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PATOLOGA MOLECULAR Y CITOLOGA. APLICACIONES DEL FISH EN LA CITOLOGIA NO GINECOLOGICA Mara Dolores Lozano Departamento de Anatoma Patolgica. Clnica Universitaria. Universidad de Navarra. Pamplona.

En los albores del siglo XXI, parece claro que existe una creciente demanda de obtener ms informacin de menor muestra, lo cual abre la puerta a la aplicacin de nuevos mtodos en el estudio del material citolgico. Las aplicaciones del FISH, PCR,microchips, arrays, etc., van avanzando como avanzan los conocimientos genticas de las enfermedades. Los citopatlogos no estn al margen de estos avances, puesto que se nos pide ms con menor muestra. Hoy da, la integracin entre patologa quirrgica y citopatologa es algo inevitable. Aunque todava existen patlogos escpticos, el auge en la demanda de la citologa y la ampliacin de la esfera de influencia de las dos subespecialidades han ido gradualmente borrando la barrera que separa la patolologa quirrgica de la citopatologa. De entre las muchas aplicaciones de tcnica moleculares a la citologa, en eesta charla se expondr preferentemente las aplicaciones del FISH a la citologa no ginecolgica.

El FISH es una tcnica de citogentica molecular, que utiliza un ADN sonda marcado con fluorescencia, con el fin de localizar una secuencia complementaria en el ADN de la muestra de inters. Es una tcnica muy sensible y especfica, que permite analizar metafases y clulas en interfase. Existen varios tipos de sondas para FISH, cada una con una funcin especfica segn lo que se desea detectar (figuras 1 y 2).

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Fig. 1

Fig. 2 Las principales aplicaciones del FISH son: - Deteccin de alteraciones numricas y estructurales. - Deteccin de cromosomas marcadores. - Seguimiento de un seguimiento de trasplante. - Cuantificacin de las clulas alteradas.

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Fig. 3

Fig. 4 En las figuras 3 y 4 se muestran ejemplos de estas aplicaciones. El FISH, como cualquier otra tcnica tiene una serie de ventajas y tambin limitaciones. Las principales ventajas del FISH son las siguientes: - Puede ser realizado en metafases con ncleos en interfase. - Permite el uso de material congelado, material incluido en parafina y material citolgico. - Es una tcnica rpida. - Tiene gran sensibilidad y especificidad. Las limitaciones ms importantes del FISH son stas: - Es una tcnica de sreening. - Es necesario conocer lo que buscamos.

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El coste econmico en ocasiones puede ser elevado. No se pueden detectar muchas alteraciones al mismo tiempo (5 fluorocromos).

Adems de las claras aplicaciones del FISH a la citologa no ginecolgica, existen tambin aplicaciones definidas a la citologa no ginecolgica, algunas de ellas estn siendo establecidas. Sin embargo es frecuente encontrar en la literatura artculos recientes que comunican aplicaciones diversas del FISH a distintas muestras citolgicas. Las aplicaciones ms frecuentes se resumen en la Fig. 5.

Fig. 5 Diagnstico prenatal Hoy el da el FISH se utiliza para el diagnstico prenatal de numerosas alteraciones. En el mbito de la citologa del FISH puede realizarse en clulas de lquido amnitico y este estudio es relativamente frecuente para la deteccin del sndrome de Down (Fig. 6).

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Fig. 6 Determinacin del estado del gen HER-2-Neu en carcinomas de mama Varias referencias en la literatura ratifican la utilidad del FISH para el anlisis del gen Cerb-B2-Neu y del cromosoma 17, tanto en muestras de puncin aspiracin de tumores de mama, como en muestras de lavado ductal y de secrecin por pezn (Fig. 7).

Fig. 7 Diagnstico del carcinoma de urotelio y recidivas (UROVISION FISH TEST) Existe un porcentaje no muy alto pero no despreciable de falsos negativos en la citologa de orina en cuanto al diagnstico de tumores de urotelio. Por otro lado la cistoscopia que sera recomendable, es un procedimiento invasivo. La medicina actual busca mtodos ms sensible, menos invasivos e

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idealmente cuantitativos, para la deteccin de tumores. Por otro lado es conocido que la sobreexpresin de cromosoma 7, 9, 11 y 17, se relaciona con la agresividad tumoral y la fase de invasin de los tumores de urotelio. Las monosomas del cromosoma no estn relacionadas con la recidiva, por lo tanto est condicionado al desarrollo de sondas para FISH en muestras de orina. El test de Urovision (Vysis/ABBOTT) detecta aneuploidias en los cromosomas 3, 7 y 17, y prdidas del 9p21. Para ello utiliza sondas centromricas especficas para los cromosomas 3,7 y 17 y sonda locus especfica para el 9p21/p16. Una de las aplicaciones ms importantes y con mejores de resultados de este test se obtiene en citologa liquida (ThinPrep). (figuras 8 y 9).

Fig. 8

Fig. 9

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Es importante a la hora de la aplicacin de esta tcnica a muestras citolgicas la calidad del material, puesto que sta es uno de los factores ms importantes que afectan a la eficiencia de la hibridacin y la intensidad de la reaccin. La densidad celular no debe ser demasiado alta y las clulas deben estar distribuidas de manera homognea en todo el porta. De ah el valor de la citologa en medio lquido que permite una fijacin adecuada del material y la posibilidad del fondo limpio (Fig. 10).

Fig. 10

Otras aplicaciones: deteccin de carcinoma de pulmn en lavados bronquiales Existen referencias en la literatura de la aplicacin de sondas centromricas para el cromosoma 1 y sondas de secuencia nica frente a los locus 5c15, 8q24 (c-myc) y 7p12 (EGFR), aplicadas a clulas de lavado bronquial. Bsicamente estos trabajos muestran una mayor sensibilidad del FISH a la hora de detectar clulas tumorales y proponen esta tcnica como tcnica complementaria al estudio citolgico del lavado bronquial. Nosotros en el marco de dos proyectos internacionales, uno de ellos un proyecto financiado por la Unin Europea, (EU.ELGDG PORYECT), y otro proyecto internacional (I-ELCAP) de deteccin precoz del cncer de pulmn, estamos aplicando tcnicas de FISH en lavados bronquiales de estos pacientes. (Fig. 11)

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Fig. 11

Las figuras 13 y 14 muestran dos ejemplos de dos de estos pacientes. Adems estamos involucrados en el desarrollo de biomarcadores para la deteccin precoz del carcinoma de pulmn, lo cual siempre debe basarse en muestras de fcil obtencin como el esputo y el lavado bronquial.

Fig. 12

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Fig. 13

Algunos autores (Mao et al, 1954, Liloglou et al, 2001), han demostrado alteraciones de microsatlites y de oncogones tales como k-rash-153 en esputos de pacientes con estadios iniciales de cncer de pulmn. Por otro lado Palmisano y colaboradores, en el ao 2000, han demostrado una metilacin aberrante del promotor de c-16 en DNA aislado de muestras de esputo de pacientes con carcinoma escamoso tres aos antes del diagnstico clnico del tumor. En este sentido, estamos estudiando genes localizados en el brazo corto del cromosoma 3, que aparecen alterados en el cncer de pulmn (Fig. 14).

Fig. 14

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Adems, otro de los objetivos de estos proyectos es la bsqueda de biomarcadores especficos del tumor y correlacionarlo adems con las muestras tisulares. (Fig. 15).

Fig. 15

Puesto que ninguno de los biomarcadores actualmente en uso en la deteccin precoz del cncer de pulmn ha sido validado, I-ELCAP y otros proyectos son grandes oportunidades para hacer estudios de la hibridacin de biomarcadores con costos razonables. Todo esto nos lleva en primer lugar a estudiar alteraciones moleculares que se producen durante la carcinognesis de cara a identificar y buscar nuevos marcadores. En segundo lugar debemos definir la utilidad diagnstica de estas alteraciones moleculares y su deteccin en muestras de fcil extensin, como pueden ser sangre perifrica, esputo y/o lavados bronquiales. Por ltimo, todo esto conlleva un desarrollo tecnolgico adecuado para que estas alteraciones en biomarcadores puedan ser puestas de manifiesto. Como es sabido en estas tcnicas influyen multitud de factores. Las figuras 16, 17, 18, 19, 20 y 21 muestran diversos ejemplos en los que en ocasiones la tcnica ha sido realizada con xito

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Fig. 16

Fig. 17

Fig. 18

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Fig. 19

Fig. 20

Fig. 21

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y en otras no, debido a alteraciones en la fijacin, fondo, etc. (figuras 22 y 23).

Fig. 22

Fig. 23 Un paso ms en nuestra investigacin es el desarrollo de la tcnica de FICTION que permite el anlisis simultneo de la citomorfologa inmunofenotipo en balances cromosmicos (Fig. 24).

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Fig. 24 Adems de todas estas aplicaciones, dia a da aparecen en la literatura otras nuevas, como son la utilidad del FISH en lquidos pleurales y peritoneales de cara a la deteccin de clulas tumorales, su utilidad para el estudio de sarcomas y otras muchas alteraciones, como el ejemplo el esfago de Barrett. La citologa es capaz de aprovechar todas las tcnicas complementarias que se aplican al material de biopsia.