TOMA, CONSERVACION, TOMA, CONSERVACION, TRANSPORTE Y TRANSPORTE Y

PROCESAMIENTEO DE PROCESAMIENTEO DE MUESTRAS PARA EL MUESTRAS PARA EL

DIAGNOSTICO DIAGNOSTICO MICOLOGICOMICOLOGICO

Dr. William Vega E.Dr. William Vega E.

RECOGIDA DE MUESTRA

El diagnóstico de las micosis comienza con la sospecha clínica y una adecuada obtención de la muestra, a partir de la lesión, y su correcta manipulación, para mantener la viabilidad del agente etiológico y evitar posibles contaminaciones.

No debe olvidarse la importancia de etiquetar y rellenar adecuadamente el volante de petición.

También es necesario reflejar la localización anatómica, cuando ha sido recogida, el medio de transporte, si lo hay, cómo ha sido el transporte y cuanto tiempo ha durado.

CONSEJOS GENERALES

1. Debe disponerse de un protocolo de recogida.2. Es necesario recoger las muestras asépticamente,

utilizando contenedores estériles, remitirlas al laboratorio antes de 2 h y sembrarlas lo antes posible.

3. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parte activa de la lesión.

Cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible una muestra respiratoria antes que un hemocultivo.

4. Los hisopos deben ser evitados. Pero hay muestras (conducto auditivo, faringe, vagina o cérvix) que no pueden ser recogidas de otra manera.

CONSEJOS GENERALES ……

5. En heridas abiertas, drenajes o lesiones superficiales, debe limpiarse la zona previamente para evitar contaminaciones.6. Los abscesos deben ser aspirados con jeringa y transferidas a un contenedor estéril.7. El laboratorio debe ser informado de la sospecha de hongos peligrosos en la manipulación (p. ej., Coccidioides spp e Histoplasma spp) y aquellos que requieren un procesamiento especial (Malassezia spp), así como de viajes u origen de paciente.8.Histoplasma capsulatum no sobrevive por periodos largos a la refrigeración o hielo seco.

TRANSPORTE DE MUESTRASTodas las muestras deben remitirse sin conservantes. Las muestras deben ser transportadas en un recipiente

estéril, humidificado y a prueba de vertidos.Las muestras dermatológicas pueden transportarse en

un recipiente seco.Los raspados corneales y hemocultivos deben

sembrarse directamente en el medio de cultivo adecuado.

Las muestras, una vez obtenidas, deben sembrarse lo antes posible después de la recogida.

Es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus en muestras demoradas y, la pérdida de viabilidad de algunos hongos por la desecación, temperatura elevada (>37 °C) o baja (<10 °C).

TRANSPORTE DE MUESTRAS ……..

La refrigeración puede comprometer el aislamiento de hongos como dermatofitos, Malassezia spp. e H. capsulatum.

Las muestras que están potencialmente contaminadas con microbiota bacteriana deben envitarse a temperatura ambiente.

Portas y Cubres objetosPlacas de Petri estérilesTorundas de algodónBisturí y pinzas de disecciónEspátulas de siembraAsas de siembraPipetas Pasteur estériles y no estérilesCinta adhesivaGuantesLaca de uñas para sellar portas objetos

MATERIALES MATERIALES

UTENSILIOS PARA LA TOMA DE UTENSILIOS PARA LA TOMA DE MUESTRAS DE UÑAS, PELOS, MUESTRAS DE UÑAS, PELOS,

ESCAMASESCAMAS

Toda muestra debe ser tomada en condiciones de asepsia y con el material adecuado y correctamente esterilizado.

Una vez realizada la toma, las muestras deben ser colocadas en recipientes bien cerrados, estériles y transportadas al laboratorio en la mismas condiciones.

Se debe cuidar que los recipientes NO goteen, o sin ningún tipo de identificación.

Importante recalcar, que toda biopsia, catéteres, úlceras, pus, etc., debe ser colocada en solución salina fisiológica o medios de cultivo líquidos estériles o inoculados directamente en los tubos de cultivo sólido con el agar inclinado en bisel, en este caso no debe dejarse el hisopo dentro del tubo

Se debe evitar la toma de la muestra con hisopos, estos solo se sugieren cuando se trata de material procedente de la superficie o de orificios corporales, (muestras faringeas, abscesos, vagina, oído, etc.)

TRANSPORTE DE LA MUESTRA

El transporte de la muestra para un estudio micológico debe ser rápido,

sin perdida de tiempo, si este no es el caso, se debe colocar en

nevera, a 4 C. nunca en el congelador

Debemos recordar que los hongos dimórficos tienen un crecimiento lento si se comparan con bacterias, hongos levaduriformes y filamentosos, por esta razón un procesamiento tardío o un almacenaje incorrecto, perjudica el diagnóstico micológico.

TOMA DE MUESTRAS

Son muchos factores que tenemos que establecer para lograr un diagnóstico micológico.

El principal de ellos, esta relacionado con la adecuada toma y recolección del material patológico;

Debe ser examinado sin perdida de tiempo, si este no es posible, las muestras se deben conservar en nevera hasta su procesamiento.

TOMA DE MUESTRAS PIELLa muestra debe tomarse de los sitios más típicos y activos de la lesión (preferiblemente de los bordes), previa asepsia de la misma con alcohol isopropílico al 70% u otro antiséptico. Se recomienda el uso de gasa estéril. En el caso de sospecha de una candidiasis, el alcohol u otros antisépticos, pueden matar las levaduras, en este caso se debe limpiar con solución salina estéril.

MUESTRAS OCULARES

EndoftalmitisQueratitisConjuntivitisBlefaritis e infecciones del sistema lacrimal

Estructuras adyacentes

MATERIAL OCULAR 1. Obtener un exudado conjuntival de cada ojo.2. Aplicar unas gotas de colirio anestésico.3. Raspar la superficie de la lesión con un: asa de Kimura (asa de platino de punta roma, flexible, ultrafina de enfriamiento rápido, que se puede esterilizar a la llama) o con un bisturí .4. La toma de la muestra debe realizarla el oftalmólogo, controlando con microscopio o con lámpara de hendidura.5. Sembrar los medios de cultivo en el acto de la recogida, con el mismo instrumento con que se obtiene la muestra y realizando una serie de cortes en forma de C o de X en el medio de cultivo.6. Preparar dos o más extensiones en porta para teñir y fijar con alcohol.7. Muestras con criterio de exclusion: Hisopos y hojas de bisturi enviado en los medios de cultivo

MATERIAL OCULAR Muestras con criterio de exclusión

MATERIAL ÓTICO

La muestra es tomada del conducto auditivo externo por rotación de un hisopo, humedecido previamente en solución salina estéril y se inocula en medios de cultivo sin antimicóticos.

Nunca se deben dejar los hisopos en el medio de cultivo.

Cavidad oral:

Una de las localizaciones más particulares para el aislamiento de hongos es la mucosa oral.

En este sitio podemos encontrar como causantes de la lesión hongos productores de micosis sistémicas: Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum.

El hongo más comúnmente aislado es Candida spp.

Para la toma de este tipo de muestras debemos utilizar: espátula, o bisturí.

Las lesiones blanquecinas sugestivas de infección por levaduras, pueden enmascarar cuadros clínicos más graves como los producidos por hongos sistémicos.

En estos casos, eliminar la placa blanquecina, tomar la muestra del fondo de la lesión.

Cavidad oral: ….Las muestras de úlceras y lesiones necróticas, pueden ser obtenidas por raspados con bisturí o espátulas. Si se sospecha de aspergilosis, mucormicosis, entomoftoromicosis, hialohifomicosis o feohifomicosis, puede requerirse de procedimientos quirúrgicos .En los casos mencionados, es indispensable realizar una o dos exámenes directos, la presencia de hifas hialinas ramificadas o no, con o sin tabiques puede ser suficientemente representativo para involucrar alguno de estos hongos en la patología sospechada. En estos casos es de urgente comunicación, ya que muchas veces la severidad de la infección, no permite el tiempo necesario para el desarrollo del hongo en los medios de cultivo. Estos hongos son sumamente agresivos en el caso de pacientes inmunosuprimidos

MUCOSA VAGINAL

Las muestras de flujo vaginal se toma con hisopo con la ayuda de espéculo. En estos casos, la utilización de medios de transporte para hongos, puede ser de gran utilidad.

Otra forma es transportar el hisopo en solución salina estéril.

OTRAS MUCOSAS. GENITAL MASCULINA, PERIANAL

En el caso del hombre, la mucosa genital es afectada por Candida spp. produciendo, balanitis y balanopostitis.

La lesión blanquecina puede ser tomada por raspado con bisturí e incluso con hisopos.

La secreción uretral debe ser tomada con hisopos especiales y procesada de la misma manera.

Las lesiones perianales, muchas veces son producidas por hongos productores de micosis sistémicas.

Deben tomarse frotis para coloraciones así como también exámenes directos. Las muestras se inoculan directamente en SDA con antibióticos y antimicóticos

TRACTO RESPIRATORIO Estas muestras, son representativas de una

gran parte de las afecciones micóticas, recordando, que la inhalación de las esporas de los hongos por vía pulmonar, es la causa de una serie de enfermedades fúngicas:

Histoplasmosis, Paracoccidioidomicosis,

Coccidioidomicosis, Criptococosis,

Aspergilosis, entre otras.

Muestras utilizadas: esputos, esputo inducido, secreciones bronquiales, cepillado bronquial, lavado bronquioalveolar biopsias transtraqueales

Esputo por expectoración espontánea

La muestra debe obtenerse tras una expectoración profunda preferentemente matinal, mediante tos o fisioterapia respiratoria.

La "calidad", se valora en función del número de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y células epiteliales (CE) presentes presentes en la muestra (> 25 PMN y < 10 CE / campo, x100).

Tiene valor diagnóstico per se en las micosis sistémicas por hongos dimórficos patógenos primarios: H. capsulatum, C. immitis, B. dermatitidis, P. brasiliensis y P. marneffei).

.

Es de particular importancia, utilizar BAL (Lavado bronquioalveolar) este tipo de muestras para el diagnostico de la Pneumonía por Pneumocystis jirovecii.

Los lavados bronquiales, BAL y los esputos inducidos son utilizados para realizar coloraciones tales como:

Gram Wright, Kinyoun Tinta china Plata–metenamina, Papanicolau entre otras

Esputo

La muestra de esputo, debe ser representativa de una afección respiratoria, por lo que no es de utilidad la muestra de saliva o secreción nasal. Se recomienda un estudio seriado de estas muestras (mínimo tres).

La muestra se tomará por expectoración en envase estéril de boca ancha, previa limpieza de los dientes y lavado de la boca con enjuagues bucales, haciendo gargarismos por un tiempo prudencial.

Debe ser tomada preferiblemente en la mañana antes de comer. Evitando de esta forma el acúmulo de partículas alimenticias.

En aquellos pacientes de difícil expectoración, se recomienda el esputo inducido por nebulizaciones con solución salina hipertónica o con ayuda de fisioterapía.

Esputo……

La muestra debe llegar al laboratorio rápidamente para su procesamiento, si no es posible, la muestra se puede refrigerar hasta el momento del estudioEs recomendada la digestión del esputo con sustancias mucolíticas; la más utilizada es la n-acetil cisteína. Una vez realizada la digestión, el esputo se concentra por centrifugación observando el sedimento al microscopio, directamente como se mencionó o con coloraciones tales como Wright, Gram, Kinyoun.

SECRECIONES, LAVADO Y CEPILLADOS BRONQUIALES

Si se trata de lavados y cepillados bronquiales, estas muestras tomadas con la ayuda de un broncoscopio flexible, deben ser procesadas preferiblemente después de su centrifugación .

Inoculadas en medios de SDA con y sin antibióticos y antimicóticos e incubadas a temperatura ambiente y 37°C.

HEMOCULTIVO (SANGRE)

El estudio de la sangre orientada hacia la existencia de una fungémia en pacientes con Síndrome febril prolongado es sumamente difícil.Generalmente la toma de la muestra sanguínea, aunque pareciese sencilla, es una, en las que se producen mayores errores en el momento de su recolección. Entre otros, podemos encontrar: mala asepsia de la piel, y la vía de extracción no es la adecuada muchas veces la muestra es tomada a través del catéter lo cual dificulta el diagnostico de una verdadera fungémia.Otras veces no se mantienen las proporciones de sangre con respecto a los medios de cultivo, (1:10 a 1:20); inclusive, se observa un número menor de cultivos a lo recomendado (mínimo tres)..

Hemocultivo ……

Considerar las medidas de asepsia al obtener la muestra, para evitar contaminaciones en los hemocultivos.Recoger dos o tres muestras de sangre venosa de diferentes punciones y separadas por 30 minutos o una hora entre si. Adultos 8-9 ml, Niños 1-5 ml, Lactantes 1-2 ml, Neonatos 0,5-1ml.Obtenida la muestra de sangre, ésta debe ser inoculada de inmediato en el sistema de hemocultivo que el laboratorio trabaja.

HEMOCULTIVO (SANGRE)……

Como medios de cultivos comerciales podemos encontrar los medios líquidos, difásicos y últimamente medios Isolator (Sistema de lisis centrifugación).

Botellas de hemocultivo automatizado BacT/Alert Botellas de

hemocultivo automatizado BacTec

Tubos Isolator (pediátrico) e Isolator del sistema

lisis-centrifugaciónBotellas de

hemocultivodel sistema

automatizado

Orina

El cultivo de la orina es adecuado cuando existe una sospecha de candidiasis, sin embargo, debe tenerse particular atención en la cantidad, tiempo y hora de recolección, limpieza del área, transporte y conservación.La primera y tercera parte de miccion se elimina.Se recomienda colectar en un recipiente de boca ancha con tapa de rosca y esteril, volumen 10–25 mL.La orina debe ser cultivada con rapidez, si no se realiza inmediatamente puede conservarse en nevera hasta su procesamiento, nunca a temperatura ambienteSe sugiere sembrar el sedimento luego de centrifugación (10 minutos a 1500 r.p.m.)

Orina……

Se realizan examen directo, tinta china, calcofluor y coloraciones de Gram y WrightPuede existir la posibilidad de tener un cultivo positivo debido a contaminación genital sobre todo en las mujeres donde la levadura puede ser flora normal. Nunca debe tomarse muestras de orina directamente de la sonda instalada y mucho menos del recolector de orina.

OTROS FLUIDOS CORPORALES PLEURAL, PERITONEAL, PERICÁRDICO Y SINOVIAL

Estas muestras son tomadas por aspiración percutánea o por drenaje siguiendo los procedimientos de esterilidad. Utilizar frascos con tapa de rosca estériles. Recolectar la mayor cantidad que sea posible (de 2 a 10 ml), se recomienda agregar anticoagulantes

MUESTRAS DE TEJIDO BIOPSIA O AUTOPSIA

Deben ser tomadas con máxima esterilidad utilizando para ellos material estéril e instrumentos apropiados. Es preferible tomar las muestras de los bordes y del centro de la lesión.

Colocarlas en frascos boca ancha estériles con tapa de rosca y en solución salina estéril.

No olvidar enviar cantidad suficiente para los exámenes directos, coloraciones y cultivo, se deben hacer frotis por aposición, (por lo menos dos), de la parte que será enviada al laboratorio de anatomía patológica la cual no necesita esterilidad

MÉDULA ÓSEAMÉDULA ÓSEA

Una de las muestras más valiosas para el estudio micológico de histoplasmosis.

Se recolecta bajo estrictas condiciones de asepsia, Como mínimo 1 a 2 ml de medula osea. Con jeringa heparinizada para evitar la coagulación. Es indispensable realizar un frotis o extendido para

coloraciones. Se inoculan no menos de dos tubos de cultivo con y

sin antibióticos y antimicóticos Incubándolos a temperatura ambiente y 37°C

MATERIAL PURULENTO

Este material debe ser tomado preferiblemente de abscesos cerrados previa limpieza de la zona, utilizando para ello jeringas heparinizada. Si se trata de un absceso abierto que ha drenado espontáneamente se recoge el material con bisturí, asa, espátula y se transporta en tubos cerrados con solución salina estéril.En el caso de sospechar de un Micetoma debe hacerse particular atención a los granos, característicos de este tipo de patologías. Puede colocarse una gasa estéril 24 horas antes de tomar la muestra intentando conseguir los granos que espontáneamente se adhieren a la misma.

MATERIAL PURULENTO…..

Se envía al laboratorio en placas de Petri las cuales serán lavadas con solución salina estéril intentando obtener los granos para procesamiento en el laboratorio. En este caso particular debemos inocular en medios para hongos y para bacterias del Género Actinomicetes.

LAVADO GÁSTRICO

Generalmente este tipo de muestra no es utilizada en el laboratorio sin una buena orientación del hongo productor de la infección. En caso de sospecha de histoplasmosis, candidiasis, geotrichosis e incluso blastomicosis, este material debe ser procesado intentando el aislamiento del hongo. Los resultados exitosos son bajos.La muestra se obtiene por lavado gástrico y se transporta el laboratorio en frasco con tapa de rosca estéril. Se procesa posterior a la centrifugación de la muestra a 1500 r.p.m. por 10 minutos, el sedimento se utilizará para exámenes directos, coloraciones e inoculaciones en medios con o sin antibióticos y antimicóticos. Se incubaran a temperatura ambiente y 37° C.

Cateter intravascular

Desinfectar con alcohol la zona cutanea alrededor de la insercion del cateterRetirar el cateterAsepticamente cortar 5 cm del extremo distal e introducir enun contenedor esteril con tapa de roscaRotular y enviar al laboratorioProcesar de inmediato, conservando a temperatura ambiente por 15 minutos, De lo contrario conservar a 40C por un maximode 24 horas, en este caso sumergirlo en solucion salina esteril.

Catéteres vasculares

Las técnicas más aconsejadas por su simplicidad de procesado, son:1. Técnica semicuantitativa de Maki. Se realiza rodando 5 cm del segmento distal del catéter, sobre placas de agar sangre y SDA cuatro veces, con la ayuda de una pinza estéril.2. Técnica cuantitativa de Brum-Buisson.El extremo distal del catéter, se introduce en un medio de cultivo líquido, se agita en un Vórtex durante 1 min y se siembran 50 μl en placas de agar sangre y SDA

MUESTRA DE HECES

Este tipo de material no es recomendado para estudio micológico ya que existe una gran variedad de hongos comensales que pudieran confundir y dificultar el diagnóstico.

MOCO FECAL: busqueda de Histoplasma capsulatum

PATOGENOS FUNGICOS AISLADOS EN SANGRE OTRAS MUESTRAS ESTERILES