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CLART PneumoVir

CARACTERIZACIÓN DE VIRUS CAUSANTES DE INFECCIONES RESPIRATORIAS HUMANAS

MEDIANTE IDENTIFICACIÓN GENÓMICA

PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO

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CLART PneumoVir

CARACTERIZACIÓN DE VIRUS CAUSANTES DE INFECCIONES RESPIRATORIAS HUMANAS

MEDIANTE IDENTIFICACIÓN GENÓMICA

PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO

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CLART PneumoVir

Extracción

24 determinaciones Ref: AT-0507-24

48 determinaciones Ref: AT-0507-48

CLART PneumoVir Amplificación

24 determinaciones Ref: AT-0607-24-MT 48 determinaciones Ref: AT-0607-48-MT

CLART PneumoVir Detección

24 determinaciones Ref: AT-0707-24 48 determinaciones Ref: AT-0707-48

48 determinaciones Ref: CS-0408-48 96 determinaciones Ref: CS-0408-96

Los contenidos del presente Kit se encuentran bajo el ámbito de protección de la solicitud de Patente internacional PCT/GB2009/050574 CLART, PneumoVir y CLART-Strip son marcas registradas por GENOMICA

GENOMICA, S.A.U. Alcarria, 7, 28823 Coslada, Madrid, Spain Telf: +34 91 674 89 90, Fax: +34 91 674 89 91 www.genomica.es

Versión 8

Noviembre 2010

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ÍNDICE: 1. GLOSARIO DE TÉRMINOS 2. INTRODUCCIÓN 3. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO 4. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT

4.1. Reactivos de extracción 4.2. Reactivos de amplificación 4.3. Reactivos de visualización 4.4. Otros componentes

5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO

5.1. Reactivos y material 5.2. Equipos

6. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓ N

6.1. Recomendaciones generales 6.2. Precauciones para la visualización

7. TOMA DE MUESTRAS

7.1. Lavados nasofaríngeos 7.2. Exudados faríngeos 7.3 Exudados nasofaríngeos

8. PROTOCOLO DE TRABAJO

8.1. Extracción del material genético de virus asoc iados a infecciones respiratorias

8.2. Extracción automática 8.3. Reacción de amplificación 8.4. Visualización del producto amplificado

9. LECTURA DE RESULTADOS 10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO 12. BIBLIOGRAFÍA

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1.-GLOSARIO DE TÉRMINOS

Atención, ver instrucciones de uso

Fecha de caducidad

Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro

Lote

Conservar a temperatura ambiente

Conservar entre 4 ºC y 8 ºC

Conservar entre –30 ºC y –18 ºC

20ºC

25ºC

4ºC

8ºC

30ºC

-18ºC

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2.-INTRODUCCIÓN

Las infecciones respiratorias agudas (IRA) se encuentran entre las enfermedades

más frecuentes en nuestro medio y, desde el punto de vista de la morbilidad, son una de las primeras causas de consulta y hospitalización. En el año 2002, la OMS (Organización Mundial de la Salud) estimaba que 4,9 millones de muertes al año en todo el mundo, incluyendo a países desarrollados, eran causadas por IRA, siendo la primera causa de muerte infantil10. Por otro lado, las infecciones respiratorias son las mayores causantes de visitas a urgencias y consultas de medicina familiar en la estación de invierno, independientemente de la edad del paciente18.

La mitad de las IRA son causadas por virus6, afectando especialmente a pacientes

inmunodeprimidos7, ancianos y lactantes8,9. Dentro de estas enfermedades, la neumonía sigue siendo la causa más común de mortalidad1-4, aunque existen otras patologías de importancia como gripe, bronqueolitis5, faringitis, traqueo-bronquitis y resfriados. Todas ellas cursan con sintomatología muy parecida, por lo que es necesario disponer de un sistema de diagnóstico que permita identificar el agente causante de la infección y poder aplicar el tratamiento adecuado al paciente.

Entre los virus más frecuentes asociados a infecciones respiratorias humanas se

destacan los siguientes: Adenovirus, Bocavirus, Coronavirus, Enterovirus (Echovirus), Influenza virus A, B, y C, Metapneumovirus, Parainfluenza virus 1, 2, 3, y 4, Rhinovirus, Virus Sincitial Respiratorio; de ellos, los virus de la Influenza tienen una alta tasa de evolución, siendo los virus Influenza A los que causan brotes de gripe de mayor gravedad y proliferación. Los cambios genéticos en dichos virus Influenza A suelen provocar epidemias globales o pandemias, las cuales se han venido repitiendo periódicamente desde 1918 en ciclos de diez-quince años, de hecho el último brote de gripe A (H1N1) de 2009 está originado por una variante del virus Influenza A de origen porcino (subtipo H1N1) y fue clasificado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) de seis, es decir, pandemia.

Debido a esta gran variedad de posibles agentes patógenos, y la alta frecuencia

de coinfecciones, especialmente en niños debido a su incipiente sistema inmunológico; se hace necesaria la utilización de métodos de diagnóstico que permitan la identificación múltiple, sensible, eficaz, rápida de todos los posibles virus presentes en la muestra clínica11.

Un aspecto importante a tener en cuenta es el uso excesivo de antibióticos en el

tratamiento de las infecciones respiratorias y neumonías en general (ver figura 1). En muchos casos, estas infecciones son causadas por virus y esta práctica es contraproducente no sólo desde la perspectiva del coste económico, sino de las resistencias a los antibióticos que puede ocasionar15. Una caracterización adecuada de la etiología de la enfermedad, permitiría minimizar este inconveniente.

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Vis

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a( ×× ××

1000

)

0

5000

10,000

15,000

20,000

25,000Visitas a médico de cabecera

Prescripción de antibióticos

Prevalencia bacteriana

30%

76%

70%62%

59%

InfecciónVías Altas

Otitis media Sinusitis Faringitis Bronquitis0

20

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60

80

100

Prescripción

de antibióticosy

Prevalencia

bacteriana(%

de visitas)V

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Visitas a médico de cabecera

Prescripción de antibióticos

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30%

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70%62%

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InfecciónVías Altas

Otitis media Sinusitis Faringitis Bronquitis0

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40

60

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100

Prescripción

de antibióticosy

Prevalencia

bacteriana(%

de visitas)

Figura 1. Uso de antibióticos en atención primaria y prevalencia bacteriana (EEUU, 1998).

Varios trabajos sugieren que los virus respiratorios están infradiagnosticados, por

los métodos tradicionales (inmunofluorescencia directa, cultivo, etc) y que pueden ser responsables de una parte considerable de las neumonías adquiridas sin caracterizar12. Las pruebas diagnósticas tradicionales además de ser muy lentas, laboriosas y con bajo umbral de sensibilidad, no identifican virus comunes y de alta incidencia como rhinovirus o nuevos virus como coronavirus. Recientemente se han descrito métodos de diagnóstico molecular para adenovirus, enterovirus, bocavirus, virus sincitial respiratorio y coronavirus. (19)

GENOMICA ha desarrollado el kit CLART® PneumoVir basado en la amplificación

de fragmentos específicos del genoma del virus y la posterior detección mediante la hibridación con sondas de captura específicas de cada virus, lo que conlleva una serie de ventajas:

1 Alta sensibilidad permitiendo la detección de cantidades mínimas de ADN. Esto supone una gran ventaja en muestras clínicas en las que la cantidad de moléculas de virus son escasas.

2 Detección simultánea de múltiples virus presentes en una misma muestra. 3 Elevada especificidad, al utilizar una secuencia correspondiente a una región

altamente conservada dentro del genoma vírico y sondas de captura específicas para cada tipo de virus respiratorio.

4 Fácil de estandarizar en un laboratorio hospitalario. 5 Rápido ya que se obtienen los resultados de los análisis en 8 h.

3.-DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO CLART PneumoVir es capaz de detectar y caracterizar la presencia de los 19

tipos y subtipos más frecuentes de virus humanos que causan infecciones respiratorias en

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las muestras clínicas más comunes, incluída la detección específica del subtipo de Influenza A causante de la Nueva Gripe A (H1N1/2009).

Los virus analizados son: Adenovirus; Bocavirus; Coronavirus; Enterovirus

(Echovirus); Influenza virus A (subtipos H3N2 human o, H1N1 humano, B, C y H1N1/2009); Metapneumovirus (subtipos A y B); Parai nfluenza virus 1, 2, 3, y 4 (subtipos A y B); Rhinovirus; Virus Sincitial Respi ratorio tipo A (VSR-A); Virus Sincitial Respiratorio tipo B (VSR-B).

La detección de los virus se lleva a cabo mediante la amplificación por RT-PCR (PCR reversa) de un fragmento específico del genoma vírico de entre 120-330 pb. La visualización del amplificado es posible gracias al uso de una nueva plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART® (Clinical Array Technology).

La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo pero a la vez muy cómodo y eficaz que consiste en incluir un microarray en la parte inferior de un tubo de 2 ml (Array TubeTM-AT) o en el fondo de un pocillo de placa microtiter (CLART Strip-CS) (Figura 2), lo que simplifica todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de arrays clásicos.

Figura 2. Plataforma CLART® Strip-CS en forma de tira de 8 pocillos.

El sistema de detección con CLART PneumoVir se basa en la precipitación de un producto insoluble en aquellas zonas del array en las que se produce la hibridación de los productos amplificados con las sondas específicas. Durante la RT-PCR, los productos amplificados se marcan con biotina. Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del array, tras lo que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, con lo que se produce la precipitación de éste en las zonas del array en las que ocurre la hibridación (Figura 3).

Sondas sobre array Producto marcado

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La sensibilidad obtenida con el kit CLART PneumoVir al combinar la reacción de

amplificación con la visualización en el array, es tan alta, que no es necesario hacer dobles amplificaciones (nested-PCR), evitando así el riesgo de contaminación que éstas conllevan. Uno de los principales inconvenientes de la detección por amplificación genética son los falsos negativos de amplificación, debidos principalmente a la presencia en las muestras que se quieren analizar, de inhibidores de la mezcla de enzimas (Retrotranscriptasa y DNA polimerasa), como polisacáridos ácidos contenidos en esputo, sales, etc. Con el kit CLART PneumoVir se han eliminado estos falsos negativos añadiendo al tubo de amplificación un control interno de la eficiencia de la reacción de amplificación. Si la extracción RNA/DNA se realiza de forma incorrecta la técnica dará lugar a un falso negativo, por lo que se recomienda especial cuidado a la hora de realizar este proceso.

4.-COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT

Figura 3: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie, capturan sus

productos amplificados complementarios marcados con biotina. A través de la biotina, se une el conjugado, en

este caso estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la

acción de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación.

biotina

Hibridación

Incubación con el conjugado

Reacción de revelado

Precipitación del sustrato

Conjugado

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El kit CLART PneumoVir contiene suficientes reactivos para la extracción y análisis de 24, 48 ó 96 muestras clínicas, según el formato del que se trate. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad del kit.

4.1. Reactivos de extracción El kit de extracción-purificación se envía a -20 ºC y se debe conservar a esta temperatura hasta su uso.

• SEML (solución de extracción). Una vez descongelada se debe guardar

a 4ºC y consumir antes de 8 días. • SD (solución de dilución). Conservar a -20ºC o a 4ºC. • IP (Isopropanol). Conservar a -20ºC. • DE (Etanol 70%). Conservar a -20ºC.

4.2. Reactivos de amplificación Se envían y se conservan a -20 ºC.

• Tubos de Amplificación listos para su uso. Contienen 43 µL de mezcla de reacción. Sólo se deben descongelar sobre hielo el número preciso de tubos de amplificación que se vayan a procesar en ese momento, conservando el resto de los tubos a -20ºC.

Se envían dos tipos de tubos de amplificación: -Tubo incoloro (multiplex-PCR 1) para la amplificación de Coronavirus; Metapneumovirus (subtipos A y B); Parainfluenza virus 1, 2, 3 y 4 (subtipos A y B) y VRS-A. ¡ADVERTENCIA!: Hay que añadir la mezcla de enzima antes de introducir el material genético extraído. -Tubo coloreado (multiplex-PCR 2) para la amplificación de Adenovirus; Bocavirus; Enterovirus (Echovirus); Influenza virus A, B C e Influenza A H1N1/2009; Metapneumovirus, Rhinovirus y VRS-B. ¡ADVERTENCIA!: Hay que añadir la mezcla de enzima antes de introducir el material genético extraído.

• Mezcla de enzimas ( es una mezcla de las enzimas RT (retrotranscriptasa) y DNA Polimerasa. Lista para su uso. Conservar a –20ºC.

Nota: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún momento los productos han sobre pasado la temperatura de conservación de –20 oC y no deben utilizarse.

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4.3. Reactivos de visualización El kit de visualización se envía a 4 ºC. ¡ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, los strips CS deben conservarse a temperatura ambiente.

• Tubos AT o Tiras CS (incluyendo las sondas específicas). Se suministran en un sobre termosellado. Conservar siempre cerrado, a temperatura ambiente y protegido de la luz.

• SH (Solución de Hibridación). Conservar a 4ºC • DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC. • CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de

usar. • RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC. • TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC.

4.4 Otros componentes

Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesita un equipo o lector, un adaptador, y un software, capaces de generar de manera automática un informe por cada muestra analizada:

• Lector CAR (Clinical Array Reader): permite la lectura e interpretación

automática de hasta 12 CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras. En este lector también pueden leerse ATs. Está fabricado y distribuido por GENOMICA para su uso exclusivo con los kits de diagnóstico.

• Soporte adaptador que se coloca sobre la bandeja del CAR, sobre el cual se

acopla la placa antes de la lectura.

• Software : específico para CLART ® PneumoVir , diseñado y validado por GENOMICA.

CAR (Clinical Array Reader)

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5. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO

A continuación enumeramos todo el material requerido y que no es suministrado.

5.1. Reactivos y material

- Agua destilada. - Guantes desechables. - Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo. - Recipiente con hielo picado. - Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados. - Gradillas para tubos de 1,5 ml. - Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml.

5.2. Equipos

- Microcentrífuga. - Termociclador. - Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción. - Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de extracción. - Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir la mezcla de enzimas a los tubos de amplificación. - Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir el material genético a los tubos de amplificación. - Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl , 20-200 µl y 200-1000 µl para el laboratorio de visualización. - Termobloque con agitación ajustable a 25°C, 30°C y 50 ºC. Compatible con tubos tipo Eppendorf y placas de 96 pocillos.

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- Vórtex. - Sistema de vacío (opcional).

6.- RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓ N

¡Muy importante para evitar contaminaciones!. Leer detenidamente antes de comenzar la técnica.

6.1. Recomendaciones generales

1. La técnica se debe realizar en CUATRO AREAS separad as físicamente , para evitar la contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas.

• Área pre-PCR de extracción : En esta área se hace la extracción del ADN/ARN. Se debe usar campana de flujo laminar.

• Área pre-PCR de preparación de los tubos de amplificación. En esta

área se añade a los tubos de amplificación la mezcla de enzimas. Se recomienda el uso de campana.

• Área pre-PCR de adición del material extraído . En este lugar se añade el

ADN/ARN extraído a los tubos de amplificación a los que previamente se les ha incorporado la mezcla de enzimas. Se debe usar campana de flujo laminar.

• Área post-PCR : En esta área se lleva a cabo la amplificación y la

visualización del producto amplificado.

2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empieza a trabajar en las áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se preparen los tubos de amplificación y cuando se añada el ADN/ARN a esos tubos. 3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas) en profundidad con lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras , y obligatoriamente después de una contaminación. En el caso de termocicladores y termomixers, se recomienda limpiarlos antes y después de su uso, en estas mismas condiciones.

4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desp lazamiento positivo para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de pipetas para cada área. 5. Emplear material de laboratorio desechable y aut oclavado.

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6. Nunca mezclar reactivos de dos tubos diferentes, aunque sean del mismo lote.

7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente des pués de su uso para evitar contaminaciones. 8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo. 9. Separar los tubos unos de otros en todo momento durante la manipulación, con especial precaución durante la extracción .

10. GENOMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas o ADN/ARN extraído por un protocolo distinto al indicado.

6.2 Precauciones para la visualización 1. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo, ya que podría dañarse el microarray situado en el fondo/pocillo. 2. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo AT/CS, nunca directamente sobre el fondo.

3. Es conveniente no añadir la solución SH hasta que se vayan a añadir los productos desnaturalizados de PCR. 4. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el microarray para evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones erróneas del resultado.

5. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las distintas soluciones. 6. Mantener limpia la base del pocillo para evitar posibles interferencias en la lectura de resultados. 7. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de posición y de que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso contrario, limpiar el fondo del pocillo con un papel de celulosa.

7. TOMA DE MUESTRAS 7.1. Lavado nasofaríngeo . Se instilan de 3 a 7 ml de solución salina estéril en la fosa nasal, manteniendo la cabeza del paciente hacia atrás, y se recoge la solución en un contenedor estéril

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colocado bajo las fosas nasales, inclinando la cabeza hacia adelante. Conservar la muestra a 4ºC si se va a procesar en el día, o a -80ºC si se va procesar después.

7.2. Exudado faríngeo . Para la recogida de exudado faríngeo (que es el más habitual para la detección de virus respiratorios después del lavado nasofaríngeo), se utiliza un depresor de lengua para evitar la contaminación con la saliva, y se toma la muestra de la zona posterior de la faringe en las zonas inflamadas y eritematosas o donde existan lesiones visibles, girando la torunda y procurando desprender células epiteliales de la lesión. Si aparecen exudados o restos mucosos adheridos a las lesiones se deben retirar con otra torunda antes de proceder a la toma de la muestra. Introducir la torunda en su tubo con el medio de conservación. Mantener a 4ºC si se va a procesar en el día, o a -80ºC si se va procesar después. 7.3. Exudado nasofaríngeo . Para la toma de muestra de exudado nasofaríngeo se inserta una torunda de alambre flexible a través de la nariz en la nasofaringe y se gira suavemente unas cuantas veces. Volver a introducir la torunda en su tubo con el medio de conservación. Mantener a 4ºC si se va a procesar en el día, o a -80ºC si se va procesar después.

8. PROTOCOLO DE TRABAJO 8.1. Extracción manual de ADN/ARN a partir de difer entes muestras Se recomienda que, para obtener unos óptimos result ados, el rendimiento de la extracción sea, como mínimo de 5-10 ng/ µl de ADN/ARN, independientemente de que la extracción se realice de forma manual o automática.

Recomendaciones específicas antes de comenzar la ex tracción:

• Trabajar en el área pre-PCR de extracción , siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 6.1.

• Mantener las muestras en hielo y lo más separadas posible entre sí. • Añadir los reactivos en el orden en que se indica. • No utilizar solución salina para las torundas.

Protocolo de la Extracción:

1. Incluir con cada serie de muestras un control negativo, constituido por 200 µl SD (solución de dilución) y procesarlo igual que el resto de las muestras. 2. Tomar 200 µl de muestra clínica. En el caso de las torundas que llevan medio de conservación, agitar en vortex durante 30 segundos y tomar después 200 µl.

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3. Añadir 600 µl de SEML (solución de extracción de muestras líquidas). Esperar a que la solución se descongele y se vuelva transparente antes de usarla. Mezclar invirtiendo los tubos varias veces, y esperar 15 min. a Tª ambiente.

4. Añadir 600 µl de IP (isopropanol), almacenado a -20ºC; mezclar invirtiendo los tubos varias veces y centrifugar, preferiblemente a 4ºC, a 13000 rpm durante 20 min.

5. Aspirar el sobrenadante con micropipeta. Se puede utilizar la micropipeta de 1000 µl para eliminar el sobrenadante, siempre y cuando se emplee al final una micropipeta de menor escala, por ejemplo de 20 µl, para los restos del fondo del tubo y evitar eliminar el precipitado por equivocación.

6. Añadir 1000 µl de etanol 70%, almacenado a -20ºC. Agitar ligeramente para limpiar el precipitado del fondo.

7. Centrifugar preferiblemente a 4ºC, a 13000 rpm durante 15 min.

8. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente como se indica en el paso 5. Dejar secar perfectamente en la campana durante 15 ó 20 min. hasta que no queden residuos de etanol. Antes de resuspender la muestra, comprobar que no queda etanol.

9. Resuspender en 20 µl de SD (Solución de dilución).

8.2. Extracción automática

Seguir recomendaciones del fabricante y verificar que en esas condiciones el material extraído es adecuado a la técnica CLART® PneumoVir-2.

8.3. Amplificación por RT-PCR

Recomendaciones específicas para la amplificación: • Trabajar en el área pre-PCR de preparación de los tubos de amplificación, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 6.1. • Tener especial cuidado a la hora de añadir la mezcla de enzima, ya que contiene un elevado porcentaje de glicerol. Por lo que, si se introduce demasiado la punta de la pipeta, la mezcla se adhiere a las paredes provocando, por un lado, que se añada más mezcla de lo necesaria al tubo de reacción, y por otro lado, se produzca una pérdida de producto, pudiendo darse el caso de no tener suficiente para el resto de tubos de amplificación del kit.

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• Añadir el ADN/ARN en el Área pre-PCR de adición del material extraído, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 6.1. Durante el proceso mantener los tubos separados y en hielo.

Protocolo de la Reacción de Amplificación:

1. Descongelar y mantener en hielo, por cada muestra que se vaya a analizar, dos tubos de amplificación (uno incoloro y otro coloreado). 2. Centrifugar unos segundos los tubos de reacción en la microcentrífuga para que quede todo el líquido en el fondo del tubo. Si no se dispone de adaptadores de microcentrífuga para los tubos de reacción, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa. 3. Añadir 2 µl de la mezcla de enzima a ambos tubos de amplificación. 4. Añadir 5 µl del ARN/ADN extraído a cada uno de los tubos de reacción, y resuspender varias veces con la micropipeta. Dejar los tubos en el hielo.

5. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas:

Arrancar el programa y colocar los tubos de reacción en el termociclador.

La duración de la amplificación es de unas 5 horas, aunque puede variar ligeramente dependiendo del termociclador.

8.4. Visualización del producto amplificado 8.4.1. Visualización en Array Tubes (AT) Recomendaciones específicas:

• El protocolo descrito a continuación se debe realizar siempre en el área post-PCR . Nunca llevar el producto amplificado al área de pre-PCR. Seguir las recomendaciones del punto 6.2.

• Colocar los tubos de amplificación separados en el termociclador durante la desnaturalización. Nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.

1 ciclo 45ºC 45 min 95ºC 15 min

45 ciclos 95ºC 0,5 min 50ºC 1,5 min 68ºC 1,0 min

1 ciclo 68ºC 10 min

4ºC continuo hasta la recogida de tubos (opcional)

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• Atemperar la SH (solución de hibridación) específica para AT a temperatura ambiente.

• Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro. Salvo en la adición de amplificados al tubo AT donde sí es necesario.

• Asegurar que los termomixers han alcanzado la temperatura adecuada antes de introducir los tubos AT.

• En caso de fallo de lectura, escribir el número que aparece en el tubo AT especificado como Assay ID.

• Encender el lector de ATs al comienzo del proceso, la autocalibración del equipo tarda unos minutos y debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado.

Protocolo de la Visualización:

1.- Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los amplificados. Para este paso, colocar los tubos en el termociclador, lo más separados posible, e incubar a 95 ºC durante 8 min. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 min. los amplificados sigan a 95 ºC. Sacar los tubos de la incubación a 95 ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo.

2.- Preparación de la Solución TL diluida: • Para 48 muestras, añadir 6 ml de Solución TL a 54 ml de agua destilada.

3.- Pre-lavado del tubo AT: añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada AT e invertir el tubo 10-15 veces. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con vacío. Repetir este paso de lavado una vez más. Este paso es necesario para lavar los tubos que vienen envasados, antes de añadir la muestra. El tubo debe quedar sin restos de la solución de lavado, para ello también secamos las tapas con vacío, pero en ningún caso se deben dejar los tubos secos durante mucho tiempo. 4.- Hibridación: Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de Solución SH atemperada, evitando que se forme espuma, a cada tubo AT. Añadir al mismo tubo AT 3 µl del amplificado del tubo incoloro y otros 3 µl del coloreado. Resuspender varias veces para que se mezcle con la SH, con cuidado de no tocar el cristal. Incubar en el termobloque durante 1 hora y media a 50ºC, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar los tubos y desechar la Solución SH si se usa vacío con una pipeta pasteur diferente en cada AT, o si se usa la pipeta manual con una punta distinta. Dejar programado el termobloque a 30ºC y en

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movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Se puede quitar la tapa para que baje antes la temperatura. 5.- Lavado: añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o vacío. Si el termobloque no hubiera llegado a los 30ºC se dejan los tubos con Solución TL diluida hasta que el termobloque alcance la temperatura 6.- Bloqueo y conjugado: 15 minutos antes de concluir la hibridación, se debe preparar la solución CJ diluida y mantener en hielo. Antes, se recomienda centrifugar la solución CJ durante 10 segundos. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Para ello, mezclar en un tubo 100 µl de Solución DC y 1 µl de Solución CJ por cada AT (preparar mezcla para un AT más por cada diez, para compensar los errores de pipeteo). Se debe dar un vórtex a la solución una vez diluida para homogenizar. Añadir al tubo AT 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos a 30ºC, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, desechar la Solución del tubo AT con pipeta o vacío inmediatamente. Bajamos la temperatura del termobloque a 25 ºC para su utilización en el paso 9. 7.- Lavado: Añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces, desechar la solución con la pipeta o vacío. Si este lavado no se realiza inmediatamente tras los 15 min a 30ºC, puede causar en la lectura una señal no legible 8.- Lavado: Este lavado es el más importante . Añadir 300 µl de Solución TL diluida a cada tubo AT e invertir los tubos de 10-15 veces. Desechar la Solución TL con pipeta o vacío. Es importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica. No es necesario el cambio de punta para cada tubo, pero sí es importante no llegar al cristal

9.- Revelado con Solución RE: Se recomienda trabajar en tandas de 12 tubos AT . Esta solución debe mantenerse en la nevera a 4ºC, sacarla en el momento de su uso y devolverla a la nevera tras su uso. Quitar la solución TL, añadir 100 µl de solución RE al tubo AT e incubar 10 minutos a 25 ºC en el termobloque sin agitación.

¡ADVERTENCIA! Es muy importante utilizar el termobloque sin agitación y leer las muestras inmediatamente después de la incubación. 10.- Leer en forma “Análisis seriados” en la que se toman las imágenes de todos los tubos para posteriormente ser analizadas.

8.4.2 Visualización del producto amplificado en CLA RT Strip (CS)

Recomendaciones específicas antes de comenzar la vi sualización:

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EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR . NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR.

1. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación el termomixer de placas ha estado a 59ºC al menos durante 1 hora.

2. Colocar los tubos de amplificación separados en el termociclador durante la

desnaturalización. Nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.

3. Atemperar la SH (solución de hibridación) a temperatura ambiente.

4. Encender el CAR (Clinical Arrays Reader) al comienzo del proceso. La

autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario además introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. El aparato debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado.

5. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD.

6. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner en marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos de amplificación separados en el termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización.

7. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es necesario

usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario utilizar puntas con filtro durante la adición de amplificados al tubo CS.

8. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo del pocillo.

9. Introducir la tira en el termomixer INMEDIATAMENTE después de añadir la

solución de hibridación (SH).

10. En el caso de que se realicen un número alto de tiras a la vez, se recomienda añadir los reactivos de visualización con pipetas multicanal y cubetas específicas; para esto se debe seleccionar una cubeta para cada tipo de reactivo y se deben lavar primero con lejía al 10% y después con agua destilada cada vez que se concluya el ensayo.

VISUALIZACIÓN:

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1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95º C durante 8 minutos. Programar en el termociclador 15 minutos para que una vez transcurridos los 10 minutos los amplificados sigan a 95º C. Sacar los tubos de la incubación a 95º C y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo.

2. Preparación de la Solución TL diluida:

Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida, añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada.

3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar añadiendo

200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Se recomienda realizar este lavado mientras se desnaturalizan los amplificados y mantener la solución de lavado en la tira hasta la adición de los mismos. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío. El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco durante mucho tiempo. Añadir la siguiente solución inmediatamente.

4. Hibridación: antes de usar la Solución SH, ésta debe estar temperatura ambiente.

Una vez desnaturalizados los productos de PCR, añadir 100 µl de solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. Añadir al mismo pocillo de CS 3 µl del amplificado del tubo incoloro y otros 3 µl del coloreado. Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación, con cuidado de no tocar el array. Se recomienda cargar cada tira de manera independiente y separada del resto para evitar contaminaciones. Incubar la tira cubierta con la tapa de plástico transparente en el termomixer de placa tapado durante 1 hora a 59º C, agitando a 550 rpm.

Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la Solución SH con pipeta o bomba de vacío. (Dejamos programado el termomixer de placa a 30º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura).

5. Doble Lavado: usar puntas diferentes para cada pocillo en ambos lavados. Añadir

200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a15 veces con la pipeta multicanal. Desechar la Solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío multicanal. Repetir la operación. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 30º C, se dejan los pocillos con esta solución hasta que el termomixer alcance la temperatura.

6. Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ durante 10

segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida. Por cada CS, se añade 1 ml de solución DC y 7.5 µl de Solución CJ.

Desechar la Solución TL diluida y añadir a cada pocillo del CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 15 minutos exactos en el termomixer de placa a 30º C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la solución

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rápidamente con pipeta o bomba de vacío multicanal. (Dejar programado el termomixer de placa a 25º C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura).

7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de Solución TL diluida a cada

pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y desechar la solución con la pipeta o bomba de vacío. Repetir la operación dos veces más. Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica.

8. Revelado con Solución RE: quitar la solución TL diluida, añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo del CS e incubar 10 minutos a 25 º C en el termomixer de placa sin agitación.

¡Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación

9. Desechar la Solución RE completamente con pipeta o vacío. El array debe quedar

seco

10. CAR (Clinical Arrays Reader): Se coloca un adaptador especial sobre la bandeja del CAR, sobre el cual se acopla la placa, para tomar las imágenes de todos los pocillos que posteriormente son analizadas automáticamente.

9. LECTURA DE RESULTADOS

El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se indican los resultados.

En la pantalla del equipo aparecerá una tabla con tres columnas, en la columna de la izquierda aparecerán las especies de virus y los subtipos que se caracterizan en el micro-array. En la columna del centro aparece el resultado de positivo o negativo para cada especie de virus, y en la de la derecha aparecerá la conformidad del control de ADN/ARN de la extracción y de la amplificación.

10. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN/ARN de la muestra (por toma de cantidad insuficiente de muestra, por degradación del ADN/ARN debida a una inadecuada conservación o por pérdida del ADN/ARN de la muestra durante su extracción), o bien a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras en las que se quiere analizar la presencia del virus (hemoglobina, restos de parafina, sales, etc). Con el kit CLART PneumoVir se han eliminado estos falsos negativos añadiendo a uno de los tubos de amplificación un control interno de la eficiencia de la reacción de amplificación.

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Si la extracción RNA/DNA se realiza de forma incorrecta la técnica dará lugar a un falso negativo, por lo que se recomienda especial cuidado a la hora de realizar este proceso.

El tubo de RT-PCR se ha diseñado para favorecer la amplificación de los virus frente a la del control de amplificación. De manera que, en ciertas condiciones (ej. cuando hay un elevado número copias de un virus o cuando la muestra presenta coinfecciones con varios virus a la vez), puede suceder que no se amplifique el control y aparezca una lectura de: CONFORME. Teniendo en cuenta estas observaciones, podemos considerar las siguientes interpretaciones de los resultados de lectura: 1. Muestras positivas: 1.1. Con control de amplificación positivo (control interno positivo)

Este se considera un RESULTADO VÁLIDO. Podemos decir que se trata de un verdadero resultado positivo .

1.2. Con control de amplificación negativo (control interno negativo)

Virus Resultado Control Especie Positivo Conforme

Control Señal Resultado Control Interno > 0.165 Conforme

Virus Resultado Control Especie Positivo Conforme

Control de amplificación (Control interno)

Marcas de alineamiento

Control de amplificación (Control interno) Marcas de alineamiento

Virus

Virus

CLART Strip (CS)

Array Tube (AT)

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Control Señal Resultado Control Interno < 0.165 Sin señal

Este se considera un RESULTADO VÁLIDO , aunque el control de amplificación se muestre SIN SEÑAL. Esto se debe al efecto de la competencia con los virus. Podemos decir que se trata de un verdadero resultado positivo.

2. Muestras negativas

Virus Resultado Control Especie Negativo Conforme

Control Señal Resultado Control Interno > 0.165 Conforme

Control de amplificación (Control interno)

Marcas de alineamiento

Marcas de alineamiento Virus

Marcas de alineamiento Virus

Array Tube (AT)

CLART Strip (CS)

CLART Strip (CS)

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Este se considera un RESULTADO VÁLIDO . En este caso podemos decir que se trata de un verdadero resultado negativo .

3. Muestras inadecuadas, inhibidas Virus Resultado Control Especie Negativo PCR Inhibida

Este se considera un RESULTADO NO VÁLIDO . Esto se debe a que algunas sustancias pueden inhibir la reacción de PCR al perjudicar la actividad de la enzima ADN polimerasa. La solución es verificar que en la muestra o el material genético extraído no hay presencia de ninguna de estas sustancias. Se recomienda repetir la extracción o, si esto no es posible, pedir al facultativo una nueva toma de muestra al paciente. Existen tres posibilidades que dan lugar a un resultado de Virus No Concluyente :

Marcas de alineamiento

Marcas de alineamiento

Control de amplificación (Control interno)

Marcas de alineamiento

Array Tube (AT)

CLART Strip (CS)

Array Tube (AT)

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• En aquellos casos en que las réplicas de una sonda sean muy distintas entre sí.

• En coinfecciones de más de 5 virus.

• Cuando la intensidad de la señal de absorbancia no normalizada se

muestre en el rango establecido por el software para cada tipo de virus.

11. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO

11.1 Control de interferencias conocidas:

Existen sustancias que pueden interferir en la detección del Kit CLART PneumoVir. Principalmente, son sustancias que inhiben la mezcla de enzimas y, por tanto, la reacción de amplificación. Las interferencias más conocidas son:

• Utilización de muestras no adecuadas . El análisis de cualquier otro tipo de muestra clínica distinta a las indicadas en el manual del kit CLART PneumoVir, así como una toma incorrecta de las muestras, puede conllevar que el resultado del análisis no sea concluyente o no conforme debido a una falta de amplificación por falta de muestra o por reacción inhibida. • La conservación inadecuada de las muestras puede influir en el resultado del análisis. Si las muestras se someten a condiciones que den lugar a una degradación del ADN/ARN que contienen, el resultado del análisis será erróneo.

• La presencia de hemoglobina o etanol tras la extracción de ADN/ARN puede inhibir la reacción de amplificación, puede evitarse purificando y dejando secar el ADN/ARN.

11.2 Especificaciones técnicas: Parámetros Analíticos:

• Sensibilidad analítica. La sensibilidad analítica se determina mediante la amplificación de diluciones seriadas de ADN de plásmidos recombinantes para cada uno de los virus detectados en el kit. Cada uno de ellos lleva inserto el producto amplificado (incluyendo la parte complementaria a las sondas específicas de detección). La visualización se realizó en CS dando lugar a los siguientes resultados (Tabla 1):

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Virus asociados a Infecciones

Respiratorias

Nº copias de

plásmido recombinante por reacción de PCR

Metapneumovirus

Coronavirus Influenza virus A (H1N1 humano, H3N2

humano, Influenza A H1N1/2009) Influenza virus B Influenza virus C

Parainfluenza virus 4 VRS-A VRS-B

Adenovirus Bocavirus

100

Enterovirus (Echovirus) Parainfluenza virus 1 Parainfluenza virus 2 Parainfluenza virus 3

Rhinovirus

1000

Tabla 1. Relación del número de copias de plásmido recombinante (especificadas por tipo vírico) necesarias para obtener una sensibilidad del 100% en la detección de cada uno de los virus.

• Especificidad analítica. Se llevaron a cabo experimentos de especificidad con los 17 plásmidos recombinantes, observándose que no se produce detección inespecífica de otros virus diferentes al que se quiere determinar. Por tanto, se considera que la técnica alcanza una especificidad analítica del 100%. Parámetros de utilidad diagnóstica : Para determinar los parámetros diagnósticos del kit, se realizó una evaluación comparativa de la técnica CLART PneumoVir con las técnicas más ampliamente utilizada en los Hospitales: Inmunofluorescencia, Inmunocromatografía, PCR Cuantitativa, CLART PneumoVir, que no incluye la detección de Influenza A H1N1/2009, y CLART Fluavir. Para esta evaluación se colaboró con los centros siguientes:

• Servicio de Microbiología del Hospital Universitari Germans Trías i Pujol de

Badalona. • Unidad de Virología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. • Laboratorio de Virología del Hospital Clínico Universitario de Reims

(Francia).

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A partir de 296 muestras de lavado nasofaríngeo se extrajo el material genético y se analizó la presencia de cada uno de los virus descritos en la Tabla 2. Para cada muestra se asume como verdadero el resultado concordante entre la técnica de referencia y CLART® PneumoVir. En el caso de existir discordancias entre ambas técnicas, se considera como verdadero el resultado de la secuenciación; y en el caso de no disponer de este dato, se analiza las discrepancias mediante una Nested PCR de desarrollo propio y su posterior secuenciación.

Virus PV-2 Sensibilidad Especificidad

Respiratorio Sincitial A 100,00 100,00 Parainfluenza 1 88.24 100 Parainfluenza 2 100,00 100,00 Parainfluenza 3 100,00 100,00 Parainfluenza 4 100,00 100,00

Coronavirus 100,00 100,00 Metapneumovirus 86.67 100

Respiratorio Sincitial B 100,00 100,00 Adenovirus 98,15 99,55 Enterovirus 83.33 100 Influenza A 83.33 99.63 Influenza B 87,50 99,63 Influenza C 100,00 100,00 Rhinovirus 96.55 100 Bocavirus 95 100

H1N1 porcino 100,00 100,00 Respiratorio Sincitial 100,00 100,00

Tabla 2. Sensibilidad y Especificidad diagnósticas de la técnica CLART® PneumoVir para cada tipo de virus.

Los parámetros diagnósticos anteriormente descritos fueron determinados en la plataforma CLART® Strip-CS. Para validar los resultados en formato AT (Array Tube) se ha efectuado una comparación entre los resultados de visualización de 203 tubos de amplificación CLART PneumoVir en paralelo en las plataformas CS y AT, con la siguiente distribución respecto a los tipos virales.

Virus Muestras

analizadas Resultado

en CS Resultado

en AT Parainfluenza 1 7 7 7 Parainfluenza 2 8 8 7

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Parainfluenza 3 8 8 7 Parainfluenza 4 5 5 4

Coronavirus 12 12 12 Metapneumovirus 11 11 11

RSV B 16 16 16 Adenovirus 44 44 43 Enterovirus 6 6 6 Influenza A 27 27 26 Influenza B 7 7 7 Influenza C 4 4 4 Rhinovirus 31 30 31 Bocavirus 34 34 34 New H1N1 9 9 9

RSV 76 76 76

Tabla 3. Análisis comparativo del kit CLART® PneumoVir para cada tipo viral en las plataformas de visualización CS y AT.

La concordancia entre las dos plataformas es de 97.04 %, hecho que nos permite afirmar que las plataformas son tan similares que los parámetros diagnósticos son los mismos para ambas.

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