TÉCNICAS TÉCNICAS HISTOLÓGICASHISTOLÓGICAS

TECNICA DE MONTAJE TECNICA DE MONTAJE

MICROSCOPIOMICROSCOPIOÓPTICO COMPUESTOÓPTICO COMPUESTO

COLORANTESCOLORANTESCOLORACIÓNCOLORACIÓN

Clase 1Clase 1

TÉCNICAS HISTOLÓGICASTÉCNICAS HISTOLÓGICAS

Es el conjunto de procesos aplicados Es el conjunto de procesos aplicados para preservar la estructura y la para preservar la estructura y la organización de la célula y los tejidos, a organización de la célula y los tejidos, a fin de obtener una preparación fin de obtener una preparación microscópica que permita su examen con microscópica que permita su examen con el microscopio óptico.el microscopio óptico.

Abarcan desde el momento en que se Abarcan desde el momento en que se toma el material (toma de muestra) hasta toma el material (toma de muestra) hasta que el preparado puede observarse.que el preparado puede observarse.

PASOS DE LAS TÉCNICAS PASOS DE LAS TÉCNICAS

HISTOLÓGICASHISTOLÓGICAS • 1.- Toma de la muestra1.- Toma de la muestra• 2.- Fijación2.- Fijación• 3.- Deshidratación3.- Deshidratación• 4.- Aclaración4.- Aclaración• 5.- Inclusión en parafina5.- Inclusión en parafina• 6.- Modelado del bloque – catalogación6.- Modelado del bloque – catalogación• 7.- Corte 7.- Corte • 8.- Montaje del corte en el portaobjeto8.- Montaje del corte en el portaobjeto• 9.- Desparafinación 9.- Desparafinación • 10.- 10.- HidrataciónHidratación• 11.- 11.- Coloración: de rutina o especialesColoración: de rutina o especiales

TÉCNICAS HISTOLÓGICASTÉCNICAS HISTOLÓGICAS• TOMA DE MUESTRATOMA DE MUESTRA

– FROTISFROTIS

– IMPRONTAIMPRONTA

– ASPIRACIÓN Y/O LAVADOASPIRACIÓN Y/O LAVADO

– PUNCIÓN/ASPIRACIÓN CON AGUJA FINAPUNCIÓN/ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA

– PUNCIÓN CON TROCARPUNCIÓN CON TROCAR

– BIOPSIA BIOPSIA

– NECROPSIA NECROPSIA

TÉCNICAS HISTOLÓGICASTÉCNICAS HISTOLÓGICASETAPASETAPAS FINALIDADFINALIDAD DURACIÓNDURACIÓNFIJACIÓFIJACIÓN: en fijador simple o N: en fijador simple o mezclas fijadora (formol 10%, mezclas fijadora (formol 10%, vol. 40/1) vol. 40/1)

Preserva la morfología y Preserva la morfología y composición de los tejidos, composición de los tejidos, detiene los procesos vitales, detiene los procesos vitales, evita la autolisisevita la autolisis

De 12 a 24 horas, dependiendo De 12 a 24 horas, dependiendo del fijador y del tamaño de la del fijador y del tamaño de la pieza pieza

DESHIDRATACIÓNDESHIDRATACIÓN: en alcohol : en alcohol etílico (etanol), en etílico (etanol), en concentraciones crecientes, concentraciones crecientes, empezando con 70º y empezando con 70º y terminando con 100º terminando con 100º

Eliminar el agua de los tejidos, Eliminar el agua de los tejidos, facilitando la penetración de facilitando la penetración de solventes solventes

De 6 a 24 horas, dependiendo De 6 a 24 horas, dependiendo del tamaño de la piezadel tamaño de la pieza

ACLARACIÓNACLARACIÓN: en benzol, xilol : en benzol, xilol o toluol, solventes del alcohol y o toluol, solventes del alcohol y la parafina la parafina

Embeber la pieza con una Embeber la pieza con una sustancia miscible con la sustancia miscible con la parafina, favoreciendo la parafina, favoreciendo la penetración de la parafinapenetración de la parafina

De 1 a 6 horas dependiendo del De 1 a 6 horas dependiendo del

tamaño de la piezatamaño de la pieza

IMPREGNACIÓNIMPREGNACIÓN: con parafina : con parafina fundida en autotecnicon a 60ºC fundida en autotecnicon a 60ºC

La parafina penetra en los La parafina penetra en los vasos, en los espacios vasos, en los espacios intercelulares y también en el intercelulares y también en el interior de la célula interior de la célula impregnando el tejidos impregnando el tejidos otorgando dureza para facilitar otorgando dureza para facilitar la obtención de cortes en el la obtención de cortes en el microtomo microtomo

De 30 minutos a 6 horas, De 30 minutos a 6 horas, dependiendo del tamaño de la dependiendo del tamaño de la

piezapieza

INCLUSIÓNINCLUSIÓN: la pieza se coloca : la pieza se coloca en un molde rectangular que en un molde rectangular que contiene parafina fundida contiene parafina fundida

Obtención del bloque de Obtención del bloque de parafina de forma regular, para parafina de forma regular, para dar un soporte al tejido y dar un soporte al tejido y facilitar el corte en el facilitar el corte en el microtomo microtomo

TÉCNICAS HISTOLÓGICASTÉCNICAS HISTOLÓGICASETAPASETAPAS FINALIDADFINALIDAD INSTRUMENTINSTRUMENT

OOCORTE: 8- 10 CORTE: 8- 10 µmµm Permite la visualización de Permite la visualización de

estructuras pequeñasestructuras pequeñasMicrotomoMicrotomo: instrumento de : instrumento de precisión, para obtener cortes precisión, para obtener cortes muy delgados (8-10 muy delgados (8-10 µm)µm) y y uniformesuniformes

MOMTAJE DEL MOMTAJE DEL

CORTE EN EL CORTE EN EL PORTAOBJETOPORTAOBJETO

Soporte para la observación Soporte para la observación en el microscopioen el microscopio

PORTAOBJETOSPORTAOBJETOS: los cortes : los cortes se depositan en un recipiente se depositan en un recipiente con agua y luego se montan con agua y luego se montan en los portaobjetosen los portaobjetos

DESPARAFINACIÓNDESPARAFINACIÓN Facilita la penetración del Facilita la penetración del alcoholalcohol

Xilol, benzol, se sumengen los Xilol, benzol, se sumengen los tejidos en concentraciones tejidos en concentraciones decrecientesdecrecientes

HIDRATACIÓNHIDRATACIÓN Permite la penetración de los Permite la penetración de los colorantes acuososcolorantes acuosos

La muestra se sumerge en La muestra se sumerge en soluciones de etanol en soluciones de etanol en concentraciones decrecientes concentraciones decrecientes hasta el lavado final en agua hasta el lavado final en agua destiladadestilada

COLORACIÓNCOLORACIÓN Otorga colores diferentes a la Otorga colores diferentes a la muestramuestra

Es necesaria para dar mayor Es necesaria para dar mayor contraste a los tejidoscontraste a los tejidos

DESHIDRATACIÓNDESHIDRATACIÓN Facilita el montaje con medios Facilita el montaje con medios hidrófoboshidrófobos

Soluciones crecientes de Soluciones crecientes de etanoletanol

ACLARACIÓNACLARACIÓN Otorga transparencia a los Otorga transparencia a los tejidostejidos

Otorga transparencia a los Otorga transparencia a los tejidostejidos

MONTAJE DEL MONTAJE DEL CUBREOBJETOCUBREOBJETO

Permite obtener una Permite obtener una preparación permanentepreparación permanente

El corte se cubre con un vidrio El corte se cubre con un vidrio delgado, con bálsamo de delgado, con bálsamo de CanadáCanadá

COLORACIÓNCOLORACIÓN• Es la propiedad que poseen algunos cuerpos de ejercer Es la propiedad que poseen algunos cuerpos de ejercer

sobre la luz una absorción selectiva, es decir, un cuerpo se sobre la luz una absorción selectiva, es decir, un cuerpo se ve con color porque él absorbe algunas ondas de luz.ve con color porque él absorbe algunas ondas de luz.

• Los cuerpos absorben las ondas de los colores de acuerdo Los cuerpos absorben las ondas de los colores de acuerdo a su composición química, es decir, el color es la a su composición química, es decir, el color es la morfología de la constitución químicamorfología de la constitución química

• El color de una sustancia se debe a la presencia de El color de una sustancia se debe a la presencia de radicales, que dan a la molécula el color.radicales, que dan a la molécula el color.

• Esos grupos se denominan cromóforos y la sustancias que Esos grupos se denominan cromóforos y la sustancias que contienen sus moléculas son llamadas cromógenas.contienen sus moléculas son llamadas cromógenas.

• Tiene por objeto aumentar el contraste de las estructuras Tiene por objeto aumentar el contraste de las estructuras biológicas e identificar los componentes mediante su biológicas e identificar los componentes mediante su afinidad tintorial.afinidad tintorial.

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS COLORATESTÉCNICAS HISTOLÓGICAS COLORATES

• ColoranteColorante: es una sustancia natural o : es una sustancia natural o artificial que tiene la capacidad de transmitir artificial que tiene la capacidad de transmitir su color a otra sustancia o elemento afín a su color a otra sustancia o elemento afín a él, según su composición química o la él, según su composición química o la presencia de ciertos radicales en su presencia de ciertos radicales en su estructura.estructura.

• Pueden ser:Pueden ser:ÁcidosÁcidos----negativo----aniónico---------negativo----aniónico-----acidófilas-----rosadoacidófilas-----rosado

Básicos-Básicos----positivos---catiónicos-------positivos---catiónicos----basófilos-----azul basófilos-----azul

COLORANTESCOLORANTES• Aunque existen varios tipos de colorantes Aunque existen varios tipos de colorantes

para observar los múltiples componentes de para observar los múltiples componentes de las células y tejidos, pueden agruparse en las células y tejidos, pueden agruparse en tres clases:tres clases:

– Colorantes que diferencian los componentes Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de las célulasácidos y básicos de las células

– Colorantes especializados que distinguen los Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelularcomponentes fibrosos de la matriz extracelular

– Sale metálicas que se precipitan en los tejidos y Sale metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales en ellos.forman depósitos de metales en ellos.

COLORACIÓNCOLORACIÓN RESULTADORESULTADO

HematoxilinaHematoxilina Color azul:Color azul: núcleo, matriz del cartílago, regiones núcleo, matriz del cartílago, regiones ácidas del citoplasmaácidas del citoplasma

EosinaEosina Color rosado: Color rosado: fibras colágenas, región básica fibras colágenas, región básica del citoplasmadel citoplasma

Tricrómica de MassonTricrómica de Masson Color azul oscuro:Color azul oscuro: núcleos núcleos

Color rojo:Color rojo: músculo, queratina, citoplasma músculo, queratina, citoplasma

Color azul claro:Color azul claro: mucinógeno, colágeno mucinógeno, colágeno

Elástica de Orceína Elástica de Orceína Color pardo:Color pardo: fibras elásticas fibras elásticas

Elástica de WeigertElástica de Weigert Color azul:Color azul: fibras elásticas fibras elásticas

Argéntica Argéntica Color negro:Color negro: fibras reticulares fibras reticulares

Hematoxilina férrica Hematoxilina férrica Color negroColor negro: estrías del músculo, núcleos, : estrías del músculo, núcleos,

eritrocitoseritrocitos

Ácido Periódico de SchiffÁcido Periódico de Schiff Color magenta:Color magenta: glucógeno, moléculas ricas en glucógeno, moléculas ricas en carbohidratos carbohidratos

Wrigth y GiemsaWrigth y Giemsa Color rosadoColor rosado: eritrocitos, gránulos de : eritrocitos, gránulos de eosinófilos.eosinófilos.

Color purpúreo:Color purpúreo: núcleos de los leucocitos, núcleos de los leucocitos, gránulos de basófilosgránulos de basófilos

Color azul:Color azul: citoplasma de monocitos y linfocitos citoplasma de monocitos y linfocitos

EL MICROSCOPIOEL MICROSCOPIO• El Microscopio es cualquiera de los El Microscopio es cualquiera de los

distintos tipos de instrumentos que se distintos tipos de instrumentos que se utilizan para obtener una imagen utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos.aumentada de objetos.

• Los microscopios compuestos surgieron Los microscopios compuestos surgieron en el siglo XVII, diestramente utilizados en el siglo XVII, diestramente utilizados por el holandés Antonie van Leewenhock por el holandés Antonie van Leewenhock en el estudio de la microfauna de los en el estudio de la microfauna de los estanques y charcas y por Robert Hooke, estanques y charcas y por Robert Hooke, con los primeros estudios de células.con los primeros estudios de células.

TIPOS DE MICROSCOPIOSTIPOS DE MICROSCOPIOS• El microscopio compuestoEl microscopio compuesto u óptico utiliza u óptico utiliza

lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. lentes para ampliar las imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, El aumento obtenido con estos microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz visible que impone debido a la longitud de onda de la luz visible que impone limitaciones. limitaciones.

• Microscopio de campo oscuroMicroscopio de campo oscuro. . Este Este microscopio está provisto de un microscopio está provisto de un condensador paraboloidecondensador paraboloide, , que hace que los rayos luminosos no penetren directamente que hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre un fondo oscurooscuro..

• Microscopio de fluorescenciaMicroscopio de fluorescencia. . La La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas. energéticas.

TIPOS DE MICROSCOPIOSTIPOS DE MICROSCOPIOS

•Microscopio de contraste de Microscopio de contraste de fasesfases. . Se basa en las modificaciones de Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la producen contrastes notables en la

preparación.preparación.

•El microscopio electrónico El microscopio electrónico utiliza como fuente de iluminación un haz utiliza como fuente de iluminación un haz de electrones de alta velocidad acelerados de electrones de alta velocidad acelerados en alto vacío y enfoca sobre una pantalla en alto vacío y enfoca sobre una pantalla por medio de un campo electromagnéticopor medio de un campo electromagnético

MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTOCOMPUESTO

El microscopio óptico común está conformado por tres El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas:sistemas:

• El sistema mecánicoEl sistema mecánico está constituido por una serie de está constituido por una serie de piezas en las que se instalan las lentes y partes que piezas en las que se instalan las lentes y partes que permiten el movimiento para el enfoque. permiten el movimiento para el enfoque.

• El sistema ópticoEl sistema óptico comprende un conjunto de lentes comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de las dispuestas de tal manera que produce el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas. imágenes que se observan a través de ellas.

• El sistema de iluminaciónEl sistema de iluminación comprende las partes del comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad microscopio que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio. microscopio.

La parte mecánica del La parte mecánica del microscopiomicroscopioEstos elementos sostienen la parte óptica y Estos elementos sostienen la parte óptica y

de iluminación, y permiten los de iluminación, y permiten los desplazamientos necesarios para el desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto:enfoque del objeto:

• El pieEl pie• El tuboEl tubo• El revólverEl revólver• El asa o columnaEl asa o columna• La platinaLa platina• El carroEl carro• El tornillo macrométricoEl tornillo macrométrico• El tornillo micrométrico El tornillo micrométrico

Sistema óptico del Sistema óptico del microscopiomicroscopio Es el encargado de reproducir y Es el encargado de reproducir y

aumentar las imágenes mediante el aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes dispuestas de tal conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de las manera que produce el aumento de las imágenes que se observan a través de imágenes que se observan a través de ellas. ellas.

• Los ocularesLos oculares

• Los objetivos.Los objetivos.

Sistema de iluminación del Sistema de iluminación del microscopiomicroscopio Este sistema tiene como finalidad dirigir Este sistema tiene como finalidad dirigir

la luz de tal manera que ilumine la la luz de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende observar en el microscopio. Comprende los siguientes elementos:los siguientes elementos:

• El condensadorEl condensador

• El Diafragma El Diafragma

Propiedades del microscopioPropiedades del microscopio • Poder separador Poder separador oo poder de resolución poder de resolución, es la , es la

distancia mínima entre dos puntos próximos que distancia mínima entre dos puntos próximos que pueden verse separados. (0,2 micras)pueden verse separados. (0,2 micras)

• Poder de definiciónPoder de definición. Se refiere a la nitidez de . Se refiere a la nitidez de las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a las imágenes obtenidas, sobre todo respecto a sus contornos. Depende de la calidad y de la sus contornos. Depende de la calidad y de la corrección de las aberraciones de las lentes corrección de las aberraciones de las lentes utilizadas. utilizadas.

• Aumento del microscopioAumento del microscopio. Es la relación entre . Es la relación entre el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o el diámetro aparente de la imagen y el diámetro o longitud del objeto. Para calcular el aumento de longitud del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta multiplicar el aumento del un microscopio, basta multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. ocular por el aumento del objetivo.

Célula, funciones, propiedades,Membrana y citoplasma