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RELACIONES DOSIS-RELACIONES DOSIS-

RESPUESTA RESPUESTA

Y CALCULOSY CALCULOS

Anabel G. Tatis R., M.Sc.Anabel G. Tatis R., M.Sc.CIIMET, Faculta de MedicinaCIIMET, Faculta de Medicina

Universidad de PanamáUniversidad de Panamá

?

IntroducciónIntroducción

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Uno de los aspectos importantes en Uno de los aspectos importantes en toxicología y ecotoxicología es la relación toxicología y ecotoxicología es la relación entre la concentración de un compuesto entre la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo, y químico a la cual se expone un organismo, y el consecuente efecto nocivo que le produce. el consecuente efecto nocivo que le produce.

Esta relación, conocida como la relación Esta relación, conocida como la relación dosis-respuesta, constituye la base para la dosis-respuesta, constituye la base para la evaluación del peligro y el riesgo generado evaluación del peligro y el riesgo generado por las sustancias químicas en el medio por las sustancias químicas en el medio ambiente. ambiente.

Los gráficos bivariables de estas Los gráficos bivariables de estas relaciones muestran en general patrones relaciones muestran en general patrones no rectilíneos de tipo sigmoide.no rectilíneos de tipo sigmoide.

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Existen muchas formas de determinar la Existen muchas formas de determinar la toxicidad, y aunque los efectos toxicidad, y aunque los efectos bioquímicos, fisiológicos, reproductivos bioquímicos, fisiológicos, reproductivos y de comportamiento son de gran y de comportamiento son de gran utilidad, el indicador comúnmente más utilidad, el indicador comúnmente más utilizado es la muerte del organismo de utilizado es la muerte del organismo de prueba. prueba.

La mayoría de las pruebas de toxicidad La mayoría de las pruebas de toxicidad suministran una estimación de la dosis suministran una estimación de la dosis (o concentración en el alimento, aire o (o concentración en el alimento, aire o agua) que produce una respuesta tóxica agua) que produce una respuesta tóxica a un nivel del 50%.a un nivel del 50%.

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5

Dosis Cantidad

Dosis potencial (externa)

=

Es la cantidad de una sustancia

contenida en el material ingerido, en el aire

inspirado o en el material aplicado a la piel

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Dosis tóxicaDosis tóxica

Aquella dosis que produce algún efecto dañino

Dosis letalDosis letal

Aquella que produce la muerte

DL100

DL50

(Dosis letal 100)

(Dosis letal 50)

Valores o estimaciones Valores o estimaciones más comunesmás comunes

La dosis letal media es la dosis o La dosis letal media es la dosis o concentración que mata al 50% de la concentración que mata al 50% de la población (CLpoblación (CL5050).).

Otro indicador que ha ganado gran Otro indicador que ha ganado gran

popularidad es la dosis o concentración popularidad es la dosis o concentración más alta a la cual no se observa ningún más alta a la cual no se observa ningún efecto (NOEC/NOEL).efecto (NOEC/NOEL).

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El análisis de relaciones entre dos o El análisis de relaciones entre dos o más variables implica la utilización de más variables implica la utilización de técnicas estadísticas de regresión. técnicas estadísticas de regresión.

Estas técnicas requieren, antes de ser Estas técnicas requieren, antes de ser aplicadas, la selección de la ecuación aplicadas, la selección de la ecuación matemática (el modelo) con la que se matemática (el modelo) con la que se relacionarán las variables analizadas. relacionarán las variables analizadas.

A su vez, en la selección del modelo a A su vez, en la selección del modelo a utilizar, es de vital importancia el tipo utilizar, es de vital importancia el tipo de variables a relacionar.de variables a relacionar.

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Tipos de Tipos de VariablesVariables

Cualitativas Cualitativas

Cuantitativas Cuantitativas discretas discretas

(valores enteros)(valores enteros) continuas continuas

(valores reales)(valores reales)

Deben ser expresadas Deben ser expresadas de forma cuantitativa de forma cuantitativa antes del análisis. antes del análisis.

En los ensayos de En los ensayos de mortalidad, sólo se mortalidad, sólo se pueden tomar los pueden tomar los estados de vivo o estados de vivo o muerto.muerto.

Debe expresarse en % Debe expresarse en % de muertos antes ser de muertos antes ser analizadas por regresión.analizadas por regresión.

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Análisis Análisis estadístico de estadístico de

regresiónregresión

En lo que respecta a las relaciones entre la En lo que respecta a las relaciones entre la concentración-respuesta, existen otras concentración-respuesta, existen otras aproximaciones al análisis de dichas aproximaciones al análisis de dichas relaciones. relaciones.

P.e. determinar la concentración a la cual P.e. determinar la concentración a la cual no se observa un efecto tóxico sobre el no se observa un efecto tóxico sobre el organismo expuesto, o la concentración organismo expuesto, o la concentración más baja a la cual se observa un efecto más baja a la cual se observa un efecto tóxico. tóxico.

Este tipo de análisis se realiza a través del Este tipo de análisis se realiza a través del método de ANOVA (análisis de la varianza) método de ANOVA (análisis de la varianza) o su equivalente no paramétrico.o su equivalente no paramétrico.

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Pruebas de toxicidadPruebas de toxicidad

Una prueba de toxicidad típica involucra:Una prueba de toxicidad típica involucra:

agente o estímulo agente o estímulo (p.ej., un plaguicida, un (p.ej., un plaguicida, un metal pesado o una muestra ambiental con metal pesado o una muestra ambiental con contaminantes químicos), el cual se aplica a contaminantes químicos), el cual se aplica a un… un…

sujetosujeto , que es un organismo o grupo de , que es un organismo o grupo de organismos (p.ej., un cultivo bacterial o de organismos (p.ej., un cultivo bacterial o de un alga, animales, o plantas), sobre el que un alga, animales, o plantas), sobre el que se evalúa una… se evalúa una…

respuestarespuesta preseleccionada. preseleccionada. 11

La respuesta del sujeto se valora La respuesta del sujeto se valora mediante…mediante…

la cuantificación final de alguna la cuantificación final de alguna características (peso del cuerpo, peso del características (peso del cuerpo, peso del hígado, ritmo cardiaco, etc.),hígado, ritmo cardiaco, etc.),

el cambio de ella (aumento en el peso el cambio de ella (aumento en el peso corporal, disminución en la presión corporal, disminución en la presión sanguínea) o sanguínea) o

por la ocurrencia o no de un determinado por la ocurrencia o no de un determinado fenómeno (muerte, inhibición del fenómeno (muerte, inhibición del crecimiento, una contracción muscular, crecimiento, una contracción muscular, etc.).etc.). 12

Como la magnitud o la frecuencia de la Como la magnitud o la frecuencia de la respuesta dependen de la dosis aplicada, las respuesta dependen de la dosis aplicada, las pruebas se diseñan utilizando distintas dosis.pruebas se diseñan utilizando distintas dosis.

La información obtenida permite la La información obtenida permite la cuantificación de la relación entre las dos cuantificación de la relación entre las dos variables (dosis y respuesta), caracterizando variables (dosis y respuesta), caracterizando así al compuesto. así al compuesto.

Los ensayos se diseñan para comparar o Los ensayos se diseñan para comparar o estimar la potencia de un agente con estimar la potencia de un agente con relación a una relación a una preparación estándar o preparación estándar o control.control.

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Métodos estadísticosMétodos estadísticos

Utilizar una metodología estadística Utilizar una metodología estadística desde la planificación hasta la ejecución desde la planificación hasta la ejecución y el posterior análisis de los resultados.y el posterior análisis de los resultados.

Se recomienda seleccionar un método Se recomienda seleccionar un método estadístico sencillo, que se ajuste a las estadístico sencillo, que se ajuste a las condiciones experimentales y que condiciones experimentales y que permita obtener resultados válidos.permita obtener resultados válidos.

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Validez y Validez y precisiónprecisión

Diseños de los Diseños de los experimentosexperimentos

En las pruebas de toxicidad se deben En las pruebas de toxicidad se deben seguir los principios básicos para el seguir los principios básicos para el diseño de experimentos. diseño de experimentos.

Implica un número razonable de Implica un número razonable de repeticiones, aleatorización de las dosis repeticiones, aleatorización de las dosis en las unidades experimentales y un en las unidades experimentales y un control para lograr una estimación control para lograr una estimación válida del error experimental.válida del error experimental.

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Elementos básicos del Elementos básicos del diseño experimentaldiseño experimental

Unidad experimentalUnidad experimental Respuesta (Respuesta (punto finalpunto final))

Observación. medición. identificaciónObservación. medición. identificación Condiciones para la evaluaciónCondiciones para la evaluación

Tamaño de población, ensayo de supervivencia Tamaño de población, ensayo de supervivencia paraleloparalelo

Grupos de tratamientoGrupos de tratamientoDosis-respuesta, controles, varias muestras Dosis-respuesta, controles, varias muestras individualesindividuales

Fuentes de variabilidadFuentes de variabilidad Fuentes de sesgosFuentes de sesgos Métodos de evaluación estadísticaMétodos de evaluación estadística 16

Establecimiento de una Establecimiento de una relación dosis-respuestarelación dosis-respuesta

Determinar los valores de la variable Determinar los valores de la variable concentración de tóxico concentración de tóxico que causan un que causan un grado de efecto, en particular sobre los grado de efecto, en particular sobre los organismos expuestos.organismos expuestos.

Concentración letal, efectiva o Concentración letal, efectiva o inhibitoria 50 inhibitoria 50 (CL(CL5050/CE/CE5050/CI/CI5050), que es la ), que es la concentración que produce la respuesta concentración que produce la respuesta esperada sobre el 50% de los organismos esperada sobre el 50% de los organismos expuestos.expuestos.

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Establecimiento de una relación Establecimiento de una relación dosis-respuesta de tipo dosis-respuesta de tipo mortalidadmortalidad

Cuatro métodos para la estimación de Cuatro métodos para la estimación de CL50/CE50/CI50:CL50/CE50/CI50:

1. Método Probit (paramétrico).1. Método Probit (paramétrico).

2. Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico).2. Método de Litchfield-Wilcoxon (gráfico).

3. Método de Sperman-Karber (no 3. Método de Sperman-Karber (no paramétrico).paramétrico).

4. Método gráfico.4. Método gráfico.

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Análisis de regresión y Análisis de regresión y análisis Probitanálisis Probit En un experimento típico de pruebas de En un experimento típico de pruebas de

toxicidad aguda se tiene la siguiente toxicidad aguda se tiene la siguiente situación:situación:

• • Concentración de la sustancia o dosis (Concentración de la sustancia o dosis (dd).).

• • Número de individuos (Número de individuos (nn).).

• • Número de organismos muertos o afectados Número de organismos muertos o afectados ((rr).).

• • Porcentaje de efecto (Porcentaje de efecto (pp).).

19 Software de la US Environmental Protection Software de la US Environmental Protection

Agency (US EPA): Probit Analysis Program, versión Agency (US EPA): Probit Analysis Program, versión 1.5.1.5.

La gráfica de La gráfica de p vsp vs. . dd, o relación dosis-, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que respuesta, genera una curva parabólica que presenta dificultades en la construcción de presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal.un modelo lineal.

Se transforma Se transforma dd a una escala logarítmica ( a una escala logarítmica (XX = log10(= log10(dd), lo cual mostrará una relación ), lo cual mostrará una relación dosis-respuesta de forma dosis-respuesta de forma SS o sigmoidea o sigmoidea normalnormal

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Ejemplo de cálculo simplificado Ejemplo de cálculo simplificado de la CLde la CL5050 por el método Probit por el método Probit

Contar, por lo menos, con dos % intermedios del Contar, por lo menos, con dos % intermedios del efecto esperado (valores entre 0 y 100%).efecto esperado (valores entre 0 y 100%).

Con los resultados obtenidos se construye la tabla Con los resultados obtenidos se construye la tabla A:A:

• • Concentración de la sustancia ensayada (en %).Concentración de la sustancia ensayada (en %).

• • Logaritmo 10 de las anteriores concentraciones (Logaritmo 10 de las anteriores concentraciones (xx).).

• • No. de organismos en cada concentración (No. de organismos en cada concentración (NN).).

• • No. de organismos muertos en cada concentración (No. de organismos muertos en cada concentración (rr).).

• • Porcentaje de mortalidad en cada concentración (Porcentaje de mortalidad en cada concentración (PP).).

• • Probit empírico (Probit empírico (PEPE).).

• • Probit esperado o calculado (Probit esperado o calculado (YY).).21

Los cinco primeros resultados corresponden a Los cinco primeros resultados corresponden a datos experimentales; el Probit empírico se datos experimentales; el Probit empírico se obtiene de la tabla B con el porcentaje de obtiene de la tabla B con el porcentaje de mortalidad observada en cada una de las mortalidad observada en cada una de las concentraciones.concentraciones.

Tabla A. Ejemplo de cálculo de la CL50 por el método Probit.

[C] del

agente

tóxico

(%)

Log10 de

la [C]

(X)

No. de

organismos

(N)

No. de

muertos

(r)

% de

mortalidad

(P)

Probit

empirico

(PE)

Probit

calculado

(Y)

100 2,0 20 15 75 5,67 5,53

50 1,7 20 9 45 4,87 4,96

25 1,4 20 5 25 4,33 4,40

12,5 1,1 20 2 10 3,72 3,84

6,25 0,8 20 1 5 3,36 3,27

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Tabla B. Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad.

% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12

20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45

30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72

40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97

50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23

60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50

70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81

80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23

90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

% 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

99a 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 9,09

a Valores entre 99,0 y 99,9.

23

Se elabora una gráfica en papel cuadriculado, Se elabora una gráfica en papel cuadriculado, colocando en el eje colocando en el eje xx el logaritmo de las el logaritmo de las concentraciones y en el eje concentraciones y en el eje YY el Probit empírico el Probit empírico (figura 1), y se ajusta la recta a través de estos (figura 1), y se ajusta la recta a través de estos puntos. puntos.

En el gráfico se traza una línea a partir del Probit En el gráfico se traza una línea a partir del Probit 5,0 hasta cortar la línea trazada; el valor 5,0 hasta cortar la línea trazada; el valor correspondiente en el eje correspondiente en el eje xx se denomina se denomina mm y el y el antilogaritmo de este valor corresponderá a la antilogaritmo de este valor corresponderá a la CECE5050 o CL o CL5050. En este ejemplo, . En este ejemplo, mm = 1,72, por tanto, = 1,72, por tanto, CLCL5050 = 52,5 miligramos por litro. = 52,5 miligramos por litro.

24

25

Figura 1. Representación gráfica del cálculo de la CL50.

Método gráficoMétodo gráfico

Se parte de los datos obtenidos en las pruebas de Se parte de los datos obtenidos en las pruebas de toxicidad aguda, y utilizando papel logarítmico se toxicidad aguda, y utilizando papel logarítmico se grafican en el eje de las grafican en el eje de las XX las concentraciones las concentraciones (mg/L) y en el eje de las (mg/L) y en el eje de las YY el porcentaje de el porcentaje de mortalidad. Se colocan los puntos de los mortalidad. Se colocan los puntos de los porcentajes de mortalidad observados (en escala porcentajes de mortalidad observados (en escala lineal) en función de las concentraciones probadas lineal) en función de las concentraciones probadas (en escala logarítmica);(en escala logarítmica);

Se conectan los puntos obtenidos más cercanos al Se conectan los puntos obtenidos más cercanos al 50% del efecto observado, o sea, a la mayor 50% del efecto observado, o sea, a la mayor concentración que no causa efecto tóxico y a la concentración que no causa efecto tóxico y a la menor concentración que causa efecto tóxico. menor concentración que causa efecto tóxico. 26

A partir de la recta trazada, se obtiene A partir de la recta trazada, se obtiene el punto de corte correspondiente al el punto de corte correspondiente al 50% del efecto observado.50% del efecto observado.

Este valor corresponde a la Este valor corresponde a la CLCL5050/CE/CE5050/CI/CI5050 del estímulo o agente del estímulo o agente estudiado (Hubert, 1980 y 1995; Finney, estudiado (Hubert, 1980 y 1995; Finney, 1978). 1978).

27

Método gráficoMétodo gráfico

28

DOSIS ESTIMADA DE DOSIS ESTIMADA DE EFECTOS TÓXICOSEFECTOS TÓXICOS

29

CURVAS DOSIS-CURVAS DOSIS-RESPUESTARESPUESTA

Pruebas para evaluar la diferencia Pruebas para evaluar la diferencia entre organismos expuestos a entre organismos expuestos a distintas dosis contra un control distintas dosis contra un control negativo (dosis 0)negativo (dosis 0)

Para determinar la concentración más alta a la Para determinar la concentración más alta a la que no se observa efecto (NOEC) o la que no se observa efecto (NOEC) o la concentración más baja a la que se observa concentración más baja a la que se observa efecto (LOEC) se aplican pruebas de hipótesis.efecto (LOEC) se aplican pruebas de hipótesis.

El método clásico para este análisis es el ANOVA, El método clásico para este análisis es el ANOVA, seguido por la prueba seguido por la prueba a posterioria posteriori de Dunnet. de Dunnet.

Diseñada para comparar los resultados obtenidos Diseñada para comparar los resultados obtenidos para un tratamiento en particular contra un para un tratamiento en particular contra un control negativo (tratamiento con dosis 0).control negativo (tratamiento con dosis 0).

30

Diplomado de Toxicología Ambiental 31

NOAEL Y LOAELNOAEL Y LOAEL

32

Dosis Interna

Es la cantidad de una sustanciaque atraviesa una barrera de

absorción (límite de intercambio) de un organismo, ya sea por

medio de mecanismos físicos o biológicos.

(Dosis absorbida)

mg/kg/día

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Una estimación de la dosis (exposición) diaria que esprobable que no resulte enefectos adversos, aún si la exposición es continua durante toda la vida.

IDA

IDA = -------------------------NOAEL

Factor de Seguridad

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Dosis de Referencia: DRf

Una estimación (con un factor de incertidumbre) de una dosisque administrada durante toda la vida, es improbable que cause un riesgo significativo parala salud de poblaciones humanas.

EPA

DRf = -----------NOAEL

F I x FP

Se expresa en mg/kg/día

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Dosis de Referencia (DRf)

36

Para sustancias no carcinogénicas

Factores de incertidumbre

Considera variaciones en la sensibilidad de la población humana

Al extrapolar al hombre la información obtenida en animales

Cuando para calcular la DRf se utilizaun NOAEL derivado de un estudio subcrónico en lugar de uno crónico

Cuando se utiliza LOAEL en vez de NOAEL

10

10

10

10

37

Para sustancias no carcinogénicas

Factores de ponderación

Considera factores de incertidumbre no incluidos anteriormente a juicio del profesional

> 0 a 10