CICLO DE KREBS Material elaborado por: J. Monza, S. Doldn y S. Signorelli. En las clulas aerobias distintas vas catablicas convergen en el ciclo de Krebs El ciclo de Krebs (de los cidos tricarboxlicos o del cido ctrico) es una va metablica presente en todas las clulas aerobias, es decir, las que utilizan oxgeno como aceptor final de electrones en la respiracin celular. En los organismos aerobios las rutas metablicas responsables de la degradacin de los glcidos, cidos grasos y aminocidos convergen en el ciclo de Krebs, que a su vez aporta poder reductor a la cadena respiratoria y libera CO2 (figura 1). Figura 1. Visin panormica de la convergencia de las vas catablicas de glcidos, aminocidos y cidos grasos al ciclo de Krebs. Los hidrgenos presentes en esas molculas son los que abastecen a la cadena respiratoria desde el NAD o FAD, hasta combinarse con el oxgeno y formar agua. Los carbonos se eliminan como CO2. El catabolismo oxidativo de glcidos, cidos grasos y aminocidos puede dividirse en tres etapas, de las cuales el ciclo de Krebs es la segunda. En la primera etapa, que incluye a las vas catablicas de cidos grasos y a la gluclisis se genera acetil-CoA (2C). Los aminocidos pueden dar indirectamente acetil CoA , o directamente intermediarios del ciclo de Krebs. En la tercera etapa el poder reductor aportado por el ciclo de Krebs es drenado hasta el oxgeno a travs de los transportadores de cadena respiratoria (NADH.H, FADH2, CoQ y citocromos) y parte de la energa liberada se emplea en la sntesis de ATP por fosforilacin oxidativa (figura 1). El ciclo de Krebs es una ruta anfiblica: participa en procesos catablicos y anablicos. El ciclo proporciona -cetoglutarato y oxalacetato para la sntesis de glutamato y aspartato respectivamente, entre otras molculas fundamentales para la clula. CICLO DE KREBS 18 El piruvato genera la principal molcula abastecedora del ciclo: la acetil coenzima A La reaccin de oxidacin - decarboxilacin del piruvato es el nexo entre la gluclisis y el ciclo de Krebs. Esta reaccin irreversible es catalizada por un complejo enzimtico (piruvato deshidrogenasa) localizado en la matriz mitocondrial de eucariotas, y en el citosol de procariotas (figura 2). El piruvato pierde el grupo carboxilo como CO2, y los dos carbonos restantes unidos a la CoA conforman la acetil-CoA (figura 2). En la reaccin se reduce un NAD a NADH.H que a su vez cede los H a los otros transportadores de cadena respiratoria, con la consecuente formacin de 3 ATP. Figura 2. Reaccin resumen de la descarboxilacin oxidativa del piruvato. PDH (piruvato deshidrogenada). Una visin panormica del ciclo de Krebs La acetil-CoA generada por los diferentes catabolismos se condensa con el oxalacetato y genera citrato. A travs de 7 reacciones de oxidacin y descarboxilacin sucesivas (de la 2 a la 8, figura 3) se regenera oxalacetato, capaz de iniciar un nuevo ciclo. Figura 3. Representacin del ciclo de Krebs. Cada reaccin se indica con un nmero. CICLO DE KREBS 19 En cuatro reacciones del ciclo ocurren oxidacin de intermediarios y reduccin de coenzimas de cadena respiratoria: tres NAD y un FAD (figura 3). Esas molculas reducidas que integran la cadena respiratoria se reoxidan, y parte de la energa liberada se usa para fosforilar el ADP a ATP. En el ciclo propiamente dicho se produce una fosforilacin a nivel de sustrato que produce un GTP, que equivale energticamente a un ATP. El ciclo se puede resumir en la siguiente ecuacin: Acetil-CoA + 3NAD + FAD + GDP + Pi CoA-SH + 3 NADH.H + FADH2 + GTP + 2 CO2 Las reacciones del ciclo Reaccin 1: condensacin del oxalacetato con la acetil CoA La enzima citrato sintasa condensa a la acetil-CoA (2C) con el oxalacetato (4C) para dar una molcula de citrato (6C). Como consecuencia de esta condensacin se libera la coenzima A (HSCoA). La reaccin es fuertemente exergnica: es irreversible. Reaccin 2: isomerizacin del citrato a isocitrato La isomerizacin del citrato en isocitrato ocurre por dos reacciones, que se resumen en una. Reaccin 3: oxidacin y decarboxilacin del isocitrato El isocitrato es sustrato de la isocitrato deshidrogenasa, enzima que tiene como cofactor un NAD, que forma parte de la cadena respiratoria. En la reaccin 3 se resumen dos reacciones a partir de las cuales el isocitrato forma -cetoglutarato (5C). Para lograr ese producto ocurre una decarboxilacin, es decir la liberacin de una molcula de CO2, y la reduccin de un NAD que permite la formacin de 3 ATP. CICLO DE KREBS 20 Reaccin 4: el -cetoglutarato se transforma en succinil-CoA Este paso implica la segunda decarboxilacin oxidativa, catalizada por la -cetoglutarato deshidrogenasa, que lleva a la formacin de succinil-CoA (4C). El NAD es la coenzima de la deshidrogenasa, de manera que se formarn 3 ATP como consecuencia de la actividad de cadena respiratoria. Reaccin 5: la succinil-CoA rinde succinato y GTP La succinil-CoA, es un tioster de alta energa con un G de hidrlisis de -33.5 KJ.mol-1 aproximadamente. La energa liberada por la ruptura de ese enlace se utiliza para generar un enlace fosfoanhidro entre un fosfato y un GDP para dar 1GTP por fosforilacin a nivel de sustrato. En la reaccin se libera HSCoA. El GTP se puede convertir en ATP segn la siguiente reaccin: GTP + ADP GDP + ATP G = 0 KJ.mol- 1 Reaccin 6: el succinato se transforma en fumarato El succinato es oxidado a fumarato por la succinado deshidrogenasa, enzima que tiene como cofactor al FAD: se producen 2ATP en la cadena respiratoria. La enzima usa FAD porque la energa asociada a la reaccin no es suficiente para reducir al NAD. El complejo enzimtico de la succinato deshidrogenasa es el nico del ciclo que est asociado a la membrana mitocondrial de eucariotas, y en la membrana plasmtica de procariotas. CICLO DE KREBS 21 Reaccin 7: el fumarato se hidrata y genera malato La fumarasa cataliza la adicin de agua, es decir la hidratacin del fumarato. El producto de la reaccin es el malato. Reaccin 8: el malato se oxida a oxalacetato Dada la naturaleza cclica de la va, las reacciones en su conjunto conducen a la regeneracin del oxalacetato. La malato deshidrogenasa cataliza la oxidacin del malato a oxalacetato, con la reduccin de un NAD: se forman 3 ATP en la cadena respiratoria. Regulacin del Ciclo de Krebs La regulacin del ciclo hace posible la produccin de molculas de acuerdo a las necesidades celulares, y asegura que no ocurra sobre o sub produccin en un momento dado. La regulacin del ciclo se da en diferentes puntos, porque puede alimentarse o ser abastecido a travs de cualquiera de sus intermediarios. La regulacin es compleja en comparacin con la de vas catablicas como la gluclisis, y se considerarn situaciones de regulacin relacionadas al estado energtico celular. La regulacin de las enzimas es por modulacin alostrica, por modificacin covalente y por acumulacin de productos. La lgica de la regulacin se rige principalmente por la relacin ATP/ADP y NADH.H/NAD, as como por las concentraciones de algunos intermediarios del ciclo. Las relaciones entre ATP/ADP y NADH.H/NAD estn relacionadas entre s a travs de la fosforilacin oxidativa que ocurre en la cadena respiratoria, y ambas son seales del estado energtico de la clula. A continuacin se presentan tres situaciones regulatorias, relacionadas a la energa celular momentnea. Situacin 1: regulacin de la principal reaccin abastecedora del ciclo El complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) de vertebrados, que cataliza la transformacin de piruvato en acetilCoA, es un punto de regulacin clave porque la acetilCoA es la principal molcula abastecedora del ciclo. La regulacin se logra por dos mecanismos: alosterismo y modificacin covalente de la enzima. CICLO DE KREBS 22 Figura 4. Esquema de la regulacin de la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH) a travs de la fosforilacin/desfosforilacin de serinas de la subunidad E1 de esta enzima. La quinasa es inhibida alostricamente por el ATP, de manera que cuando los niveles de este son elevados el complejo PDH es inactivado por fosforilacin. Cuando desciende la concentracin de ATP celular, la actividad quinasa decrece y la actividad fosfatasa se incrementa y elimina el fosfato de la subunidad E1 convirtiendo a la enzima en su estado activo. Cuando las relaciones ATP/ADP, NADH.H/ NAD y acetil-CoA/ HSCoA son altas la enzima PDH es modulada negativamente. Cualquiera de las tres relaciones indican que en la clula hay un estado metablico rico en energa. Cuando esas relaciones descienden la enzima se activa, se incrementa entonces la oxidacin del piruvato y se sintetiza acetil CoA. La regulacin de la PDH a travs de la subunidad E1 (figura 4) es por modificacin covalente de la enzima, a la que una quinasa fosforila y una fosfatasa desfosforila residuos especficos de serinas. Para que la quinasa fosforile a E1 debe haber alta concentracin de ATP, que es un modulador positivo de la quinasa, que est regulada entonces alostricamente. Cuando aumenta la concentracin de ADP la actividad quinasa desciende y se incrementa la fostatasa, que desfosforila a la enzima que pasa a su forma activa (figura 4). Adems, la actividad del complejo PDH est modulada negativamente a nivel de la subunidad E2 por alta concentracin de acetilCoA y a nivel de la subunidad E3 por alta concentracin de NADHH. Es decir, tambin est regulado alostricamente a travs de distintos moduladores con diferentes subunidades. Situacin 2: regulacin de la enzima citrato sintasa La actividad de la citrato sintasa (reaccin 1, figura 3) est regulada por disponibilidad de sus sustratos: la acetil-CoA y el oxalacetato, cuya concentracin vara y determina la velocidad de formacin de citrato. El ATP es un modulador alostrico negativo de la citrato sintasa, que aumenta la KM de la enzima por el acetil CoA. As, cuanto mayor sea la concentracin de ATP menor ser la actividad de la enzima. Lo mismo produce el aumento de la concentracin de NADH.H (figura 5). Situacin 3: regulacin de las deshidrogenasas NAD Los pasos catalizados por las deshidrogenadas NAD dependientes (reacciones 3, 4 y 8, figura 3) regulan la velocidad del ciclo segn la relacin NADH.H/NAD. Cuando la concentracin de NADH.H aumenta la actividad de las deshidrogenasas desciende. El ATP tiene el mismo efecto inhibidor sobre las enzimas, mientras el ADP es un activador (figura 5). En resumen, si bien no es el nico, hay un principio unificador en la regulacin: cuando a nivel celular se dan condiciones de alta energa, la clula es capaz de reducir la eficiencia del proceso de produccin de ATP, y viceversa (figura 5). CICLO DE KREBS 23 Figura 5. Esquema general de regulacin del ciclo de Krebs. Tomado de Bioqumica, Mathews y van Holde, Editorial McGraw Hill Interamericana. Un balance posible de la degradacin total de la glucosa Para calcular la energa que se obtiene de la glucosa se pueden establecer cuatro instancias en su degradacin: gluclisis, decarboxilacin oxidativa del piruvato, ciclo de Krebs y cadena respiratoria. La cantidad de ATP generado difiere segn las lanzaderas implicadas y el tipo de clula (procariota o eucariota). En el cuadro 1 se plantea un balance en una clula eucariota, en la que oper slo la lanzadera del glicerol fosfato. Tabla 1. Resumen del balance energtico en ATP de la degradacin total de la glucosa. Se us para este balance la lanzadera del glicerol fosfato. CICLO DE KREBS 24El cido propinico generado en el rumen ingresa al Ciclo de Krebs como succinil CoA En los rumiantes, los microorganismos del rumen producen por fermentacin cidos grasos voltiles (AGV) a partir de los alimentos ingeridos. El AGV producido mayoritariamente es el cido propinico (3C). Esta molcula mediante dos reacciones produce succinil CoA (figura 6). A partir de esta molcula el hgado puede generar glucosa por glucognesis. Figura 10. Produccin de succinil-CoA a partir del propinico. La succinil-CoA ingresa al ciclo de Krebs (figura3) y mediante 3 reacciones (5, 6 y 7) es transformada en malato, que puede salir de la mitocondria por transportadores especficos. Una vez en el citoplasma el malato es convertido en oxalacetato que, mediante el rodeo metablico saltea la reaccin irreversible de Piruvato a PEP, y puede sintetizar glucosa por glucognesis. Este proceso incluye otras dos reacciones irreversibles en la etapa de hexosas (ver Gluclisis).

Fosforilacin oxidativa

Esquema actual del sistemamitocondrialde la fosforilacin oxidativa. Los equivalentesreducidosque se generan en elmetabolismo(NADH,FADH2) son oxidados por lacadena de transporte de electrones. Laenerga libregenerada en estareaccinse emplea parabombearprotones(puntos rojos) desde lamatriz mitocondrialhasta el interior de las crestas mitocondriales, para dar lugar a lafuerza protn-motriz. Cuando ste se disipa a travs del retorno a la matriz de los protones a travs de laATP sintasa, la energa almacenada se emplea parafosforilarelADPcon ungrupo fosfatopara formarATP.El modelo actual cubre algunos problemas suscitados por el anterior. En primer lugar, todos los componentes activos de la cadena de transporte de electrones se encuentran exclusivamente en lascrestas mitocondrialesy formando supercomplejos, en la imagen representado por elsupercomplejo I1III2IV1. Esto permite canalizar de unos complejos a otros las molculas de transferencia de electrones. Previamente se pensaba que difundan libremente. En segundo lugar, la diferencia depH, uno de los componentes de la fuerza protn-motriz junto con elpotencial de membrana() es de tan slo 0,55 unidades, equivalente a 32mV, insuficiente para impulsar la fosforilacin. Sin embargo, existen circunstancias locales que aumentan este pH en un factor de 2 unidades. En primer lugar, la ATP sintasa formadmerosy filas que comban y dan forma a la cresta mitocondrial, haciendo que el espacio interno tenga tan slo 204nm. El espacio entre la membrana interna y externa es menor, de 122,5nm, pero cuenta con poros lo suficientemente grandes como para estar en equilibrio con el citoplasma. Los protones se concentran gracias al "efecto superficie" y al rpido flujo desde las fuentes de protones a los sumideros.Lafosforilacin oxidativaes un procesometablicoque utiliza energa liberada por laoxidacindenutrientespara produciradenosina trifosfato(ATP). Se le llama as para distinguirla de otras rutas que producen ATP con menor rendimiento, llamadas "a nivel de sustrato". Se calcula que hasta el 90% de la energa celular en forma de ATP es producida de esta forma.1Consta de dos etapas: en la primera, laenerga libregenerada mediantereacciones qumicas redoxen varioscomplejos multiproteicos-conocidos en su conjunto comocadena de transporte de electrones- se emplea para producir, por diversos procedimientos como bombeo, ciclos quinona/quinol o bucles redox, ungradiente electroqumicodeprotonesa travs de unamembranaasociada en un proceso llamadoquimiosmosis. Lacadena respiratoriaest formada por tres complejos de protenas principales (complejo I,III,IV), y varios complejos "auxiliares", utilizando una variedad de donantes y aceptores deelectrones. Los tres complejos se asocian en supercomplejos para canalizar las molculas transportadoras de electrones, lacoenzima Qy elcitocromo c, haciendo ms eficiente el proceso.La energa potencial de ese gradiente, llamadafuerza protn-motriz, se libera cuando se translocan los protones a travs de un canal pasivo, laenzimaATP sintasa, y se utiliza en la adicin de un grupofosfatoa unamolculadeADPpara almacenar parte de esa energa potencial en losenlacesanhidro "de alta energa" de la molcula deATPmediante unmecanismoen el que interviene la rotacin de una parte de la enzima a medida que fluyen los protones a travs de ella. En vertebrados, y posiblemente en todo el reino animal, se genera un ATP por cada 2,7 protones translocados. Algunos organismos tienen ATPasas con un rendimiento menor.Existen tambinprotenas desacopladorasque permiten controlar el flujo de protones y generar calor desacoplando ambas fases de la fosforilacin oxidativa.Aunque las diversas formas de vida utilizan una gran variedad de nutrientes, casi todas realizan la fosforilacin oxidativa para producir ATP, la molcula que provee de energa almetabolismo. Esta ruta es tan ubicua debido a que es una forma altamente eficaz de liberacin de energa, en comparacin con los procesos alternativos defermentacin, como lagluclisisanaerbica.Pese a que la fosforilacin oxidativa es una parte vital del metabolismo, produce una pequea proporcin deespecies reactivas del oxgenotales comosuperxidoyperxido de hidrgeno, lo que lleva a la propagacin deradicales libres, provocando dao celular, contribuyendo aenfermedadesy, posiblemente, alenvejecimiento. Sin embargo, los radicales tienen un importante papel en lasealizacin celular, y posiblemente en la formacin de enlaces disulfuro de las propias protenas de la membrana interna mitocondrial. Las enzimas que llevan a cabo esta ruta metablica son blanco de muchas drogas y productos txicos queinhibensu actividad.