Cinética Enzimática

Funciones de las Proteínas

Las funciones de las proteínas son específicas de cada tipo de proteína y permiten a las células defenderse de agentes externos, mantener su integridad, controlar y regular funciones, reparar daños… Todos los tipos de proteínas realizan su función de la misma forma: Por unión específica de otra molécula o ión (ligando o ligante)

De la unión se derivan:

Formación de estructuras celulares (Proteínas fibrosas)

Transporte y almacenamiento

Reactividad específica (catálisis)

Cambios conformacionales (alosterismo, motores moleculares, transmisión y transducción de señales)

Enzimas

• Las enzimas son catalizadores biológicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, pero no modifican la constante de equilibrio.

• Por tanto aceleran en igual proporción la velocidad de la reacción en las dos direcciones.

Reacciones catalizadas por enzimas

Condiciones de velocidad inicial[S]=100% [P]=0%

Curva de Evolución de los componentes de la reacción

Maud Menten (izq) Leonor Michaelis (der)

La ecuación de Michaelis-Menten describe como varía la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo

a la concentración de sustrato:

La concentración de sustrato ([S]) es mucho mayor que la concentración de enzima ([E]).

La reacción esta en equilibrio: [ES] no cambia durante el tiempo (la reacción se asume en equilibrio de flujos), es decir, la velocidad de

formación de ES es igual a la velocidad de su transformación en E + S y en E + P).

Velocidad Inicial: Deben usarse velocidades iniciales (vo). Esto significa que la velocidad de la reacción debe determinarse tan pronto como el

sustrato y la enzima son mezclados.La concentración de sustrato debe permanecer “casi”

constante durante el periodo de tiempo en que se mide la reacción

La Temperatura, la fuerza iónica, el pH, y otras constantes físicas que puedan afectar la velocidad de la reacción deben permanecer constantes

Cada molécula de enzima debe actuar en una molécula de sustrato en cada ocasión

La enzima debe permanecer sin ninguna modificación, ni en su estructura, ni en su concentración, durante todo el tiempo que dure la determinación de la reacción.

Variables de la ecuación de velocidad

Variable dependiente: velocidad inicial

Variables independientes:

A) Concentración de enzimaB) Concentración sustrato

Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten

Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten

Paramétros cinéticos

Son las constantes que aparecen en la ecuaciones de velocidad

Están compuestos por las constantes de velocidad de los pasos que constituyen la reacción catalizada

Unidades

Velocidad máxima

Es la velocidad límite a la que tiende la reacción catalizada por enzimas a concentraciones saturantes de sustrato, es decir cuando

toda la enzima está como ES

Vmax= kcat[E]total

Constante catalítica (kcat)

La constante catalítica solo se puede conocer cuando se tiente a la enzima pura y por tanto se conoce su concentración

kcat= Vmax/[E]total o kcat= Vmax/[sitios activos]

A kcat también se le conoce como número de recambio, porque indica el número de ciclos catalíticos por sitio activo y

por unidad de tiempo

Constante de Michaelis-Menten (Km)

Constante de especificidad

La enzima betaína aldehído deshidrogenasa cataliza la oxidación de betaína aldehído a glicina betaína usando NAD+ como coenzima. Se estudió la cinética de la reacción catalizada por la enzima pura en

ensayos de velocidad inicial en los que la concentración de NAD+ era variable y la de betaína aldehído constante. La masa molecular de esta enzima es de 125 kDa. Los datos de velocidad inicial obtenidos

son los siguientes:

[NAD+] (μM) v (U/mg prot) 50 20.1 100 36.2 125 42.6 250 70.0 500 100.5 1000 132.4 2000 151.4 4000 166.510000 176.2

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Hacer un análisis gráfico de los datos experimentales usando las transformación lineal a la ecuación de Michaelis-Menten y

determinar la cat y kcat/Km

La caracterización cinética de una actividad enzimática en una preparación parcialmente pura proporcionó los siguientes datos de

velocidad inicial:

A) Determine por regresión no lineal las constantes cinéticas de la enzima. B) ¿Podría calcular estas constantes por regresión lineal? C)

¿Qué conclusionespreliminares podría derivar del análisis de los resultados?

En ensayos de actividad realizados con 0.1 ml de una preparación enzimática en un volumen final de 1 ml se obtuvieron las siguientes velocidades iniciales a las concentraciones de sustrato indicadas. A)

Demuestre si esta reacción sigue o no la cinética de Michaelis-Menten por análisis gráfico y, si procede, determine Km para el sustrato y Vmax

y Vmax/Km para esta concentración de enzima

B) ¿Cuáles son las velocidades iniciales a [S]=1.0×10-6 M y a [S]=1.0×10-3 M? C) Calcule la cantidad total de producto formado

durante los primeros 5 min a [S]=2.0×10-3 M y a [S]= 2.0×10-6 M. D)

Suponga que la enzima en cada mezcla de reacción se aumenta por un factor de 4 ¿cuál sería el valor de Km y Vmax?

La Quimotripsina puede hidrolizar ademas de enlaces peptídicos, enlaces amido y ésteres derivados de aminoácidos. Las constantes cinéticas de la reacción canalizada por esta enzima con diferentes

ésteres se incluye en la siguiente tabla:

Determinar el orden de preferencia con el que la quimiotripsina catalizará la hidrólisis de estos sustratos si los tres se encuentran

presentes en la misma concentración.

¿Cuál sería la razón entre velocidades de producción de la N-acetilvalina y N-acetiltirosina si en el medio de reacción se encuentran

presentes estos dos sustratos a la misma concentración?

¿Qué conclusión puede obtener acerca del sitio activo de esta enzima a partir del análisis de estos datos?

La enzima acetilcolinesterasa tiene una Km. para acetilcolina de 9.5X10-5 M y una kcat de 1.4x104 s-1, mientras que la enzima catalasa tiene una Km para el H2O2 de 2.5x10-2 M y una kcat de 1.0x107 s-1. ¿Cuál de las dos enzimas está más próxima a la perfección catalítica?

En la siguiente tabla se incluyen las velocidades iniciales de una reacción catalizada por una enzima que sigue cinética de Michaelis Menten, medidas en ausencia (1), y en la presencia de dos diferentes inhibidores totales (1 y 2), ambos a una concentración de 10 mM. Se usó la misma concentración de enzima en todas las determinaciones.

Determinar las constantes cinéticas de la enzima en ausencia y presencia de los inhibidores, realizar la curva de Michaelis. (B) Para cada inhibidor determinar el tipo de inhibición. (C) ¿Qué información adicional requeriría para calcular el número de recambio de la enzima?

En una reacción enzimática monosustrato se determinaron las siguientes constantes de velocidad: k1=5x10-7 M-1s-1, k-1= 2x102 s-1 y k2 (kcat) = 4x4 s-1.(A) Calcular Ks y Km para esta reacción.

Factores que afectan la velocidad

Concentración de sustrato o sustratos (cofactores)

Concentración de enzima

Inhibidores

Activadores

pH

Temperatura

Regulación de la actividad enzimática por union a la enzima de ligandos que no son sustratos

Tipos de Inhibidores

Sólo se afecta la Km

Afecta la Km y Vmax