Clase Micro Arrays (060910) Final

Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina, Universidad de Chile

TECNOLOGA DE MICROARRAYS Y ANALISIS DE DATOS

Programa de Biologa Celular y Molecular 6 Septiembre 2010

Dra. Nevenka Jureti D.

BIOINFORMTICA

Biologa Computacin Tecnologa de la informacin

Microarrays

Arreglo ordenado de secuencias de DNA conocidas sobre un sustrato slido (soporte).

Soportes1.- Filtros o membranas de nitrocelulosa o nylon 2.- Silicio 3.- Portaobjetos de vidrios cubiertos con: aminosilanos aldehdos epoxi polilisinaUrza 2006

Superficies qumicas

Fabricacin1.- Sntesis in situ sobre un soporte slido (vidrio) a) Fotolitografa (Affymetrix) Sondas cortas Muy caro b) Tecnologa a chorro de tinta (ink-jet) Sondas ms largas Ms barato, se basa en qumica convencional

Fabricacin

2.- Deposicin mecnica de sondas presintetizadas: a) Oligonucletidos b) Productos de PCR c) EST (Expressed Sequence Tagged)

Urza 2006

Tipos de microarrays1.- Microarrays de DNA: DNA o cDNA depositado sobre soporte slido 2.- Microarrays de oligonucletidos: Oligonucletidos directamente sintetizados in situ sobre el soporte slido Generalmente se sintetizan en el mismo punto hasta 20 oligos perteneciente al mismo cDNA.

Tipos de microarrays de DNA1.- Microarrays en portaobjetos Fabricacin mediante spotting o microinyeccin

2.- Microarrays de alta densidad o DNA chips

Sntesis de sondas in situ (Affymetrix) Fotolitografa

3.- Chips microelectrnicos o Nano Chips

Tecnologas de Microarrays Affymetrix Spotting

Que nos permite un array?

Identificacin de una secuencia de DNA (gen/mutacin de un gen) Determinacin del nivel de expresin (abundancia) de genes

Se utilizan para estudiar el perfil de expresin de miles de transcritos a la vez.

Tcnica de MicroarraysRNA de muestras control RNA de muestras estimuladas

Marcacin con Alexa 555-dUTP Alexa 647-dUTP

Hibridacin a 58C toda la noche Escaner laser dual Microarray

Anlisis computacionalSoftware GenePix Pro 3.0

Marcacin fluorescente

(Herrera 2007)

- Cyanine 3-dUTP

532 nm 635 nm 555 nm 647 nm

Fluorforos ms utilizados

- Cyanine 5-dUTP - Alexa 555-dUTP - Alexa 647-dUTP

Principio bsico: hibridacin

Hibridacin

Urza 2006

Cmara de hibridacin

TE

Array Cubreobjeto PortaobjetoLABEL

Nmero (marca)

Lavados

Urza 2006

Escaner

Urza 2006

Variables que pueden afectar los resultados

Calidad del RNA

Pureza Integridad

Cantidad de RNA disponible

Amplificacin del RNA1) Sntesis de la primera hebra de cDNA

2) Tallo de la primera hebra de cDNA

3) Sntesis del promotor T7

4) Transcripcin in vitro

Pregunta biolgicaDiseo experimental Experimento de microarrays

Anlisis de imagen Preprocesamiento y Normalizacin Anlisis estadstico Anlisis fxProc. biolgicos / vas / cluster / etc

Verificacin biolgica e interpretacin

Anlisis de imgenesSoftware GenePix Pro 3.0 (imgenes en tiff a gpr y jpg)

Image

Analyze Image

Scan Wash Hybridize probe to Array

Gal file(Gene array list file)

Control

Experiment

DNA Samples

Bloque con grilla superpuesta

Bloque alineado

Resumen de las etapas del anlisis de imagen Programa Gene Pix Pro- Se abren las imgenes escaneadas (.tif) - Se descarga el archivo GAL apropiado (.gal) - Se alinea la grilla con los bloques impresos del array - El programa realiza las mediciones - Los resultados se obtienen como archivos .gpr

Obtencin de datos crudos

Normalizacin

Correccin tcnica (experimental) Ajuste de los resultados a un estndar comn que permite corregir la diferencias de las intensidades de hibridaciones entre experimentos (genes housekeeping)

Preprocesamiento

1.- Remover los replicados inconsistentes 2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays 3.- Inputacin (KNN-Inpute)

1.- Remover los replicados inconsistentes

X

2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays

X

3.- Inputacin (KNN-Inpute)

Valor asignado mediante algoritmo

Preprocesamiento

1.- Remover los replicados inconsistentes 2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays 3.- Inputacin KNN-Inpute

Matriz de datos completos y normalizados

Preprocesamiento Normalizacin

Anlisis estadstico

Datos crudos

Datos completos y normalizados

Set de genes

Anlisis funcional

Bases de datos

TIPOS DE BASES DE DATOS

Base de datos privadas Base de datos pblicas

Base de datos privadaBase de datos para Microarrays del National Cancer Institute of Frederick, EEUU

mAdb(microarray database)

http://nciarray.nic.nih.gov

Image

Software GenePix Pro 3.0 (imgenes en tiff a gpr y jpg)

MicroArray database (mAdb)

Analyze Image

Format and Upload Image and Data

Scan Wash Hybridize probe to Array

Web/ Application Server

Central Expression Database

Control

Experiment

MGD

KEGG

TIGR

DNA Samples

GenBank (via Entrez)

UniGene

dbEST*

GeneCards

External Databases

Internal Databases

mAdb Home Page (http://nciarray.nci.nih.gov)

Creacin de un proyecto


Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)

Filtros adicionales % de arrays

Razn mayor o igual a 2 (simtrico)

Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)

Resultados expresados como Promedio ER (Log2)



Filtros adicionales % de arrays

Razn mayor o igual a 2 (simtrico)



Subir los archivos a la base de datos

Arrays Ingresados a la base de datos


Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array (dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background) Filtros adicionales % de arrays, Razn mayor o igual a 2 (simtrico) Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)


Selecting Filtering Options Signal Calculation: Median Int Median Bkg Normalization Method: 50th Percentile (Median) Default Ratio: ChanB/ChanA

Exclude any Spots indicated as Bad or Not Found Signal >= 200 and 200 Override if Chan B Signal >= 5000 Override if Chan A Signal >= 5000

Filtros segn la calidad del spot Go to next page to choose arrays

Resultado

Spot que cumplen con las caractersticas asignadas



Filtros adicionales

% de arrays, Razn mayor o igual a 2 (simtrico)



Selecting spots based on value characteristics

Anlisis estadstico

Anlisis funcional

Clustering

Base de datos pblica GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es)

GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es)

Anlisis funcional de genes: 1) FatiGO de GEPAS

2) FatiGO Plus de GEPAS

Otros links de inters

1) Venn Diagram Generator(http://pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgi)

Diagrama de Venn

131 131

19 19

Grupo 1

113 113

Genes comunes Grupo 2

Figura 1: Se ingresaron 2 listas de genes, una con 150 y la otra con 132 genes. En el diagrama se observa el nmero de genes que se expresan diferencialmente en cada grupo de estudio.

2) SOURCE Search(http://smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch)

Figura 2: Bsqueda de informacin sobre el gen de Interleuquina-6Datos ingresados: Organism: Mus musculus Option: Gene name/Symbol Term: IL-6

3) Chilibot (http://www.chilibot.net)

Figura 3: Se ingres una lista con 44 genes y se realiz la bsqueda utilizando la palabra clave calcio. En el esquema se observan todos los genes que de alguna manera estn relacionado con calcio, segn la base de datos del pubmed.

Pregunta biolgicaDiseo experimental Experimento de microarrays

Anlisis de imagen Preprocesamiento y Normalizacin Anlisis estadstico Anlisis fxProc. biolgicos / vas / cluster / etc

Verificacin biolgica e interpretacin

Gracias! Contacto: [email protected]

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