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APUNTES DE BIOQUMICA

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ENZIMAS & CINTICA ENZIMTICA

Julin A. Chamucero Millares1

os catalizadores son sustancias que se caracterizan por:

1. Aumentar la velocidad de una reaccin qumica

2. No se alteran en el proceso [no se consumen]

3. No interfieren en el estado de equilibrio de la reaccin. Es decir, no cambiar la direccin de la reaccin.

En los sistemas biolgicos, la mayora de las sustancias catalizadoras son protenas que reciben el nombre de enzimas. Las enzimas y cualquier catalizador acta sobre otras sustancias a las que llamamos sustratos.

En el siguiente ejemplo observamos la reaccin de descomposicin del perxido de hidrgeno:

H202 2H20 + 02

Esta reaccin est favorecida

termodinmicamente, puesto que su G es negativo y por lo tanto la direccin de la reaccin se encuentra desplazada hacia la izquierda; sin embargo, la descomposicin de 1 mol de perxido de hidrgeno a condiciones ambientales puede tardar

1 Mdico Interno. Internado nfasis en

investigacin. Laboratorio de Biomimticos Instituto de Biotecnologa. Universidad Nacional

de Colombia. 2012

mucho ms de un ao. No obstante, la adicin de una molcula de in frrico es capaz de acelerar la velocidad de la reaccin hasta 1000 veces; ms an, la hemoglobina incrementa la tasa en un milln de veces.

El ejemplo anterior nos permite concluir dos cosas:

1. Existen sustancias que aumentan la velocidad de una reaccin, y

2. El hecho de que una reaccin sea termodinmicamente favorable; es

decir, que su G sea negativo, no significa en absoluto que la reaccin ocurra a gran velocidad.

Cmo se estudian las velocidades de las reacciones?

El estudio de las velocidades de las reacciones es el campo de aplicacin de la cintica qumica. sta rama de la qumica utiliza modelos y ecuaciones matemticas para evaluar la velocidad a la cual una serie de sustancias reaccionan para formar unos productos, veamos:

Consideremos una reaccin qumica simple,

A B

L

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donde la velocidad es igual a la concentracin de B por unidad de tiempo: es decir, a la velocidad de la formacin del producto.

Donde la velocidad es igual a menos la concentracin de A por unidad de tiempo; es decir, la velocidad a la que se consume el reactante.

Dado que estamos considerando una reaccin irreversible, existe una proporcin lineal en la que:

O sea que la velocidad a la que se forma el producto es la misma a la que se consume el reactante, por lo que podemos obtener una constante K de velocidad:

Consideremos ahora la misma reaccin, pero sta vez con la particularidad de ser reversible: A B Por lo que ahora,

Estas demostraciones nos permiten tener un conocimiento bsico de las velocidades de una reaccin y de sus respectivas constantes de velocidad, empero, qu determina la velocidad de una reaccin qumica? Primero que todo es importante conocer el significado del valor de K:

Una k alta indica una reaccin rpida Una k baja indica una reaccin lenta

Por lo que al intentar conocer los determinantes de la velocidad de una reaccin, lo que queremos averiguar en s, son las variables que afectan la constante de velocidad. Entre dichas variables tenemos la temperatura y el pH de la solucin; sin embargo, la ms importante es la BARRERA ENERGTICA DEL ESTADO DE TRANSICIN. El estado de transicin es una fase de la reaccin qumica en la que los reactantes adoptan una configuracin intermedia para transformarse luego en productos. La importancia del estado de transicin radica en que presenta

un valor de G muy grande el cual deben superar los reactantes para continuar el curso de la reaccin; esto quiere decir que

cuanto ms alto sea el G del estado de transicin, ms lenta ser la reaccin. Para que los reactantes alcancen ese nivel de energa se requieren mnimo 3 cosas:

1. Una adecuada disposicin de las molculas

2. Colisiones eficientes entre las molculas

3. Precisa energtica de las colisiones

Recordemos ahora que la energa libre del estado de transicin se define por:

G = H - T. S

Entonces si H es alto y S es bajo, el G ser mayor a cero, por ende la reaccin ser lenta. Esto nos indica que una reaccin tendr una constante de velocidad baja entre mayor sea la energtica de las colisiones y

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menor desorganizacin haya en el sistema; es decir, donde el movimiento de las molculas tienda a la no aleatorizacin y disminuya entonces la adecuada disposicin y las colisiones de las mismas.

Cmo trabajan las enzimas? Las enzimas actan en dos puntos

crticos:

1. Disminuyen la barrera energtica de la reaccin

2. Aumentan la fraccin de las molculas reactantes

Como hemos indicado, la barrera energtica se define por:

G = H - T. S

Y lo que debe hacer una enzima es permitir una reacomodacin de los valores de entalpia y entropa para aumentar la velocidad de la reaccin:

Para disminuir H, el sustrato adopta dentro del sitio activo de la enzima una configuracin molecular diferente con menor energa.

Para aumentar S, la enzima ajusta la direccin de los sustratos para favorecer la colisin.

odelos del mecanismo de accin de las enzimas

Reconocemos ahora que las enzimas

disminuyen el valor de G [energa libre de Gibbs estndar del estado de transicin] facilitando la formacin de un estado similar al estado de transicin. Para que ello sea posible, el sustrato se une a una regin aminoacdica especfica denominada sitio activo donde ocurre la formacin de dicho estado. Para explicar la interaccin del sustrato con el sitio activo de la enzima, se han planteado 2 modelos o hiptesis:

1. El primero de ellos fue postulado hacia el ao 1894 por un bioqumico alemn llamado Emili Fischer. El pretenda explicar que el sustrato se une a la enzima del mismo modo que una llave encaja perfectamente en una cerradura; sin embargo, este modelo slo explica la especificidad de las enzimas pero no responde a la pregunta de cmo se consigue formar un estado configuracional similar al del estado de transicin.

2. Posteriormente Daniel Koshland propona en 1958 un modelo diferente al que llam del ajuste inducido. Esta hiptesis plantea que el sitio activo de la enzima induce al sustrato y a la misma enzima a

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adoptar una configuracin molecular diferente. Teniendo en cuenta esta modificacin del modelo previo, la hiptesis del ajuste inducido explica tanto la especificidad como las caractersticas propias de la catlisis enzimtica [disminucin de la barrera energtica].

Ahora, si bien es cierto que la estructura completa de la enzima es importante, debido a que la secuencia completa de aminocidos es la que permite el diseo especfico de cada tipo de enzima, es el sitio activo quien juega el papel ms substancial en la funcin cataltica de la enzima. Veamos 2 ejemplos para reconocer por qu.

1. Triosa fosfato isomerasa. Esta enzima como su nombre lo indica isomerisa las triosas fosfato. Un ejemplo es el cambio del gliceraldehido-3-fosfato a dihidroxiacetona-fosfato. El sitio activo de la enzima contiene 2

residuos de aminocidos importantes:

a. La histidina que acta como donadora de protones

b. El glutamato que funciona como aceptor de protones

Durante la catlisis se forma un compuesto intermediario de menor energa llamado enediol, ya que, el glutamato acepta un protn del carbono 2 [C2] del gliceraldehido-3-fosfato y el residuo de histidina dona un protn al grupo carbonil del mismo G3P.

2. Serina proteasas. Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de los enlaces peptdicos. Las serina proteasas son proteasas en las cuales el residuo de serina del sitio activo es el que juega el papel fundamental en la actividad cataltica. Dos ejemplos de esta clase de enzimas son la tripsina y la quimotripsina. El sitio

activo de las enzimas est

formado por los

residuos aspartato,

histidina y serina; sta ltima se ubica justo

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al lado del bolsillo donde se posar la cadena lateral del residuo de aminocido en el cual la enzima corta el enlace peptdico. Ya que todas las serina proteasas tienen los mismos residuos en el sitio activo, stas se diferencias por la caracterstica del bolsillo que fija la cadena laretal del residuo especfico para el que trabaja la enzima.

intica enzimtica

La cintica enzimtica estudia las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas. Consideremos lo siguiente:

La reaccin entre la enzima y el sustrato incluye la formacin de un complejo enzima-sustrato

E + S ES E+P

La constante de velocidad de la reaccin entre la enzima y el sustrato est dada por la suma entre la constante de disociacin del complejo enzima sustrato en enzima y sustrato (K-1) y la constante de disociacin del complejo en enzima y producto (K2).

K1[E][S] = K-1[ES] + K2[ES]

Sacamos factor comn

K1[E][S] = {[ES] (K-1+K2)}

Despejamos la concentracin del complejo enzima sustrato

(

)

Encontramos una constante de equilibrio general para toda la reaccin

(1)

Reemplazamos en la ecuacin anterior

(

)

Despejamos y obtenemos la concentracion del complejo enzima sustrato en la constante de quilibrio en trminos de la concentracin de la enzima y el sustrato

KM [ES] = [E] [S] (2)

Teniendo en cuenta que cuantificar la concentracin del complejo enzima-sustrato es en trminos prcticos algo imposible, consideremos que la concentracin de la enzima despus de la reaccin es igual a la suma de la concentracin de la enzima total menos la del complejo

[E]f = [E]T [ES] (3)

Reemplazamos esta ecuacin en la igualdad nmero 2

KM [ES] = {[E]T [ES]} . [S]

C K1

K-1

K2

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KM [ES] = [E]T[S] [ES][S]

Organizamos trminos para obtener una formulacin que nos permita calcular la concentracin del complejo con valores que si podamos medir

KM [ES] + [ES][S] = [E]T[S]

[ES] (KM + [S]) = [E]T[S]

(4)

Ahora, partiendo que la reaccin inicia desde el complejo enzima-sustrato ya formado, la velocidad de la reaccin est dada por:

v = K2 [ES]

Reemplazamos este trmino en la ecuacin nmero 4

v = K2

(5)

Llegado el momento, hay un punto de saturacin de la concentracin total de la enzima por el sustrato, por lo que la reaccin llega a su velocidad mxima:

vmax = K2 [E]T

Establecemos este trmino en la ecuacin nmero 5

v =

(6)

Esta es la ecuacin final del anlisis de cintica enzimtica y se denomina ecuacin de Michaelis Menten y KM es la constante de Michaelis.

Cul es la interpretacin de KM?

Revisemos la siguiente fraccin de la constante:

Si KM tiene un valor mayor a cero [>0] nos indica que,

K-1>k1, por lo que hay una disociacin rpida del sustrato.

De este modo, una primera aproximacin a la constante de Michaelis es la de la afinidad por el sustrato, por lo que, entre ms grande sea el valor de KM menor ser la afinidad. No obstante, la interpretacin real es que la KM constituye un valor numricamente igual a la concentracin del sustrato ([S]) a la que la la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima; es decir, vmax/2.

Ejemplo: los valores de KM para la tripsina y la quimotripsina son:

Tripsina: 1.5 x10-2 M Quimotripsina: 3 x10-4 M

Esto quiere decir que se nececita una solucin de sustrato en una concentracin de 0,015 M para conseguir la mitad de la velocidad mxima de la reaccin. Supongamos que la vmax = 10 moles/s; o sea, que en un segundo la enzima cataliza 10 moles de sustrato. Cuando el sustrato alcanza una concentracin de 0,015 M, la enzima cataliza la reaccin de 5 moles de sustrato por segundo. Si comparamos los valores de KM para ambas enzimas, la tripsina requiere una concentracin menor que la quimotripsina para conseguir la mitad de la velocidad mxima de la reaccin.

Para los diferentes estudios experimentales con enzimas, la tabulacin y diagramacin de los datos, se facilita el uso de una transformacin algebrica de la ecuacin de michaelis-menten. Al obtener los recprocos a ambos lados de la igualdad y organizando los trminos, obtenemos una ecuacin que obedece a la formulacin de lnea recta:

y = (m) (x) + b

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Esta igualdad se conoce como la ecuacin de Lineweaver-Burk y permite hacer una grfica en lnea recta denominada representacin doble-inversa que presenta:

Una pendiente

Una intercepcin de

sobre el

eje

(o sea el eje y)

Una intercepcin de

sobre el eje

de

(o sea el eje x]

nhibicin enzimtica

Las enzimas son macromolculas cuya funcin cataltica es susceptible de ser inhibida, existen dos grandes grupos de inhibidores:

1. Inhibidores reversibles 2. Inhibidores irreversibles

La diferencia entre ellos radica en el tipo de enlace que forman con la enzima, el primero de ellos utiliza enlaces o fuerzas de interaccin dbiles, mientras que el segundo lo hace a travpes de enlaces covalentes.

De acuerdo al sitio de unin del inhibidor, los inhibidores reversibles se dividen en 3 tipos:

1. Inhibidor competitivo: se caracteriza por ser una molcula estructuralmente similar al sustrato original, por lo que, dependiendo de la concentracin de uno y el otro, compiten por ocupar el sitio activo de la enzima. A mayor concentracin del inhibidor, menor ser la concentracin de sustrato que sea catalizado por la enzima. La enzima dihidrofolato reductasa en una enzima encargada de participar en la sntesis de purinas y pirimidinas a partir de las reacciones con el dihidrofolato. Debido a que la sntesis del DNA y el RNA dependen de la formacin de nucletidos en los que participan las bases de purina y pirimidina, se desarroll una molcula anloga al dihidrofolato conocida como metotrexate y que actualmente se usa entre otras cosas para el tratamiento quimioteraputico del cncer, con lo cual se inhibe la divisin celular por disminucin de la sntesis de las bases constituyentes de los nucletidos.

2. Inhibicin acompetitiva: en ella, el

inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima sustrato y por obvias razones en una regin diferente al sitio activo de la enzima.

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3. Inhibicin no competitiva: en ella tanto el sustrato como el inhibidor pueden fijarse a la enzima y acta disminuyendo el nmero de recambio de sustrato.

4. Inhibicin mixta: se caracteriza porque el inhibidor puede unirse tanto a la enzima como al complejo enzima sustrato, prevenir la unin del sustrato o disminuir el recambio.

aractersticas cinticas de los inhibidores

Los experimentos que determinan las velocidades de reacciones catalizadas a

diferentes concentraciones de sustrato y del inhibidor, permiten distinguir las caractersticas cinticas de los diferentes tipos de inhibidores:

1. Inhibidor competitivo: ya que la molcula anloga desplaza al sustrato del sitio activo, la KM aparente aumenta, ya que hablando en trminos del sustrato - se requiere mayor concentracin del sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad mxima de la reaccin. Ahora, hablando en trminos de la reaccin en si, independientemente de qu molcula ocupe el sitio activo sea sustrato o inhibidor la velocidad mxima de la reaccin se conseguir cuando la concentracin de alguna de las dos molculas sature la concentracin de enzima disponible, por lo que finalmente, la vmax no cambia.

2. Inhibicin acompetitiva: el inhibidor acompetitivo slo se une al complejo enzima sustrato ya formado y bloquea la formacin del producto. Ya que la enzima libre tiene ahora mayor concentracin de sustrato disponible, la velocidad

C

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mxima de la reaccin es ms fcil de alcanzar, por lo que el valor de vmax disminuye. Si el valor de vmax disminuye, significa que se requiere una concentracin menor de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad mxima, por ende la KM aparente tambin disminuye.

3. Inhibicin no competitiva: como

mencionamos, el inhibidor no competitivo se une a una regin diferente al sitio activo de la enzima por lo que no interfiere con la unin del sustrato y por ende la concentracin para alcanzar la mitad de la velocidad mxima sigue siendo la misma y la KM no se ve alterada; sin embargo, como el inhibidor si retrasa el efecto cataltico, y la enzima demora en disociarse, hay menos enzimas libres para una concentracin mayor de sustrato por lo que la velocidad mxima se alcanza ms rpido y el valor de vmax disminuye.

4. Inhibicin mixta:dado que acta tanto en la enzima como en el complejo enzima sustrato, aumenta la KM y disminuye el valor de vmax

En relacin a los inhibidores irreversibles, en general son sustancias txicas que se unen de manera covalente al sitio activo de la enzima y bloquear su actividad cataltica. Los podemos dividir en:

1. Reactivos de grupo especfico: son molculas que reaccionan con cadenas laterales especficas de algunos residuos de aminocidos en el sitio activo.

2. Sustratos anlogos reactivos: son molculas estructuralmente similares a los sustratos nativos pero que se unen de manera covalente al sitio activo de la enzima.

3. Inhibidores suicida: son moleculas similares al sustrato que se caracterizan por permitir una reaccin cataltica; sin embargo, los productos resultan ser intermediarios txicos que se unen de manera covalente a la enzima y la inactivan.

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ecanismos de regulacin enzimtica

Como cualquier otro mecanismo dentro de los seres vivos, la catlisis de las

reacciones bioqumicas deben ocurrir en el lugar y el tiempo adecuados, por lo que se hace necesaria una regulacin de la actividad enzimtica. Se han descrito 5 mecanismos reguladores:

1. Control alostrico: ocurre en aquellas enzimas de naturaleza proteca que contienen mltiples subunidades que actan como sitio funcional y sitio de control. Presentan adems una propiedad llamada cooperatividad de unin y que quiere decir que la unin de una molcula a un sitio control o funcional afecta la actividad de los dems sitios o subunidades. Si ese control cooperativo se da por la unin al sustrato, el mecanismo se denomina homoalosterismo; mientras que, si la cooperatividad es por otras molculas diferentes al sustrato, la regulacin es del tipo heteroalosterismo. Este tipo de enzimas no obedecen la cintica de Michaelis-Menten puesto que su comportamiento no se refiere a la unin de una sola molcula de sustrato al sitio activo sino de varias molculas a los sitios funcionales. Un ejemplo clsico de enzima alostrica es la aspartato carbamoiltransferasa [ATCasa], una protenas con estructura cuaternaria que incluye 6 unidades catalticas unidad por 6 unidades reguladoras. La ATCasa cataliza la primera reaccin de la biosntesis de las pirimidinas que incluye la condensacin del carbamoil fosfato y el aspartato para formar carbamoilaspartato. De la secuencia de la reaccin de sntesis se obtiene un nucletido de pirimida llamado citidin trifosfato [CTP] el cual cuando comienza a acumularse se une a uno de los sitios regulares de

la enzima e inhibe su actividad indicando que ya se sintetiz la suficiente canditad de nucleotidos necesarios.

2. Diferentes formas de la enzima: hace referencia a las isozimas o isoenzimas, enzimas estructuralmente diferentes pero que catalizan la misma reaccin; sin embargo, varan sus parmetros cinticos y sus mecanismos de regulacin. Dos ejemplos de esta clase de enzimas son la lactado deshidrogenasa, una enzima que participa en la gluclisis anaerobia y que presenta 2 isoenzimas, una en el msculo cardiaco y otra en el msculo esqueltico y mostrndo diferente afinidad por la glucosa entre ambos tejidos. El segundo ejemplo lo constituye la glucoquinasa, una isoenzima de la hexoquinasa presente en el tejido heptico pero con menor afinidad por la glucosa para un adecuado control de los niveles de liberacin de insulina y glucagn.

3. Modificaciones covalentes reversibles: es un elemento regulador abundante en los mecanismos de sealizacin intracelular e involucra la unin covalente reversible de grupos fosfato para la activacin o inactivacin de las enzimas. Una de las enzimas encargadas de la fosforilacin [activacin] de otras enzimas es la protein cinasa K que cataliza la reaccin de transferencia de un grupo fosfato desde el ATP hacia un residuo de aminocido de otra enzima.

4. Activacin proteoltica: son enzimas que son sintetizadas en un estado inactivo o zimgenos y que requieren de un clivaje proteoltico para su activacin. El tripsingeno [el zimgeno de la tripsina] es sintetizado en el pncreas y secretado al duodeno donde es

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activado por la enteroquinasa intestinal.

5. Sntesis de la enzima: es el control absoluto y est mediado por la expresin gnica y la sntesis de mRNA.

Bibliografa

Mathews, C.K.; Van Holde, K.E.; Ahern K.G.(2002). Enzimas: catalizadores biolgicos. Bioqumica. (pp 403-455)Pearson Education, S.A., Madrid.

Nelson, D.L & Cox, M.M. (2008) Enzymes. Lehninger. Principles of Biochemistry. (pp 183-228). W.H. Freeman and Compay, New York.

Berg, J.M.; Timoczko, J.L.; Stryer Lubert (2007) Enzymes: basic concepts and kinetics. Regulatory Strategies Lehninger. Principles of Biochemistry. (pp 205-236, 275-296). W.H. Freeman and Compay, New York.