Citometria de flujo. linfomas y leucemias
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Unidad mixta
CSIC/UAH
APLICACIONES CLÍNICAS DE
LA CITOMETRÍA DE FLUJOAlfredo Prieto Martín
Profesor Contratado Doctor de InmunologíaCoordinador del programa de doctorado en
Inmunología
MENCIÓN DE CALIDAD MECD
Universidad de Alcalá
http://www.alfredoprieto.tk
www2.uah.es/problembasedlearning
Objetivos
1. Recapitular y reforzar lo que habeis aprendido sobre fundamentos y aplicaciones de la citometría de flujo.
2. Conocer las distintas técnicas de citometria de flujo con aplicación diagnóstica o terapéutica
Plan de la exposición
1. Generalidades de la Citometría y su utilidad clínica 1-102. CDs y estudio de la heterogeneidad celular 11-163. Inmunofenotipo de superficie 17-384. Marcaje intracelular 395. Ciclo celular 45
1. Cantidad de DNA 462. Historial de divisiones 52
6. Estudio de apoptosis 557. Uso de micropartículas 708. Anticuerpos biespecíficos y microbeads biespecíficas78
¿Qué es la citometría de flujo?¿Qué es la citometría de flujo?
FSC
90º90º2- 4º
Columna de muestra
Meeting pointMeeting pointLáserLáser
Detecto
res de lu
z
Detecto
res de lu
z
AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización
RepresentaciónRepresentación y Análisis y Análisis
FlujoFlujo
Permite identificar células, contarlas y caracterizarlas
Uso clínico de los citómetros
Células
CitómetroInformación Numérica(analizador)
Células purificadas(separador)
Decisión diagnóstica o terapéutica
Transfusión celular
1. Citometría como herramienta de utilidad clínica
• Metodología en la que se basan decisiones diagnósticas y terapéuticas
• La citometría de flujo posibilita: 1. La diagnosis de leucemias y linfomas mediante
detección de células con fenotipos aberrantes 2. El seguimiento de marcadores pronósticos como las
cuentas de linfocitos CD4 en pacientes con infección por HIV
3. La determinación de la eficacia de tratamientos antitumorales e inmunosupresores
PROBLEMAS CLÍNICOS ABORDABLES MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO
• Estudio de la heterogeneidad de las células sanguíneas o de otros tejidos– Neoplasia, – inmunodeficiencias congénitas y adquiridas– Monitorización del efecto de terapia inmunosupresora en
pacientes trasplantados • Estudio de la ploidia y proliferación celular• Estudio de la apoptosis• Cuantificación de concentraciones de moléculas
solubles• Purificación de células antígeno-específicas
Comparación con otras metodologías de análisis clínicos en células
Citometría de imagen
Citometría de flujo
Bioquímica
Unidad de la que extrae
información
Célula Célula Muestra
Localización en la célula(s)
Si No “Si” fraccionando
Velocidad baja alta alta
Tipo de información
Cualitativa Cuantitativa Cuantitativa
Medida de fluorescencia en células individuales por citometría de flujo
Propiedades Ventajas
Es específica de color Permite estudio multiparamétrico simultáneo
Es cuantitativa con un amplio rango de medida
Altísima sensibilidad1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel)
Alta
velocidad
Mide en cantidades elevadas de células
Obtener conclusiones estadísticamente fidedignas objetivas y reproducibles
Evolución instrumentación
• Análisis multiparamétrico – FACScan 3 colores 1986– FACSaria 12 colores 2003
• Soporte informático tecnología se abarata
1961 1981 2001
IBM IBM PC Clónico de sobremesa
4.000.000 $ 4000 $ 800 $
Nomenclatura:Cluster Designation Numbers
• Tecnología de monoclonales permitió obtener Tecnología de monoclonales permitió obtener anticuerpos frente a antígenos leucocitarios.anticuerpos frente a antígenos leucocitarios.
• Mismo antígeno reconocido por distintos Mismo antígeno reconocido por distintos anticuerpos monoclonales con distintos nombres.anticuerpos monoclonales con distintos nombres.
• Sinonimias generaban una nomenclatura caótica Sinonimias generaban una nomenclatura caótica que causaba jaquecas a los inmunólogos.que causaba jaquecas a los inmunólogos.
• Se decidió crear una nomenclatura internacional Se decidió crear una nomenclatura internacional para los antígenos de superficie linfocitarios.para los antígenos de superficie linfocitarios.
• Se asigna un CD a cada antígeno que incluye a Se asigna un CD a cada antígeno que incluye a todos los anticuerpos que lo reconocen. todos los anticuerpos que lo reconocen.
CD19CD19
CD3CD3
CD56CD56
CD4CD4 CD8CD8
CD2CD2
CD45
CD14
CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO
CD15
NeuNeuMonoMonoBBNKNKT4T4 T8T8
Estudio de la heterogeneidad celularEstudio de la heterogeneidad celular
Criterios de caracterización Criterios de caracterización de los tipos celularesde los tipos celulares
• CelularesCelulares– Morfología al microscopio.Morfología al microscopio.
• MolecularesMoleculares– GenotípicoGenotípico. (Genoma) Recombinaciones somáticas.. (Genoma) Recombinaciones somáticas.– Fenotípico (Proteoma) Fenotípico (Proteoma) RNARNA expresado, expresado, proteínas. proteínas.
Antígenos de diferenciación leucocitariaAntígenos de diferenciación leucocitaria Los antígenos de superficie pueden ser utilizados Los antígenos de superficie pueden ser utilizados
como como marcadores moleculares específicosmarcadores moleculares específicos de de líneas, tipos y subtipos celulares.líneas, tipos y subtipos celulares.
Para estudiar la heterogeneidad Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias técnicas:celular son necesarias técnicas:
• 1. Con resolución a nivel de célula individual. 1. Con resolución a nivel de célula individual.
• 2. Que caractericen la célula en función de varias 2. Que caractericen la célula en función de varias
características (parámetros). V, W, X, Y, Z.características (parámetros). V, W, X, Y, Z.
• 3. Capaces de realizar medidas en números representativos 3. Capaces de realizar medidas en números representativos
de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%.de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%.
• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y
reducir toda esa información sobre células individuales en reducir toda esa información sobre células individuales en
conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares.conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares.
1) Discriminación por FSC-SSC
2) Marcaje celular con anticuerpos
monoclonales
HETEROGENEIDAD CELULARDE LAS CELULAS SANGUINEAS
R1
Granulocitos
Linfocitos
Monocitos
1) DISCRIMINACIÓN POR FSC-SSC
0 256 512 768 1024
4C5144001 FSC-Height ->
GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+
MonocitosMonocitosCD14+CD14+
LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+
CD4+CD4+CD8+CD8+
CD56+CD56+CD19+CD19+
CD5+CD5+CD5-CD5-
Morfología y antígenos de diferenciación en el Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celularanálisis de la heterogeneidad celular
3. Marcaje Superficial
4. Marcaje Intracelular
Marcaje de antígenos por inmunofluorescencia
3. MARCAJE SUPERFICIAL
Estudio monoparamétrico
FICT
CD3
T
PE
CD56
NK
PerCP
CD19
B
Estudio multiparamétrico
Doblesnegativos
Simplespositivos
Doblespositivos
Triplespositivos
Fenotipos posibles
Representación de la información
- Caracterización fenotípica: CD3, CD56, CD19
- Diferenciación celular: CD95, CD45RA, CD45RO
- Coestimulación: CD28, ICOS, CTLA-4
- Recirculación: CD62L, CLA, 47
- Activación celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71
¿De que nos informan los estudios inmunfenotípicos?
Aplicación clínica del marcaje inmunofluorescente: diagnóstico de
leucemias y linfomas1. Identificar la población leucémica.
2. Describir su fenotipo, cada leucemia tiene un patrón
de expresión característico.
3. Interpretar estos hallazgos en el contexto de la
morfología para diagnosticar y clasificar la leucemia.
- Leucemia Mieloide MPO: CD33, CD14, CD15- Leucemias Linfoides:
- T: CD3, TRC- B: CD79a, Ig, CD22
- BI proB: CD79a, CD22, CD19- BII: CD10- BIII: preB- BIV B: sIg
Clasificación diagnóstica de las leucemias
El aumento de expresión de CD38 en pacientes
con Leucemia Linfática Crónica de células B
(LLC-B) es signo de un mal pronóstico de
evolución de la enfermedad
Expression de Zap 70 correlaciona con CD38
Clasificación pronóstica de los síndromes linfoproliferativos
-Reaparición de células leucémicas tras trasplante
de médula ósea. Detección de EMR
-Reaparición de células cancerígenas en sangre
periférica después de un tratamiento
anticancerígeno. Cáncer de mama.
Monitorización del tratamiento
Tipos de leucemias linfoides
Síndromes linfoproliferativos de células B maduras
Clasificación de línfomas B
Leucemias agudas B y T
CD4 T cellsCD4 T cells
CD 8 CD 8 T CellsT Cells
Cuantificación del número de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV
Seguimiento de HIV recuento de linfocitos CD4
Otras aplicaciones clínicas del inmunofenotipo de superficie
• Identificación de pacientes sépticos con alto riesgo de mortalidad por sus niveles aumentados de CD69 y CD62L.
• Actividad de la enfermedad y predicción de la eficacia terapéutica en pacientes con Lupus Eritematoso Sistémico – Aumento porcentaje CD19+, CD27high+/CD20- aumento cuentas
CD19+ CD27high+/CD20-– Disminución porcentaje CD27-/CD20+CD19– Arthritis & Rheumatism 48:1332-1342, (2003)
Porcentaje y cifras de linfocitos T CD69+ en pacientes con sepsis de alto riesgo
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD
3+C
D69
+ (%
)
0
10
20
30
40
p<0.05
p<0.05
p<0.05vs
p<0.05vs
‡
† ‡
*
*
*
*
**
CONTROLES
SEPSIS NO SOBREVIVENSEPSIS SOBREVIVENIAM NO SOBREVIVENIAM SOBREVIVEN
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD
3+C
D69
+ (N
º/ l
)
0
50
100
150
200
250
300
p<0.05
p<0.05vs
p<0.05vs
p<0.05vs
†
*
*
*
* ‡
CONTROLES
SEPSIS NO SOBREVIVENSEPSIS SOBREVIVENIAM NO SOBREVIVENIAM SOBREVIVEN
†
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD
19+C
D23
+ (%
)
0
20
40
60
80
100
120
p<0.05 †
*
*
*
*
*
CONTROLES
SEPSIS NO SOBREVIVENSEPSIS SOBREVIVENIAM NO SOBREVIVENIAM SOBREVIVEN
††
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD
19+C
D23
+ (N
º/ l
)
0
100
200
300
400
p<0.05
p<0.05vs
*
**
CONTROLES
SEPSIS NO SOBREVIVENSEPSIS SOBREVIVENIAM NO SOBREVIVENIAM SOBREVIVEN
†
Porcentaje y cifras de linfocitos B CD23+ en pacientes con sepsis de alto riesgo
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD
3+
CD
8+
CD
62
L+
(N
º/ l
)
0
100
200
300
400
500
p<0.05
p<0.05
p<0.05vs
§p<0.05vs
†‡*
*
**
*
CONTROLES
SEPSIS NO SOBREVIVENSEPSIS SOBREVIVENIAM NO SOBREVIVENIAM SOBREVIVEN
†*
Porcentaje y cifras de linfocitos T CD8+ CD62L+ en pacientes con sepsis de alto riesgo
Expresión de CD38 y riesgo en LLC-B
Stage group
% o
f C
D19
+C
D38
+ c
ells
0
20
40
60
80
100
StableSm
ProgressiveSm
A non Sm
B & C
EscasaHipermutaciónPregerminalesZAP-70+Mal pronóstico
HipermutaciónelevadaPosgerminalesZAP-70-
Buen pronóstico
Marcaje
superficial
Fijación
Permeabilización
Marcaje
intracelular
4. MARCAJE INTRACELULAR
0.22%
33.8%
PRODUCCION DE IL-6 POR LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
R1
EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)
R1
R1= MONOCITOS
CONTROL
0.1%
CONTROL NEGATIVO (GATE R1)
PACIENTE SHOCK SEPTICO
R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)
PE
0.3%
PE
- Detección de linfocitos CD4 productores de IL-4 y
células plasmáticas secretoras de IGE en síndrome
hipereosinofílico.
-Producción descontrolada de citocinas en pacientes
sépticos de alto riesgo.
APLICACIONES DEL MARCAJE INTRACELULAR
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD3+
CD8+
CD45
RO+
IL-2
+ (%
)
0
10
20
30
40
50
60
*
*
* ††p<0.05
*
CONTROLES
SEPSIS SOBREVIVEN
IAM SOBREVIVEN
SEPSIS NO SOBREVIVEN
IAM NO SOBREVIVEN
B
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD3+
CD8+
IL-6
+ (%
)
0
10
20
30
40
†
‡
‡*
* †p<0.05
CONTROLES
SEPSIS SOBREVIVEN
IAM SOBREVIVEN
SEPSIS NO SOBREVIVEN
IAM NO SOBREVIVEN
B
CONTROL SEPSIS IAM
T=0 T=0 T=3 T=7 T=14 T=28 T=0 T=1 T=28
CD3+
CD8+
IL-4
+ (%
)
0
5
10
15
20
25
30
†
†*p<0.05
*
CONTROLES
SEPSIS SOBREVIVEN
IAM SOBREVIVEN
SEPSIS NO SOBREVIVEN
IAM NO SOBREVIVEN
B
Producción aumentada de citocinas en linfocitos CD8 de pacientes con sepsis
de alto riesgo
Detección de la quinasa ZAP-70
• Marcaje intracelular.
• Su expresión correlaciona con mala prognosis de los pacientes con LLC-B.
5.1 Estudio de la cantidad de DNA en células
individuales
5.2 Historial de divisiones de células marcadas
5 . ESTUDIO DEL CICLO CELULAR
Ciclo celular
Fase Cantidad DNA
G0/G1 2n
S 2n-4n
G2/M 4n
CANTIDAD DE DNAEN RELACIÓN CON LA FASE
DEL CICLO
PI
Fijación
Permeabilización
MARCAJE FLUORESCENTE DE DNA EN CÉLULAS INDIVIDUALES
M1
M2M3
G0/G1
SG2/M
2n2n 4n4n
RESULTADO DE LA MEDIDA RESULTADO DE LA MEDIDA DE DNA EN POBLACIONES DE DE DNA EN POBLACIONES DE
CÉLULAS CÉLULAS
Aneuploidías en células tumorales
Hiperplasia y lesión celularHiperplasia y lesión celular
- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)
- Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y
que se reparte por igual entre las células hijas
5.2 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
CFSE
XX
Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula
X / 2X / 2 X / 4X / 4
MONITORIZACIÓN DEL HISTORIAL DE DIVISIONES CON CFSE
Sin dividir
Tras una división Tras dos divisiones
ESTUDIO DE ALORREACTIVIDAD EN TRASPLANTE CON CSFE
No proliferantesProliferantesalorreactivas
ESTUDIO DE LA APOPTOSIS
Apoptosis correlaciona con grado de Apoptosis correlaciona con grado de
actividad de enfermedades autoinmunesactividad de enfermedades autoinmunes
Utilidad pronostica en evaluación y Utilidad pronostica en evaluación y
predicción de respuesta a tratamiento con predicción de respuesta a tratamiento con
IFNIFN en pacientes con esclerosis en pacientes con esclerosis
múltiplemúltiple
-La apoptosis es un modo de muerte celular
activo y fisiológico en el que la célula ejecuta
el programa de su propia muerte
- Deben existir señales que induzcan la
apoptosis
APOPTOSIS
- La apoptosis es un modo de muerte celular
activo y fisiológico en el que la célula ejecuta
el programa de su propia muerte.
- La necrosis es una muerte accidental debida
a un estrés: choque térmico, hipotónico, pH...
- Los métodos deben distinguirlas
APOPTOSIS vs. NECROSIS
APOPTOSIS vs. NECROSIS
Temprana
Apoptosis NecrosisProgramada genéticamente Accidental
Se mantiene Se pierde
Disminuye Aumenta
Se preservan Se desintegran
Condensación de la cromatina Tardía
Fragmentación del DNA
Tardía en fragmentos grandes
. En cuerpos apoptóticos rodeados por membrana
Son reconocidos y fagocitados
Los contenidos de los orgánulos
se liberan Inducen
inflamación local
Integridad de membrana
Tamaño celular
Orgánulos
Temprana en fragmentos
oligonucleosomalesFragmentación celular
Restos celulares
Mecanismo
Diferencias entre apoptosis y necrosis.
Activación decaspasas
Pérdida de laasimetría de la membrana
Pérdida de laintegridad demembrana /FragmentaciónDNA
Fragmentaciónen cuerposapoptóticos
DIAGRAMA DE LA CINETICADE LA APOPTOSIS
Sustratos Sustratos de de
caspasascaspasas
Unión de Unión de anexina Vanexina V
Extracción Extracción LMW LMW DNADNA
TUNELTUNEL
Sondas Sondas catiónicascatiónicas
Marcaje de Marcaje de fragmentosfragmentos
Sustratos de caspasas
• Se vuelven fluorescentes al ser hidrolizados por ellas
• FLICA
Permeabilidad sondas catiónicas
• No distingue entre células apoptoticas y necróticas
• Hay que combinarla con un método específico
- Translocación de la PS durante la apoptosis
- La translocación es universal y específica
- Anexina V reconoce específicamente PS
- Combinación con sondas vitales (7AAD)
CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA: AUMENTO DE PS
Viables
Necróticas
Apoptóticastempranas
Apoptóticastardías
CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA: AUMENTO DE PS
(En combinación con una sonda vital)
CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN LIPÍDICA: AUMENTO DE PS
Ventajas: - Detecta fase temprana de la apoptosis - Se puede combinar con marcaje con
anticuerpos monoclonales. - Discrimina necróticas
Desventajas: - No es específico en determinadas condiciones
EXTRACCIÓN DE DNA DEBAJO PESO MOLECULAR
Diploide (2n)
Viables
Hipodiploide (<2n)
Apoptóticas
PI
EXTRACCIÓN DE DNA DEBAJO PESO MOLECULAR
M1
M2
M1
M2
MEDIO CHX
EXTRACCIÓN DE DNA DEBAJO PESO MOLECULAR
Ventajas: - Simple y barato - Permite estudio de ciclo celular
Desventajas: - Detecta apoptosis intermedia y tardía - Puede generar artefactos - No discrimina necróticas
EXTRACCIÓN DE DNA DEBAJO PESO MOLECULAR
Marcaje de los fragmentos 3’OH con nucleósidos
marcados mediante la transferasa terminal de
deoxinucleótidos (TdT)
TUNEL
V) TUNEL
Ventajas: -Permite estudio simultáneo de ciclo celular-Puede combinarse con marcaje antigénico
Desventajas: - Detecta apoptosis intermedia y tardía - No discrimina necróticas
V) TUNEL
6. Uso de micropartículas1. Referencia para enumeración celular.
2. Referencia para cuantificación de la expresión
antigénica en células individuales.
3. Detección de moléculas solubles
1. Distintas esferas utilizables simultáneamente
2. Kits comerciales con fines diagnósticos
Quantibrite Quantibrite
CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS
SOLUBLES POR BEAD ARRAYS
El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante
PROTOCOLO
Incubación Lavado
Marcaje
Lavado
DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES
Citocina
- +
Citocina
- +
SSC
CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS
SOLUBLES
• Más rápido y sensible que el ELISA. 90 min.
Sensibilidad fentomolar: 10-15 M
• Multiparamétrico se pueden detectar las
concentraciones de múltiples citocinas en una
misma muestra en un mismo ensayo
7. MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS
BIESPECÍFICOS
• Uso de anticuerpos biespecificos anti-CD45-anti-citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales
• Se pueden fabricar también con fragmentos Fab
• Su utilidad es la selección de células productoras de una determinada citocina para terapia de transfusión celular
MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
CD45 Anti-citocina Citocina
MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
• Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética
• Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones
Selection of reactive T cells by Cytokine secretion assays
•
3. Captura del producto secretadoDuring the incubation of 45 minutes at 37°C, the secreted cytokine binds to the Cytokine Catch Reagent on the surface of the secreting cells. It is important to avoid close contact of the cells, they are kept in suspension using the MACSmix™.
1. EstimulaciónThe cells are stimulated, e.g. with antigen, for 3-16 hours in vitro. The responding cells rapidly begin to secrete cytokines.
2. Marcaje con reactivo de capturaA Cytokine Catch Reagent is now attached to the cell surface of all leukocytes via the CD45 antigen.
Selection of reactive T cells by Cytokine secretion assays
•
4. Marcaje de la citocina capturada4. Marcaje de la citocina capturadaThen the cells are stained with a fluorochrome-labeled Cytokine Detection Antibody. The cells are now ready for analysis by flow cytometry.
5. Marcaje con anticuerpos unidos a microparticulas paramagnéticasPara aislar, cytokine-secreting cells se marcan con micropartículas recubiertas de anticuerpos Anti-PE.
6. Selección de las células productorasThe cytokine-secreting cells are now enriched by using a MACS Separator and MACS Columns (up to 10,000-fold).
Separación células para terapias de transfusión celular
• Tetrámeros permiten la selección de células antígeno especificas
• Anticuerpos biespecíficos permiten la selección de células productoras de una citocina especifica.
• Clonación de células antileucémicas con un perfil determinado de producción de citocinas para su posterior expansión y reinfusión en el paciente
Habéis aprendido
• Los métodos de citometría de flujo que tienen aplicación clínica
Bibliografía
• Shapiro H Practical Flow Cytometry 4th Edition 2003 Ed Willey
• www2.uah.es/problembasedlearning/