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3.0CINETICA DE FORMACIONDE PRODUCTODr. Blgo. CARLOS E. VILLANUEVA AGUILAR

MSc. Microbiologa Industrial Y Biotecnologa

Los microorganismos pueden elaborar ( concentrar ) numerosos metabolitos.

Este hecho, y adems la rapidez (velocidad) con la cual los producen, justifican el inters de su utilidad en Biotecnologa, basada en su gran poder de sntesis.

Cuando en un proceso microbiano, paralelamente al establecimiento de la curva de crecimiento celular (X) , con la ayuda de tcnicas de dosificacin apropiadas, se traza la curva de evolucin de la concentracin del metabolito apropiado ( P), se puede deducir las variaciones de la velocidad de formacin del metabolito ( rp = dP/dt ), expresada en g L 1 h-1CONTENIDO

1. Velocidad de formacin de producto (rp)

Aplicando Yp/x (rendimiento producto en relacin al crecimiento)

Aplicando r x (velocidad de crecimiento celular)

Aplicando q p ( velocidad especifica de formacin de producto)2. Velocidad especifica de formacin de producto (qp)

3. Velocidad de formacin de producto y mantenimiento celular4. Relacin consumo de substrato, formacin de productos y crecimiento5. Relacin entre las Velocidades especficas: Consumo de Sustrato (qs), Crecimiento (), Mantenimiento (m) y

Formacin de producto (qp)LISTA DE SMBOLOS

Concentraciones

P

S

X

Coeficientes

m

Yx/s

Yp/s

Velocidades especificas

qPqSq02

Velocidades

rXrSrPro2Producto

Substrato

Biomasa

Mantenimiento

Coeficiente de rendimiento celular (biomasa)

Coeficiente de rendimiento de producto

Velocidad especifica de crecimiento

Velocidad especifica de muerte celular

Velocidad especifica de formacin de producto

Velocidad especifica de consumo de substrato

Velocidad especifica de consumo de oxigeno

Velocidad de crecimiento celular

Velocidad de consumo de substrato

Velocidad de formacin de producto

Velocidad de consumo de oxigeno

1. VELOCIDAD DE FORMACION DE PRODUCTO ( rP ) 1.1. Aplicando Yp/x (Rendimiento de producto en relacin al crecimiento):

Si reordenamos Ec. (1) y derivamos respecto al tiempo se obtiene Ec. (25):

(1) Yp/x = dp / dx Yp/x = dp / dt / dx / dt

Despejando: dp / dt

(24) dp / dt = Yp/x . dx / dt

Aplicando sus equivalentes se tiene (25) : (25) VELOCIDAD DE FORMACION DE PRODUCTO ( rP )

rp = Yp/x . rx donde: rp = velocidad de formacin de producto

rx = velocidad de crecimiento celular Aplicando rX ( velocidad de crecimiento celular ):

Introduciendo la Ec. (18) en la Ec. (25) se obtiene Ec. (26):

(18) rX = x donde: = velocidad especifica de crecimiento (25) rp = Yp/x . rX (26) VELOCIDAD DE FORMACION DE PRODUCTO (rP)

rP = Yp/x . XAplicando qp ( velocidad especifica de formacin de producto ):

(27) VELOCIDAD DE FORMACION DE PRODUCTO (rP )

Si: rX = . x por analoga rP puede expresarse como: rP = qp . x donde: qp = velocidad especifica de formacin de producto

2. VELOCIDAD ESPECIFICA DE FORMACION DE

PRODUCTO ( qP ) 2.1. Comparando rP ( velocidades de formacin de producto):

Comparando las Ec. (26) y (27), se obtiene Ec. (28)

(26) y (27) Yp/x . x = qp . x

Despejando qp se tiene (28) (28) VELOCIDAD ESPECIFICA DE FORMACION DE PRODUCTO (qP )

qP = Yp/x / Referencia: FAO Pg. 38

3. VELOCIDAD DE FORMACION DE PRODUCTO Y MANTENIMIENTOLa velocidad de formacin de producto tendr dos contribuciones (crecimiento y el mantenimiento) segn la expresin de Luedeking y Piret:

rP = Yp/x . X + x qP = Yp/x / + Donde:Yp/x . X : expresa la velocidad de formacin de producto debida al crecimiento : expresa la velocidad de formacin de producto debida al mantenimiento.

4. RELACION CONSUMO DE SUBSTRATO, FORMACIN DE PRODUCTOS Y CRECIMIENTOEs posible relacionar consumo de sustrato, la formacin de productos con el crecimiento al hacer BALANCES DE MATERIAL para cada uno.

1.- PARA EL CRECIMIENTO: Acumulacin total = crecimiento - desaparicin

dx / dt = X - X ( Ec.10.15) 2.- PARA LA FORMACIN DE PRODUCTO:

Acumulacin de = formacin - destruccin

producto producto producto

dp / dt = qp X - k P ( Ec.10.17)

3.- PARA EL CONSUMO DE SUSTRATO: Acumulacin de = Alimentacin de - Substrato para - substrato substrato crecimiento

Substrato para requerimiento para

formacin de - mantenimiento

producto

- ds / dt = FSO / Vo - X / Yx/s - qp X / Yp/s - m X (Ec. 10.16)Substrato para crecimientoSubstrato para formacin de producto

Yx/s = dx/dt / - ds/dt

- ds/dt = dx/dt / Yx/s

= X / Yx/s

rsx = X / Yx/s

Yp/s = dp/dt / - ds/dt

- ds/dt = dp/dt / Yp/s

= qpX / Yp/s

rsp = qp X / Yp/s

La Ec.10.16 incluye un trmino que corresponde al suministro de sustrato ( FSo /V ).EN UN CULTIVO BATCH la Ec 10.16 se transforma en Ec. 10.18

- ds / dt = - X / Yx/s - qp X / Yp/s - m X (Ec. 10.18)5. Relacin entre las Velocidades especficas: Consumo de Substrato (qs), Crecimiento (), Mantenimiento (m) y Formacin de Producto (qp)Reemplazando Ec. 10.18 en Ec. 10.19 resulta Ec. 10.20

rs= - X / Yx/s - qp X / Yp/s - m X (Ec. 10.18)Se sabe la velocidad de consume de substrato ( - ds / dt ): - ds / dt = qs . X (Ec. 10.19) qs . X = - ds / dt Despejando qs

qs = 1 / X . - ds / dt qs = 1 / X . (- X / Yx/s - qp X / Yp/s - m X ) qs = 1 / X . (- X / Yx/s - qp X / Yp/s - m X ) qs = 1 / X . X (- / Yx/s - qp / Yp/s - m ) qs = (- / Yx/s - qp / Yp/s - m ) (Ec. 10.20) A.- Los Productos se pueden formar durante la fase de crecimiento: En este caso la velocidad especfica de sntesis de productos (qp) se relaciona directamente con la velocidad especfica de crecimiento (u) B.- Los Productos pueden formarse despus de un periodo de crecimiento previo:

Debido a la acumulacin de algunos metabolitos primarios subsecuentemente puede relacionarse con el crecimiento ( fig. 10.16 )

C.- Los Productos pueden formarse independientemente de la fase de crecimiento

END

GRACIAS

8.- CINTICA DE LA FORMACIN DE PRODUCTOS.

Los microorganismos pueden elaborar (concentrar ) numerosos metabolitos.

Este hecho, y adems la rapidez (velocidad) con la cual los producen, justifica el inters de su utilidad en Biotecnologa, basada en su gran poder de sntesis.

Cuando en un proceso microbiano, paralelamente al establecimiento de la curva de crecimiento celular (X) , con la ayuda de tcnicas de dosificacin apropiadas, se traza la curva de Evolucin de la concentracin del metabolito apropiado (P). Se puede deducir las variaciones de la velocidad de Formacin del metabolito ( d P/dt ), expresada en g L 1h-1

9.- VELOCIDAD DE FORMACIN DE PRODUCTOS

La Velocidad de Formacin de Productos (rp) est dada por

Donde qp . Velocidad especfica de formacin de productos.

Al cabo de un tpo , t , y suponiendo que inicialmente P =0

Esta cc indica que tanto la concentracin celular (X) como su capacidad biosinttica ( qp ) son importantes en la obtencin de un metabolito. ( P 9

10 .- VELOCIDAD DE FORMACIN DE PRODUCTOS

(S) (X) (P)

Sustratos Microorganismos Productos

INDICE

1.- Velocidad de Formacin de productos

2.- Productividad.

3.- Clasificacin de los Productos de Bajo peso molecular

4.-

5

6.-

11.- PRODUCTIVIDAD (rp) Cantidad de producto obtenido ( g L-1 )

r p = d p = q p X Dividido por el tiempo ( h)

d t

La productividad puede ser mejorada aumentada X, q p o ambos.

Puede que un aumento de X cause disminucin de qp. Sera necesaria una solucin de compromiso ( una combinacin que haga mxima la productividad.)

12 .- PRODUCTIVIDAD TOTAL

Si se tiene la curva P = f (t) y se traza una lnea recta del tipo de la fig 4.6. se deduce la PRODUCTIVIDAD TOTAL (Pt ) que concierne al metabolito que se busca con respecto a Pf : concentracin de metabolito obtenido cuando se detiene la fermentacin de tiempo Tm, ( duracin total de un ciclo de produccin ) expresada en Gl-1h-1

Fig 4.6

Este concepto es importante por que nos permite calcular las dimensiones de la instalacin de fermentacin que se necesita para la obtencin del objetivo de produccin, definido por las obligaciones econmicas

Ya establecidas las 2 curvas de variaciones de X y P en funcin de tiempo , se deduce la velocidad especfica de formacin de producto

Que expresa la rapidez de produccin relacionada a la Unidad de Biomasa ( g g-1 h-1 ) y que permite evaluar el poder de sntesis y por tanto la eficacia de las clulas que actuan y la rentabilidad de las fermantaciones .

PRODUCTIVIDAD TOTAL

Este Concepto es importante por que nos permite calcular las dimensiones de la instalacin de fermentacin que se necesita para la obtencin del objetivo de produccin, definido por las obligaciones econmicas.

Ya establecidas las 2 curvas de variaciones de X y P en funcin del tiempo, se deduce la de la rapidez especfica en funcin del tiempo.

d P l qp

d t X

(37)

Que expresa la rapidez de produccin rada a la Unidad de Biomasa que existe (g g 1 h-1 ) y permite evaluar el poder de stesis, y por tanto la eficacia de las celulas que actuan y la rentabilidad de las fermentaciones.

Como los metabolitos son producidos por las clulas, la forma de la curva de produccin es dependiente de la curva de crecimiento.

La relacin existente entre las 2 curvas vara de un metabolito a otro segn

1.- su Naturaleza

2.- Su lugar en la actividad Bioqumica celular, y

3.- Los mecanismos de las reacciones metablicas que los originan.

Desde este punto de vista se distinguen 2 tipos principales de compuestos. Para los primeros : CRECIMIENTO Y PRODUCCIN SON CONCOMITANTES

Es el caso de los compuestos que son resultado de las vias metablicas.

Son producidos por las vias de metabolismo que proporcionan a la clula la ENERGIA que necesitan para efectuar su SNTESIS y tambien para la produccin

Ejmplo:

1.- Se observa este tipo de dependencia en la FERMENTACIN ALCOHOLICA;las curvas de crecimiento y de produccin, tienen exactamente

igual perfil .

Al final de la operacin se puede tener un efecto de regreso debido al poder antisptico del etanol sobre los microbios.

Estamos mas marcada cuando mas elevada sea la concentracin inicial del sustrato.

Por tanto , es la produccin quien ejerce una influencia sobre el crecimiento.

EJEMPLO

2.- Se observa igualmente este tipo de dependencia en la produccin de compuestos intermedios del metabolismo, denominados METABOLITOS PRIMARIOS: Aminocidos y vitaminas necesarios para la sntesis celulares y cuya produccin,por sta razn ,esta directamente ligada al crecimiento.

Las vias metablicas que originan estos compuestos estan en su mayor parte, sometidos a los mecanismos de regulacin que permiten a la clula evitar el despilfarro, jugando en ciertos casos, el mismo producto el papel de inhibidor de su propia sntesis.

Por mutacin es posible anular stos mecanismos, en forma que en el curso de la produccin se pueda observar el fenmeno de la saturacin.

PARA LAS CINTICAS DE CRECIMIENTO Y DE PRODUCCIN CONCOMITANTE

Relacin en la cual YP/X expresa la cantidad de metabolito producido por unidad de biomasa celular.

EN EL CASO DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS

La fase de produccin ( Idiofase ) est retrasada definidamente con ocilacin a la fase de crecimiento (trofofase)

Con frecuencia est bajo el control de mecanismos an mal deducidas en la mayor parte de los casos.

La represin catablica ( efecto glucosa ) parece , en forma particular, jugar un papel fundamental, por lo que sobreentiende que la SNTESIS DE ESTOS METABOLITOS SECUNDARIOS no se modifican sino cuando la concentracin la glucosa es inferior a un costo valor, dando fin al crecimiento celular.

La Biosntesis est por consiguiente sometida a los mecanismos de regulacin alortaicos el producto terminal inhibe a una a varias enzimas que lo originan.

LA DEPENDENCIA DE LA CURVA DE PRODUCCIN EN LA RELACION A LA CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR que se presenta al final de otros casos tienen un perfil intermediario entre los dos:

LA PROIDUCCION es por lo tanto cocomitante con el crecimiento en un periodo de tiempo determinado por ejemplo a partir de una cierta concentracin en Biomasa.

Ejm Es el caso de la produccin de cido lctico por ciertas bacterias lcticas.

Conclusin

. Es de acuerdo a la forma y al lugar de la curva de produccin con respecto a las de la curva de crecimiento que se selecciona el MODELO ,MATEMTICO DE PRODUCCIN O INTERACCION.

CLASIFICACION DE LOS PRODUCTOS DE BAJO PESO MOLECULAR

SEGN SU FUNCION DENTRO DEL METABOLISMO

I.- Productos finales del Metabolismo Energtico.

II.- Productos intermedios del Metabolismo Primario

III.- Productos del Metabolismo Secundario

LA FORMACIN DE PRODUCTOS FINALES DE METABOLISMO ENERGTICO

Ejemplo Etanol, Ac Lctico, butrico, butanol otras asociados a procesos anaerobios.

Su formacin es consecuencia directa de la degradacin de la fuente de C para obtener

Energa

La Energa se emplea tanto para el CRECIMIENTO Y MENTENIMIENTO

CELULAR.

POR LO QUE . La velocidad de formacin de producto tendr 2 contribuciones

Velocidad de formacin de producto deducida de

Reemplazando .:

Se tiene :

Dividiendo entre X se tiene .:

De donde:

Expresa la velocidad de formacin de producto debido al

Crecimiento

Expresa la velocidad de formacin de producto debido al

Mantenimiento.

Estrategia para la obtencin de productos tipo I

1.- Contar con una concentracin celular elevado sometida a condiciones tales

que el mantenimiento sea grande, pueda lograrse:

Aumentar la tonicidad del medio

Modificar la temperatura.

Limitar el cultivo en nitrgeno:celulas impedidas de duplicarse y fuente de C deriva via mantenimiento a foprmacin de producto.

2.- Ejemplo Obtencin de Etanol Por levadura

Etapa l : Proceso Aerobio

Medio de cultivo contiene relacin C/N apropiada para obtener un buen

Crecimiento .

Etapa 2 .- Proceso Anaerbio.

Medio con escasa concentracin N y ekevado C es convertido en un 90 % en Etanol y CO2

La tolerancia de la Levadura al Etanol es un aspecto importante a considerar.

FORMACIN DE PRODUCTOS INTERMEDIOS DEL METABOLISMO PRIMARIO

Ejmplo a a , nucletidos , Vitaminas Acidos orgnicos bispdinom (Enzimas )

Los procesos de obtencin son Aerobios.

La formacin ocurre principalmente en organismos sometidos a imitaciones o crecidos en medios degficientes.

Qu se pretende lograr una regulacin anormal del metabolismo tal que C y Energa se derive hacia la formacin de producto.

Ejemploi Obtencin de Lisina:

Cepas corinebacterium glutamicum carentes de Homoserina deshidrogenasa. De este modo son trfos para metionina y ticonina (fig 13 )

Enzima deshidroxipicolinato sintetasa no es inhibida por lisina

Lisina treonina ejercen inhibicin concertada sobre la Aspartatoquinasa. No se acumular Lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre.

ESTRATEGIAS PARA LA OBTENCIN DE PRODUCTOS II : LISINA

Cultivar en concentraciones mnimas de treonina libre Alimentar el cultivo con treonina y mantener su concentracin a valores muy pequeas. Se evita la inhibicin concertada. La Lisina no ejerceretoinhibicin sobre la dihidroxipicolinato sintetasa y se acumula en el medio de cultivo.

Es pues importante el conocimiento del metabolismo y su regulavcin en la relacin de mutantes apropiados

2 la eleccin de una tcnica de cultivo adevcuada en la produccin.

No existe una relacin directa entre la generacin de energa y la sntesis de producto.

En Lisina, por mol se forman 4 de NADH y se consume uno de ATP por lo que la formacin de Lisina est asociada en una formacin neta de ATP si se tiene en cuenta el poder reductor acumulado.

CINTICA DE FORMACIN DE PRODUCTOS II

Es mas compleja

No existe ninguna expresin simple que abarquew a todos

Pods y Kossen han propuesto la sgte ec.

(5)

Posee gran flexibilidad, E puede tomar cualquier valor > 0 lo cual permite ajustar

distintas relaciones entre qp y U

Ejemplo.

Si E = 1 la relacin entre q p y u es directa

Si E= 100 se tiene que q p alcanza valores cercanos al mximo aun a valores pequeas de u/ um

En general y cualquiera sea el producto se trata siempre de encontrar que tipo de

relacin existe entre q p y u ya que ste es uno de los factores a tener encuenta en

el momento de planear la estrategia de produccin.

III LA FORMACIN DE PRODUCTOS DEL METABOLISMO SECUNDARIO

Ejemplos : Antibiticos , toxinas , alcaloides , gliberelinas

Son indispensables para las funciones vitales del mo

Histricamente consideradas como no indispensables aumque tal afirmacin se encuentra en revisin

Sus caractersticas

1.- Sus precursores especficos para su biosntesis son obtenidos por modificaciones

del metabolitos primarios.

Por ejemplo Antibiticos contienen aminocidos infrecuentes

D- Aminocidos

N- Metil aminocidos.

B - aminocidos o iminocidos

Azcares modificados en forma de dimetil

2.- Estos precursores suelen ser limitantes de la biosntesis

por ejemplo:

Adicin de Ac fenilactico estimula la produccin de Bencilpenicilina

Los cidos alfa aminobutrico y y alfa y gama diaminobutrico son limitantes de la biosntesis de colistina

En estos casos la supresin de los mecanismos de regulacin de la sntesis de precursores puede resultar en un incremento en la produccin

3.- Algunas Enzimas no poseen alta especificidad por el sustrato

por ejemplo La Penicilina acil tranferasa del Penicillium chrysogenum que cataliza el intecambio del resto alfa aminoadipit de la penicilina N ( aminoadipit penicilina )por restos cidos hidrofobios (fig 14)

La enzima es especfica para uno de los sustratos, el cido 6 amino penicilmico, mientras que es relativamente inestable para el precursor de la cadena lateral, el cual debe posee el grupo CH2 COOH terminal para ser incorporado.

4.- La mayoria de productos se forman cuando los microorganismos crecen bajo valores de U.

Causa probable: el fenmeno de REPRESIN CATABLICA por el cual estaria reprimida la biosntesis de las enzimas asociadas al metabolismo secundario cuando el crecimiento ocurre a valores u altos, mientras que se desreprimira a valores u bajos.

DURANTE AOS SE UTILIZ lactosa como fuente carbonada para la obtencin de penicilina porque daba mejores rendimientos que la glucosa. La diferencia radicaba en que la lactosa era metabolizada lentamente por el hongo y la lactosa rapidamente.

En la actualidad se emplea glucosa como fuente carbonada pero suministrndola lentamente al cultivo a fin de regular u valores compatibles con la sntesis de penicilina.

4 .- El cultivo continuo y batch alimentado son sistemas de cultivo que permiten regular la velocidad de crecimiento y por tanto muy apropiadas para obtener este tipo de productos.

6.- Los productos de ste grupo comparten la necesidad de un adecuado suministro de 02 para su formacin. Cuando ste requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen

fig 14 Distintas penicilinas que pueden obtenerse en funcin del precursor de la cadena lateral

penicilina acil tranferasa

OPTIMIZACION

Tradicionalmente, las fermentaciones industriales se conducen manteniendo las variables de accin constante. Sus valores son a menudo determinados a partir de criterios biolgicos buscando la MAYOR PRODUCTIVIDAD la mas alta concentracin la ms rpidamente posible. con el menor riesgo de contaminacin

Se puede considerar variar la temperatura con objeto de mejorar los resultados

Esto es lo que permite aplicar tcnicas de OPTIMIZACION

Una fermentacin como toda OPERACIN INDUSTRIAL est sujeta a la nocin de indice de comportamiento en el cual se considera en particular:

Tiempo de operacin

La produccin por

Consumo de energa

Materias primas.

Rendimiento . por

EL CRITERIO DE OPTIMIZACION

El criterio segn el cual se debe hacer la optimizacin puede ser de tres clases

Obtener la MXIMA CONCENTRACIN DE PRODUCTOS: Biomasa Microbiana, Metabolitos

Lograr el TIEMPO MINIMO DE FERMENTACIN

LOGRAR EL COSTO MINIMO DE OPERACIN

Los dos primeros criterios implican: La definicin de las condiciones con el mejor perfil en las curvas de crecimiento y de produccin

TCNICAS DE OPTIMIZACION En Microbiologia, algunas veces se aplican:

a.- LAS TCNICAS DE OPTIMIZACION ESTATICA ( mtodo de programacin lineal y no lineal )

por ejemplo para optimizar la composicin de un medio de cultivo estas tcnicas no permiten resolver en la mejor forma todos los problemas.

b.- LOS , METODOS DE OPTIMIZACION DINAMICA, mejor adaptadores al modelo matemtico del sistema de optimizacin consiste en llevar al mximo una funcionabilidad de comportamiento.

J =

51

Lo que vuelve a encontrar una ley de variacin del VECTOR DE VARIABLES DE ACCION U (t) para que sean capaces de hacer pasar X y P de un estado inicial a un estado final ptimo Xf y Pf siguiendo el perfil dado por las ecuaciones del modelo matemtico del procedimiento.

El ordenamiento ptimo por cumplir debe considerar las condiciones impuestas en especial por la fisiologa Microbiana. Pero tambien por los aspectos fsico qumicos del proceso. As el provceso microbiano no se puede llevar a cabo sino dentro de lmites muy estrechops de los valores de la temperaytura de pH por citar algn ejm:.

El MODELO MATEMTICO EN GENERAL NO SE presenta en forma explcita pero est constituido por un sistema de ecuaciones diferencialeas no lineales.

Por esto la definicin del ordenamiento optimo requiere de tcnicas numricas.

Entre estos metodos de optimizacibn Dinmica es aplicado en mayor frecuencia en fermentacin es :

PRODUCTIVIDAD ( GRAMOS DE biomasa producida por litro de medio y por hora )

Es con frecuencia el criterio que se mantiene para evaluacin de un procedimiento de fermentacin.Es ello lo que servir para determinar las dimensiones de una instalacin para fermentacin

EVALUACIN DE LA PRODUCTIVIDAD

En el caso de procesos discontinuos se debe tener en cuenta:

1. El tiempo necesario para hacer la limpieza del fermentador t v (ensayo precedente )2. El tiempo de lavado T N3. El tiempo de llenado t r para el ensayo que se va a efectuar4. La Esterilizacin5. El tiempo en que el ensayo se detiene . t m

Se puede tambin definir la PRODUCTIVIDAD MXIMA , Uniendo

Fig 4,4 ) el origen en el punto tm , Xm

Pm = Xm

Tm

Si suponemos que el detener el ensayo al cabo del tiempo Tm , la concentraciones celular no ha alcanzado su valor mximo Resulta una prdida de substrato no metabolizado ( Disminucin del Rendimiento )

LA PRODUCTIVIDAD TOTAL SE EXPRESA POR:

Pt = Xf

Tm