en

todos los tejidos analizados: es decir, se detectó una acumulación de ACG que

fue 1.5, 1.2, 1.3 y 1.18 veces más alta que en plantas intactas en la hoja dañada,

en hojas distales inferior y superior y en raíz, respectivamente.

En la línea WT × Nt-LeSYS 03 los niveles basales de ACG en todos los

tejidos analizados, excepto la hoja de transición tejido consumidor-tejido fuente

(C-F), fueron superiores a los detectados en las plantas WT (entre 1.95 [raíz] y

3.8 [hoja distal inferior] veces más altos). Sin embargo, el daño mecánico causó

una disminución significativa en los niveles de ACG en todos los tejidos

analizados de estas plantas (entre 2.4 [respuesta sistémica en raíz] y 5.3

[respuesta sistémica en hoja distal superior] veces más bajos).

Al comparar los niveles basales de ACG en plantas WT y Nt-LePS 8, se

observó una drástica reducción (27× menores), a valores casi indetectables, en

la hoja de transición C-F (hoja local) de ésta última, mientras que en las hojas

distales inferior y superior, y en raíz, los niveles basales de ACG fueron

superiores a los de las plantas WT (1.5× [hoja distal inferior], 4.1× [hoja distal

superior] y 1.3× [raíz] veces más altos). Curiosamente el daño mecánico causó

75

un incremento significativo en ACG solamente en los tejidos aéreos más viejos

de plantas de esta línea (hoja C-F o local [25×] y hoja distal inferior [1.6×]); en

raíz y en la hoja distal superior se observó una disminución significativa, la cual

fue mucho más marcada en éste último tejido (13×). En plantas WT × Nt-LeSYS

03 se detectó una disminución altamente significativa de ACG en todos los

tejidos de las plantas dañadas.

En la línea Nt-LeSYS 03 se observó una disminución generalizada en los

niveles basales de ACG, los cuales fueron entre 2.5 (raíz) y 6.2 (hoja C-F) más

bajos que los detectados en plantas WT intactas. Al igual que la línea WT × Nt-

LeSYS 03, el daño mecánico provocó una disminución altamente significativa en

los niveles de ACG en tejido aéreo, particularmente la hoja distal inferior

(respuesta sistémica basal) donde el ACG disminuyó a valores no detectables.

En cambio, esta línea fue la única en la cual se detectó una acumulación

significativa de ACG en raíces de plantas dañadas.

Los niveles basales de ACG en plantas WT jóvenes fueron menores a los

detectados en las plantas adultas, particularmente en la hoja inferior, u hoja

“local” (0.56 µg/mg PF) (Fig. 32 A). Los niveles de este metabolito fueron 16

(hoja inferior), 3.3 (hoja superior) y 4.5 veces más bajos que los detectados en la

hojas C-F y distal inferior, y raíces de plantas adultas, respectivamente. Un

comportamiento similar se observó en las tres líneas de plantas transgénicas. A

su vez, el daño mecánico en plantas WT sólo produjo una acumulación sistémica

significativa de ACG en las hojas inferiores adyacentes intactas y en la raíz.

Los niveles basales de ACG en hojas de las tres líneas de plantas

transgénicas analizadas fueron menores a los detectados en las plantas WT,

particularmente en las hojas de la línea Nt-LeSYS 03, donde no se detectó este

metabolito en las hojas inferiores. En hojas jóvenes adyacentes superiores los

niveles se redujeron, entre 3.0 y 3.6 veces, con respecto a hojas similares en

plantas WT. La respuesta sistémica al daño mecánico en la línea WT × Nt-

LeSYS 03 fue similar a la observada en plantas WT, mientras que en las raíces

de plantas dañadas se observó una desaparición de ACG. La ausencia de ACG

en raíces de plantas dañadas también se observó en la línea Nt-LePS 08.

Asimismo, el daño mecánico causó una reducción significativa de ACG a nivel

local (Nt-LePS 08) y sistémico (Nt-LeSYS 03). Resultó interesante observar la

76

completa falta de respuesta local al daño mecánico en esta última línea, lo cual

contrastó con la acumulación de ACG en raíz, cuyos niveles fueron los más

elevados de todas las plantas en estudio.

En síntesis, los niveles de ACG en tabaco están al parecer regulados por

el estado de desarrollo de la planta, ya que se incrementaron notablemente en

plantas WT adultas. El estado de desarrollo de la planta también ejerció una

influencia sobre la acumulación de ACG en follaje en respuesta al daño

mecánico en plantas WT, ya que ésta fue detectada tanto en forma local como

sistémica en plantas adultas, mientras que en plantas jóvenes solo se observó

en forma sistémica, incluyendo la raíz. Excepto en casos aislados, se observó

una disminución generalizada en los niveles de ACG basales e inducidos por

daño en las plantas transformadas, la cual también se vio fuertemente influida

por el estado de desarrollo de la planta. El ejemplo más claro de esta tendencia

se observó en la línea WT × Nt-LeSYS 03, que en hojas de plantas jóvenes se

comportó en forma similar a las plantas WT, detectándose un incremento

significativo de ACG en respuesta al daño en tejido sistémico, mientras que en

plantas adultas el daño causó una disminución significativa en los niveles de

ACG en todos los tejidos analizados. Asimismo, los niveles de ACG, tanto

basales como inducidos por daño, se redujeron drásticamente tanto en plantas

jóvenes (líneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03) como adultas (línea Nt-LeSYS 03).

Esta última línea se distinguió por la alta acumulación constitutiva de ACG en

raíz, cuyos niveles se incrementaron aún más en plantas adultas dañadas

mecánicamente. Esta característica contrastó con lo observado en las raíces de

plantas jóvenes y adultas de las dos líneas restantes, en las cuales el daño

mecánico redujo el contenido de ACG en forma altamente significativa,

especialmente en plantas jóvenes, donde no pudo ser detectado.

77


Figura 32. Niveles de ácido clorogénico en plantas (jóvenes y adultas) WT y

transgénicas intactas (0 h) y cinco días después de haber sido sometidas a daño

mecánico (5 día). En hoja local (HL), hoja sistémica (HS), hoja distal vieja (HDV),

hoja distal jóven (HDJ) y raíz. Los asteriscos indican la diferencia


WT

0

1

2

3

HL HS RAÍZug C

loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

*

A

WT X Nt-LeSYS 03

0.0

0.2

0.4

0.6

HL HS RAÍZug C

loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

C

Nt-LePS 08

0.0

0.2

0.4

0.6

HL HS RAÍZug C

loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

*

E

Nt-LeSYS 03

0.0

0.2

0.4

0.6

HL HS RAÍZ

ug C

loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

G

WT

0

5

10

15

20

HL HDV HDJ RAÍZug C

loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

*

*

*

***

B

WT X Nt-LeSYS 03

0

5

10

15

20


loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

*

**

*

**** **

D

Nt-LePS 08

0

5

10

15

20


loro

géni

co/m

g P

F0 h

5 día

*

**

***

**

F

Nt-LeSYS 03

0

1

2

3


loro

géni

co/m

g P

F

0 h

5 día

****

**

H

78


Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 33. En plantas WT

sometidas a herbivoría con larvas de M. sexta solo se detectó ACG en las hojas

dañadas. Además, los niveles detectados en éstas disminuyeron drásticamente

con respecto a lo observado en hojas similares en plantas intactas (21×

menores) y dañadas mecánicamente (31× menores).

El efecto negativo sobre los niveles de ACG causado por la folivoría de

larvas de M. sexta en plantas WT se agudizó en las tres líneas de plantas

transgénicas analizadas, ya que en todos casos, el ACG disminuyó a niveles no

detectables en todos los tejidos analizados.

En resumen, la folivoría por M. sexta provocó una disminución muy

marcada en los niveles de ACG en plantas WT y una supresión de su síntesis y

acumulación en las plantas transformadas, donde este metabolito se redujo

hasta niveles no detectables.

6.3.3. Tratamiento: infestación por mosquita blanca (plantas adultas)

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 34. En plantas WT se

observó una disminución en los niveles de ACG, con respecto a los niveles

basales en plantas no infestadas de la misma edad, en las hojas infestada con B.

tabaci (1.8× menores) y en raíces (2.1× menores); mientras que en la hoja distal

superior (respuesta sistémica, dirección acropetal), los niveles de ACG fueron

ligeramente superiores (1.9× más altos).

Los niveles de ACG detectados en tejidos de plantas infestadas de la

línea Nt-LePS 08 no resultaron estadísticamente diferentes a los detectados en

plantas WT, mientras que en la línea Nt-LeSYS 03, el contenido de ACG en

follaje se redujo hasta niveles no detectables, mientras que en raíz la cantidad

detectada fue significativamente menor a la detectada en raíces de plantas WT

infestadas. A su vez, el nivel de ACG en raíces de plantas Nt-LeSYS 03

infestadas fue 1.7× menor a la detectada en plantas transgénicas de la misma

edad no infestadas.

79

Figura 33. Comparación entre los niveles de ácido clorogénico en plantas WT y

transgénicas adultas, 5 días después de haber sido expuestas a herbivoría por

larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV), hoja



0.0

0.5

1.0

HL HDV HDJ RAÍZug c

loro

géni

co/m

g P

F

WT

Nt-LePS 08

**

B

0.0

0.5

1.0


loro

géni

co/m

g P

F

WT

Nt-LeSYS 03

**

C

0.0

0.5

1.0


loro

géni

co/m

g P

F

WT

WT X Nt-LeSYS 03

**

A

80

La misma tendencia se observó en la línea WT × Nt-LeSYS 03. Sin embargo, la

disminución con respecto a plantas WT infestadas, aunque significativa, no fue

tan drástica, al menos en follaje. La infestación con B. tabaci causó también una

disminución considerable en ACG en todos los tejidos analizados de plantas WT

× Nt-LeSYS 03 con respecto a los niveles basales de ACG en tejidos

equivalentes de plantas de esta línea no infestadas de la misma edad.

Los resultados obtenidos indican que la infestación con B. tabaci en

plantas WT indujo un incremento sistémico (en hoja) y una disminución local y

sistémica (en raíz) en los niveles de ACG en relación a los niveles detectados en

tejidos de plantas WT no infestadas. En forma similar a los resultados obtenidos

de plantas dañadas por M. sexta (Fig. 33), la infestación con B. tabaci causó una

disminución generalizada en los niveles de ACG en plantas WT y transgénicas.

Sin embargo, el efecto fue mucho más marcado en plantas transformadas con

LeSYS (líneas Nt-LeSYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03).

6.4. Cuantificación de dihidrocapsenona en plantas jóvenes y/o adultas


Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 35. Los datos que aquí

se presentan representan una cuantificación indirecta de los niveles de capsidiol,

ya que debido a la conocida inestabilidad de este metabolito in planta, aunada a

los largos períodos de muestreo (≥28 d) solo pudo detectarse un producto de

degradación de este metabolito (ver Figs. 11 y 24-26), cuya identidad no pudo

ser determinada, pero cuyo espectro de masas resultó semejante al del cis-9,10-

dihidrocapsenona, un posible catabolito estable de capsidiol detectado en

cultivos celulares en suspensión de C. annuum (Ward et al., 1977; Whitehead et

al., 1987). Se considero, por lo tanto, que la dihidrocapsenona indica los niveles

de su precursor el capsidiol). Los niveles detectados en las plantas en estudio

resultaron de 3 a 4 órdenes de magnitud más altos a los reportados en la

literatura en tejido de N. tabacum inducido por patógenos o PMAP.

81

Figura 34. Comparación entre los niveles de ácido clorogénico en plantas WT y

transgénicas adultas medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia tabaci (28

días después de la oviposición). En hoja local (HL), hoja sistémica (HS) y raíz.


0.01 **).

0

5

10

15

HL HS RAÍZug

clo

rogé

nic

o/m

g P

F

WTNt-LePS 08

B

0

5

10

15

HL HS RAÍZug

clor

ogén

ico

/mg

PF

WT

Nt-LeSYS 03

** ** *

C

0

5

10

15

HL HS RAÍZu

g cl

oro

gén

ico/

mg

PF

WT

WT X Nt-LeSYS 03

***

*

A

82

En plantas WT, los niveles basales de dihidrocapsenona en plantas

jóvenes fueron entre 6.5 (en raíz) y 7.5 (en la hoja distal superior) veces mayores

a los detectados en tejidos equivalentes de plantas adultas, en las cuales no se

detectó dihidrocapsenona l en las hojas C-F. Además, el daño mecánico abatió

los niveles de dihidrocapsenona en todos los tejidos analizados de plantas

jóvenes (la disminución fue altamente significativa a nivel local y sistémico en la

hoja dañada y en raíz, respectivamente, y marginal a nivel sistémico en la hoja

adyacente superior), mientras que lo contrario se observó en plantas adultas, en

las cuales el daño indujo una acumulación altamente significativa de

dihidrocapsenona en todos los tejidos (aunque sin alcanzar los niveles

detectados en las plantas jóvenes). Esto sugiere que la síntesis constitutiva e

inducida de capsidiol esta regulada por el estado de desarrollo de la planta.

El efecto del daño mecánico también se modificó en las tres líneas de

plantas transgénicas analizadas el cual fue, asimismo, influido por el estado de

desarrollo. De manera que en plantas jóvenes, el daño mecánico en plantas Nt-

LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03 indujo una acumulación de dihidrocapsenona en

todos los tejidos analizados (excepto en la respuesta local en la línea Nt-LePS

08), aunque los niveles basales en estas dos líneas de plantas fueron, en

promedio, aproximadamente 6 veces menores a los detectados en las plantas

WT. Sin embargo, los niveles de detectado dihidrocapsenona en plantas WT y

transgénicas (de estas dos líneas) dañadas mecánicamente fueron muy

similares. En plantas Nt-LeSYS 03, el efecto del daño fue mucho más notable,

particularmente en follaje, ya que al parecer indujo la síntesis de novo de este

metabolito, el cual no se detectó en plantas intactas, mientras que en raíz no se

detectaron cambios significativos. A pesar de ello, los niveles de

dihidrocapsenona en plantas Nt-LeSYS 03 dañadas fueron, en general, menores

a los detectados en el resto de las plantas dañadas analizadas.

Al igual que en plantas WT, el daño mecánico en plantas adultas de las

líneas plantas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03 indujo una acumulación

generalizada y altamente significativa de dihidrocapsenona. La diferencia radicó

en el hecho de que los niveles de este metabolito acumulados en las plantas

transgénicas dañadas fueron muy elevados, entre 9 (respuesta sistémica en hoja

distal superior en las línea WT × Nt-LeSYS 03) y 80 (hoja dañada de ambas

83

líneas) veces más altos a los detectados en plantas WT dañadas. En plantas Nt-

LeSYS 03 adultas, que a diferencia de las plantas jóvenes tenían niveles basales

detectables de dihidrocapsenona en follaje, pero que en raíz fueron 1.8 veces

menores a los detectados en plantas jóvenes, sólo se observó un incremento

significativo en los niveles de dihidrocapsenona a nivel sistémico en la hoja distal

superior. En la hoja distal inferior el efecto del daño fue inhibitorio, mientras que

no se observaron cambios significativos en la hoja dañada ni en la raíz. En

plantas adultas de esta línea, la acumulación sistémica de dihidrocapsenona

inducida por daño no fue de la magnitud observada en las dos líneas restantes,

sino similar a la observada en plantas WT.


Los resultados se muestran en la Figura 36. En plantas WT adultas

sometidas a herbivoría por M. sexta, se observó un incremento con respecto a

los niveles basales de dihidrocapsenona, el cual fue más marcado en la hoja

dañada y en la raíz (8.3× más alta). El incremento en dihidrocapsenona en

ambas hojas distales fue menor, particularmente en la hoja superior. Los niveles

de dihidrocapsenona detectados en plantas adultas sometidas a herbivoría

también fueron superiores a los detectados en plantas adultas dañadas

mecánicamente.

En la línea Nt-LePS 08, la herbivoría causó una marcada reducción en los

niveles de dihidrocapsenona, hasta valores no detectables en ambas hojas

distales (respuesta sistémica acropetala y basipetala), mientras que en la hoja

dañada C-F (respuesta local), la dihidrocapsenona aumentó hasta niveles

detectables, en contraste con la ausencia de este metabolito en hojas C-F de

plantas intactas. A su vez, el contenido de dihidrocapsenona en raíces de

plantas de esta línea dañadas por M. sexta se redujo a niveles no detectables, lo

que contrastó con la acumulación significativa de dihidrocapsenona detectada en

raíces de plantas dañadas mecánicamente.

84


Figura 35. Niveles de capsidiol, cuantificado directamente en su posible

producto de degradación (dihidrocapsenona), en plantas jóvenes y adultas, WT y

transgénicas intactas 0 día y cinco días después de haber sido sometidas a daño

mecánico. En hoja local (HL), hoja sistémica (HS), hoja distal vieja (HDV), hoja



WT

0.0

0.5

1.0

1.5

HL HS RAÍZ

0 día

5 día

** **P=0.065

A

WT X Nt-LeSYS 03

0.0

0.5

1.0

1.5

HL HS RAÍZ

0 día

5 día

****

C

Nt-LePS 08

0.0

0.5

1.0

1.5

HL HS RAÍZ

0 día

5 día

** **

E

Nt-LeSYS 03

0.0

0.5

1.0

1.5

HL HS RAÍZ

0 día

5 día

** **

G

WT

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

HL HDV HDJ RAÍZ

0 día

5 día

******

**

B

WT X Nt-LeSYS 03

0

5

10

15

HL HDV HDJ RAÍZ

0 día

5 día**

**

** **

D

Nt-LePS 08

0

5

10

15

HL HDV HDJ RAÍZ

0 día

5 día

**

****

**

F

Nt-LeSYS 03

0.0

0.1

0.2

0.3

HL HDV HDJ RAÍZ

0 día

5 día

**

**

H

85

En la línea WT × Nt-LeSYS 03 se observó un patrón similar aunque

menos marcado, particularmente en la respuesta local a la herbivoría, que no fue

diferente a la detectada en plantas intactas de la misma edad. En raíces de esta

planta, los niveles de dihidrocapsenona en plantas dañadas por M. sexta fueron

3.7× más altos a los basales.

Los niveles de dihidrocapsenona detectados en plantas Nt-LePS 08 y WT

× Nt-LeSYS 03 dañadas por M. sexta fueron considerablemente inferiores a los

detectados en plantas WT dañadas. Asimismo, en ambas líneas se observó un

contraste muy marcado entre los niveles de dihidrocapsenona acumulados en

plantas dañadas mecánicamente (acumulación hasta niveles excepcionalmente

altos) o por larvas de M. sexta (disminución en los niveles o represión de su

síntesis).

Una vez más, la línea Nt-LeSYS 03 se comportó en forma diferente a las

otras dos. En todos los tejidos analizados, los niveles de dihidrocapsenona se

incrementaron en respuesta a herbivoría, con respecto a los niveles basales

detectados en plantas Nt-LeSYS 03 intactas de la misma edad. El efecto más

marcado fue en la hoja dañada y en la hoja distal inferior (niveles 5.3× más altos

en ambos casos). Los niveles detectados en plantas sometidas a folivoría por M.

sexta también fueron más altos a los detectados en plantas dañadas

mecánicamente. La acumulación de dihidrocapsenona en follaje en respuesta a

herbivoría en estas plantas fue marginal o significativamente (respuesta

sistémica en hoja distal inferior) más alta a la detectada en plantas WT. Sin

embargo, al igual que en las líneas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03, los niveles

de dihidrocapsenona en la raíces de plantas dañadas por M. sexta fueron

significativamente inferiores a los detectados en plantas WT similarmente

tratadas.

86

Figura 36. Comparación entre los niveles de capsidiol, cuantificado

indirectamente en forma de un posible producto de degradación

(dihidrocapsenona) en plantas WT y transgénicas adultas, 5 días después de

haber sido expuestas a herbivoría por larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja

local (HL), hoja distal vieja (HDV), hoja distal jóven (HDJ) y raíz. Los asteriscos


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

HL HDV HDJ RAÍZ

ug c

apsi

diol

/ mg

peso

fre

sco.

WTNt-LePS 08

** ***

B

**

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


apsi

diol

/ mg

peso

fres

co.

WTNt-LeSYS 03

**

**P = 0.22

P= 0.07

C

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

HL HDV HDJ RAÍZug

cap

sidi

ol/ m

g p

eso

fres

co.

WT

WT X Nt-LeSYS 03

**

***

A

87


Los resultados obtenidos de este tratamiento se muestran en la Figura 37.

La infestación por B. tabaci causó un marcado e inusual incremento en los

niveles de dihidrocapsenona en todos los tejidos analizados de plantas WT,

particularmente en la hoja infestada. Los altos niveles detectados apoyan la

proposición de que el dihidrocapsenona inducido por la infestación por B. tabaci

se acumuló gradualmente en forma de su catabolito más estable durante los

relativamente largos tiempos de muestreo empleados en este experimento (28

días). La acumulación sistémica de dihidrocapsenona también fue elevada (11 y

13× mayor en la raíz y la hoja distal superior, respectivamente, a la detectada en

plantas WT intactas de la misma edad). Comparando todas las plantas en

estudio, fue evidente que la infestación por B. tabaci indujo la mayor

acumulación de dihidrocapsenona en plantas WT.

Excepto por la caída en los niveles de dihidrocapsenona en las raíces de

plantas WT × Nt-LeSYS 03 infestadas, el patrón de acumulación de

dihidrocapsenona en respuesta a MB en las Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03

fue similar, aunque de menor magnitud, al observado en las plantas WT. En la

línea Nt-LeSYS 03 la respuesta sistémica en hoja y raíz también fue superior o

similar a la de las demás plantas, mientras que dihidrocapsenona en la hoja

infestada disminuyó hasta niveles no detectables. En la línea Nt-LePS 08 la

acumulación local de dihidrocapsenona en plantas infestadas y dañadas

mecánicamente fue similar, mientras que la respuesta sistémica, tanto en la hoja

distal superior como en la raíz, fue menor en las plantas infestadas.

En las tres líneas de plantas transgénicas la acumulación local y sistémica

(hoja distal superior y raíz) de dihidrocapsenona en respuesta a B. tabaci fue

igual o significativamente menor a la detectada en tejido equivalente de plantas

WT infestadas, excepto por la respuesta sistémica en hoja en plantas Nt-LeSYS

03, en la cual los niveles de dihidrocapsenona detectados fueron

significativamente más altos que en plantas WT.

En síntesis, los cambios observados en los niveles basales de

dihidrocapsenona mayores en plantas WT jóvenes, y su incremento en plantas

adultas, o disminución (plantas jóvenes) en respuesta al daño mecánico indican

88

que los niveles constitutivos o inducidos de este metabolito en planta están

ontogénicamente determinados. La acumulación de dihidrocapsenona en

respuesta a daño mecánico en plantas adultas y a infestación por MB se

potenció marcadamente en la línea Nt-LePS 08 y en menor grado en la línea WT

× Nt-LeSYS 03, particularmente en la hoja dañada o infestada. El daño por

insectos chupadores y masticadores indujo una acumulación local y sistémica de

dihidrocapsenona en plantas WT, la cual fue más intensa en respuesta a B.

tabaci. En general, la inducción de dihidrocapsenona en respuesta al daño por

insectos se redujo significativamente en las plantas transgénicas.

6.5. Cuantificación de nornicotina en plantas jóven es y/o adultas


Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 38 A y B. Éstos

indicaron que la síntesis basal de nornicotina (NN) y la inducción de su

acumulación en respuesta a daño mecánico en N. tabacum dependen del estado

de desarrollo de la planta, del tipo de tejido analizado y de la filotaxia de la

planta. De manera que no se detectó este alcaloide en plantas WT jóvenes ni en

la hoja de transición C-F de plantas adultas intactas. En éstas, NN se detectó en

las dos hojas distales, superior (0.041 µg/mg PF) e inferior (0.031 µg/mg PF) en

relación a la hoja C-F y más claramente en raíz (0.17 µg/mg PF). La cantidad de

NN detectada resultó menor a lo esperado para N. tabacum, donde este

alcaloide alcanzó hasta 0.35 µg/mg PF, equivalentes al 3% del contenido total de

alcaloides en esta especie (Saitoh et al., 1985). Al igual que en el análisis de

CGA descrito con anterioridad, esta variación podría haberse debido a

diferencias genéticas y/o analíticas.

El daño mecánico en plantas WT adultas indujo una síntesis y

acumulación significativa de NN en la hoja dañada (de niveles no detectables a

0.045 µg/mg PF) y en la hoja distal superior (de 0.041 a 0.12 µg/mg PF),

mientras que redujo su concentración a niveles no detectables en la hoja distal

89

Figura 37. Comparación entre los niveles de capsidiol, cuantificado

indirectamente en forma de un posible producto de degradación

(dihidrocapsenona), en plantas WT y transgénicas adultas, medidos al cumplirse

el ciclo de vida de Bemisia tabaci. En hoja local (HL), hoja sistémica (HS) y raíz.


0.01 **)

0

5

10

15

HL HS RAÍZ

ug C

apsi

diol

/mg

PF

WT

Nt-LePS 08**

B

0

5

10

15

HL HS RAÍZ

ug C

apsi

diol

/mg

PF

WT

Nt-LeSYS 03

**

****

0

5

10

15

HL HS RAÍZug

Cap

sidi

ol/m

g P

F

WT

WT X Nt-LeSYS 03

****

**

A

C

90

inferior. También se observó una disminución significativa en el contenido de NN

en raíces de plantas adultas dañadas mecánicamente (de 0.17 a 0.04 µg/mg PF)

(28 días después de la oviposición). Los asteriscos indican la diferencia


La línea Nt-LeSYS 03 se caracterizó por ser la única línea en la cual se

detectó NN en forma constitutiva en follaje de plantas jóvenes. El daño mecánico

en estas plantas causó una reducción a niveles no detectables (ND) en la hoja

dañada (respuesta local inhibitoria), mientras que en la raíz indujo su síntesis de

novo (de ND a 0.05 µg/mg PF). En la hoja distal adyacente se detectó un

aumento marginal de NN (0.03 a 0.12 µg/mg PF). Un comportamiento muy

similar se observó en follaje de plantas adultas de la línea Nt-LeSYS 03 dañadas

mecánicamente, ya que se volvió a presentar una reducción significativa de NN

en hojas dañadas, mientras que el incremento detectado en hojas distales

superiores (7.6× mayor; de 0.09 a 0.69 µg/mg PF) fue ahora altamente

significativo. Los niveles de NN sintetizados en raíces de plantas jóvenes Nt-

LeSYS 03 dañadas mecánicamente resultaron muy similares a los niveles

constitutivos detectados en las raíces de plantas adultas, los cuales no variaron

significativamente en respuesta al daño mecánico.

El daño mecánico tuvo un efecto sistémico negativo sobre los niveles de

NN en las dos restantes líneas de plantas adultas transformadas (Nt-LePS 08 y

WT × Nt-LeSYS 03), observado en la hoja distal superior y raíz. Aunque en

ambas líneas el daño mecánico causó una disminución de NN a niveles no

detectables, el efecto observado fue particularmente severo en la raíz.

No se detectó NN en plantas de cualquiera de los genotipos analizados

sometidas a herbivoría por M. sexta o infestación por MB (resultados no

mostrados).

91

PLANTA JOVEN PLANTA ADULTA

Figura 38 . Niveles de nornicotina en plantas (jóvenes y adultas) WT y





Nt-LeSYS 03

0.0

0.1

0.2

HL HS RAÍZug N

orni

cotin

a/m

g P

F

0 día

5 díaP=0.072

**

**

D

WT

0.0

0.1

0.2

0.3


orni

cotin

a/m

g P

F

0 h

5 día

***

**

A

WT X Nt-LeSYS 03

0.0

0.1

0.2

0.3


orni

cotin

a/m

g P

F

0 h

5 día

** **

B

Nt-LePS 08

0.0

0.1

0.2

0.3


orni

cotin

a/m

g P

F

0 h

5 día

** **

C

Nt-LeSYS 03

0.0

0.5

1.0


orni

cotin

a/m

g P

F

0 h

5 día

**

*

E

92

6.6. Cuantificación de fenoles totales en plantas j óvenes y/o adultas


Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 39 A y B. Los niveles

basales de fenoles totales en plantas WT adultas fueron superiores (entre 1.92 y

7.7× más altos) en las hojas distal inferior y de transición C-F, pero más bajos

(entre 1.7 y 1.1× menores) en raíz, que los observados en tejidos equivalentes

de plantas de las tres líneas transgénicas en estudio (Fig. 39 B)

Asimismo, los niveles basales de fenoles en la raíz de las tres líneas de

plantas transgénicas jóvenes fueron menores a los detectados en plantas WT de

la misma edad, particularmente en la línea WT × Nt-LeSYS 03 en la cual no se

detectaron. En follaje se repitió esta tendencia en las líneas Nt-LePS 08 (1.3 y 2

veces menores en las hojas inferiores y superiores, respectivamente) y WT × Nt-

LeSYS 03 (2.7 y 3.8 veces menores en hojas inferiores y superiores,

respectivamente), mientras que en la línea Nt-LeSYS 03, los niveles de fenoles

en follaje no variaron mucho en relación a los detectados en las plantas WT

(Fig.39 A).

En plantas WT jóvenes dañadas mecánicamente se observaron efectos

sistémicos contrastantes, ya que se detectó un incremento y disminución

significativos en la hoja distal adyacente superior y raíz, respectivamente. En las

plantas transgénicas jóvenes, el daño mecánico no indujo un cambio en los

niveles basales de fenoles en follaje (línea WT × Nt-LeSYS 03) o bien provocó

una reducción significativa de éstos (líneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03). En raíz,

la disminución significativa de fenoles totales observada en plantas WT dañadas,

se repitió en la línea Nt-LePS 08, mientras que en las dos restantes se detectó

un incremento significativo (Figs. 39 C, G).

En plantas WT adultas dañadas mecánicamente, sólo se observó un

aumento significativo en fenoles totales a nivel sistémico en la hoja distal inferior.

En contraste con lo observado en las plantas Nt-LePS 08 jóvenes, el daño

mecánico aplicado a plantas adultas de esta línea indujo un incremento

significativo generalizado en fenoles totales, tanto en follaje como en raíz. En las

líneas Nt-LeSYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03, se observó en general lo contrario, ya

93

que los niveles de fenoles totales detectados en la hoja dañada (respuesta local),

hojas distales inferiores y superiores y raíz (respuesta sistémica) resultaron

marginal o significativamente menores a los observados en plantas intactas

(excepto por el incremento significativo detectado en la hoja distal superior en la

línea WT × Nt-LeSYS 03) (Fig. 39 D).


Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 40. La herbivoría por

M. sexta causó, en general, una reducción en los niveles de fenoles totales (en

relación a los niveles basales detectados en plantas intactas de la misma edad)

en todos los tejidos analizados, tanto de plantas WT como transgénicas (excepto

en la línea Nt-LePS 08, en cuyas hojas distales superior e inferior,

respectivamente, se observó un ligero aumento). La disminución fue más

marcada en la hoja dañada, en la hoja distal inferior (es decir en las hojas más

viejas) y en raíz, mientras que en la hoja distal superior los niveles se

mantuvieron iguales o variaron levemente.

El nivel de fenoles detectado en follaje y raíz de las plantas transgénicas

dañadas por M. sexta resultó marginal o significativamente inferior al detectado

en plantas WT, excepto en la raíz de la línea Nt-LeSYS 03, cuyos niveles

resultaron significativamente superiores al de las plantas WT.

94


Figura 39. Fenoles solubles totales en plantas (jóvenes y adultas) WT y





WT

012

345

HL HS Raízug/m

g pe

so fr

esco

0 día

5 día**

*

A

Nt-LePS 08

0

0.2

0.4

0.6

0.8

HL HS Raízug/m

g pe

so fr

esco

0 día

5 día

******

E

Nt-LeSYS 03

0

0.51

1.5

2

HL HS Raízug/m

g pe

so fr

esco

0 día

5 día

*** **

G

Nt-LeSYS 03 X WT

00.10.20.30.40.5

HL HS Raízug/m

g pe

so fr

esco

0 día

5 día

**

C

WT

0

2

4

6

8

HL HDV HDJ Raízug/m

g pe

so fr

esco

0 día

5 día

**

B

Nt-LePS 08

0

1

2

3


g pe

sofr

esco

0 día

5 día

** ** **

**

F

Nt-LeSYS 03 X WT

012

34


g pe

so fr

esco

0 día

5 día

**

*

**

D

Le-Nt'SYS 03

0

1

2

3


g pe

so fr

esco

0 día

5 día

** **

H

Nt-LeSYS 03

95

Figura 40. Comparación entre los niveles de fenoles totales solubles en plantas

WT y transgénicas adultas, 5 días después de haber sido expuestas a herbivoría

por larvas de M. sexta durante 24 h. En hoja local (HL), hoja distal vieja (HDV),



0

0.4

0.8

1.2

1.6

HL HDV HDJ Raíz

ug/m

g pe

so fr

esco

WT

Nt-LePS 08

** **

B

0

0.4

0.8

1.2

1.6

HL HDV HDJ Raíz

ug/m

g pe

so fr

esco

WT

WT X Nt-LeSYS 03

** **

*

**

A

0

0.4

0.8

1.2

1.6

HL HDV HDJ Raíz

ug/m

g pe

so fr

esco

WT

Nt-LeSYS 03

*

**

C

96


Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 41. En plantas WT, la

infestación por B. tabaci causó una disminución en los niveles de fenoles en

follaje, particularmente en la hoja infestada donde los niveles fueron 2.9 veces

menores a los detectados en plantas WT no infestadas de la misma edad. En la

raíz, los niveles de fenoles fueron similares en plantas WT infestadas y no

infestadas.

En las plantas transgénicas, el comportamiento en respuesta a la

infestación por B. tabaci fue variable: mientras que en la línea Nt-LePS 08 se

observó un aumento de fenoles totales tanto local (2× más alto) como sistémico

(3.3× más alto), con respecto a plantas no infestadas de la misma edad, en las

dos restantes la respuesta fue inhibitoria, excepto por el ligero incremento

detectado en la hoja distal superior de la línea WT × Nt-LeSYS 03. El efecto

inhibitorio fue más marcado en la hoja infestada (2.6× menor en ambas líneas).

En raíz de las tres líneas transformadas se detectó una disminución en los

niveles de fenoles con respecto a plantas no infestadas de la misma edad.

Los niveles de fenoles en todos los tejidos analizados de plantas

transgénicas infestadas fueron iguales (Nt-LePS 08) o significativamente

menores (Nt-LeSYS 03 y WT × Nt-LeSYS 03) a los detectados en plantas WT

infestadas. A su vez, el cambio en los niveles de fenoles totales detectado en

plantas transgénicas y WT en respuesta a herbivoría por M. sexta e infestación

por MB fue similar.

97

Figura 41. Comparación entre los niveles de fenoles solubles totales en plantas

WT y transgénicas adultas, medidos al cumplirse el ciclo de vida de Bemisia

tabaci (28 días después de la oviposición). En hoja local (HL), hoja distal jóven

(HDJ) y raíz. Los asteriscos indican la diferencia estadísticamente significativa (P

≤ 0.05*; P ≤ 0.01 **).

0

1

2

3

HL HDJ Ra íz

ug/m

g pe

so fr

esco

WT

Nt-LeP S 08

B

0

1

2

3

HL HDJ Ra íz

ug/m

g pe

so fr

esco

WT

WT Х Nt-Le SYS 03

** **

**

A

0

1

2

3

HL HDJ Ra íz

ug/m

g pe

so fr

esco

WTNt-LeSYS 03

** **

**

C

98

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Las plantas del género Nicotiana (Solanaceae) son capaces de sintetizar

una gran diversidad de metabolitos secundarios, principalmente alcaloides,

compuestos fenólicos y terpenoides, muchos de los cuales ejercen una influencia

sobre las interacciones biológicas que estas plantas tienen con su ambiente

circundante.

Este trabajo es parte de un estudio cuyo objetivo fue determinar el efecto

que la sobreexpresión de prosistemina (LsPS) y sistemina (LeSYS) de jitomate

en N. tabacum pudiera tener sobre la capacidad de responder a agobios

(a)bióticos. La inquietud de analizar los niveles constitutivos e inducibles de

metabolitos secundarios relacionados con defensa contra herbívoros y/o

patógenos (nicotina, nornicotina, ácido clorogénico, capsidiol y fenoles solubles

totales) en estas plantas surgió de la posibilidad de que la resistencia diferencial

contra herbivoría por larvas de M. sexta, así como las numerosas modificaciones

morfológicas y fisiológicas observadas en plantas transformadas con LePS y/o

LeSYS (Rocha-Granados, 2004 y resultados no publicados) podría deberse a

cambios en la síntesis y/o acumulación de estos metabolitos en follaje y raíz. En

apoyo a esta propuesta está el hecho de que la síntesis de novo de muchos de

estos compuestos, principalmente alcaloides, compuestos fenólicos y

terpenoides, se incrementa dramáticamente como respuesta al daño mecánico o

ataque por herbívoros y/o patógenos, y que este cambio es inducido en muchos

casos por ácido jasmónico, el cual funciona como una señal mediadora de

cambios en el metabolismo secundario en respuesta a muchos tipos de agobio

biótico y abiótico (Gundlach et al., 1992; Hildman et al., 1992; Reinbothe et al.,

1994). Es también bien conocido que la inducción de genes de defensa en

respuesta al daño en L. esculentum, parte de la cual es dependiente de

sistemina, ocurre a través de la intermediación de AJ (Schilmiller y Howe, 2005).

La nicotina es uno de los metabolitos secundarios de defensa más

estudiados. Es el alcaloide predominante en variedades comerciales de N.

tabacum, incluyendo la variedad Xanthi utilizada en esta investigación. La

nicotina constituye en promedio el 94.8% del total de alcaloides (ca. 11.5 mg/g

de peso seco) presentes en follaje de N. tabacum (subgénero Tabacum; sección

99

Genuinae); el resto está constituido por los alcaloides nornicotina (3.0%),

anabasina (0.3%) y anabatina (1.9%) (Saitoh et al., 1985). Se estima que la

nicotina contribuye a la resistencia contra insectos herbívoros gracias a su

capacidad de interactuar con receptores de acetilcolina del sistema nervioso de

animales (Steppuhn et al., 2004; Liu et al., 2005). Asimismo, se ha encontrado

que el daño al follaje, mecánico o por herbívoros, tanto en N. tabacum como en

las especies silvestres N. attenuata, N. sylvestris y otras, induce la síntesis de

novo de nicotina en raíces, la cual es posteriormente reubicada en el follaje (vía

el xilema) para contribuir a la defensa de la planta y reducir la pérdida de área

foliar por herbivoría. El ácido jasmónico, que es producido en las hojas dañadas

y rápidamente transportado a las raíces vía el floema, es un componente

esencial de la señalización entre hoja y raíz que facilita esta respuesta (Zhang y

Baldwin, 1997). De acuerdo a Ohnmeiss y Baldwin (2000), la distribución de la

nicotina proveniente de la raíz en el follaje estará determinada por los postulados

de la teoría de defensa óptima, que predice que los tejidos más valiosos para la

planta, o aquellos con una mayor probabilidad de ser atacados, serán los mejor

defendidos. Éstos son en general los tejidos jóvenes, con altas tasas

fotosintéticas y/o las estructuras reproductivas; sin embargo, se ha encontrado

que el valor del tejido varía de acuerdo a la ontogenia de la planta y puede estar

influido por su nivel nutricional. El ataque por herbívoros o patógenos también

puede alterar la cantidad y la distribución de metabolitos defensivos.

Como se observa en las Figuras 29 A y B, los niveles basales de nicotina

fueron similares en plantas WT jóvenes y adultas. Sin embargo, la acumulación

significativa de nicotina en respuesta a daño mecánico sólo se observó en los

tejidos analizados (predominantemente en la hoja dañada y en la hoja distal

joven) de las plantas adultas; en plantas jóvenes dañadas, se observó, en

contraste, una disminución generalizada en los niveles de nicotina, la cual fue

significativa a nivel sistémico. De acuerdo a la teoría de la defensa óptima,

descrita anteriormente, la diferencia entre plantas jóvenes y adultas podría

explicarse en parte, si se considera que el valor que tienen las hojas expandidas

en una planta joven es similar debido a que la diferencias en el estado de

desarrollo son mínimas, tal como se ha observado en plantas de N. sylvestris en

el estadio de roseta (Baldwin et al., 1997). Otros factores que podrían haber

contribuido a la débil respuesta en plantas jóvenes, en cuanto a la inducción de

100

la acumulación de nicotina en respuesta al daño mecánico, son los siguientes: i)

la alta disponibilidad de recursos en plantas jóvenes, los cuales al no estar

siéndo desviados hacia la generación de estructuras reproductivas o producción

de semillas, permiten la utilización de estrategias menos costosas desde el punto

de vista metabólico que la síntesis de nicotina, como el rebrote de tejidos

después del daño; ii) las plantas jóvenes son incapaces de fijar altas

concentraciones de nicotina; iii) la nicotina no es necesariamente el metabolito

de defensa más importante en esta etapa de desarrollo; iv) el similar valor que el

tejido foliar tiene en plantas jóvenes garantiza una distribución uniforme de

metabolitos de defensa, y/o v) la incapacidad de exportar suficiente JA a la raíz

para inducir la síntesis de nicotina, aún a pesar de que los tejidos jóvenes y

reproductivos son los que producen los mayores niveles de AJ, tanto

constitutivos como inducibles (Creelman y Mullet, 1997;Ohnmeiss y Baldwin,

2000). Esta última posibilidad podría haberse debido al hecho de que las hojas

inmaduras constituyen tejidos consumidores que importan fotosintatos desde las

hojas maduras y viejas, de manera que la exportación de AJ hacia el floema y

eventualmente hacia la raíz, podría estar comprometida en plantas jóvenes en

crecimiento activo y sin un aparato fotosintético eficiente.

En cuanto a las plantas WT adultas dañadas, la máxima acumulación de

nicotina se observó a nivel local y sistémico apical, lo que sugiere que estas

hojas tienen un mayor valor para la planta que la hoja distal basal. De manera

que la acumulación local de nicotina podría ser parte de una estrategia de

defensa para la defensa de tejidos valiosos (e. g., aquellos con las tasas

fotosintéticas más altas por área foliar, tal como se ha reportado para hojas

maduras en N. sylvestris) contra insectos, especialmente de aquellos que tienen

poca movilidad. También se ha especulado que la acumulación de defensas en

tejido dañado puede disuadir a los herbivoros a consumir tejido de menor valor e

inclusive, a migrar hacia plantas vecinas competidoras. En todo caso, los

resultados para nicotina obtenidos en este trabajo contrastaron con los

reportados para N. sylvestris, en las cuales se observó que la sensibilidad al

daño mecánico disminuía gradualmente a medida que las plantas avanzaban en

su estado de desarrollo (Ohnmeiss et al., 1997; van Dam et al. 2001).

En plantas transgénicas jóvenes, exceptuando la línea Nt-LeSYS 03, los

niveles basales de nicotina fueron menores a los detectados en las plantas WT.

101

El efecto negativo que el daño mecánico tuvo sobre el contenido de

nicotina en plantas WT jóvenes se hizo más marcado en la línea Nt-LePS 08

(disminución significativa generalizada), lo cual contrastó con la inducción local

(en Nt-LeSYS 03) y sistémica (en WT × Nt-LeSYS 03) de niveles

significativamente más altos de nicotina. En plantas adultas, el patrón de

acumulación de nicotina como respuesta al daño resultó muy similar entre

plantas WT y transgénicas, aunque estas últimas mostraron una respuesta más

intensa al daño, particularmente la respuesta sistémica en la hoja distal joven en

las líneas Nt-LePS 08 y Nt-LeSYS 03. Estos resultados sugieren que la

expresión de LePS y LeSYS en tabaco alteró el patrón de síntesis y distribución

de nicotina en la planta. Tomando en cuenta que la acumulación de metabolitos

defensivos en tabaco se produce de acuerdo al valor relativo que los tejidos

tienen para la planta atacada, es válido sugerir que el comportamiento

observado fue un indicio de que el valor de estas hojas en las plantas

transgénicas se incrementó. Las razones de este cambio se desconocen, pero

podrían estar relacionados con cambios fisiológicos causados por la

sobreexpresión de estos genes en tabaco, los cuales podrían haber alterado las

relaciones entre tejidos consumidores y tejidos fuente (debido a la síntesis

constitutiva de proteínas y metabolitos de defensa) o bien, podrían haber

alterado el desarrollo normal de N. tabacum. Este último argumento podría

aplicarse a la línea Nt-LeSYS 03, la cual presenta un fenotipo caracterizado por

alteraciones marcadas en su desarrollo, como enanismo, hojas modificadas,

floración precoz y senescencia acelerada (Rocha-Granados, 2004 y resultados

no publicados; ver Fig. 13). En plantas adultas de todos los genotipos analizados

se observó también un incremento significativo de nicotina en raíz en respuesta

al daño, lo que fue un indicio de que la síntesis de novo de AJ en las hojas y su

posterior transporte, vía floema, a la raíz, no se alteró en las plantas

transgénicas. Sin embargo, los niveles de nicotina en raíces de plantas Nt-

LeSYS 03 intactas y dañadas, fueron inferiores a los detectados en plantas WT y

demás plantas transgénicas. Es posible que la floración precoz y la senescencia

acelerada observada en esta línea hayan causado una reducción en la síntesis

de nicotina y/o un aumento en el catabolismo de nicotina como parte de una

estrategia para canalizar el nitrógeno hacia la producción de estructuras/tejidos

102

reproductivos. Esta propuesta se sustenta en cierta medida con lo observado en

plantas de N. attenuata y N. sylvestris, en las cuales se detectó una reducción en

el contenido de nicotina durante las etapas de elongación (generación de

estructuras reproductivas) y floración (Ohnmeiss y Baldwin, 2000; Baldwin,

2001).

La reducción en los niveles de nicotina, con respecto a plantas intactas,

observados en hojas de plantas WT y transgénicas sometidas a herbivoría por

larvas de M. sexta (Figuras 30 A y 30 B) estuvo de acuerdo a varios reportes en

la literatura en los que se ha observado que el daño causado por este insecto

tolerante a la nicotina en especies silvestres de Nicotiana, reprime su síntesis, a

pesar de un marcado aumento en los niveles de AJ, tanto en hoja como en raíz

(McCloud y Baldwin, 1997). Este efecto se ha atribuido a una síntesis de novo

sostenida de etileno, que al igual que en otras especies (e.g., Arabidopsis

thaliana, Griffonia simplicifolia), es antagónico al efecto inductivo local y/o

sistémico de AJ (Zhu-Salzman et al., 1998; Rojo et al., 1999; Kahl et al., 2000).

Además, se ha demostrado que está inhibición se debe a la supresión por etileno

de dos genes (putrescina-N-metil transferasas 1 y 2) que son esenciales para la

síntesis de nicotina en raíz (Winz y Baldwin, 2001). El contraste observado entre

daño mecánico (inducción) y herbivoría (represión), coincidió con estudios

previos que han demostrado que la síntesis de etileno, responsable a su vez de

la represión de la síntesis de nicotina, se produce exclusivamente en respuesta a

un grupo de amidas, sintetizadas a partir de la conjugación de ácidos grasos con

aminoácidos, presentes en las secreciones orales de M. sexta (Halitschke et al.,

2001; Schittko et al., 2001). Además de su efecto sobre la síntesis de nicotina, la

herbivoría por M. sexta también causa una reorganización transcripcional en

plantas de tabaco diferente a la observada en respuesta a daño mecánico, la

cual se caracteriza por la expresión diferencial de más de 500 genes

involucrados en fotosíntesis, transporte de electrones, síntesis y funcionamiento

del citoesqueleto, metabolismo de carbono y nitrógeno, y respuesta al daño o

invasión por patógenos (Hermsmeier et al., 2001).

La represión de la acumulación de nicotina en hojas atacadas por M.

sexta fue, sin embargo, mucho más marcada en las plantas transgénicas que en

las plantas WT. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de LePS y

LeSYS en tabaco potenció el efecto inhibitorio que la herbivoría por M. sexta

103

tiene sobre la síntesis de nicotina. Considerando que los ensayos de daño

mecánico no afectaron la inducción de la acumulación local y sistémica de

nicotina en las plantas transformadas, y que estudios previos han confirmado

que la síntesis de AJ no es afectada negativamente por herbivoría (McCloud y

Baldwin, 1997), es posible que la potenciación del efecto inhibitorio observado en

las plantas transgénicas se haya debido a una sobre-producción de etileno

endógeno en respuesta a las secreciones orales de M. sexta. Esta es una

posibilidad que deberá analizarse con mayor detalle, ya que no hay evidencia de

que la sobreexpresión de prosistemina, por lo menos en L. esculentum,

favorezca la síntesis de etileno en respuesta a herbivoría. El efecto sistémico en

raíz fue aún más marcado, ya que en las plantas transgénicas los niveles

disminuyeron marcadamente (1.67 veces en la línea Nt-LeSYS 03 y hasta

niveles no detectable en las otras dos líneas). Esto contrastó con las plantas WT,

en las cuales se detectó una acumulación de nicotina en raíz de plantas dañadas

por herbivoría que fue 6.8 veces mayor a la observada en plantas WT dañadas

mecánicamente. Este efecto se podría explicar en base a los argumentos de

Baldwin (2001), quién sugirió que la acumulación de nicotina en raíces de

plantas dañadas por herbívoros que consumen follaje constituye una estrategia

benéfica para la planta, ya que al localizar la síntesis y localización de este

metabolito en la raíz, se favorece el empleo de la nicotina para la defensa de

tejidos aéreos durante el subsiguiente período de recuperación, en la cual la

capacidad fotosintética de la planta (y por lo tanto la síntesis de novo de nicotina)

estará seriamente comprometida.

La infestación B. tabaci también tuvo un efecto negativo sobre la

acumulación de nicotina en plantas WT y transgénicas, particularmente a nivel

local. Es posible que el efecto observado haya sido debido, al igual a lo

observado por daño con M. sexta, a la síntesis facilitada de etileno, aunque esto

no ha sido demostrado aún. La única evidencia experimental a favor de esta

posibilidad, es la inducción de proteínas RP en jitomate en respuesta a la

infestación por este insecto (Mayer et al., 1996), las cuales dependen de etileno

para su expresión en patógenos (Kombrink y Somssich, 1997; Ohtsubo et al.,

1999). Sin embargo, parece más probable que la infestación por B. tabaci, que

es un insecto succionador que se alimenta directamente del floema, haya

cambiado la relación tejido fuente-tejido consumidor en los tejidos infestados, de

104

manera que la demanda de fotosintatos en la hoja infestada de las plantas WT

podría haber reducido la fuerza de la raíz como tejido consumidor, similarmente

a lo que ocurre cuando las plantas de tabaco entran en la fase de floración

(Shiroya et al., 1961), causando una disminución en el transporte de JA a la raíz,

con la consecuente supresión de la inducción de la síntesis de nicotina. Esta

posibilidad se apoya en los resultados obtenidos al analizar las raíces de las

plantas infestadas, excepto la línea Nt-LeSYS 03, en las cuales la nicotina se

redujo hasta niveles no detectables. Otra posibilidad es que los niveles de

nicotina regresaron a sus niveles basales, al menos en follaje, debido al largo

tiempo de muestreo, que se hizo 28 días después de haber infestado con

insectos adultos las hojas de plantas que, al inicio del experimento, tenían solo 4

hojas expandidas. De acuerdo a lo anterior, es probable que los bajos niveles de

nicotina detectados en hojas y raíces de plantas WT y transgénicas infestadas

por B. tabaci se hayan debido a una combinación de efectos ontogénicos y

fisiológicos, caracterizados estos últimos por cambios en el estatus fotosintético

del tejido fuente o consumidor de los tejidos analizados. Esta suposición

concuerda en cierto modo con evidencias experimentales previas obtenidas en

Nicotiana que indican que cualquier tratamiento capaz de incrementar la fuerza

de la raíz como tejido consumidor (e. g., fertilización con nitrógeno) facilita el

transporte de AJ y consecuente síntesis de nicotina, desde las hojas dañadas a

la raíz (Ohnmeiss y Baldwin, 2000) y con la noción de que las relaciones tejido

fuente-tejido consumidor ejercen una influencia muy marcada sobre la

resistencia de las plantas a agobios bióticos y abióticos (Coleman 1986;

Coleman y Leonard, 1995).

Después de la nicotina, la nornicotina es el alcaloide más abundante en N.

tabacum (3% y 6% del total de alcaloides en hojas y raíces, respectivamente)

(Saitoh et al., 1985). En ciertas especies como N. glauca, la nornicotina es

acilada mediante la formación de enlaces amida con ácidos grasos de 12 a 16

átomos de carbono en respuesta a daño mecánico y AJ exógeno; esta

transformación la hace más tóxica hacia herbívoros adaptados a la nicotina

como M. sexta (Laue et al., 2000). Los resultados obtenidos en plantas WT, en

las cuales solo se detectó nornicotina en las hojas distales superior e inferior y

en la raíz de plantas adultas intactas, coincidieron en cierto modo con los

reportados en plantas de N. sylvestris (cuyo contenido de nornicotina es superior

105

al reportado en N. tabacum) en las cuales la nornicotina y otros alcaloides

menores fueron cuantitativamente importantes sólo en plantas senescentes

(Baldwin, 1989). En forma similar a la acumulación de derivados acilados de

nornicotina en plantas de N. glauca dañadas y tratadas con AJ, la nornicotina se

acumuló en hojas dañadas y distales superiores de plantas WT. Por su parte, la

acumulación en respuesta al daño en plantas adultas se reprimió completamente

en las líneas Nt-LePS 08 y WT × Nt-LeSYS 03, mientras que en la línea Nt-

LeSYS 03 se observó una inducción sistémica apical relativamente intensa (ver

Figura 30). Además, esta línea fue la única en la que se detectó este alcaloide,

tanto en forma constitutiva como inducible, en hojas y raíces de plantas jóvenes.

Tampoco se detectó nornicotina en todos los genotipos sometidos a herbivoría

por M. sexta o a infestación por B. tabaci, lo que posiblemente fue un reflejo de

los niveles abatidos de nicotina detectados en respuesta a estos tratamientos.

Los resultados sugieren que la expresión de LeSYS en tabaco altera el flujo

biosintético de nitrógeno entre nicotina en raíz y nornicotina en follaje,

especialmente en plantas jóvenes. La presencia de nornicotina en plantas

jóvenes de esta línea podría haber sido consecuencia de la senescencia

acelerada que la caracteriza.

El ácido clorogénico (ACG) es un metabolito presente constitutivamente

en varias especies de plantas, particularmente en solanáceas, que funciona

como agente protector contra desafíos de tipo biótico. Por ejemplo, en plantas de

jitomate y tabaco con altos niveles de este metabolito (en tabaco se acumula en

los tricomas glandulares de la superficie de las hojas), se observó una

progresión más lenta y una reducción en los niveles de infección por

Pseudomonas syringae y patógenos fungosos, respectivamente (Maher et al.,

1994; Shedle et al., 2003). Asimismo, incrementos en el contenido de ácido

clorogénico fueron detectados en hojas de plantas infectadas con virus del

mosaico de tabaco, aunque éstos se asociaron más con la formación de

quinonas y productos poliméricos que con la generación de lesiones necróticas y

acumulación de compuestos fenólicos propias de la reacción hipersensible

(Tanguy y Martin, 1972). Su efecto se atribuye, al menos en parte, a la actividad

antioxidante de este metabolito. Esta cualidad favorece su oxidación, después

del daño causado por la infección microbiana o por insectos, por la enzima

106

polifenol oxidasa para generar quinonas reactivas, que tienen la propiedad de

limitar el crecimiento de microorganismos invasores y/o el daño tisular gracias a

su capacidad de formar entrecruzamientos con componentes de la pared celular

(Rober, 1989; Keinänen et al., 2001).

Los niveles basales de ACG resultaron mucho menor en hojas de plantas

jóvenes que en las de plantas adultas. Este resultado posiblemente fue un reflejo

del control estricto que sobre la biosíntesis de fenilpropanoides se presenta

durante el desarrollo de la planta (Bate et al., 1994; Whetten y Sederoff, 1995).

Al parecer, el nivel de estos metabolitos en hoja depende de un balance entre la

actividad de 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato-sintasa, DAHPS (ruta

del ácido shiquímico) y fenilalanina amonio liasa, FAL (ruta de los

fenilpropanoides de donde se produce finalmente el ACG). La actividad de FAL

también depende de señales (a)bióticas derivadas del medio ambiente, como

aquellas que se producen en respuesta al daño, lo que coincidió con la

acumulación sistémica y local de ACG (en plantas WT adultas). A su vez, la

expresión de LePS y de LeSYS en plantas transgénicas jóvenes causó una

disminución generalizada, en relación a las plantas WT, del contenido de ACG

en plantas intactas y dañadas. En plantas transgénicas adultas de la línea WT ×

Nt-LeSYS 03 y Nt-LeSYS 03 también se observó una marcada disminución en

los niveles de ACG locales y sistémicos de plantas dañadas, particularmente en

ésta última. La línea Nt-LePS 08 mostró un efecto altamente contrastante

caracterizado por niveles muy bajos de ACG en la hoja de transición tejido

fuente-consumidor, pero muy elevados en la hoja distal superior de plantas

intactas, situación que se invirtió en los mismos tejidos de plantas dañadas. A su

vez, los niveles de ACG disminuyeron drásticamente en plantas WT (reducción a

niveles no detectables en la respuesta sistémica en hoja y raíz) y transgénicas

(reducción generalizada a niveles no detectables en todos los tejidos analizados)

sometidas a herbivoría por M. sexta (Figs. 33 A, B y C). La infestación por B.

tabaci también provocó una disminución en los niveles de ACG, pero ésta fue de

mucho menor intensidad, excepto en hojas de la línea Nt-SYS 03, donde el ACG

se mantuvo por debajo de los límites de detección (ver Figura 34 B). Estos

resultados indican que al igual que en el caso de la nicotina, la herbivoría por

insectos, particularmente M. sexta, redujo los niveles de ACG en plantas WT y

107

que este efecto negativo se potenció en las plantas transgénicas, observándose

inclusive en plantas dañadas mecánicamente. Esto sugiere que el metabolismo

de fenilpropanoides se alteró, de un modo aún no determinado, por la expresión

de LePS y LeSYS en N. tabacum.

Sin embargo, los resultados obtenidos en plantas de la línea Nt-LeSYS

03, en las cuales se detectaron en general niveles significativamente reducidos

de ACG podrían ofrecer una posible pista sobre el mecanismo mediante la

expresión de LePS y LeSYS pues podrían estar afectando la ruta de los

fenilpropanoides, ya que el crecimiento y desarrollo anormal que se presenta en

estas plantas caracterizado por enanismo de las plantas, floración precoz,

morfología alterada de las hojas (lanceoladas, con bordes irregulares y lesiones

necróticas constitutivas) y flores (más pequeñas, con un desarrollo incompleto de

los estambres), lo que se reflejó en una producción de semillas reducida con

muy baja eficiencia de germinación (Rocha-Granados, 2004) se asemeja al

observado en plantas de tabaco en las cuales se encuentra alterado el

metabolismo de fenilpropanoides. Con estos antecedentes se podrían sugerir los

siguientes escenarios para explicar la reducción de ACG (y de fenoles totales) en

plantas de tabaco sobreexpresantes de LeSYS y LePS: i) alteración del balance

de aminoácidos aromáticos, tal como se observó en plantas transgénicas de

tabaco en las cuales la sobreexpresión de triptófano y tirosina descarboxilasas

resultó, curiosamente, en una reducción en los niveles de triptófano y tirosina.

Esto causó alteraciones fisiológicas y bioquímicas en las plantas transgénicas

debido a un giro compensatorio en el flujo de la ruta del ácido shiquímico para

favorecer la síntesis de estos dos aminoácidos y disminuir la de compuestos

fenilpropanoides; tales cambios se asociaron a la detección de niveles

anormales de metabolitos secundarios como nicotina y ácido clorogénico (Guillet

et al., 2000); ii) modificación del equilibrio entre citocininas y auxinas, similar a la

observada en plántulas de tabaco transformadas con variantes del gen 6b de

Agrobacterium tumefaciens, que se considera como un gen accesorio que

modula la acción de estas hormonas. Este cambio se atribuyó a una reducción

en el catabolismo de auxinas debido al efecto protector asociado con la

acumulación temprana de los fenilpropanoides escopolina y ACG (Gális et al.,

2002, 2004), y/o iii) alteración en la actividad de la enzima fenilalanina amonio

liasa (FAL), que es la enzima clave responsable de catalizar la reacción limitante

108

en la síntesis de ACG, que junto con la rutina, son los compuestos fenólicos

extraíbles más abundantes en hoja de tabaco. Esta última posibilidad se apoya

en el hecho de que plantas de tabaco en las cuales la expresión de FAL

endógeno se suprimió por la sobreexpresión de dos genes FAL exógenos,

provenientes de fríjol, presentaron niveles muy bajos de fenilpropanoides así

como un fenotipo caracterizado por alteraciones morfológicas severas como

enanismo, curvatura y cambio en la textura de las hojas, morfología y

pigmentación alterada de las flores, reducción de la viabilidad del polen, lesiones

necróticas y fluorescentes en hojas y lignificación reducida, particularmente en el

xilema (Elkind et al., 1990).

Una forma relativamente sencilla de comprobar que existe una relación

entre la reducción de ACG, un mayor catabolismo de auxinas y una consecuente

inhibición del crecimiento por citocininas en plantas Nt-LeSYS 03, podría hacerse

mediante la adición de niveles bajos (0.3 µM) de auxinas sintéticas exógenas

(ej., ácido naftalenacético) al medio de cultivo usado para la regeneración in vitro

de estas plantas, tal como fue demostrado por Gális et al., (2002).

Por lo menos siete sesquiterpenos bicíclicos (capsidiol, risitina, lubimina,

solavetivona, fituberina, fituberol y debneiol) se acumulan en respuesta a estrés

en N. tabacum (Guedes et al., 1982; Threlfall y Whitehead, 1988). De éstos, el

capsidiol es el más abundante, no sólo en N. tabacum sino en otras plantas

solanáceas como Capsicum annuum, Solanum tuberosum y Datura spp.

(Guedes et al., 1982). Usualmente, el capsidiol se encuentra ausente en tejidos

sanos y se sintetiza rápidamente en N. tabacum; la acumulación de esta

fitoalexina se detecta entre 12 y 24 h después de la infección de plantas intactas

por hongos, oomicetos, bacterias y virus o de la inducción de suspensiones

celulares con evocadores bíoticos (esporas fungosas, fragmentos de paredes

celulares de hongos, glicoproteínas derivadas de oomicetos como criptogeína,

celulasa, etc.) o abióticos (e. g., iones metálicos) (Threlfall y Whitehead, 1988;

Vögeli y Chappel, 1988, 1990; Yin et al., 1997; Keller et al., 1998). Sin embargo,

la acumulación de capsidiol en cultivos celulares inducidos de tabaco, papa y

chile es relativamente fugaz, ya que éste tiende a desaparecer con la misma

velocidad con la cual se acumuló, mediante un proceso catabólico que no ha

sido plenamente identificado (Threlfall y Whitehead, 1988). En contraste, la

109

síntesis de capsidiol está bien definida. Este metabolito, al igual que todas las

fitoalexinas sesquiterpénicas, se sintetiza a través de la ruta biosintética de los

isoprenoides. Su síntesis de novo es precedida por la activación de la enzima

clave 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGR), de cuya reacción se

derivará eventualmente el farnesil pirofosfato (FPP). El FPP es el último

compuesto en común por el que compiten las rutas biosintéticas de los esteroles

y sesquiterpenos, respectivamente. En esta última, los esqueletos carbonados

son dirigidos hacia la síntesis de capsidiol y otras fitoalexinas similares mediante

una ruta cuya reacción determinante, catalizada por la enzima 5-epi-

aristoloqueno sintasa (EAS), es la conversión de FPP a 5-epi-aristoloqueno

(Dudley et al., 1986; Croteau et al., 1987; Threlfall y Whitehead, 1988; Bohlmann

et al., 2002).

En este estudio no se pudo detectar capsidiol sino un producto de

degradación (Ramírez E, comunicación personal) que bien podría ser similar a

aquellos reportados por otros investigadores, como la capsenona o la cis-9,10-

dihidrocapsenona (Zacharius et al., 1985; Whitehead et al., 1987). Es probable

que la ausencia de capsidiol en las muestras analizadas tomadas de las plantas

dañadas mecánicamente o por insectos se haya debido a los tiempos de

muestreo, los cuales rebasaron ampliamente la vida media del capsidiol (12-24

h). Resulta, sin embargo, difícil de explicar la detección de catabolitos del

capsidiol en tejidos de plantas intactas donde, debido a la naturaleza

estrictamente inducible de este metabolito, no debería estar presente (pero ver

los argumentos presentados más adelante).

Posiblemente, y tal como se ha observado con otros metabolitos

secundarios de N. tabacum analizados en este trabajo, la acumulación

constitutiva del capsidiol, la cual se asume por la presencia de su catabolito,

pudiera estar regulada también por la ontogenia de la planta, ya que los niveles

constitutivos de esta fitoalexina detectados tanto en hoja como en raíz, fueron de

9 a 30 veces más altos en plantas jóvenes. El efecto sobre los niveles de

capsidiol causado por daño mecánico, que se sabe induce levemente la

expresión de EAS (Yin et al., 1997), también varió con la edad de las plantas,

siendo inductivo en plantas adultas, e inhibitorio en plantas jóvenes (Fig. 35 A y

B). La detección de bajos niveles de dihicrocapsenona en plantas intactas,

aunque inesperada, tiene relación con resultados previos en los cuales se

110

detectó una expresión basal del gen GUS en hojas, tallos y raíces de un número

de plantas transgénicas de N. tabacum transformadas con el promotor de EAS4,

uno de las 12 a 15 copias del gen de esta sesquiterpeno ciclasa que se han

detectado en el genoma de N. tabacum (Fachini y Chappel, 1992). De manera

que la presencia de múltiples formas del gen EAS en tabaco sugiere que, en

esta especie, cada uno de los genes podría ser regulado independientemente, y

en forma diferencial, durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estímulos

ambientales (Yin et al., 1997), lo que podría explicar los resultados contrastantes

entre plantas jóvenes y adultas obtenidos tanto con plantas intactas como

dañadas. En las raíces de plantas de N. tabacum intactas también se detectó

capsidiol cuantificado en forma directa como dihicrocapsenona cuyos niveles, al

igual que en follaje, fueron superiores en plantas jóvenes. Este resultado

coincidió con lo encontrado en raíces de plantas de tabaco silvestres (N.

attenuata y N. sylvestris), donde se detectó la expresión constitutiva del gen

EAS, a la cual se le atribuyó una leve acumulación de capsidiol (10 ng/g PF) en

raíces de plantas intactas (Bohlmann et al., 2002). De acuerdo a estos

investigadores, este hallazgo sugiere que el capsidiol no es solamente un

metabolito defensivo cuya acumulación se induce en respuesta a patógenos,

sino que constituye una defensa de tipo constitutivo que se expresa en forma

tejido específica en algunas especies de Nicotiana para impedir la invasión de

patógenos en la rizósfera, cuyas células epidérmicas, las cuales carecen de una

capa de cutícula protectora, son particularmente vulnerables debido a la abrasión

a la que continuamente están expuestas.

La sobreexpresión en tabaco de LePS y LeSYS redujo, en general, los

niveles constitutivos de capsidiol (dihidrocapsenona), en las plantas

transformadas, que en algunos casos (e. g., hojas de plantas jóvenes de la línea

Nt-LeSYS 03) estuvieron por debajo del límite de detección. El daño mecánico

tuvo un ligero efecto inductivo en plantas transgénicas jóvenes, que contrastó

con lo observado en plantas WT, mientras que en plantas transgénicas adultas

(excepto en la línea Nt-LeSYS 03) el daño mecánico causó una acumulación

extraordinaria de dihidrocapsenona, particularmente en plantas Nt-LePS 08 (Fig.

35 F). Estos resultados sugieren fuertemente que los mecanismos de regulación

que controlan la síntesis de este metabolito en N. tabacum se alteraron de tal

forma que permitieron la sobre acumulación de dihidrocapsenona en respuesta a

111

daño mecánico. Un posible blanco podría ser el gen EAS, cuya expresión está

estrechamente relacionada con la acumulación de capsidiol y otras fitoalexinas

sesquiterpénicas en N. tabacum. De modo que, al igual a lo que se ha observado

en la inducción del gen FAL (Kuhn et al., 1984; Bolwell et al., 1985; Lawton y

Lamb, 1987; Lois et al., 1989), que como se ha mencionado anteriormente es

una de las enzimas claves que regulan la ruta biosintética de los

fenilpropanoides, la síntesis elevada y estable de capsidiol en la plantas Nt-LePS

08 y WT × Nt-LeSYS 03 podría haberse debido a un incremento en: i) la tasa de

traducción de los ARNm que codifican para las diferentes formas del gen EAS y

la subsiguiente síntesis de novo de la enzima EAS; ii) la estabilidad de los

transcritos de EAS; y/o, iii) la velocidad de transcripción del gen EAS. Esta

hipótesis se apoya en los hallazgos de un estudio realizado por Vögeli y

Chappell (1990), quienes demostraron que la regulación de la actividad de la

enzima sesquiterpeno ciclasa en N. tabacum está mediada por un control, a nivel

transcripcional, de la expresión del gen EAS. Sin embargo, no puede descartarse

una posible contribución de otros genes reguladores de la síntesis de

isoprenoides, como el HMGR. Estas son posibilidades que quedan sujetas a

posterior investigación para ser verificadas o desmentidas.

La acumulación de capsidiol (dihidrocapsenona) en plantas WT sometidas a

herbivoría por larvas de M. sexta fue ligeramente superior a la detectada en

plantas dañadas mecánicamente (Figs. 35 y 36). Un efecto similar se observó en

plantas Nt-LeSYS 03 (Fig. 36 C), mientras que en las líneas Nt-LePS 08 y WT ×

Nt-LeSYS 03, la herbivoría fue claramente incapaz de inducir la acumulación de

los mismos niveles de capsidiol observados en plantas dañadas mecánicamente,

lo que sugiere que cualquiera que haya sido el factor generado por daño

mecánico que disparó la síntesis de capsidiol en estas plantas transgénicas, fue

neutralizado o suprimido por componentes presentes en las secreciones orales

de M. sexta, tal como se discutió anteriormente en el caso de la nicotina. A pesar

de ello, la leve inducción de capsidiol coincidió con los resultados reportados por

Bohlmann et al., (2002), quienes detectaron la acumulación de transcritos de

EAS y de capsidiol, aunque en niveles inferiores a los reportados en

suspensiones celulares de N. tabacum (Vögeli y Chappell, 1988), en tejido aéreo

de plantas de N. attenuata y N. sylvestris dañadas por larvas de M. sexta. Por el

112

contrario, se detectó una fuerte acumulación de capsidiol (dihidrocapsenona),

particularmente a nivel local (excepto en la línea Nt-LeSYS 03), en plantas

infestadas por mosquita blanca (Fig. 37 A a 37 C). Los altos niveles de capsidiol

detectados en estas plantas coinciden con la propuesta de que los insectos

chupadores que se alimentan directamente del floema son percibidos por la

planta como patógenos, debido a las similitudes que existen entre la manera en

que las hifas fungosas y el estilete de los insectos chupadores penetran la planta

y en menor medida, entre el tipo de enzimas hidrolíticas que se liberan durante la

invasión por hongos patógenos o alimentación de los insectos (Fidantsef et al.,

1999; Walling, 2000). La expresión de respuestas defensivas similares a las

inducidas por patógenos en plantas infestadas por insectos chupadores también

se ha atribuido a los virus y/o microorganismos, endo simbiontes que ellos

frecuentemente se encuentran (McKenzie et al. 2002). Es probable que la

inducción de capsidiol (dihidrocapsenona), por mosquita blanca detectada en las

plantas estudiadas, al igual a lo observado en plantas transgénicas de N.

tabacum transformadas con el promotor EAS4 fusionado al gen GUS (Yin et al.,

1997), haya sido independiente de ácido salicílico, ácido jasmónico y H2O2. Esta

propuesta se apoya, en cierta medida, en los resultados reportados por van de

Ven et al., (2000), quienes encontraron que la expresión del gen SLW3, inducida

en plantas de calabaza infestadas por B. argentifolii, fue independiente de estas

moléculas de señalización.

113

8. CONCLUSIONES

1. La extracción simple con metanol acético acuoso, resultó ser eficiente y

confiable para la obtención de metabolitos secundarios de interés (alcaloides,

fenoles y terpenos) con varias propiedades químicas, obviando la necesidad de

procesos de extracción más elaborados.

2. La técnica análitica por GC/MS en la cuantificación e identificación de

metabolitos de interés (nicotina, ác. clorogénico, capsidiol y nornicotina) no

modificados por la inserción de cadenas laterales (glicosilación, acetilación,

mutilación, etc.), resultó más confiable y precisa que HPLC.

3. La cantidad y distribución de metabolitos defensivos varió de acuerdo a la

ontogenia y tipo de desarrollo de la planta en Nicotina tabacum (WT y

transgénica), así como también por el tipo de tratamiento y tejido analizado.

4. La cantidad y distribución de metabolitos defensivos se modificó por la

expresión de LePS y LeSYS en N. tabacum, lo que podría tener relación con los

diferentes grados de resistencia contra herbivoría detectados entre plantas WT,

Nt-LePS y Nt-LeSYS y con el fenotipo anómalo de plantas Nt-LeSYS 03.

114

9. PERSPECTIVAS

Sería conveniente llevar a cabo un análisis tipo Tail-PCR para detectar

secuencias aledañas de la inserción del T-ADN en la línea Nt-LeSYS 03, con el

propósito de descartar la posibilidad de que el fenotipo alterado no se debió a la

interrupción de algún gen involucrado en procesos se desarrollo y crecimiento

de la planta, causante del fenotipo anormal.

Sabiéndo que el ácido jasmónico (AJ) induce la acumulación de nicotina

en plantas de N. attenuata, el cual se incrementa en las hojas dañadas y

rápidamente se transporta a las raíces vía floema, y que es un componente

esencial de la señalización entre hoja y raíz, sería interesante determinar los

niveles de AJ en plantas transgénicas de Nt-LePS y Nt-LeSYS en distintas

etapas de desarrollo para corroborar si existe una relación entre los niveles de

AJ in planta y los resultados obtenidos por daño mecánico y herviboría.

La inhibición de la síntesis de nicotina en hojas atacadas por M. sexta fue

mucho más marcada en las plantas transgénicas que en las plantas WT. Se

sugiere que la sobreexpresión de LePS y LeSYS en tabaco potencia el efecto

inhibitorio que la herbivoría por M. sexta tiene sobre la síntesis de nicotina,

posiblemene por una acumulación de etileno endógeno. De modo que sería

conveniente analizar esta posibilidad, pues no se conoce que la expresión de

sistemina y/o prosistemina incremente los niveles de Et en respuesta a

herbivoría por Manduca sexta.

Sería interesante cuantificar los niveles de nicotina el día de máxima

acumulación (5o día), en plantas infestadas con Bemisia tabaci, pues se sabe

que en plantas de Nicotiana los niveles de este metabolito se incrementan en

repuesta a daño, y verificar si la inducción de nicotina se reprime en este lapso al

igual como ocurre con herbivoría por Manduca sexta.

Sería interesante comprobar si existe algún desbalance o reducción de

algún componente de la ruta de los fenilpropanoides como FAL en la planta Nt-

LeSYS, pues su fenotipo anormal se asemeja al observado en plantas de tabaco

en las cuales se encuentra alterado el metabolismo de fenilpropanoides y si

115

existe una relación entre la reducción de ACG observado con un mayor

catabolismo de auxinas y una consecuente inhibición del crecimiento por

citocininas, debido a la expresión de LeSYS.

Considerando que el espectro de masas de la mayoría de los picos

obtenidos por GC/MS produjo señales que indicaban la presencia de

modificaciones por oligosacáridos y otros compuestos orgánicos, sería

conveniente realizar un análisis de los extractos después de su hidrólisis ácida

para tener una idea del grado de modificación que pudieran tener los metabolitos

secundarios de interés en tabaco. Resultaría interesante determinar si el grado

de modificación cambia en respuesta al daño mecánico y herbivoría, y si estos

cambios tienen relación con su actividad biológica.

116

10. BIBLIOGRAFÍA

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS … · por esos momentos de alegría que pasamos. A todos...

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