CIENCIAS CICY BIOLÓGICAS
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CICY • ( POSGRADO EN ) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS Centro de Investigación Científica de Yucatá n, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Lippia graveolen s, EN POBLACIONES SILVESTRES DE YUCATÁN, Y SU RELACIÓN CON FACTORES EDAFOCLIMÁTICOS Tesis que presenta VIOLETA ACOSTA ARRIOLA En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Opción Recursos Naturales Mérida, Yucatán, marzo 2011 .
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CICY
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( POSGRADO EN
) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Lippia graveolens, EN POBLACIONES SILVESTRES DE YUCATÁN , Y SU RELACIÓN CON FACTORES EDAFOCLIMÁTICOS
Tesis que presenta
VIOLETA ACOSTA ARRIOLA
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Opción Recursos Naturales
Mérida, Yucatán, marzo 2011 .
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e POSGRADO EN
) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE ESENCIAL DE Lippia graveo/ens, EN POBLACIONES SILVESTRES DE YUCATÁN, Y SU RELACIÓN CON FACTORES EDAFOCLIMÁTICOS
Tesis que presenta
VIOLETA ACOSTA ARRIOLA
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Opción Recursos Naturales
Mérida, Yucatán, marzo 2011.
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CICY RECONOCIMIENTO
POSGRADO EN
CIENCIAS BIOLÓGICAS
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Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado "Variación en
la composición química del aceite esencial de Lippia graveolens, en poblaciones
silvestres de Yucatán, y su relación con factores edafoclimáticos"fue realizado en
los laboratorios de la Unidad de Recursos Naturales y Biotecnología del Centro de
Invest igación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección de la Dra. Luz María
Calvo lrabién, dentro de la Opción Recursos Naturales, perteneciente al Programa
de Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.
Para los efectos que sean necesarios,
Director Académico
Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C.
1DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de materiales y métodos experimentales, los resultados y discusión de este documento proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó, para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A C., y que dicha información le pertenece en términos de la Ley de la Propiedad Industrial, por lo que no me reservo ningún derecho sobre ello.
Mérida Yucatán, 24 de Marzo del 2011 .
Violeta Acosta Arriola
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A mi abue, por su cariño y su apoyo.
A mi familia, amigos y compañeros.
A César, por impulsarme a seguir siempre adelante.
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AGRADECIMIENTOS
A Conacyt por la beca otorgada durante el desarrollo de la maestría clave 213709 .
A los proyectos de Ciencia Básica, CB-2007 -01 clave 82873 y CB-2008-01 clave 106389, y a FOMIX YUC-2008 clave C06-108231.
A los doctores Luz María Calvo lrabién y Luis Manuel Peña Rodríguez por su constante asesoría y enseñanzas durante el desarrollo de mi tesis. ·
A los miembros del "Laboratorio de Química Orgánica No 2", en especial al técnico Fabiola Escalante Erosa
Al Dr. José Luis Hernández Stefanoni por su asesoría en los análisis estadísticos.
Al grupo de "Plantas aromáticas", por su ayuda, paciencia, amistad y apoyo a lo largo del desarrollo de mi tesis. En especial a la Dra. Luz Maria Calvo y al técnico Gabriel Dzib.
A los investigadores Dra. María América Delgado Herrera , Dra. Elena Evguen ieva Stashenko, Dr. Francisco Javier Espinosa García y Dr. José Luis Andrade Torres quienes participaron en la revisión de mi trabajo de investigación ya sea como miembros del comité tutorial o del comité de examen de grado.
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ÍNDICE
Resumen
Abstract
Introducción
Bibliografía
CAPÍTULO 1
Aceites esenciales
Factores que afectan la composición del aceite esencial de las plantas
aromáticas
Factores que afectan la composición química de Lippia graveolens
Justificación
Objetivo general
Objetivos particulares
Preguntas de investigación
Bibliografía
CAPÍTULO 11
Introducción
Hipótesis
Materiales y Métodos
Resultados
Discusión
Bibliografía
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3
7
11
18
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25
26
26
26
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35
37
37
42
52
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CAPÍTULO 111
Conclusiones
Perspectivas
Bibliografía
¡¡
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65
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ABREVIA TU RAS
ACP: Análisis de componentes principales
ANOVA: Análisis de varianzas
C: Carvacrol
Q: Índice de aridez
S: No fenól ico
PAM: Plantas aromáticas y medicinales
T: Timol
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•
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Vías de la biosíntesis de los metabolitos secundarios presentes en
el aceite esencial. 13
Figura 2. Estructura y arreglos del isopreno. 14
Figura 3. Rutas de síntesis de isoprenoides. 15
Figura 4. Biosíntesis de carvacrol y timol. 16
Figura 5. Biosíntesis de cariofileno y humuleno. 17
Figura 6. Control genético de la biosíntesis en los quimiotipos de
Thymus vulgaris. 19
Figura 7. Biplot del análisis de componentes principales del porcentaje de los
metabolitos secundarios analizados en los individuos de las poblaciones
de Lippia graveolens en estudio. 43
Figura 8. Perfi les cromatográficos de los quimiotipos encontrados en las
poblaciones naturales de orégano mexicano en Yucatán. 47
Figura 9. Mapa de las poblaciones naturales de Lippia graveolens en estudio 48
Figura 1 O. Porcentaje de la varianza en el contenido de carvacrol del aceite
esencial de Lippia graveolens en los tres niveles analizados:
individuo, población y región . 48
Figura 11. Porcentaje de carvacrol en las poblaciones de Lippia graveolens 49
Figura 12. Relación entre las variables edafoclimáticas y la composición
del aceite esencial de Lippia graveolens. 50
IV
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ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Porcentajes de timol, carvacrol y rendimiento del aceite esencial de
Lippia graveolens reportado en la literatura 25
Cuadro 2. Características ambientales de las poblaciones de Lippia graveolens
39
Cuadro 3. Porcentajes de los principales metabolitos secundarios en los
quimiotipos del aceite esencial de Lippia graveolens.
Cuadro 4. Análisis de varianza (ANOVA) anidado.
Cuadro 5. Análisis de regresión lineal múltiple de la relación entre la
composición del aceite esencial de orégano y las variables
edafoclimáticas.
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45
51
V
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RESUMEN
Los aceites esenciales producidos por las plantas aromáticas están formados por una
mezcla de hasta 300 componentes, principalmente mono y sesquiterpenos. La cantidad y
el tipo de metabolitos secundarios de un aceite esencial es afectada por factores
genéticos, físicos, químicos y biológicos; el generar conocimiento científico para entender
cuáles son los factores que determinan la composición química de los aceites esenciales
permitirá controlar su calidad. El orégano mexicano (Lippia graveo/ens) es una planta
aromática de importancia económica en el país por su uso como saborizante y en la
medicina tradicional. En México se colectan aproximadamente 4000 toneladas de esta
especie al año; en Yucatán la cosecha y la venta de esta planta es una fuente importante
de ingresos en comunidades rurales . Dadas las características y propiedades biológicas
(e.g . antibióticas, antioxidantes) de su aceite esencial, L. graveo/ens presenta un potencial
económico para la industria alimenticia y farmaceútica . En esta tesis se anal izó el efecto
de las variables edafoclimáticas sobre la composición química del aceite esencial de L.
graveolens en 14 poblaciones silvestres de Yucatán, con distintas condiciones de clima y
de suelo. El aceite esencial se extrajo de hojas maduras de L. graveo/ens por destilación
por arrastre de vapor y su composición se analizó por cromatografía de gases . La
variabilidad en la composición del aceite esencial se analizó tomando en cuenta el
contenido de seis metabolitos secundarios reportados como mayoritarios (p-cimeno y
terpineno, carvacrol, timol, (-)-trans-cariofileno y a-humuleno). Un análisis de
componentes principales permitió definir tres quimiotipos: e (75% de carvacrol) , T (80%
de timol) y S (no fenólico), que se reporta por primera vez. Aunque el clima no se
relacionó significativamente con la variación en la composición del aceite esencial , los
quimiotipos no se distribuyeron al azar en las cuatro regiones climáticas estudiadas. En
climas secos los quimiotipos e y T predominaron y en climas húmedos el quimiotipo S fue
más abundante. El análisis de regresión múltiple sugirió una asociación significativa entre
la presencia del quimiotipo S y mayores cantidades de fósforo en el suelo. Los quimiotipos
e y T se asociaron con mayores valores del punto de marchitez permanente del suelo.
Asimismo el quimiotipo T y el contenido de manganeso en el suelo se asociaron
significativamente. En conclusión , este estudio mostró que factores edáficos juegan un
papel relevante para explicar la variabilidad química encontrada en el aceite esencial de L.
graveolens. Son necesarios estudios futuros que incorporen aspectos genéticos así como
interacciones bióticas para profundizar en el entendimiento de la variabilidad encontrada.
1
•
ABSTRAeT
The essential oils produced by aromatic plants are a complex combination of up to 300
compounds, mainly monoterpenes and sesquiterpenes. The quantity and type of
secondary metabolites of an essential oil is affected by genetic, physical , chemical and
biological factors. Scientific knowledge that help understand which factors determine the
chemical com position of essential oils, can contribute to control their quality. Mexican
oregano (Lippia graveolens) is an aromatic plant of economic importance in this country ,
because of its use as seasoning and in traditional medicine. Every year, almost 4000 tons
of this herb are collected in Mexico; in Yucatán , the harvest and retail of th is plant
represen ts an important source of income for rural communities. Dueto the characteristics
and biological properties (e.g . antibiotic, antioxidant) of its essential oil , this species
represen ts an economic potential for a variety of industries (e.g. food , pharmaceutical) . In
this thesis, the effect of the edaphoclimatic variables on the chemical composition of L.
graveo/ens essential oil was analyzed on 14 wild populations in Yucatán, under different
climate and soil conditions. The essential oil was extracted from mature leaves of L.
graveo/ens using steam distillation, and its composition was analyzed by gas
chromatograp hy. Variability in essential oil composition was analyzed considering the
contents of six reported as major secondary metabolites (p-cymene y-terpinene, carvacrol ,
thymol , (-)-trans-caryophyllene and a-humulene) . Using principal component analysis,
three chemotypes were defined: e (75% carvacrol), T (80% thymol) ; and S (non-phenolic) ,
reported for the first time in literature. Even though the climate did not have a significant
relation in the variation in the composition of the essential oil , the chemotypes were not
randomly distributed in the four climatic regions analyzed in this study. In dry climates ,
chemotypes e and T were dominant, whereas in humid climates chemotype S was more
abundant. The multiple regression analysis suggested a significant association between
the presence of chemotype S and greater amounts of phosphorous in the soil. The
chemotypes e and T were associated with higher values of the permanent wilting point of
the soil. Also, chemotype T and manganese content in the soil were strongly related . In
conclusion , this study showed that edaphic factors play a relevant role to explain the
chemical variability found in the essential oil of L. graveo/ens. Future studies including
genetic factors as well as biotic interactions will contribute to deepen our understanding of
the variability found in the current study.
2
•
INTRODUCCIÓN
La demanda de una ampl ia variedad de especies silvestres se ha incrementado
con el au mento de las necesidades humanas y del intercambio comercial (Schippmann
et al., 2006). Las plantas aromáticas y medicinales (PAM) conforman un grupo extenso
de productos vegetales que pueden ser utilizados ya sea en su estado natural o
sometidos a procesos de transformación. Muñoz (2002) define a las plantas
medicinales como aquellas que producen principios activos, los cuales tienen una
acción farmacológica sobre un organismo vivo . En cambio las plantas aromáticas son
aquellas que pueden generar por algún proceso fisicoquímico, un producto aromático,
entendiéndose por productos aromáticos aquellos que tienen un olor o un sabor
determinado, sin evaluar su calidad comercial o estética (Biocomercio Sostenible,
2003). Algunas plantas aromáticas, cuyas características organolépticas proporcionan
a los alimentos y a las bebidas ciertos aromas, colores y sabores, se denominan
especias o condimentos. Debido a los efectos adversos provocados por los productos
sintéticos, en la actualidad ha surgido una creciente necesidad por el uso de aditivos
de origen natural (Jacinto et al., 2007). Lo anterior, explica que el uso de las plantas
como especias también se haya incrementado. Tal como en el pasado, su uso
principal es para potenciar los sabores, además de su importancia en el ámbito
farmacéutico (Avila-Sosa et al., 2010).
En los países en desarrollo, la producción y transformación de plantas
aromáticas y medicinales se plantea como un estímulo para el desarrollo rural ; como
una forma más de proporcionar tanto un incremento en los ingresos de las personas,
como una mejora de su estado de bienestar social (Fernández, 2006). Desde la
perspectiva de la industria o del consumidor, la ventaja de la utilización de las plantas
aromáticas y medicinales y sus productos transformados, reside en sus principios
activos que tienen propiedades específicas. Algunas plantas con varios principios
activos tienen diversos usos (Fernández, 2006), e.g . Papaver somniferum L. , una
planta principalmente de uso medicinal de la que se obtiene el opio y sus alcaloides:
morfina, codeína, tebaína, etc. Por otro lado, de sus semillas se extrae un aceite muy
apreciado en la repostería fina (Cases, 2007). El comercio de este tipo de plantas se
lleva a cabo a escala local e internacional. Una gran cantidad de estas plantas que se
comercializan en los centros urbanos, provienen de zonas rurales de países en
desarrollo. La mayor parte de este comercio no se encuentra registrado en las
3
•
estadísticas oficiales o está escasamente documentado (Hamilton, 2003), por lo que
es difícil saber con exactitud la cantidad de plantas de este tipo que realmente se
comercializan (Schippmann et al., 2006).
Con relación a las cifras obtenidas de la base de datos de las Naciones Unidas,
Clasificación Uniforme de Comercio Internacional revisión 3, Fernández (2006)
menciona que el volumen de comercio mundial de las plantas medicinales y
aromáticas tiene un crecimiento continuo, particularmente en el apartado de las
especias y de los aceites esenciales. De 2004 al 2008, las e?<portaciones a nivel
mundial de aceites esenciales, perfumes, cosméticos y artículos de higiene, se
incrementó casi tres veces (de $536,165000 a $1,484694000 dólares
estadounidenses) (Bulletin MNS, 2009).
En el caso de México, durante el período de 1993 a 2006, los aceites
esenciales y resinoides incrementaron el índice de comercio intra-industrial en los
intercambios con el exterior en un 53.8% (López y Rodil , 2008). De 2004 a 2008 las
exportaciones mexicanas de los aceites esenciales, resinoides , y subproductos
terpénicos se incrementó de $39,469 a $61 ,951 dólares estadounidenses. Los
principales países importadores fueron Estados Unidos, Reino Unido, Aleman ia,
Guatemala, Brasil , Japón, Países Bajos, Francia, Italia, República de Corea, Irlanda y
Bélgica (Bulletin MNS, 2009).
En general, un aceite esencial está formado por una mezcla compleja de 80 a
300 compuestos, principalmente monoterpenos y sesquiterpenos. Estos compuestos
se producen en diversas partes de la planta (tallos, hojas, flores, frutos, semillas y raíz)
como producto del metabolismo secundario (Stewart, 2006; Lovkova et al., 2001 ), pero
la cantidad y el tipo de metabolitos secundarios es muy variable tanto entre las
especies, como entre los individuos de una misma especie (Donaldson y Lindroth,
2007). Diversos factores físicos, químicos y biológicos, externos e internos a la planta,
pueden afectar la producción de metabolitos secundarios, tanto en calidad como en
cantidad (Barra, 2009; Figueiredo et al., 2008).
Entre los factores más importantes que influyen en la producción del aceite
esencial están: los genéticos, la edad , el estado fenológico y el órgano de la planta, así
como la calidad y la cantidad de la luz, el fotoperíodo, la temperatura, el estrés hídrico,
los productos orgánicos presentes en el medio, las deficiencias minerales, las
interacciones bióticas intra e interespecíficas y los contaminantes sintéticos (Anaya,
4
•
2003; Sangwang et al. , 2001; Swain, 1977). Asimismo, las prácticas de cosecha y de
manejo, además de las condiciones de cultivo influyen en la cantidad y la calidad del
aceite esencial producido (Arcila-Lozano et al., 2004).
Algunos autores señalan que la gran variabilidad en la composición química de
los aceites esenciales se debe, sobre todo, a la naturaleza genética de la planta, más
que a la influencia del medio ambiente. Keurentjes y colaboradores (2006), mencionan
que la variación en la composición de los metabolitos de una planta, podría ser una
respuesta de adaptación a condiciones naturales específicas y que esta variación está
controlada genéticamente. Otros autores otorgan un papel preponderante al ambiente
(Amzallag et al. , 2005; Vernin et al., 2001). De esta manera se pueden dividir los
estudios realizados sobre la composición y el rendimiento del aceite esencial de
plantas aromáticas en dos grupos principales: los que estudian los factores externos a
la planta como el agua (Dunford y Silva, 2005), la estación del año (Johnson et al. ,
2004), la cantidad de luz (Letchamo y Gosselin, 1995), los nutrientes (Kanias et al. ,
1998) y la localidad (A fifí et al., 2009), entre otras, y las investigaciones sobre los
factores internos como el genotipo (Ríos-Estepa et al., 2008), la edad o fase del ciclo
de vida (Jordán et al., 2006), y la cantidad de tricomas (Kokkini et al., 1994).
Uno de los aceites esenciales utilizados en diversas industrias es el aceite
esencial del orégano. Con el nombre de orégano se conocen cerca de 61 especies de
17 géneros pertenecientes a se is familias botánicas, siendo sólo las famil ias
Lamiaceae y Verbenaceae las de mayor importancia económica. Dentro de la familia
Lamiaceae, se encuentra el orégano del Mediterráneo perteneciente al género
Origanum, mientras que en la familia Verbenaceae el orégano está representado por
los géneros Lantana y Lippia, en particular, Lippia graveolens comúnmente conocida
como orégano mexicano (Kintzios, 2002).
El orégano mexicano es una de las plantas aromáticas de mayor importancia
para nuestro país. Su aceptación en el mercado, se debe a su gran poder saborizante
(Huerta, 1997), usándose principalmente como condimento para preparar comida
mexicana, pizzas y salsas para barbacoas (Kintzios, 2002) . Sin embargo, en la
medicina tradicional mexicana, las partes aéreas de esta especie se han utilizado
como antiséptico, antipirético, analgésico, abortivo, antiespasmódico, anti-inflamatorio
y para el tratamiento de problemas menstruales y diabetes (Martínez-Rocha et al.,
5
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2008). Anualmente en México se colectan cerca de 4000 toneladas de orégano; de
éstas aproximadamente la mitad son reguladas por dependencias oficiales y
comercializadas principalmente a Estados Unidos, en tanto que el resto es extraído de
forma clandestina y se exporta a diferentes países bajo aranceles falsos, de los que no
se tienen datos precisos del precio obtenido (Huerta, 1997). La colecta de hojas de
orégano mexicano es una actividad complementaria a la siembra de temporal en las
zonas áridas y semi-áridas del Norte del país (González-Guereca et al., 2010). Por
otra parte, en el estado de Yucatán las mujeres y los niños de las comunidades rurales
son quienes principalmente cosechan el orégano del monte. La cosecha y la venta del
orégano representa una fuente importante de ingresos para el sustento fam iliar ya que,
en términos comparativos, representa cerca del doble del ingreso de un padre de
familia que labora en una granja avícola local (Calvo-lrabién y Dzib, 2006).
Algunos productores y/o colectores de Lippia graveolens han optado por
extraer el aceite esencial con la finalidad de tener mayores ganancias, por su creciente
demanda y por los altos precios de venta que tiene este producto a nivel internacional
(Jacinto et al., 2007). El aceite esencial de L. graveolens es apreciado por ser un
saborizante natural y por su uso como conservador. Además se utiliza en perfumería
(Vernin et al. , 2001) y en la elaboración de cosméticos, fármacos y licores (Arcila
Lozano et al., 2004). También tiene una actividad antimicrobiana y antioxidante
significativa (Martínez-Rocha et al. , 2008). En Estados Unidos, el precio del aceite
esencial del orégano mexicano es de aproximadamente $400 dólares por kilogramo
(Bulletin MNS, 2009).
Esta tesis aportará información acerca de cuáles son los principales factores
edafoclimáticos que afectan la composición del aceite esencial del orégano mexicano
(L. graveolens) en poblaciones naturales del estado de Yucatán . El conocer dichos
factores permitirá homogenizar y aumentar la calidad del aceite esencial producido y
de esta manera incrementar su valor comercial.
En el capítulo 1 de la tesis se presenta la revisión bibliográfica sobre la
importancia de los terpenos, los principales componentes del aceite esencial y su
biosíntesis; así como la revisión acerca de los factores que influyen en la cal idad del
aceite esencial en las plantas aromáticas, con especial énfasis en las especies cuyo
aceite esencial presenta una composición química similar a la del orégano mexicano
(e.g. Origanum spp. y Thymus spp.). De manera especial, se mencionan los trabajos
6
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realizados acerca de la composición del aceite esencial de L. graveolens. Por último,
se presentan los objetivos y las preguntas generales de investigación.
En el segundo capítulo, se presenta el caso específico de L. graveo/ens, la
descripción de la especie, la importancia ecológica y económica de su aceite esencial
y los reportes acerca de los factores que afectan la presencia y la concentración de los
metabolitos secundarios que componen su aceite esencial. Además, se analiza la
relación entre los factores ecológicos (climáticos y edáficos) estudiados y la variación
en la composición del aceite esencial entre los individyos, las poblaciones y las
regiones en el estado de Yucatán. En el tercer capítulo se presentan las conclusiones
generales y las perspectivas.
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10
•
CAPITULO 1
ANTECEDENTES
ACEITES ESENCIALES
Los aceites esenciales son mezclas complejas y variables de metabolitos
secundarios, principalmente del grupo de los terpenos. Además contienen productos
aromáticos derivados de fenilpropanos y pueden presentar productos de degradación
de metabolitos no-volátiles. Son líquidos a temperatura ambiente, con densidades
generalmente menores a la del agua. Tienen alto índice de refracción y la gran
mayoría rota el plano de luz polarizada. Son liposolubles y solubles en solventes
orgánicos (Bruneton, 1999).
Los aceites esenciales están involucrados en diversas funciones de defensa,
protección y comunicación vegetal por lo que intervienen en diversas interacciones
biológicas como planta-patógeno, planta-carnívoro, planta-herbívoro y planta-planta
(Arimura et al., 2009). En la literatura se menciona que los aceites esenciales pueden
funcionar como una barrera física contra los insectos y reducir la pérdida de agua de la
planta (Duke, 1994). Por otro lado, se ha reportado que sirven para atraer
pol inizadores, como alimento para herbívoros y disminuyen la competencia con otras
plantas causando fitotoxicidad en el suelo (Deans y Waterman , 1993).
Aunado a lo anterior, los aceites esenciales presentan una actividad
antimicrobiana y antioxidante importante, la cual se debe a la presencia de
componentes activos, principalmente monoterpenos y sesquiterpenos. Es por ello, que
los aceites esenciales sirven como desinfectantes y para preservar alimentos, además
de producir efectos astringentes, bactericidas y antiinflamatorios (Lovkova et al., 2001 ;
Duke, 1994 ). Las propiedades que los metabolitos secundarios le confieren a los
aceites esenciales hacen que estos productos naturales sean utilizados por la industria
farmacéutica, alimenticia, cosmética y agrícola (Duke, 1994).
Por otra parte y dado que la biosíntesis de los aceites esenciales se restringe
por lo general a grupos selectos de plantas (Pichersky y Gang, 2000), los metabolitos
secundarios que componen un aceite esencial son utilizados para fines de clasificación
quimiotaxonómica. Los resultados de la variación química de los taxa de plantas se
emplean también para conocer o esclarecer las relaciones evolutivas o filogenia. Con
esta información se pueden escoger plantas con probabilidad de encontrar un cierto
11
•
tipo de metabolitos o de seleccionar métodos de estudio de acuerdo a los posibles
componentes de una planta elegida al azar (Marcano y Hasegawa, 2002).
Los aceites esenciales se encuentran en cantidades muy pequeñas en
comparación con el peso total de la planta (Marín-Loaiza y Céspedes, 2007). La
síntesis, acumulación y liberación al ambiente de estos aceites generalmente se
asocian con la presencia de estructuras histológicas especializadas, que se localizan
sobre o cerca de la superficie de diversos órganos de la planta (Bruneton , 1999). Estas
estructuras (tricomas glandulares, micropelos, conductos resiníferos y células de
aceite, entre otras) se pueden encontrar en diversas partes d~ una planta (flores,
hojas, tallos, rizomas, frutos, semillas y madera) y dependiendo del grupo taxonómico
al cual pertenece la especie, van a tener características morfológicas y anatómicas
particulares (Sangwan et al., 2001 ).
Los metabolitos que componen un aceite esencial, pueden formarse por medio
de tres rutas metabólicas (Figura 1 ): la primer ruta da lugar a aldehídos, ésteres,
alcoholes y jasmonatos por medio de la vía de los ácidos grasos/lipooxigenasa, la
segunda ruta da lugar a los terpenos (mono, sesqui y diterpenos) la tercera ruta, del
ácido shikímico da lugar a los bencenoides (Marín-Loaiza y Céspedes, 2007).
Debido a que los terpenos son los principales componentes de los aceites
esenciales, y a que los metabolitos secundarios mayoritarios del aceite esencial de
Lippia graveolens, son mono y sesquiterpenos, a continuación se describirá con más
detalle su biosíntesis.
Las estructuras de los terpenos suelen ser muy diversas (acíclicas, cíclicas y
policíclicas) (Eisenreich et al. , 2004), pero básicamente están formados por un arreglo
de cadenas de isopreno C5 (Figura 2) . De esta manera, los monoterpenos constan de
dos moléculas de isopreno, los sesquiterpenos de tres y los diterpenos de cuatro
(Dubey et al., 2003; Chappell , 1995). Existen dos rutas independientes para la síntesis
de isoprenoides: la ruta citosólica del acetato/mevalonato y la ruta del no-mevalonato
(Fig .2) , también llamada ruta del 1-deoxi-D-xylulosa-5-fosfato (DXP) o ruta del 2-C
metii-D-eritritol-4-fosfato (MEP) que se lleva a cabo en los plastidios (Pichersky et al.,
2006; Liu et al., 2005; Eisenreich et al. , 2004; Dubey et al., 2003; Lichtenthaler, 1999).
En la Figura 3, se muestra la ruta citosólica, en la que se biosintetizan los esteroles,
los sesqu iterpenos y los triterpenos y la ruta del no-mevalonato en la que se sintetizan
12
Vía ácjdos arasos COOH
Lipooxigenasa
Dióxido de carbono j Vía meyalonato
l Glucólisis
Glucos G!iceraldeh ído-3-PP--~~~Piruvato
Acetil corzima A
• COOH
1
VíaPOXP y t 1-Deoxi-D-xilulosa-5-fosfato
Eritrosa-4~-fosfato L ~ Vía ácjdo 00 IPP shjkjmíco -~ N (lsopenteni\_P
Ácido shikimico : 1 d 1H
A d J. //ii ;;"-- .rr~CH, Cl O COriSimiC<L....... u u j Ácido salicílico
.. l t
A"'"'L 6-H--·óoc", 5:7-
Ácido 13-Hidroperoxi!inolénico
Salicilato de metilo
~-...... .. ·· . ..
~"''"~"' ........
o /"'--. 11 OPP ................. .,.. (l C-OH
irofosfato) y~ .o
." Acido 7-iso-jasmónico
{ ~H Vía YQI;Uílt:li !!1: 1!2in v~r!!~li
v=ycHO
Ocimeno Linalool 3-Z-hexenal~
~CH20H ~CHO
~v 3-Z-hexenol 2-E-hexenal
1
J~ ~CH20 CH20 H
3-E-hexenol 2-E-hexenol
Ácido benzóico Benzoato de metil Farmeseno L_ __________ ~ Cariofileno ------···········.,.. Indica varios pasos
Figura 1. Vías de la biosíntesis de los a metabolitos secundarios presentes en los aceites esenciales. (Tomado de: Marín-Loaiza y Céspedes, 2007).
13
•
lsopreno
Cabeza-cola Cabeza-cabeza Cabeza-parte media
Figura 2. Estructura y arreglos del isopreno (Tomado de: Croteau et al., 2000) .
los carotenoides, el fitol , la plastoquinona-9, el isopreno, y los mono y diterpenos
(Lichtenthaler, 1999). Ambas rutas generan isopentenil pirofosfato (IPP) y dimetilal il
pirofosfato (DMAPP) si se adiciona otra unidad de IPP al DMAPP se forma el geranil
piro fosfato (GPP) que da origen a los monoterpenos (Pichersky et al., 2006; Liu et al.,
2005).
El carvacrol y el timol son los principales componentes presentes en el aceite
esencial del orégano mexicano (Calvo-lrabién , et al., 2009; Dunford y Silva, 2005;
Silva y Dunford, 2005; Uribe-Hernández et al., 1992; Domínguez et al., 1989;
Compadre et al., 1987); ambos metabolitos son clasificados como monoterpenos.
Haagen-Smit (1953), al estudiar las relaciones biogenéticas del género Monarda,
reportó que el p-cimeno es el precursor del carvacrol y el timol. Estudios realizados en
Thymus vulgaris, proporcionan evidencia de que el timol se deriva por aromatización
del y-terpineno al p-cimeno, seguido de la hidroxilación qe este último. Poulose y
Croteau (1978) señalan que para el carvacrol , sucede algo semejante; después de la
aromatización hay una hidroxilación enzimática en el C-2 del anillo en presencia de la
hidroxilasa (Vernin et al. , 2001 ), (Figura 4).
14
•
Vía del Mevalonato Citoplasma-Mitocondria
Vía de la Deoxixilulosa Fosfato Cloroplastos-Piastidios
OH o )l_SCoA
O + H~~OP pjru:a::COOH 0 Gljcernldehjdo-3P
o o )l___ASCoA-CoASH ;
Acetoaceti!CoA t
Ubjgyjnona
O QH .~ CoA~/(__._cooH
MYA
~ 2NAP
Ho, / ~COOH
HMG-CoA
~ ~OPP
lP.P.
~OPP QMAP.P.
Proliprenoides ~
~Efe Escualeno Triterpenos Estero les
/ ~ Sesquiterpenos
<:== Cs ~ lsopreno
<:== C1o ~ Monoterpenos
<:== C1s ~
~ Thiamine-PP
O OH
A~OP i OH
' QXP.
~!
~OPP QMAef.
Plastoqyinona
Ei12l. Djterpenos Carotenoides
Figura 3. Rutas de síntesis de isoprenoides. Tomado de: Hüsnü y Demirci , 2007.
15
16
•
Geranil pirofosfato
J N.,, prsfato
GAMA-TERPINENO
J PARA-CIMENO
<f Gecaolol
t OPP A,oH ~ Linalol
A Terpenil-8
~~Q.PP /
~ Terpenil-4
A X" oH TIMOL
CARVACROL
Alfa-terpineol
Tuyanol-4 (& terpinen-4-ol , Mircenol-8 & Linalool)
Figura 4. Biosíntesis de carvacrol y timol (Tomado de: Thompson et al., 2003) .
•
~~OPP
+ ~OPP
Catión E.E-farnesyl
Catión humulil
Catión cariofilil
H
(±) - H
a
ALFA-HUMULENO
Beta-cariofileno
Figura 5. Biosíntesis de cariofi leno y humuleno. Tomado de: Dewick, 2003.
17
•
Además del timol y el carvacrol , el y-terpineno, el p-cimeno, el (-)-trans
cariofileno y el a-humuleno han sido reportados como los componentes principales del
aceite esencial de Lippia graveolens (Calvo-lrabién et al., 2009; Silva y Dunford , 2005;
Uribe-Hernández et al., 1992; Domínguez et al., 1989; Compadre et al. , 1987). La
biosíntesis de los sesquiterpenos (-)-trans-cariofileno y a-humuleno se lleva a cabo en
el citosol a través de la vía del mevalonato (Figura 5).
FACTORES QUE AFECTAN LA COMPOSICIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE
LAS PLANTAS AROMÁTICAS
Para estudiar la variabilidad química de las plantas aromáticas, es necesario
analizar al menos tres factores: la variabilidad genética individual , la variabilidad morfo
y ontogenética y las modificaciones debidas al ambiente (Franz, 1993).
Factores genéticos
Rios-Estepa y colaboradores (2008) encontraron que la expresión genética y la
modulación de la activación enzimática en Mentha x piperita, son factores importantes
que regulan la biosíntesis de los monoterpenos. Por otra parte, se sabe que en
Thymus vulgaris existen seis quimiotipos: geranio! (G), alfa-terpineol (A) , thujanol-4
(U) , linalol (L), carvacrol (C) y timol (T) y que los factores genéticos controlan la
presencia o ausencia de los diferentes metabolitos secundarios (Franz, 1993). La
presencia del monoterpeno dominante es controlada por una serie epistática de cinco
loci y cuando todos los loci son homocigos recesivos, el timol es el monoterpeno
dominante (Thompson et al. , 2003; Vernet et al., 1986). Las relaciones epistáticas son
comunes cuando más de dos loci controlan la misma ruta biosintética (Vernet et al.,
1986). En las plantas aromáticas como el tomillo, que tienen un gen de series de
multilocus G>A>U>L>C> T (Fig. 6), cuando cambian las · condiciones ambientales
podría también cambiar la dirección de la dominancia (Loziene y Venskutonis, 2005).
18
•
x0 - x, GIG G+g
- x2 AlA A+ a
OH
Tipo/Locus: Geranio! (G) Alfa-Terpineol (A) Tujanol-4 (U)
-OH
OH
Timol (T)
Linalol (L) Carvacrol (C)
Figura 6. Control genético de la biosíntesis en los quimiotipos de Thymus vulgaris. Tomado de:
Vernet, 1976, en Franz, 1993.
Factores asociados a la ontogenia
Se sabe que en las flores de Boronia megastigma la concentración de a y ~
pineno y de limoneno aumenta conforme la planta empieza a fructificar (Bussell et al.,
1995). Ríos-Estepa y colaboradores (2008) encontraron que la mentona es el
componente principal de las hojas jóvenes en Mentha x piperita , mientras que en las
hojas maduras el mentol es el componente mayoritario. Por otra parte, Johnson y
colaboradores (2004) encontraron que en Origanum vu/gare L. ssp. hirtum existe un
mayor porcentaje de p-cimeno en plantas jóvenes, conforme la planta va creciendo el
porcentaje de carvacrol aumenta mientras que el porcentaje de p-cimeno disminuye.
En un estudio realizado en condiciones controladas de temperatura , humedad y suelo,
Jacinto y colaboradores (2007) compararon los porcentajes de timol y carvacrol del
aceite esencial en plántulas e individuos adultos· de orégano mexicano. En sus
resultados reportaron una gran variabilidad en la composición de los genotipos de
orégano analizados. En las plantas adultas el porcentaje de timol disminuyó (7 .12%},
mientras que el porcentaje de carvacrol aumentó (5.66%).
19
•
Factores relacionados con las características de las estructuras secretoras
Los tricomas glandulares, estructuras en las que se sintetiza y almacena el
aceite esencial, varían en cuanto al órgano en el cual se encuentran y en la cantidad
en que se producen (Sangwan et al., 2001). Lo anterior se ve reflejado en el
rendimiento del aceite esencial; tanto Kokkini y colaboradores (1994), como Werker y
colaboradores (1985) reportan que en Origanum vulgare la densidad de tricomas
glandulares está correlacionada positivamente con el contenido total de aceite
esencial , mientras que para la composición de aceite esencial contenido en los
tricomas no se encontraron diferencias entre los tipos de tricomas giJ3ndulares de los
diferentes quimiotipos examinados . En Lippia scaberrima la composición del aceite
esencial depende del tipo de tricoma; en tricomas peltados con bulbos grandes se
encontraron terpenoides, en tanto que en tricomas peltados y capitados pero con
bulbos pequeños se observó la presencia de productos fenólicos (Combrinck et al.,
2007).
Factores ecofisiológicos
Se sabe que las principales rutas de la biosíntesis de los metabolitos
secundarios derivan del metabol ismo primario del carbono y que la fotosíntesis,
proceso mediante el cual se fija el carbono, es limitado por diversos factores como la
luz, la temperatura, la disponibilidad hídrica, etc. (Lambers et al. , 1998; Cornic y
Massacci , 1997). Lamontagne y colaboradores (2002) encontraron que la fotosíntes is
y la disponibi lidad de luz fueron las principales fuentes de energía y de carbono para la
biosíntesis de monoterpenos en el follaje de Abies balsamea. Lo anterior coincide con
lo reportado por Sangwan y colaboradores (2001 ), quienes encontraron que el
gliceraldehído-3-fosfato y el piruvato están involucrados en la biosíntesis de los
terpenos vía plastidial. Misra y colaboradores (2005) mencionan que la tasa de
fotosíntesis neta (PN) está asociada positivamente con el contenido de zinc del
sustrato y con el porcentaje de los monoterpenos de la hoja de Pelargonium
graveolens.
En un estudio hecho con Mentha x piperita se encontró que la concentración de
(+)-mentofurano fue mayor (20mM) en las plantas sometidas a baja intensidad de luz
(3001Jmolm-2s-1) que en las plantas mantenidas en condiciones regulares de luz
(menor de 4001-JM) (Ríos-Estepa et al., 2008). Por otra parte, Letchamo y Gosselin
(1995) reportan que el contenido de timol en el aceite esencial de Thymus vulgaris
aumenta en plantas sometidas a un régimen de luz bajo (2001Jmolm-2s-\
20
•
Dado que, la disponibilidad de agua también afecta la tasa fotosintética , en
Thymus piperilla se ha reportado que el índice de aridez está relacionado con el
quimiotipo carvacrol (Boira y Blanquer, 1998). De la misma forma, el quimiotipo
carvacrol de Thymus vulgaris, se restringe a zonas secas, mientras que el quimiotipo
timol crece en otros ambientes y es menos susceptible al frío (Gouyon et al., 1986).
Turtola y colaboradores (2003) encontraron que el estrés hídrico afecta de distinta
manera la concentración de alfa-pineno en plántulas de Pinus sylvestris y de Picea
abies sujetos a 20% de capacidad de campo en el suelo. Mientras que para Pinus
sylvestris la concentración del metabolito aumentó, en Picea abies no hubo un efecto
significativo. Said-AI y colaboradores (2009) , al comparar el porcentaje de carvacrol en
individuos de Origanum vulgare sujetos a diferentes porcentajes de humedad en el
suelo (40%, 60% y 80%) encontraron que el porcentaje de carvacrol fue mayor en los
suelos con 80% de humedad; sin embargo este incremento se atribuyó a factores
ambientales tales como el aumento de temperatura que aceleró la transformación de
terpineno y p-cimeno a productos fenólicos. Khalid (2006) reportó que el porcentaje de
los principales metabolitos secundarios del aceite esencial de Ocimum sp. aumentó en
individuos cultivados en suelos con capacidad de campo del 50%. En Origanum
vulgare ssp. hirtum, el índice de eficiencia térmica del clima, calculado en función de la
temperatura y de la longitud del día (Rivera et al., 2002), explica mucha de la variación
observada en la suma de las concentraciones de timol y carvacrol , y de timol,
carvacrol, p-cimeno y y-terpineno (Vokou et al. , 1993).
Factores asociados con el suelo
Amzallag y colaboradores (2005) sugieren que el metabolismo de Origanum dayi se ve
afectado en su conjunto por las variaciones en las propiedades del suelo ya que el
fierro, el zinc, el manganeso y el cobre juegan un papel importante en la composición
de su aceite esencial. Lo anterior concuerda con Lovkova y colaboradores (2001 ),
quienes mencionan que algunos iones (e.g. cobalto, zinc y manganeso), modulan las
etapas iniciales de la biosíntesis de los productos fenólicos. En Thymus hyemalis
también se ha reportado la importancia del suelo en el aceite esencial , ya que los
individuos que se desarrollan en suelos limosos tienen mayor cantidad de fenoles y
metabolitos de bajo peso molecular, que los individuos que se encuentran en suelos
arcillosos (Martínez et al., 2005). Por otra parte, en Thymus vulgaris los quimiotipos
fenólicos (carvacrol y timol) se localizan preferentemente en suelos arcillosos,
21
..
regosoles y fersialiticos, rojos, más o menos rocosos, poco profundos y secos que se
encuentran en colinas calizas y en mesetas (Gouyon et al., 1986). En esta misma
especie, Thompson y colaboradores (2003) reportaron que los individuos que crecen
en suelos profundos y poco rocosos presentan bajas cantidades de carvacrol, lo que
concuerda con lo encontrado por Gouyon y colaboradores (1986) . En Origanum
vulgare , el cromo y el fierro en el suelo se correlacionaron de manera positiva con el
carvacrol y de forma negativa con el timol (Kanias et al. , 1998). La cantidad de materia
orgánica y de carbonatos se relaciona positivamente con el contenido de p-cimeno en
Thymus piperilla (Boira y Blanquer, 1998). Finalmente, estudio~ con la leguminosa
Copaifera multijuga muestran que las propiedades del tipo del suelo no modifican el
porcentaje de sesquiterpenos ni de otros metabolitos secundarios como fenoles y
taninos (Nascimento y Langenheim, 1986).
Factores asociados con la altitud
Los productos fenólicos parecen tener una asociación positiva con la altitud ,
particularmente el timol y el carvacrol. Stashenko y colaboradores (2009) mencionan
que los individuos de los quimiotipos timol y carvacrol en Lippia origanoides crecen en
altitudes más elevadas que los individuos del quimiotipo a y ~-fe l andreno , p-cimeno y
limoneno. Comparativamente este quimiotipo tuvo menor rendimiento de aceite
esencial que los anteriores (entre 1 y 1.5% y entre 2.4 y 4.4% respectivamente).
Hudaib y Aburjai (2007) reportaron que en Thymus vulgaris , los individuos ricos en
carvacrol crecen en sitios más elevados (entre 616 y 785 msnm), que aquellos ricos en
timol , p-cimeno y y-terpineno (590 msnm). Asimismo, los individuos de T. hyemalis que
crecen a una altitud de 690 msnm tuvieron mayor cantidad de productos fenólicos y de
bajo peso molecular (Martínez et al., 2005). En cambio en Rosmarinus officinalis y
Lavandula latifolia no se encontró ninguna correlación entre el rendimiento y la altitud ,
mientras que en Salvia lavandulifolia, el ~-pineno mostró una ligera correlación positiva
con la altitud (Usano- Alemany et al., 2009).
22
•
FACTORES QUE AFECTAN LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ACEITE
ESENCIAL DE Lippia graveolens
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios reportados sobre Lippia graveolens,
se enfocan en conocer la composición química y la actividad biológica de su aceite
esencial (Martinez-Rocha et al., 2008; Salgueiro et al. , 2003; Pascual et al., 2001;
Senatore y Rigano, 2001 ; Dominguez et al. , 1989; Pino et al. , 1989; Compadre et al.,
1987). Sin embargo, a pesar de que los trabajos realizados han demostrado que existe
una considerable variación en la composición y rendimiento del aceite esencial del
orégano mexicano, aún son pocos los estudios que intentan entender las causas de
esta variación. Este conocimiento no solo es indispensable para comprender cuales
son los principales factores que afectan la calidad del aceite esencial del orégano,
también ayudará a comprender, en un ámbito general , cuáles podrían ser las causas
de la enorme variabi lidad química reportada para otras especies de las plantas
aromáticas.
De los estudios realizados para analizar las posibles causas de la variación en
la composición del aceite esencial de L. graveolens se puede mencionar que, con
respecto a la fenología, las plantas en floración y las que presentan semillas maduras,
tienen mayor contenido de carvacrol en su aceite esencial (Aianiz-Gutiérrez et al. ,
2000). En cambio, en plantas juveniles la cantidad de timol aumenta (Silva y Dunford,
2005). En un estudio bajo condiciones controladas, Jacinto y colaboradores (2007)
reportaron que la calidad del aceite esencial de L. graveolens está determinada por el
genotipo de la planta. La gran variabilidad encontrada, en la composición de los
aceites de los genotipos analizados, sugiere que la diversidad genética favorece la
capacidad de estos genotipos para tolerar los efectos adversos de los factores bióticos
y abióticos. Sin embargo esta variabilidad es desfavorable para la comercialización,
puesto que en el mercado se demanda homogeneidad en los componentes principales
del aceite esencial del orégano. Otros autores han encontrado variaciones en el aceite
esencial del orégano mexicano de acuerdo al sitio de colecta (Castillo-Herrera et al.,
2007, Alaniz-Gutiérrez et al. , 2000). Uribe-Hernández y colaboradores (1992) atribuyen
estas variaciones a las diferencias en la disponibilidad de agua entre los sitios. En un
experimento en campo y otro en invernadero, Silva y Dunford (2005), y Dunford y Silva
(2005), no encontraron diferencias significativas entre los porcentajes de timol y
carvacrol del aceite esencial de plantas sometidas a diversos niveles de riego.
23
•
Con base en una revisión y sistematización de los reportes que existen de la
composición química de Lippia graveolens, en el Cuadro 1, se muestra que, con
excepción de un individuo de Guatemala y de una muestra comprada en un mercado
de Chicago lll inois, el aceite esencial del orégano mexicano tiene mayor porcentaje de
carvacrol que de timol en los individuos que crecen a latitudes menores (Yucatán,
Guatemala y El Salvador). En cambio, en los estados de Durango, Coahuila ,
Chihuahua, Jalisco y Querétaro, en donde la latitud es mayor, el aceite esencial de
Lippia graveolens tiene más porcentaje de timol que de carvacrol.
Finalmente, se puede resumir que existe una gran variacjón en el rendimiento y
la composición del aceite esencial del orégano mexicano entre y dentro de las
poblaciones de cosecha. Aún hacen falta estudios que ayuden a explicar el origen de
estos resultados. La información acerca de los factores edafoclimáticos que afectan la
composición del orégano mexicano es escasa, por lo que esta tesis aportará
información importante en el conocimiento de las plantas aromáticas, particu larmente
de Lippia graveo/es.
24
•
Cuadro 1. Porcentajes de timol, carvacrol y rendimiento del aceite esencial de Lippia
graveolens reportado en la literatura.
Localidades Timol Carvacrol Rendimiento
Cita (%) (%) AE (%)
El Salvador (1 s, 2i) 5.95 53.05 0.32 Vernin et al., 2001 .
(4.9-7) (35.1-71) (0.3-0.35) Guatemala (1 i) 31.6 0.8 0.26 Senatore y Rigano, 2001 .
(2i) 12.75 22.5 3.25
Salgueiro et al., 2003. (7 .4-18.1) (0.2-44.8) (3-3.5)
Yucatán (1 s, 5i) 5.9 62.2 2.28
Calvo-lrabién et al. , 2009. (3.98-8.75) (47.30-77.55) (0.65-4.49)
Durango (40i) 50.95 38.50
Jacinto et al., 2007 (6.63-99. 79) (0-83.92)
(1 Os) 31 7 5
Alaniz-Gutiérrez et al., 2000. (0.77 -60.21) (0-24.22) (0.69-7.65)
Coa huila 24.59 24.54 4.3 Castillo-Herrera et al., 2007.
Chihuahua (864i) 20 12.5 2
Silva y Ounford, 2005. (1 0-30) (5-20)
(60i) 38 .3 32.8 1.6
Dunford y Silva, 2005. (22.7-53.9) (15. 7 -50) (0.7-2.5)
Chicago lllinois 12.02 24.84 0.29 Compadre et al., 1987.
(muestra mercado) Jalisco 45.97 0.34 4 Castillo-Herrera et al., 2007.
(7s, 12i) 16.75 7.24 1.68 Uribe-Hernández et al.,
(0.22-56.86) (0.43-20.38) (0.67 -2.25) 1992. Querétaro 27.26 12.3 4 Castillo-Herrera et al., 2007.
Se presenta el valor promedio y entre paréntesis los valores máximo y mínimo. Los valores de
porcentaje más altos de timol y de carvacrol , así como del rendimiento, se muestran en
negritas.
JUSTIFICACIÓN
El aceite esencial del orégano mexicano es de importancia económica para
nuestro país (Huerta, 1997). Sin embargo, su composición química es muy variable
(Jacinto et al., 2007). En la literatura existe un vacfo en la información acerca del
efecto que los factores bióticos y abióticos tienen sobre la calidad del aceite esencial
de L. graveolens. Esta tesis proveerá información relevante que permitirá avanzar en
el entendimiento de la relación entre los factores ecológicos y la composición química
del aceite esencial producido por las plantas. En particular, aportará información sobre
el efecto que el clima y el suelo tienen sobre la composición del aceite esencial de L.
graveo/ens en poblaciones naturales del estado de Yucatán.
25
•
Por otro lado, la información obtenida será de utilidad para el diseño de
protocolos de cultivo y para la selección de individuos (genotipos) que permitan
establecer una producción homogénea, con las mejores características tanto
cualitativas como cuantitativas y de esta manera incrementar la calidad de la materia
prima obteniendo un producto comercialmente competitivo.
OBJETIVO GENERAL
Generar conocimientos para avanzar en el entendimiento del efecto que '
ejercen los factores climáticos y edáficos sobre los principales componentes del aceite
esencial del orégano mexicano (Lippia graveolens) .
OBJETIVOS PARTICULARES
Caracterizar la variación en los principales componentes del aceite esencial de
Lippia graveolens en individuos que se encuentran creciendo en diferentes
condiciones climáticas y edáficas del estado de Yucatán.
Analizar la variación en la composición del aceite esencial de L. graveo/ens a
nivel de población e individuos.
Analizar la relación entre las diferencias en la composición del aceite esencial
en las poblaciones estudiadas y las variables climáticas y edáficas seleccionadas.
PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN
¿Existen diferencias en la composición del aceite esencial de los individuos de L.
graveolens analizados?
¿El tipo de clima en donde se desarrollan los individuos de orégano mexicano afecta la
composición de su aceite esencial?
¿Las diferencias en las propiedades químicas del suelo modifican la composición del
aceite esencial de L. graveo/ens?
26
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•
34
•
CAPÍTULO 11
INTRODUCCIÓN
Diversos factores físicos, químicos y biológicos, tanto externos como internos a
la planta, pueden afectar la producción de metabolitos secundarios, tanto en su calidad
como en la cantidad producida (Anaya, 2003; Sangwang et al., 2001 ; Swain, 1977).
Algunos autores señalan que la gran variabilidad en la composición química de los
aceites esenciales se debe, sobre todo, a la naturaleza genética de la planta, más que
a la influencia del medio ambiente (Rios-Estepa et al., 2008; Thompson et al. , 2003;
Vernet et al. , 1986). Sin embargo, otros autores otorgan un papel preponderante al
ambiente (Jacinto et al., 2007; Amzallag et al., 2005; Vernin et al. , 2001). Es
importante conocer de manera puntual cuales son los principales factores que afectan
la composición y el rendimiento de los metabolitos secundarios, dado que esta
información permitirá producir aceite esencial de una calidad adecuada para su
comercialización. Esto es importante ya que en los últimos años, se ha incrementado
el uso de las plantas aromáticas en diversos campos, como el agroalimentario, el
farmacéutico y el cosmético (Baatour et al., 2009). El aceite esencial del orégano es
apreciado por ser un saborizante natural y por sus propiedades como conservador,
además de utilizarse en perfumería (Vernin et al., 2001) y en la elaboración de
cosméticos, fármacos y licores (Arcila-Lozano et al. , 2004). Este aceite tiene una
actividad antimicrobiana y antioxidante significativa (Martinez-Rocha et al., 2008) y su
calidad comercial se define por su contenido de timol y carvacrol (Padulosi, 1996).
Ambos metabolitos secundarios, junto con p-cimeno, y-terpineno, a-humuleno y trans
cariofileno han sido reportados como los componentes mayoritarios de Lippia
graveolens (Calvo-lrabién et al., 2009; Silva y Dunford, 2005; Uribe-Hernández et al.,
1992; Domínguez et al., 1989; Compadre et al., 1987).
El orégano mexicano (L. graveolens) es un arbusto aromático con inflorescencias
en espigas capitadas, axilares. Las flores son pequeñas (4mm), sésiles, zigomorfas,
hermafroditas, autocompatibles y se autofecundan. Quizá también presente
fecundación cruzada, pues la flor permanece abierta alrededor de siete días antes de
envejecer. Alrededor del 11.4% de las flores producen frutos. Cada fruto produce de
una a dos semillas (Ocampo-Velázquez et al., 2009). La distribución de L. graveolens
incluye el sur de Estados Unidos, México, Belice, Guatemala, San Salvador,
Honduras, Nicaragua y Costa Rica. Es una especie abundante en la vegetación
35
-
•
primaria de ciertas zonas áridas y semiáridas de México, aunque puede establecerse
en la vegetación secundaria de zonas húmedas (Soto et al. , 2007). El orégano crece
en lugares con suelos poco profundos y en su mayoría con pendientes constantes. Por
lo general se encuentra en áreas con elevaciones clasificadas como "Torriorthents"
(Martínez-Ríos et al. , 2005). Los "Torriorthents" tienen suelos de desarrollo limitado, ya
sea porque se encuentran sobre rocas, porque son muy estratificados o porque tienen
una gran pedregosidad (Luzio y Alcayaga, 1992). Dada la amplia variedad de
ambientes que ocupa esta especie, L. graveolens es un taxón morfológica y
químicamente muy variable (Soto et al., 2007; Pool, 2001 ). Al igual que en el aceite
esencial de otras especies, en el caso del orégano mexicano se ha reportado una
variación considerable en la composición química del aceite de esta especie. En la
literatura se sugiere la presencia de tres quimiotipos: carvacrol, timol y carvacrol/timol
(Senatore y Rigano, 2001 ; Salgueiro et al., 2003). Soria y colaboradores (2008)
definen a un quimiotipo como un grupo infraespecífico de individuos que se
caracterizan y distinguen de modo significativo de los demás miembros de su especie
por la presencia o concentración de uno o varios metabolitos.
A pesar de la importancia económica de L. graveolens, es muy poco lo que se
conoce sobre cuáles son los factores que podrían explicar la variación observada en la
composición de su aceite esencial. Este estudio proveerá una evaluación del efecto de
los factores edafoclimáticos sobre la producción de metabolitos secundarios, en
particular monoterpenos y sesquiterpenos que componen el aceite esencial de esta
especie. Por otra parte, el conocer la influencia de dichos factores permitirá proponer
condiciones de cultivo que permitan homogeneizar y aumentar la calidad del aceite
esencial producido y de esta manera incrementar su valor comercial. Es por esto que,
el objetivo de este capítulo es caracterizar y analizar la variación en los principales
componentes del aceite esencial de L. graveolens en individuos que se encuentran
creciendo bajo diferentes condiciones edafoclimáticas eri el estado de Yucatán. El
estado de Yucatán proporciona un escenario natural idóneo para este estudio, debido
a que, a diferencia del resto del país, su relieve poco accidentado reduce al mínimo el
efecto que se ha reportado de otras variables como son la altitud , la pendiente, la
intensidad de la luz y la exposición al viento entre otras (Amzallag et al., 2005; Anaya,
2003; Kofidis et al., 2003).
La hipótesis de este trabajo es: Dado que la composición química del aceite
esencial de las plantas aromáticas es afectada por las variaciones en la disponibilidad
de agua y en las propiedades físicas y químicas del suelo, se espera que las diversas
36
•
condiciones edáficas y de disponibilidad de agua presentes en las regiones climáticas
estudiadas, modifiquen la calidad del aceite esencial de Lippia graveo/ens, ya sea en
porcentaje o en el tipo de metabolitos secundarios que lo componen.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se seleccionaron 14 poblaciones silvestres de orégano en el estado de
Yucatán, sujetas a diversas condiciones ambientales (Cuadro 2). Estos sitios se
situaron en un gradiente climático (semiárido a subhúmedo). Las poblaciones fueron
elegidas con base a viajes prospectivos e información de ejemplares de herbario. La
distancia mínima entre poblaciones fue de 5.6 Km y la máxima de 239 Km.
En cada población , para la colecta de hojas, se seleccionaron de 5 a 6
individuos, con una distancia mínima de 0.005 m y máxima de 35 m entre ellos. Para
garantizar que todos los individuos fueran reproductivos y que el tamaño entre ellos
fluctuara lo menos posible, únicamente se eligieron individuos con una altura entre 1.2
y 1. 7 m. En total se obtuvieron 76 individuos. Para cada individuo se registraron los
siguientes datos: coordenadas geográficas, altura, medidas micro- ambientales como
pedregosidad (en escala porcentual 0%, 25%, 50% 75% y 100%) y cobertura del dosel
por medio de un densiómetro (Lemmon, 1956), además del tipo de vegetación y
observaciones generales del sitio.
El diseño experimental para la toma de datos fue anidado, lo que permitió
evaluar la variación en la composición química del aceite a nivel de región (cuatro tipos
de clima) , población (de dos a cinco en cada tipo de clima) e individuo (cinco en cada
población). En Yucatán el suelo se caracteriza por su diversidad , en la región centro y
norte del estado, los suelos son someros con abundante contenido de piedras y
frecuentes afloramientos de coraza calcárea, suelos profundos caracterizan a la región
sur y oriente (Borges-Gómez, et al., 2005). Por lo anterior se tomaron muestras de
suelo de todas las poblaciones analizadas. En cada uno de los sitios, la
caracterización del suelo, se hizo mediante una muestra compuesta (5 submuestras
distribuidas de manera aleatoria en el área de muestreo de cada población) colectada
a una profundidad entre 7 y 15 cm. Se realizaron análisis químicos del suelo para
evaluar pH, densidad aparente del suelo, capacidad de intercambio catión ico , punto de
marchitez permanente (cantidad de agua en el suelo en la que las raíces ya no
37
•
absorben agua y por lo tanto la planta se marchita) (Kirkham, 2005), contenido de
materia orgánica, nitrógeno total, boro, calcio, magnesio, manganeso, fósforo, potasio,
cobre, fierro, zinc y sulfatos de acuerdo a la NOM-021-SEMARNAT-RECNAT-2000
(SEMARNAT, 2002). El clima se caracterizó por medio del programa DIVA-GIS, el cual
al introducir las coordenadas geográficas de los sitios, proporciona datos climáticos del
lugar específico. La base de datos climáticos del DIVA-GIS abarca el periodo
comprendido entre 1961 y 1990 y fueron tomados de New y colaboradores (2002)
usando una cuadrícula global con una resolución de 1 O minutos.
Muestreo de hojas
Para el análisis de la composición química del aceite esencial del orégano, el
muestreo de hojas se realizó en un lapso de dos meses Uulio-agosto), durante la
época de lluvias. De esta forma se trató de evitar en la medida de lo posible, los
cambios debidos a la variación estacional en la producción del aceite esencial
(Amzallag et al. , 2005). Para cosechar las hojas, se seleccionaron tres ramas
primarias por individuo, las cuales corresponden a las réplicas dentro de este nivel. De
cada rama, se colectaron aproximadamente 100 hojas maduras (totalmente
expandidas) , para obtener un total aproximado de 300 hojas por individuo.
38
•
Cuadro 2. Características ambientales de las poblaciones de Lippia graveolens
8 Región bCoordenadas CT dpp 9Tipo de
Población 8Aridez 1Aititud (O) (N) (OC) (mm) vegetación
Chicxulub 89.57 21.25 25.5 538 0.089 MC
Sierra Papacal 89.80 21 .16 25.7 614 0.071 5 SBC
Chabihau 89.11 21 .33 25.7 684 0.091 o MC
11 San Felipe 88 .18 21 .56 25.5 650 0.103 4 MC
Las Coloradas 88 .08 21.56 25.4 664 0,101 5 MC
Tajo 88 .70 21 .34 25.7 893 0.078 4 SBC
Chenche T. 88 .98 21.15 25.9 979 0.074 10 SBC
111 Abalá 89.65 20 .63 26.1 1007 0.074 15 SBC
Kochol 90.13 20.57 26.7 1046 0.067 8 SBC
Opichén 89.83 20.53 26.3 1069 0.072 58 SBC
Maxcanú 90.00 20.57 26.6 1099 0.067 35 SBC
Sacalum 89.10 20.60 26.1 1014 0.075 17 SBC
IV Tixcacaltuyub 88.90 20.49 26.1 1151 0.073 25 SBSC
Sotuta 88 .94 20 .51 26.2 1156 0.073 25 SBSC
a Aridéz, Region 1 > Región 11 > Región 111 > Región IV. b Latitud y longitud expresadas en
grados decimales. ~emperatura media anual, dPrecipitación anual , 8 lnverso del índice de
aridez. 1Aititud medida en msnm . 9Derivada de MC (Matorral costero) , SB (Selva baja
caducifolia, SBSC (selva mediana subcaducifolia) .
Las hojas de cada rama se colocaron por separado en bolsas de papel y se
transportaron en una hielera al laboratorio. Debido a la gran cantidad material vegetal
recolectado y para evitar modificaciones en las características químicas del aceite, las
hojas provenientes de campo se secaron en una estufa de flujo de aire (Novatech
HS60) a 35° e durante una semana aproximadamente (ealvo-lrabién et al., 2009)
hasta alcanzar un peso constante. Una vez secas las hojas, se refrigeraron a 4° e
hasta la extracción de su aceite esencial (Amzallag et al., 2005).
El aceite esencial de Lippia graveolens se extrajo por destilación por arrastre de
vapor. Se trabajó con 5 g de material vegetal seco, lo que representa un promedio de
50 hojas, utilizando 100 mL de agua destilada para la generación de vapor. La
destilación duró aproximadamente 1 h hasta alcanzar un volumen final de destilación
de 50 mi. Debido a los bajos volúmenes de aceite esencial obtenido, el destilado se
39
•
colectó en una bureta con una trampa de hexano de 2 mi. Una vez terminada la
destilación, y para asegurarnos de retirar completamente la fase acuosa, se filtró la
mezcla de aceite esencial y hexano a través de una pipeta Pasteur empacada con
aproximadamente 1 cm de sulfato de sodio anhidro. Para evaporar el hexano del
aceite, se utilizó una corriente de nitrógeno durante 30 min. El aceite esencial se
almacenó a 4° C en viales de vidrio hasta su análisis por cromatografía de gases
(Saéz, 2001 ).
Los perfiles cromatográficos de los principales metabolitos secundarios del aceite
esencial del orégano se obtuvieron en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard
modelo 5890, con un detector de ionización de flama (FID). Se utilizó una columna HP-
5MS (5% de fen il)-metilpolisiloxano de 30 m de largo, 0.32 mm de diámetro interno y
0.5 IJm de espesor y nitrógeno como gas acarreador, con un flujo de 1 ml/min. El
programa de temperaturas fue T1=75o C (1 min), T2=200o C (10 min), con un
gradiente de 5° C /min . La temperatura del detector fue de 290° C y la del inyector de
280° C. Cada muestra de aceite esencial de orégano (1 IJL) al 7.5x1 o-4% (0 .0075
¡Jg/IJL) se inyectó en el cromatógrafo por triplicado. El software utilizado para obtener
el porcentaje de área de los perfiles cromatográficos fue PeakSimple, Chromatography
Data System 302.
La identificación de los seis metabolitos secundarios mayoritarios del aceite
esencial del orégano, se hizo por medio de ca-cromatografía utilizando los siguientes
estándares: carvacrol 98% (ALDRICH), (-)-trans-cariofileno (SIGMA), p-cimeno 99.5%
(Fiuka), y-terpineno 98.5% (Fiuka), timol 99.9% (Fiuka) y a-humuleno 98.0% (Fiuka).
La elección de estos seis metabolitos mayoritarios (p-cimeno, y-terpineno, timol,
carvacrol, (-)-trans-cariofileno y a-humuleno), se definió considerando estudios previos
de la composición del aceite esencial del orégano mexicano para la Península de
Yucatán (Calvo et al., 2009) y con base en la composición .reportada para el aceite
esencial de esta especie en la literatura (Castillo-Herrera et al. , 2007; Silva y Dunford,
2005; Senatore y Rigano, 2001 ; Vernin et al. , 2001 ; Alaniz-Gutierrez et al., 2000;
Uribe-Hernández et al., 1992; Compadre et al., 1987). La cuantificación se realizó
utilizando el valor del porcentaje de las áreas de los picos del cromatograma, en donde
el 1 00% del área se obtuvo restando el área del solvente del área total.
40
•
Análisis estadístico
Para evaluar la existencia de diferentes quimiotipos, es decir, si los ind ividuos
muestreados forman grupos distinguibles en función de sus semejanzas y/o
diferencias en la composición química del aceite esencial , se realizó un análisis de
componentes principales (ACP). Para ello, se utilizó una matriz que contiene datos del
porcentaje de los seis metabolitos secundarios mayoritarios en los 76 individuos
provenientes de las 14 poblaciones naturales de Lippia graveo/ens.
Debido a que no hay independencia estadística entre los metabolitos
secundarios analizados, se eligió únicamente al carvacrol para evaluar el porcentaje
de variación explicada por los tres diferentes niveles en los que se real izó el estudio
(región, población , individuo). Para ello se utilizó un análisis de varianza (ANOVA)
anidado. Posteriormente, al interior de cada región climática , se hizo una prueba a
posteriori de comparación múltiple de medias tipo Tukey para saber cuáles
poblaciones mostraban diferencias estadísticamente significativas. Los datos
originales (% área) fueron transformados mediante Lag 1 O para cumplir con los
supuestos de normalidad y homocedasticidad (Sokal y Rohlf, 1995) y retransformados
a porcentajes para su representación gráfica.
Con el objetivo de explorar la relación entre los quimotipos obtenidos y las
variables edafoclimáticas, se realizó un análisis de regresión múltiple, tipo forward ,
entre las variables edafoclimáticas y los valores de los individuos en los ejes 1 y 11
obtenidos en el ACP descrito previamente. Para este análisis, el clima se resumió por
medio del inverso del índice de aridez de Emberger (Wallen , 1967). Este índice
resume los valores de precipitación mensual y de temperatura . Mientras mayor sea el
valor del inverso de Q, más árida es una región. Dicho índice fue calculado con la
siguiente fórmula: Q= 100(P)/2(T12+t1)/2(T1rt1) , en donde: Q: índice de Emberger o
coeficiente pluviotérmico mensual , P: precipitación mensual (mm), T12 : temperatura
media máxima mensual C C), T1 : temperatura media mínima mensual (° C). Se uti lizó
el valor promedio de los 12 meses. Las variables edáficas analizadas en cada
población fueron el pH , la materia orgánica, el nitrógeno total , la densidad aparente del
suelo, la capacidad de intercambio catiónico, el punto de marchitez permanente, y los
micro y macronutrienes: boro, calcio, magnesio, manganeso, fósforo, potasio, cobre,
fierro, cobre, zinc y sulfatos. El valor de significancia de las pruebas múltiples fue
corregido por medio de una prueba de Bonferroni (Sokal y Rohlf, 1995). Se eligió el
41
•
modelo de regresión con base en el valor del coeficiente de determinación (R2) , el
factor de inflación de la varianza (FIV), el índice de condición y la tolerancia . R2 mide la
proximidad del ajuste de la ecuación de regresión de la muestra, a los valores
observados de la variable dependiente (y) ; es decir, la proporción de la varianza de la
variable dependiente que está explicada por la variable independiente. El valor más
alto que puede tomar el coeficiente de determinación es 1, mientras que el menor es O.
En todos los casos las diferencias observadas se consideraron estadísticamente
significativas cuando el valor de P ~0.05 . Los análisis estadísticos se realizaron
utilizando los programas estadísticos STATISITICA '99 Edition y .sPSS Statistics 17.0.
RESULTADOS
En función de sus semejanzas en el porcentaje de los seis metabolitos
analizados, el análisis de componentes principales ordenó a los individuos en tres
grupos o quimiotipos (Fig. 7), un quimiotipo representado principalmente por
compuestos no fenólicos (S), y dos quimiotipos dominados por monoterpenos, el
quimiotipo carvacrol (C) y el quimiotipo timol (T). Los primeros dos ejes del ACP
explicaron el 68.75% de la variabilidad total (45.37% y 23.38% respectivamente).
Los valores positivos del componente principal 1 (CP 1) se relacionaron con la
presencia de p-cimeno y en menor medida del y-terpineno, mientras que los valores
negativos de este CP 1 se relacionaron con la presencia de (-)-trans-cariofileno y el a
humuleno. El p-cimeno y el y-terpineno tienen una correlación con el CP 1 de 0.55 y
0.65 respectivamente, mientras que los valores fueron de -0.87 y -0.88 para el (-)
trans-cariofileno y el a-humuleno. Asimismo, valores positivos del componente
principal 2 (CP 2) , se asociaron con un mayor porcentaje de carvacrol , mientras que
en los valores negativos del mismo componente, el metabolito mayoritario fue el timol.
El índice de correlación entre este componente y el carvacrol y el timol fue de O. 72 y -
0.81 respectivamente El porcentaje más alto de (-)-trans-cariofileno y a-humuleno lo
presentaron los individuos que conforman el quimiotipo S, con un promedio de
8.3±1 .0% y 5.4±0.5%, respectivamente (Cuadro 3). Los quimiotipos C y T obtuvieron
los porcentajes más altos de carvacrol (75.2±1.4%) y de timol (80.0±3.0%)
respectivamente.
42
3 .-----------------------~----------------------~
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-6 -4 -2 o 2 4 6
Componente Principal 1
o Chicxulub /),. Sierra Papacal ~ Chabihau o San Felipe
* Las Coloradas
* Tajo o Chenche de las Torres ... Abalá $ Kochol !'!!! Opichén ~ Maxcanú • Sacalum 1 Tixcacaltuyub
So !uta • Metabolitos secundarios
Figura 7. Biplot del análisis de componentes principales del porcentaje de los metabolitos secundarios analizados en los individuos de las poblaciones
de Lippia graveolens en estudio. Quimiotipos, S: no fenólico, C: carvacrol y T: timol. Los grupos fueron dibujados arbitrariamente.
43
•
•
Cuadro 3. Porcentajes de los principales metabolitos secundarios en los quimiotipos del aceite
esencial de Lippia graveolens
aMetabolitos
secundarios (%)
p-cimeno
2 y-terpineno
3 Timol
4 Carvacrol
5 Trans-cariofileno
6 a-humuleno
2 2 1 2
bQuimiotipo
Carvacrol (C) Timol (T) No fenólico (S)
3.0±0.5 (0.03-6.8) 3.7±0.9 (0.01-19.7) 0.5±0.2 (0.01-7.0)
0.9 ±0.2 (0.01-3.5) 0.5±0.1 (0.01-2.2) o,02±0.01 (0.01-0.5)
5.2±0.5 (2.4-11 .7) 80.0±3.0 (25.4-90.2) 2.1±1.8 (0.01-62.7)
75.2±1.4 (60.0-86.8) 0.3±0.02 (0.2-0.6) 0.3±0.04 (0.01-1 .0)
1. 7±0.2 (0.04-3.4) 2.4±0.2 (0.5-4.8) 8.3±1.0 (1.2-30.6)
1.6±0.2 (0.3-5.0) 1.6±0.1 (0.5-3.1) 5.4±0.5 (0.4-17.4)
~ ~H QH CH'Y cH, ""' OH
.::: CH3
3 4 5 6
aldentificación de los metabolitos secundarios por medio de estándares y tiempos de
retención. bPromedio ± error estándar, valor máximo y mínimo entre paréntesis . En negritas se
encuentra el valor promedio más alto. El número de las estructuras indican el metabolito
secundario.
El quimiotipo con mayor dispersión de los individuos fue el S, seguido del C. El
quimiotipo T fue el grupo más homogéneo, es decir, el porcentaje de sus metabolitos
secundarios fue menos variable entre individuos. En los perfiles cromatográficos (Fig.
8) de los quimiotipos T y C, los seis metabolitos secundarios analizados representaron
el 87.5% del área total del cromatograma, mientras que en el quimiotipo S, los mismos
metabolitos únicamente representaron el 16% del área total.
44
•
Al analizar la distribución de los quimiotipos en las poblaciones estudiadas, se
pudo notar que existe una segregación espacial. En la Figura 9 se observa que las
poblaciones del quimiotipo C se restringen a la zona norte del estado, cerca de la
costa, donde las condiciones de aridez son altas (inverso de Q de 0.08 a 0.09) y que
en dichas poblaciones todos los individuos analizados pertenecen al quimiotipo C. Por
otro lado, el quimiotipo T se distribuye desde el noroeste hasta el sureste del área de
estudio. Con excepción de la población de San Felipe, las demás poblaciones
presentaron individuos tanto del quimiotipo T como del S. Sin embargo, llama la
atención que la proporción de individuos con quimiotipo T disminuye en las
poblaciones que se ubican al suroeste del estado (Opichén y Abalá con una
proporción 3:3 y 2:3 del los individuos con quimiotipos T y S, respectivamente). Por
otro lado, todas las poblaciones donde predomina el quimiotipo S, excepto Sierra
Papacal, se ubican al centro y sur del estado.
En el cuadro 4 se observa que la variación en el porcentaje de carvacrol es
significativa en los tres niveles de análisis (región, población e individuo). El mayor
porcentaje de variación explicada se encontró entre poblaciones dentro de una misma
región , este nivel explicó 59.24% de la variación total observada. El nivel región
explicó 40.2% de la variación, mientras que a nivel de individuo la respuesta fue
relativamente homogénea y únicamente se explicó el 0.32% de la variación
encontrada (Figura 1 0) .
Cuadro 4. Análisis de varianza (ANOVA) anidado.
Efecto general Grados de Suma de
F p libertad cuadrados
Región 3 54.0098 8374.00 0.00
Población (Región) 10 79.6011 3702.55 0.00
Individuo (Región*Población) 56 0.4397 3.65 0.00
Error 140 0.3010
Total 134.3516
45
•
Con base en los resu ltados de las pruebas de Tukey, en la región climática
semiárida muy cálida (1) se formaron dos grupos, el primero lo integraron las
poblaciones de Chicxulub y Chabihau en las cuales los individuos tuvieron un
porcentaje de carvacrol promedio de 72.2±1.6% y 73.4±1.0% respectivamente. El
segundo grupo lo forma Sierra Papacal, con 0.3±0.1% de carvacrol en su aceite
esencial. En la región subhúmeda la más seca (2) nuevamente se observaron
individuos con altos porcentajes promedio de carvacrol (Tajo 73.0±3.0% y Chenche de
las Torres 77.0±1 .0%), e individuos con porcentajes significativamente menores (San
Felipe 0.2±0.005% y Las Coloradas 0.2±0.02%). Los individuos de las regiones 1 y 2 . presentaron el mayor porcentaje promedio de carvacrol.
46
e l Timol (T) j D Carvacrol (C) a No fenólico (S)
1
e l t
a
Figura 8. Perfiles cromatográficos de los quimiotipos encontrados en las poblaciones naturales de orégano mexicano en Yucatán. Quimiotipos: timol
(T), carvacrol (C), no fenólico (S). A: p-cimeno, B: y-terpineno, C: timol, D: carvacrol, E: trans-cariofileno, F: a-humuleno.
47
•
•
+ + +
S 40 Kllometers + + +
Figura 9. Mapa de las poblaciones naturales de Lippia graveolens en estudio (Características
de las poblaciones en la Tabla 2). Quimiotipos: carvacrol : C, timol : T y no fenólico: S. El
subíndice indica el número de individuos de cada población .
• 40.2% Región
o 59.24% Población (Región)
o 0.32% Individuo (Población*Región)
o 0.22% Error
Figura 1 O. Porcentaje de la varianza en el contenido de carvacrol del aceite esencial de Lippia
graveolens en los tres niveles analizados: individuo, población y región.
48
•
R~eg io n es : 1 • 80 .0 20
78 .0 a 3-
i 4-
76 .0
a o 7 4 .0
~ u
"' > 7 2 .0
"' u
"' u
"' "' e
"' 0 .8 u o "-
0 .6 ab.
0.4
0 .2
0 .0
Figura 11. Porcentaje de carvacrol en las poblaciones de Lippia graveo/ens. Letras distintas
indican diferencias estadísticas significativas dentro de cada una de las regiones , Tukey HDS,
p:s;0.05 , promediaD ± error estándar. Las gráficas muestran los valores en la escala original
para facili tar la interpretación.
Los individuos de las regiones de clima subhúmedo con lluvias de verano (3) y la
subhúmeda cálida intermedia (4) mostraron porcentajes promedio inferiores al 1% de
carvacro l. En la región 3 los individuos de la población Maxcanú tuvieron el mayor
porcentaje (0.4±0.3%}, y los de la población de Kochol el porcentaje más bajo
(0.1±0.03}. En la región 4, no se encontraron diferencias estadísticas significativas en
el porcentaje promedio de carvacrol (Tixcacaltuyub 0.5±0.1% y Sotuta 0.5 ±0.06%).
Para evaluar si existe una relación entre las variables edafo-climáticas y la
composición química del aceite esencial del orégano mexicano, se realizó un análisis
de regresión múltiple entre los componentes principales 1 y 2 del ACP y dichas
variables (Figura 12). En el cuadro 5, se observa que el punto de marchitez
permanente y el fósforo del suelo, se asociaron significativamente (R2= 0.332) con el
CP 1. El modelo que explicó esta asociación fue: Y= -1 .34 + 0.064 punto de marchitez
permanente- 0.042 fósforo, en donde la contribución parcial del punto de marchitez
permanente fue de 15.5%, mientras que la del fósforo fue del 7.7%.
49
(~· · ··
' \
....... S
' ... .....
Componente Principal 1 R2= 0.332
·· .....
Y= - 1.34 + 0.064PMP - 0.042P PMP= 15.5% P= 7.7%
.... · . · -- · ··~
*\ e i
i
Componente Principal 2 R2= 0.135
Mn Y= 1.143 - 0.36Mn
PMP
o Chicxulub 6 Sierra Papacal 0 Chabihau o San Felipe
* Las Coloradas
* Tajo o Chenche de las Torres ... Abalá $ Kochol !!!'1 Opichén ~ Maxcanú
Sacalum Tixcacaltuyub
Sotuta
Figura 12. Relación entre las variables edafoclimáticas y la composición del aceite esencial de Lippia graveolens. Quimiotipos: C (carvacrol) , T (timol)
y S (no fenólico). Variables edafoclimáticas en letras verdes. PMP: punto de marchitez permanente. P: fósforo y Mn: manganeso.
50
•
•
Por otro lado, se encontró una asociación significativa {R2=0.1 35) entre el CP 2 y
el contenido de manganeso en el suelo. El manganeso explicó el 13.5% de esta
asociación. El modelo que explicó estos resultados fue el siguiente: Y= 1.143 - 0.36
manganeso.
En resumen, en las 14 poblaciones analizadas en este estudio se observó que
los individuos con quimiotipo carvacrol se encontraron tanto en matorral costero como
en selva baja caducifolia, en zonas donde la temperatura anual promedio fluctúa entre
25.5 y 25.9° C, con una precipitación anual entre 539 y 979 mm. Este quimiotipo se ve
favorecido en sitios bajo condiciones de estrés, en donde ·los valores promedio del
punto de marchitez permanente son de 35% en suelos Solonchak con alto contenido
de sales, Rendzina y Leptosoles que son suelos de poco profundos a someros.
Cuadro 5. Análisis de regresión lineal múltiple de la relación entre la composición del aceite
esencial de orégano y las variables edafoclimáticas.
Modelo Coeficiente no
estandarizado (B) Coeficiente estandarizado Contribución parcial
1 R2= 0.332, Y= -1.34 + 0.064 punto de marchitez permanente - 0.042 fósforo
(Constante) -1 .334
PMP 0.064 0.414 0.1 552
p -0.042 -0.292 0.077
R = 0.135, Y= 1.143- 0.36 manganeso
(Constante) 1.143
Mn -0.043 -0.368 0.135
Regresión múltiple entre las variables edafoclimáticas y el: 1componente principal 1 y el 2componente principal 2. Los valores son significativos con un a<0.05.
Los individuos con quimiotipo timol se encontraron en matorral costero, selva
baja caducifolia y con menor frecuencia en selva baja subcaducifolia, en zonas donde
la temperatura anual promedio fluctúa entre 25.4 y 26.3° C, con una precipitación
anual entre 650 y 1014 mm. Este quimiotipo se ve favorecido en sitios bajo
condiciones de baja disponibilidad de agua (valor promedio del punto de marchitez
permanente 28%), en suelos solanchak, leptosol y leptosol-vertisol, en donde la
presencia de manganeso es importante.
51
•
Los individuos con quimiotipo no fenólico (S), se encontraron en selva baja
caducifolia y en selva baja subcaducifolia, en zonas donde la temperatura anual
promedio fluctúa entre 25.7 y 26.r C, con una precipitación anual entre 614 y 1156
mm. Este quimiotipo se ve favorecido en sitios con mayor disponibilidad de agua (valor
promedio del punto de marchitez permanete 23%) que los quimiotipos e y T, en suelos
leptosol , leptosol-vertisol y luvisol , donde la presencia de fósforo es importante.
DISCUSIÓN
Se encontraron tres quimiotipos claramente diferenciables de' L. graveolens en
las poblaciones analizadas en este estudio. Dos de ellos están representados
principalmente por monoterpenos, el quimiotipo carvacrol (e) y el quimiotipo timol (T);
ambos quimiotipos concuerdan con lo reportado previamente en la literatura (Calvo
lrabién , et al., 2009; Castillo-Herrera et al., 2007; Dunford y Silva, 2005; Salgueiro et
al. , 2003; Senatore y Rigano, 2001 ; Vernin et al., 2001 ; Alaniz-Gutierrez et al., 2000;
Uribe-Hernández et al., 1992; Compadre et al., 1987). Sin embargo, en el tercer
quimiotipo (S) o quimiotipo no fenólico, los metabolitos secundarios mayoritarios son
sesquiterpenos, en tanto que el timol y el carvacrol sólo se detectan a nivel de trazas.
Con base en la revisión bibliográfica, este es el primer reporte de un quimiotipo no
fenólico para Lippia graveolens.
Los elevados porcentajes promedio de carvacrol y timol (75.2% y 80.0%,
respectivamente) en los quimiotipos e y T sugieren que el aceite esencial del orégano
de los individuos encontrados en las poblaciones de Yucatán , presentan un alto
potencial para su comercialización, dada la considerable actividad antimicrobiana y
antioxidante que se ha reportado para estos dos metabolitos secundarios (Martinez
Rocha et al., 2008).
En cuanto al rendimiento del aceite esencial , se observaron diferencias en los
tres quimiotipos. El rendimiento de aceite esencial promedio en el quimiotipo S fue
comparativamente muy bajo (0.2%), en tanto que los quimiotipos e y T tuvieron
rendimientos promedio de 1.8% y 2.3%, respectivamente. Llama la atención que estos
resultados coinciden con lo encontrado en Lippia origanoides (Stashenko et al., 2009),
en donde los quimiotipos con mayor porcentaje de monoterpenos (T y e), mostraron
rendimientos más elevados que el quimiotipo con mayor porcentaje de sesquiterpenos.
En cuanto a la distribución espacial de los quimiotipos, se han reportado diferencias en
la composición y el rendimiento de las diversas especies de plantas aromáticas
52
•
encontradas en distintas ubicaciones (Gende et al., 2010; Salamon et al., 2010), que
dan lugar a la existencia de distintos quimiotipos (Figueiredo et al., 2008). En este
estudio los quimiotipos e y T, predominaron en la zona norte de Yucatán en donde el
clima es más árido, esto concuerda con lo encontrado para Thymus piperilla, donde
estos quimiotipos se asocian a sitios áridos (Boira y Blanquer, 1998). En la zona sur, la
proporción de individuos con quimiotipo T disminuyó, sin embargo los individuos con
quimiotipo S fueron más abundantes. Estos resultados son similares a los encontrados
por Gouyon y colaboradores (1986), ya que en un estudio realizado en Thymus
vulgaris , encontraron que en sitios con ambientes xéricos h9y un mayor número de
individuos con quimiotipos e y T comparados con sitios húmedos, en donde la
presencia de un mayor número de individuos con diversos quimiotipos es favorecida
por el aumento de la competencia intraespecífica.
En las poblaciones con quimiotipo C, no se encontraron individuos con los
quimiotipos T y S. Sin embargo, estos resultados pudieran sólo estar reflejando un
efecto de muestreo. Quizá si se aumentara el número de individuos muestreados se
encontrarían individuos con cualquiera de los otros dos quimiotipos faltantes. Los
resultados de la alta proporción de individuos con quimiotipo e encontrada en zonas
más áridas es contraria a lo que sucede en Thymus pulegioides, en el que la presencia
del quimiotipo e en una población, estuvo correlacionada positivamente con la
presencia de más de un quimiotipo en ese sitio (Mártonfi et al., 1994). Por otro lado,
los individuos del quimiotipo T se distribuyeron tanto en las poblaciones cercanas a la
costa, regiones más secas, como en las poblaciones en condiciones de mayor
humedad, que se encuentran al sur de la zona de estudio. Para el caso de individuos
del quimiotipo S, éstos se ubicaron preferentemente en zonas con la mayor humedad
(con excepción de la población de Sierra Papacal y un individuo de Las Coloradas que
se encuentran en climas más áridos). Los quimiotipos T y S, se encontraron tanto
poblaciones con la mezcla de ambos quimitipos, como poblaciones donde únicamente
se presentaron individuos con uno de los dos quimiotipos.
En las poblaciones silvestres del orégano mexicano en Yucatán se encontró que,
el mayor porcentaje (59.24%) de la variación química encontrada fue explicado por las
diferencias entre poblaciones de una misma región geográfica. Lo que indica que, con
relación al porcentaje promedio de carvacrol en los individuos analizados, existen
poblaciones de diferentes quimiotipos dentro de una misma región climática. Es decir,
53
•
la presencia de diversos quimiotipos no estuvo ligada únicamente a la cercanía o al
tipo de clima en el cual se desarrollan las poblaciones, porque de ser así, se hubiese
esperado encontrar que cada región estuviera representada por un solo quimiotipo. Si
la distancia entre las poblaciones explicara la variabilidad química encontrada,
poblaciones tan cercanas como San Felipe y Las Coloradas tendrían individuos de los
quimiotipos T y S. Sin embargo, San Felipe solamente tiene individuos con el
quimiotipo T, mientras que en Las Coloradas hay individuos de los quimiotipos T y S.
Lo mismo sucede con las poblaciones de Sierra Papacal y Chabihau, las cuales solo
tienen individuos de los quimiotipos S y e, respectivamente. Esto lleva a pensar que . muy probablemente otras variables ecológicas, por ejemplo el suelo, o bien
condiciones microambientales (disponibilidad de agua) al igual que el genotipo de los
individuos así como el flujo génico entre ellos (polinización y dispersión de semillas)
son relevantes para definir la combinación de quimiotipos que se presentan en una
misma región climática o poblaciones cercanas. Resultados similares fueron
encontrados en Thymus a/geriensis por Ben y colaboradores (201 0) , donde la
distribución espacial de los quimiotipos estuvo ligada en mayor medida a la distancia
geográfica entre las poblaciones, más que al tipo de clima definido en base al índice
de aridez (Q) . Estos autores consideraron que además de la altitud , la precipitación y
el tipo de clima existen otros factores que actúan sobre la diversidad de los
quimiotipos. En Rosmarinus officinalis también se encontraron individuos de diferentes
quimiotipos en un mismo tipo de clima (Zaouali et al., 2005).
En cuanto a la relación entre la composición química del aceite esencial de
Lippia graveolens y las variables edafoclimáticas, los datos analizados podrían sugerir
que las variables edafoclimáticas analizadas pueden estar funcionando como un filtro,
ya sea evitando la dispersión de un quimiotipo a lo largo del gradiente climático
analizado, o favoreciendo la presencia de individuos de un quimiotipo en particular en
unos ambientes más que en otros. El CP 1 agrupa a los 'quimiotipos con base en la
disponibilidad de agua (reflejadas por el valor del punto de marchitez permanente) y el
fósforo en el suelo. Por un lado, el quimiotipo no fenólico S, se encuentra en suelos
con mayor contenido de fósforo y disponibilidad de agua en el suelo, en cambio los
quimiotipos e y T, están asociados en zonas con menor disponibilidad de agua
(valores más altos del punto de marchitez permanente) y de macronutrientes. Estos
resultados son contrarios a lo reportado en un estudio en invernadero realizado en
Origanum vulgare, en el cual, Said-AI y colaboradores (2009) encontraron que el
contenido de carvacrol aumentó en suelos con 80% de humedad disponible. Azizi y
54
•
colaboradores (2009) no encontraron diferencias en el porcentaje de carvacrol en el
aceite esencial de individuos de Origanum vulgare sometidos a diferentes niveles de
humedad (50, 70 y 80% de capacidad de campo). Asimismo Dunford y Silva (2005) no
encontraron ninguna relación entre la concentración de timol y carvacrol del aceite
esencial de individuos de orégano mexicano sometidos a diferentes niveles de riego
en el suelo. Sin embargo, la mayoría de los individuos que analizaron tienen mayor
concentración de timol que de carvacrol. Aún cuando en este trabajo, el qu imiotipo T
se asoció con sitios con menor disponibilidad de agua, se encontraron ind ividuos con
este quimiotipo creciendo junto con individuos del quirl)iotipo S, en zonas más
húmedas, sugiriendo que el quimiotipo T es más tolerante a la humedad que el
quimiotipo C.
El CP 2 separa a los quimiotipos C y T con base en el contenido de fósforo en el
suelo. Los individuos con porcentajes elevados de carvacrol se asociaron con menores
cantidades de manganeso en el suelo, mientras que los individuos con porcentajes
elevados de timol estuvieron asociados con mayores contenidos de manganeso.
Lovkova y colaboradores (2001 ), mencionan que algunos iones como el cobalto, el
zinc y el manganeso modulan las etapas iniciales de la biosíntesis de los compuestos
fenól icos; de manera particular, Amzallag y colaboradores (2005) , encontraron que las
propiedades del suelo afectan la composición del aceite esencial de Origanum dayi, en
especial los contenidos de fierro, zinc, manganeso y cobre . En cambio en Origanum
vulgare la presencia de cromo y de fierro se correlacionó de forma positiva con el
carvacrol y negativa con el timol (Kanias et al, 1998). Sin embargo, aunque existen
reportes de la influencia de los nutrientes del suelo en la composición del aceite
esencial de diversas plantas aromáticas no se observan tendencias claras, como en el
caso de diferentes cultivares de Mentha spicata L. sometidos a estrés por manganeso,
en los cuales mientras en el cultivar Arka con deficiencia de manganeso el contenido
de carvona aumenta, en el cultivar Neera el contenido de carvona disminuye, mientras
que en el cultivar MSS-5 el no se ve afectado (Singh et al., 2001 ). Incluso algunos
autores mencionan que el suelo no tiene ningún efecto en la composición química del
suelo de ciertas especies (Duarte et al., 2009; Nascimento y Langenheim, 1986).
Figueiredo y colaboradores (2008), mencionan que las diferencias encontradas
en la composición del aceite esencial de una especie de origen diverso, refleja la
variedad de las condiciones ambientales particulares de cada localidad (d iferentes
55
•
altitudes, exposición solar, tipos de suelo, etc.). Sin embargo, estas diferencias
también se deben a causas genéticas, es decir, los diferentes mecanismos (tanto
ambientales como genéticos) que regulan la presencia de un quimiotipo podrían estar
operando con diferente intensidad en una zona en particular (Mártonfi et al., 1994). Por
lo que, para entender la relación entre la variación de los rasgos adaptativos y la
diversidad genética de los terpenos en el polimorfismo de las poblaciones son
necesarios análisis moleculares y de isoenzimas (Zaouali et al., 2005). Finalmente, si
bien en este estudio se encontró que los individuos de diferentes qu imiotipos (C, T y S)
no se distribuyen azarosamente en la Península de Yucatán, sino que tanto la . disponibilidad de el agua como de los nutrientes en el suelo ayudan a expl icar
parcialmente las diferencias encontradas en la composición qu ímica del aceite
esencial de los individuos de Lippia graveolens, aún falta explorar en experimentos de
jardín común a un nivel de organización menor, como el microambiente, cuáles serían
las cantidades óptimas de estos nutrientes que necesita un individuo de orégano para
producir aceite esencial con un quimiotipo y rendimiento determinados. Además es
necesario evaluar si, como en el caso de Thymus spp., son los genes los que definen
directamente el quimiotipo del orégano mexicano.
Otro factor que se debe tomar en cuenta al momento de analizar la variación en
la composición química del aceite esencial de las plantas aromáticas es el estrés
biótico, ya que cuando las plantas son expuestas a el consumo de herbívoros o al
ataque de virus, bacterias y hongos, hay una síntesis activa de metabolitos
secundarios (Sepúlveda et al. , 2003; ). Sin embargo, en este estudio, los ind ividuos de
L. graveolens analizados no mostraban ningún síntoma de daño en las hojas. Esto se
puede explicar debido a que el orégano mexicano es una planta de rápido crecimiento,
que solamente produce hojas durante el periodo de lluvias por lo cual se podría
clasificar como una planta "no aparente", lo que sugiere que es una planta difícil de
encontrar por los herbívoros (Anaya, 2003).
56
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63
•
CAPÍTULO 111
CONCLUSIONES
o Se encontraron tres quimiotipos (e , T y S) para el orégano mexicano, de los
cuales, el quim iotipo no fenólico (S) no había sido reportado con anterioridad.
o Se observó una segregación espacial de los quimiotipos de orégano, es
decir, no tienen una distribución aleatoria. Los individuos con quimiotipos e y
T, se localizan preferentemente en la zona norte de )'ucatán , que es la zona
más árida. Mientras que el quimiotipo S, se desarrolla en cl imas más
húmedos de la zona sur.
o Se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de carvacrol entre
las distintas poblaciones; incluso entre las poblaciones que pertenecían a un
mismo tipo de clima.
o Los individuos del quimiotipo S predominaron en sitios con suelos con mayor
cantidad de fósforo y mayor disponibilidad de agua.
o La concentración de fósforo en el suelo fue importante para separar al
quimiotipo S de los quimiotipos e y T, mientras que el manganeso fue un
factor importante en las diferencias encontradas entre los quimiotipos e y T.
PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este estudio de campo , permitieron evaluar la variación
en la composición del aceite esencial del orégano en individuos que crecen en diferentes
ambientes, así como generar hipótesis precisas sobre los factores edáficos y climáticos
que afectan su composición ; no obstante, aún se requieren evaluar en condiciones
controladas las hipótesis hasta ahora generadas , para poder determinar con detalle los
mecanismos mediante los cuales se afecta la composición del aceite esencial de Lippia
graveolens , ya que una desventaja de trabajar en poblaciones de campo es que más de
un factor se encuentra variando simultáneamente. El trabajo de Azizi y colaboradores,
(2009) es un claro ejemplo de estos estudios, ya que bajo condiciones controladas, se
pone a prueba como diferentes niveles de humedad y fertilización del suelo con nitrógeno
afectan la composición del aceite esencial. También hacen falta trabajos en los que se
explore la relación de la fotosíntesis y de variables microambientales con la composición
64
•
del orégano mexicano como el de Misra y colaboradores (201 0). Otras variables a
explorar en Lippia graveolens son la temperatura y el genotipo. Estudios recientes han
encontrado que un incremento en la temperatura, aumenta el contenido de carvacrol,
mientras que una disminución aumenta el contenido de timol (Novak et al., 201 0) . Esta
información pudiera ser abordada desde la perspectiva de estudios de cambio climático.
Bajo un escenario de aumento de temperatura, se esperaría que los individuos de L.
graveolens sintetizaran mayores cantidades de carvacrol. Por otro lado, bajo un escenario . en el que la sequía y el aumento de temperatura predominen los individuos de orégano
mexicano con quimiotipo C se desarrollarían mejor en estas condiciones, debido a que se
distribuyen en sitios con baja disponibilidad de agua y con suelos pobres en nutrientes.
Por otro lado se sabe que en Thymus spp., el quimiotipo está determinado genéticamente
(Vernet et al., 1986). En el caso del orégano mexicano no existen estudios en este
sentido. Experimentos de jardín común en los que individuos con diferentes genotipos se
sometieran a las mismas condiciones ambientales, serían de utilidad para evaluar el
efecto del genotipo, del ambiente y de la interacción genotipo-ambiente en la calidad del
aceite esencial.
Finalmente, es necesario describir con mayor detalle los quimiotipos en esta
especie, lo cual podría lograrse por medio de cromatografía de gases acoplada a un
espectrómetro de masas y con ello identificar una mayor cantidad de los metabolitos
secundarios presentes en el aciete esencial de Lippia graveolens.
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