CITOMETRIA DE FLUJO

Inmunologia – Curso 2008

Citometría de Flujo

SISTEMA FLUÍDICO

COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO

SISTEMA ELECTRÓNICO

Citometría de Flujo

PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS • El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o

FSC)

• La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)

• Intensidades relativas de emisión de fluorescencia

( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)

Citometría de Flujo

FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA - SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER

SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA -SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD -SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER

Citometría de Flujo

MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES

•Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantes fluorescentes.

•Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie.

•Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia.

•Control positivo: células normales, células de líneas celulares.

Citometría de Flujo

Fluorocromos utilizados

Citometría de Flujo

FL1

FL2

FL3FL4

ANALISIS DE DATOS

Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:

1) Histograma

Eventos medidos

FLUORESCENCIA

Citometría de Flujo

HISTOGRAMA

Intensidad de fluorescencia y sitios de unión

Intensidad de fluorescencia FITC

Número de eventos

FITC

FITC

FITC

FITCFITC

FITC

FITC

FITC

FITC FITC

Citometría de Flujo

Citometría de Flujo

Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras:

2) Dot-plot

Linfocitos

Monocitos

Analisis de datos

Granulocitos

CD3- CD4 en sangre total CD3 – CD4 en gate de linfocitos

Elijo un gate:

Ej. linfocitos

Expresión de Resultados

• Datos porcentuales• Datos absolutos : Partículas de cuantificación• Datos estadísticos

Quadrant Statistics

File: Normal01.05 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: CD3/CD8 Panel: IMK-Lymphocyte

Acquisition Date: 15-Jun-95 Gate: G1

Gated Events: 2383 Total Events: 6000

X Parameter: FL1-H CD3 (Log) Y Parameter: FL2-H CD8 (Log)

Quad Location: 17, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean

UL 126 5.29 2.10 4.51 4.12 324.82 171.35

UR 508 21.32 8.47 268.00 249.17 2472.09 1624.51

LL 420 17.62 7.00 3.92 3.50 3.13 2.53

LR 1329 55.77 22.15 306.66 289.43 1.50 1.28

Citometría de Flujo

Separación de células usando citometría de flujo(Cell sorting)

-El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células-Se puede realizar en condiciones de esterilidad.

Citometría de Flujo

Determinación de citoquinas intracelulares por citometría

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO

TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO

TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO

ANEXINA V

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO

IODURO DE PROPIDIO

PROLIFERACION CELULAR: CFSE

- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)

- Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se

reparte por igual entre las células hijas

CFSE

XX

Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula

X / 2X / 2 X / 4X / 4

Después del Después del cultivocultivo

BasalBasal

M1

Cytometric bead arrays (CBA)

Tonos de un color

Ac. unidos a beads, emitiendo a distintas intesidades de FL3

Varios analitos

Ac conjugados con PE (emitiendo en FL2), proporcionales a la conc del analito.

Multiplex ensayo por CFCitoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría

10 10 10 10 100 1 2 3 4

muestra.005FL2-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

muestra.001FL2-Height ->

IL-6

IL-10

MCP-1

IFN-g

TNF-a

IL-12

CBA para citoquinas inflamatorias

PBS CBEFL-3

FL-2 FL-2

FL-3

FL-2: Da cuenta de la concentración de la citoquina.

FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas.

Citoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría