Clase 02 Ácidos Nucleicos como Agentes Terapéuticos

ÁCIDOS NUCLEICOS COMO AGENTES TERAPÉUTICOS

Fernando Salcedo Biólogo, M.Sc. e-mail: [email protected]

Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

Conceptos Previos

MACROMOLECULA

CÉLULA

NUCLEO


Biología Molecular: Es la disciplina científica que tiene como objetivo e l e s t u d i o d e l o s p r o c e s o s q u e s e desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular. En el Proyecto Genoma Humano se le definió como: El estudio de la estructura, función y composic ión de las m o l é c u l a s b i o l ó g i c a m e n t e importantes .

Terapia Genética: Es un área de la medicina genómica que utiliza los conocimientos, técnicas y tecnología de que dispone la biología molecular, para introducir de manera dirigida copias sanas de genes defectuosos en célu las especificas del organismo y modificar el curso de la enfermedad. Para lograr esto se hace uso de otras moléculas llamadas p o r t a d o r a s y q u e s o n usualmente procedentes de virus.


Como trabaja la terapia genética: Insertar ADN complementario: Una cadena sencilla de ADN que se sintetiza a partir de una hebra simple de ARNm maduro y se utiliza para la clonación de genes propios de células eucariotas en células procariotas.

Recombinación Homologa: Es un proceso por el cual las secuencias de nucleótidos son intercambiadas entre dos cadenas similares o idénticas de ADN.

Mutación Selectiva Inversa: La mutación inversa es un proceso que permite revertir un gen mutado a su forma no mutada, mutación selectiva inversa se refiere a la realización de este proceso por medios artificiales.

Inhibición de genes: Consiste en el encendido o apagado de la expresión de un gen.


ENFERMEDADES GENÉTICAS • ► Enfermedades debidas a alteraciones de la dotación de

genes

- Genoma nuclear: cromosómico Dotación normal de cromosomas nucleares: 22 x 2 autosómicos + 2 sexuales (XX o XY). Contienen ~ 20.000 - 25.000 genes funcionales.

- Genoma mitocondrial: DNA circular Existen 8-10 copias por mitocondria y cientos de mitocondria por célula (~ 5000 copias en total). Contiene 37 genes: 13 proteicos, 22 ARNt y 2 ARNr (mitocondriales).


ENFERMEDADES GENÉTICAS ► Clasificación según el número de genes alterados y origen del gen Nucleares: - Enfermedades cromosómicas: afectan a múltiples genes. -  - Enfermedades monogénicas (~ 8.000 descritas): un

único gen alterado. - Enfermedades poligénicas: varios genes. Mitocondriales: Uno o varios genes alterados.


TERAPIA GÉNICA ► Transferencia de ácidos nucleicos (DNA o RNA) a la célula con finalidad terapéutica:

■ Incrementar la expresión de un gen endógeno con efecto terapéutico.

■ Restaurar la expresión de un gen funcional cuando el gen endógeno es disfuncional.

■ Inhibir la expresión de un gen endógeno con efectos patológicos.


TERAPIA GÉNICA ► Se fundamenta en el conocimiento de la enfermedad a nivel celular y molecular: ■ Identificación de las células/tejido de funcionamiento anómalo: Patología Celular ■ Identificación de los genes/proteínas celulares responsables: Genética/Patología Molecular


PATOLOGÍA MOLECULAR Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

ENFERMEDADES BLANCO • Enfermedades y tipos de genes ensayados en ensayos

clínicos en humanos.


• ► Individuo Receptor: • Adultos: experimental y aplicado en clínica humana • Células madre pluripotenciales in vitro: experimental • Embrión intrauterino: experimental en modelos animales.

• Se distingue entre la terapia génica somática (transferencia de DNA a tejidos normales) y terapia génica de la línea germinal (transferencia de DNA a células que producen ovocitos o esperma), ya que la primera se restringe al paciente tratado y no se transmite a la descendencia.


TIPOS DE INTERVENCION EN TERAPIA GÉNICA •  1) Transferencia de secuencias de DNA codificantes


•  FÁRMACO DNA de doble cadena que contiene una unidad transcripcional de un RNA con sentido o codificante.

•  APLICABILIDAD •  Puede reemplazar la inyección de proteínas extracelulares (ej. Insulina). •  Aplicación inédita para la producción de proteínas intracelulares (ej. Deficiencias monogénicas). •  Puede reemplazar la modulación de la actividad de proteínas endógenas con otros fármacos.

TIPOS DE INTERVENCION EN TERAPIA GÉNICA •  2) Transferencia de secuencias inhibidoras de la expresión.


FÁRMACO: secuencias de DNA/RNA complementarias a un mRNA endógeno que dirigen su destrucción o impiden su traducción. ■DNA de doble cadena con unidad transcripcional de un RNA ■DNA de cadena sencilla: oligonucleótido antisentido. ■RNA de doble cadena (pequeño RNA de interferencia siRNA) APLICABILIDAD Alternativa a la inhibición con otros fármacos de proteínas endógenas.

TIPOS DE INTERVENCION EN TERAPIA GÉNICA 3) Transferencia de secuencias de ácidos nucleicos (aptámeros) que interaccionan con una proteína.


FARMACO DNA/RNA de cadena simple o doble que interacciona con una proteína y altera su funcionalidad. APLICABILIDAD Alternativa a otros tipos de fármacos.

1) mRNA codificante, antisentido o ribozima


1) mRNA codificante, antisentido o ribozima Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

mRNA codificante Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

Oligonucleótido Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

RNAs de interferencia (siRNA y shRNA) Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

iRNA Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

EL USO DE VECTORES Un vec to r es generalmente un virus que ha sido a l t e r a d o genét icamente con el propósito d e q u e s e a inofensivo al organismo pero se aprovecha su habil idad para generar copias de ADN.


Son virus con envoltura que presentan un genoma de ARN mono catenario de cara y se replican de manera inusual a través de una forma intermedia de ADN b icatenar io . Este proceso se lleva a cabo mediante una enzima: la retrotranscriptasa o transcriptasa inversa, que dirige la síntesis de ADN a través de ARN y posee una importancia extraordinaria en la manipulación genética. Una vez se ha pasado de ARN mono catenario a ADN se inserta dentro del ADN propio de la célula infectada donde se comporta como un gen más .

Retrovirus


Son una familia de virus que infectan tanto humanos como animales. Los adenovirus f u e r o n a i s l a d o s e n l a s adenoides (amígdalas) de los humanos, de donde deriva el nombre. La Capacidad para infectar las c é l u l a s e n d i v i s i ó n o quiescentes, los hace útiles en la terapia genética ya que podrían integrar el gen en diversas zonas del organismo. El problema principal es la alta inmunogenicidad, y que su expresión sólo se realiza a corto plazo.

Los Adenovirus


Ventajas en Terapia Genética: 1.  No estimulan la inflamación en la célula huésped; 2.  Pueden entrar en células que no estén en división. 3.  Se integran en un único sitio del genoma, en el

cromosoma 19 en humanos. 4.  No causa enfermedades en humanos y no es

inmunogénico. Limitaciones:

1.  son difíciles de desarrollar en grandes cantidades, 2.  son difíciles de manipular y 3.  Necesitan otros virus durante la confección.

VIRUS ADENO ASOCIADO Se encuentran en combinación con otros virus. Sin embargo, por sí mismo son inofensivos.


Un ejemplo es la denominada inmunodeficiencia combinada severa o <<enfermedad de los niños burbuja>>, que ocasiona la muerte a los afectados, (pues estos niños no disponen de un sistema inmune sano). Con terapia somática ex vivo se han logrado salvar nueve de cada diez niños tratados, aunque dos de ellos desarrollaron leucemia que, afortunadamente, en niños suele ser tratable.

Casos clínicos en los que se ha utilizado terapia genética


Vía

Posición

Estructura ATRACTIVOS DEL HÍGADO PARA LA TERAPIA GÉNICA

Fibrosis y cirrosis hepática Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

Objetivo Terapéutico

para la Fibrosis Hepática

Base biológica legítima

Agente terapéutico debe permanecer en el micromedio del

tejido blanco por largo tiempo.

Producir pocos efectos extra

hepáticos

Concentraciones altas del compuesto activo en el

hígado.


PROCEDIMIENTOS EN EL ÓRGANO

BLANCO

Transferencia de genes entre

hígados normales y enfermos.

Inyección directa de DNA

plasmídicos desnudos unidos con diferentes ligandos.

Inyectando vectores virales recombinantes

complejos que se liberan en los

lóbulos hepáticos.



Fibrosis y Cirrosis Hepática

. El gen de la telomerasa inhibe y protege en contra de la fibrosis hepática inducida por CCL4 en ratones. . La transferencia de la sintasa del óxido nítrico neuronal en ratas cirroticas mejora la hipertención portal. . La inibición del NF- kB mediante el envió de su represor el IkB reduce la lesión temprana en ratas inducidas por alcohol. . Vectores adenovirales pueden ser transducidos en hepatocitos de hígado cirroticos y se demostró que estos no se alojan en otros órganos , a pesar de ser introducidos por vía general ( vena iliaca de la rata).



Fibrosis y Cirrosis Hepática Se puede revertir la cirrosis hepática? Los estudios en vivo se llevaron a cabo en el modelo de CCL4 y el de ligadura de conducto biliar. Se probó: La eficacia de transducción con 3x1011 partículas víricas/kg del vector adenoviral portando el gen de la metaloproteasa de matriz 8 (MMP8). El razonamiento de utilizar MMP8 fue el de la promoción de la degradación in situ de las proteínas de la matriz extracelular, liberando e factor de crecimiento hepático (HGF) y dejando espacio libre para la proliferación de células hepáticas. Resultados: Modelo: Ligadura biliar , disminución de la fibrosis de 45%. Modelo: CCL4, disminución 56%. Otro gen terapéutico fue el plasminógeno urocinasa humano (HUPA); con este gen se logró una reducción de 85% de la fibrosis hepática al día 10 posterior a la inyección del adenovirus.



Terapia antisentido

Se trata de otra estrategia metodológica, en donde las enfermedades caracterizadas por una proteína anormal o la producción en exceso de una proteína anormal pueden potencialmente tratarse mediante un bloqueo selectivo del gen o los genes que causan esta enfermedad. Cuando un gen se expresa, la secuencia de bases de DNA se transcribe a una sola cadena de RNA y luego se traduce a una proteína. La idea principal de la terapia antisentido es evitar la expresión del gen RNA de la proteína; esto es interrumpir el flujo de la información genética usando oligonucleótidos que tienen como blanco secuencias específicas de RNAm.


2002 y anteriores La terapia génica apareció a partir de los años 70 y se dieron las primeras pruebas con virus, las cuales fracasaron. En 1990, se utiliza células de médula ósea tratadas con un vector retroviral que porta una copia correcta del gen que codifica para la enzima adenosina desaminasa, la cual se encuentra mutada, es una enfermedad que forma parte del grupo de las inmunodeficiencias severas combinadas (SCID). Cinco años más tarde, publicaron los resultados de la terapia, que contribuyó a que la comunidad científica y la sociedad consideraran las posibilidades de ésta técnica. No obstante, el apoyo a la terapia fue cuestionado cuando algunos niños tratados para SCID desarrollaron leucemia. Las pruebas clínicas se interrumpieron temporalmente en el 2002, a causa del impacto que supuso el caso de Jesse Gelsinger, la primera persona reconocida públicamente como fallecida a causa de la terapia génica.

TERAPIA GENETICA LA MEDICINA DEL SIGLO XXI Edgar Fernando Salcedo, M.Sc

2003 Un equipo de investigadores de la universidad de California, en Los Ángeles, insertó genes en un cerebro utilizando liposomas recubiertos de un polímero llamado polietilen glicol (PEG). La transferencia de genes en este órgano es un logro significativo porque los vectores virales son demasiado grandes para cruzar la “barrera hematoencefálica”. Este método tiene el potencial para el tratamiento de la enfermedad del Parkinson. También la interferencia por ARN se planteó en éste año para tratar la enfermedad de Huntington.


2006 Científicos tratan exitosamente un melanoma metastásico en dos pacientes, utilizando células T para atacar a las células cancerosas. En Marzo del 2006, un grupo internacional de científicos anunció el uso exitoso de la terapia génica para el tratamiento de dos pacientes adultos contagiados por una enfermedad que afecta a las células mieloides. En Mayo del 2006, un equipo de científicos informaron del desarrollo de una forma de prevenir que el sistema inmune pueda rechazar la entrada de genes. En Noviembre del mismo año, se informó sobre VRX496, una inmunoterapia para el tratamiento del HIV que utiliza un vector lentiviral para transportar un DNA antisentido contra la envuelta del HIV. Fue la primera terapia con un vector lentiviral aprobada por la FDA para ensayos clínicos. Los datos de la fase I/II ya están disponibles.


2007 El 1 de mayo del 2007 anunciaron el primer ensayo de terapia génica para la enfermedad hereditaria de retina. La Amaurosis congénita de Leber es una enfermedad hereditaria que causa la ceguera por mutaciones en el gen RPE65. Se investigó la transfección su retiniana por el virus recombinante adeno-asociado llevando el gen RPE65, y se encontraron resultados positivos. Los pacientes mostraron cierto incremento de la visión, y no se presentaron efectos secundarios aparentes. Los ensayos clínicos de esta terapia se encuentran en fase I.


2008 Investigadores de la Universidad de Míchigan en Ann Arbor (Estados Unidos) desarrollaron una terapia genética que ralentiza y recupera las encías ante el avance de la enfermedad periodontal, la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Investigadores descubrieron una forma de ayudar a ciertas células utilizando un virus inactivado para producir más cantidad de una proteína denominada receptor TNF. Este factor se encuentra en bajas cantidades en los pacientes con periodontitis. La proteína administrada permite disminuir los niveles excesivos de TNF, un compuesto que empeora la destrucción ósea inflamatoria en pacientes que sufren de artritis, deterioro articular y periodontitis. Los resultados del trabajo mostraron que entre el 60 y el 80 por ciento de los tejidos periodontales se libraban de la destrucción al utilizar la terapia génica.


2009 En Septiembre de 2009, se publicó en Nature que unos investigadores de la Universidad de Washington y la Universidad de Florida fueron capaces de proporcionar visión tricromática a monos ardilla usando terapia génica. En noviembre de ese mismo año, la revista Science publicó resultados alentadores sobre el uso de terapia génica en una enfermedad muy grave del cerebro, la adrenoleucodistrofia, usando un vector retroviral para el tratamiento.


TERAPIA GENETICA LA MEDICINA DEL SIGLO XXI

2010 Se anuncian resultados exitosos en el tratamiento de pacientes de VIH con el uso de terapia genética, Sin embargo, los científicos admitieron que todavía existen obstáculos y que el próximo paso será asegurar que las células sanguíneas que reciban los genes de protección contra el sida no sean destruidas por el sistema inmunológico del paciente. 2011 En la actualidad se trabaja en la elaboración de nuevas estrategias genéticas contra el VIH que implican el uso del propio virus como vector, a un se esta a la espera de anuncios oficiales de los resultados.


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