Clasificación de proteínas de la membrana nuclear en la mitosis

Philippe Collas Jean-Claude Courvalin  Instituto de Bioquímica Médica, Universidad de Oslo, Oslo, Noruega

Abstracto

La envoltura nuclear (NE) se descompone reversible y vuelve a montar en la mitosis. Dos modelos de mitótico membrana nuclear desmontaje y reforma han surgido de los estudios de la dinámica de NE en las células somáticas y extractos de huevo. Uno de los modelos sugiere que las membranas fragmento nuclear reversiblemente por vesiculación, produciendo vesículas NE-derivados separados desde el retículo endoplásmico. El segundo modelo propone que las membranas nucleares desaparecen por difusión de sus proteínas integrales a través de un retículo endoplásmico continua. A continuación, se discuten críticamente los fundamentos de la elaboración de estos puntos de vista aparentemente excluyentes. Nuestras conclusiones a favor de un modelo en el que las membranas nucleares no vesicular durante la mitosis.

La envoltura nuclear (NE) compartimenta el núcleo de las células eucariotas (de mayor . Fig. 1 ). Se compone de dos bicapas concéntricas, la membrana nuclear externa y la membrana nuclear interna (INM), que están conectados por dominios de la membrana fuertemente dobladas asociados con complejos de poro nuclear (NPC). La membrana nuclear externa está en continuidad directa con el retículo endoplásmico (RE) y es bioquímicamente y funcionalmente similar a la membrana del RE. Por lo tanto, la NE puede ser considerado como un subcompartimento especializado de la sala de emergencias. El INM contiene proteínas integrales de membrana específicos que proporcionan sitios de unión para la heterocromatina y la lámina nuclear, una malla de filamentos intermedios. Como se fenestrado la lámina, el INM también interactúa directamente con la cromatina. Las membranas de la APN también puerto proteínas integrales específicos que se cree que anclar los NPC y desempeñar un papel en su conjunto.

FIGURA 1.  Diagrama de los dominios de la membrana nuclear y proteínas integrales representativos. Para mayor claridad, el complejo del poro nuclear (CPN) no está

representado. Proteínas integrales de la membrana nuclear interna (INM) incluyen el receptor de lamina B (LBR) 26 , polipéptidos lámina-asociados (PAL) 9 , emerina 27 y man1 28 . Una proteína adicional politópica INM integral, Nurim, se ha caracterizado recientemente 29 , aunque su topología es provisional en la actualidad (T. Rapoport, com. commun.). LAP2β es el componente mejor caracterizada de una familia de varias proteínas generadas por splicing alternativo a partir de una sola copia del gen 19 . Las glicoproteínas gp210 30y POM121 31 residen en la membrana de poro. Después de la síntesis, las proteínas difunden rápidamente y libremente dentro de las membranas de retículo endoplasmático (ER) y llegar a ser completamente inmovilizados por la unión fuerte de la heterocromatina y / o la lámina, o a los componentes de la APN.

El NE es una estructura dinámica que se desarrolla en la interfase, se descompone en la profase de la mitosis y la vuelve a montar en la anafase, telofase y G1 temprana. Los datos acumulados en los últimos 30 años se han generado dos modelos para la mitosis desmontaje y montaje de las membranas nucleares. En un modelo, fragmento nuclear membranas reversiblemente durante la mitosis por vesiculación y / o fusión intraluminal, la generación de vesículas NE-derivados distintos de la sala de emergencias. El segundo modelo excluye cualquier vesiculación mitótico del NE y propone que los dominios de la membrana nuclear desaparecen transitoriamente por la difusión de sus proteínas integrales específicas a través de una ER continua.

Se argumenta aquí que estos modelos aparentemente mutuamente excluyentes se han originado a partir de la utilización de diferentes métodos de análisis, la combinación de los datos obtenidos a partir de dos sistemas biológicos diferentes y la extrapolación de las membranas nucleares de los mecanismos de formación de vesículas de membrana y la fusión se describe para otros compartimentos de membrana. Para mayor claridad, se discuten por separado los datos obtenidos a partir del análisis de las células somáticas mitóticas y de los sistemas de reconstitución nucleares libres de células, principalmente derivados de huevos.

Mitótico nuclear de desmontaje y montaje en las células somáticas

Varias observaciones e hipótesis han prestado apoyo al modelo de la membrana nuclear desmontaje por vesículas. En primer lugar, los análisis ultraestructurales han demostrado que las membranas nucleares se descomponen en la mitosis por la fragmentación progresiva, dando la impresión de un proceso de escisión aleatoria 1 . En segundo lugar, los estudios de tráfico intracelular membrana condujeron a la propuesta de que, como con el aparato de Golgi y la sala de emergencias, la estructura de la NE representa un equilibrio entre las actividades de escisión y de fusión 2 . Durante la mitosis, escisión prevalecería sobre la fusión, la generación de vesículas NE derivados, mientras predominio de la fusión en la interfase permitiría la reconstitución del NE. En tercer lugar, a partir de hace una década, la identificación de un número cada vez mayor de los marcadores del INM y la membrana NPC proporciona herramientas muy valiosas para el estudio de NE desmontaje y montaje durante la mitosis (ver fig. 1 para una descripción de estos marcadores). El uso de anticuerpos contra las proteínas del INM y de la membrana de la APN, que

mostramos en los estudios morfológicos y bioquímicos de las células HeLa mitótico 3  y  4 que el huso mitótico, aparentemente excluido membranas que contienen estos marcadores, lo que permite la segregación completa de los cromosomas en metafase. Por otra parte, los marcadores del INM [lamin B receptor (LBR) y lamina asociada polipéptido 2 (LAP2)] y de la membrana NPC (glicoproteína gp210) fueron atacados de nuevo a la cromatina secuencialmente, a principios de anafase y telofase tarde, respectivamente. Por último, las fracciones de membrana enriquecidas en los marcadores INM o gp210 podrían aislarse a partir de homogeneizados de células mitóticas. En el marco conceptual de la fragmentación de la membrana nuclear durante la mitosis, estos datos fueron interpretados como un argumento a favor de una vesiculación dominio específico de las membranas nucleares 3  y  4 (ver . Fig. 2a ).

FIGURA 2.  Modelos de envoltura nuclear (NE) desmontaje y reforma en la mitosis. Dominios de la membrana que albergan la membrana nuclear interna (INM), receptor de proteína lamina B (LBR) y los poros gp210 glicoproteína de membrana se consideran como ejemplos. En todos los modelos, LBR se encuentra en el (ER) de la red retículo endoplásmico en la mitosis 7 . En la metafase, los cromosomas se segregan en el husillo, evitando cualquier contacto con las membranas NE-derivados. A partir de la anafase, estos contactos se restablecen progresivamente 4 . (A) En el modelo de vesícula, gp210 se encuentra en vesículas de membrana distintos de la sala de emergencias. Asamblea de las membranas nucleares implica la focalización secuencial de LBR por difusión dentro de la sala de emergencia y el anclaje a la superficie cromosoma, seguido de la fusión de la membrana y la orientación de gp210 a la cromatina. (B) Tanto LBR y gp210 se encuentran dentro de la sala de emergencias. Dos escenarios se prevén. En primer lugar, la pérdida de la integridad de los dominios de la membrana nuclear en los resultados de la mitosis en la difusión de todas las proteínas de la membrana nuclear en toda la sala de emergencia (modelo de difusión al azar). Alternativamente, microdominios de membrana enriquecidos en proteínas nucleares específicas de la membrana nuclear se mantienen en el RE mitótico (modelo de dominio). La reunión en microdominios de varias proteínas de una ubicación similar NE se puede imaginar (por ejemplo, LBR y lamina-asociado polipéptidos). En ambas situaciones, montaje de la membrana nuclear se produce por la focalización secuencial de LBR a la

superficie de cromosoma y de gp210 a la cromatina decondensing.

Interpretación de los datos a favor de la existencia de vesículas NE específicos está abierto a la crítica. En primer lugar, una estructura membranosa ronda observado por microscopía electrónica podría reflejar ya sea una vesícula o un túbulo interconectado a otras estructuras de membrana. En segundo lugar, la fragmentación de la NE en la mitosis puede producirse por un mecanismo diferente de la brotación y la fusión que tiene lugar en la vía secretora en interfase. En tercer lugar, la focalización secuencial a la cromatina de los marcadores de la INM y de la proteína de membrana gp210 APN (posteriormente confirmado por Yang et al. 5 y Bodoor et al. 6 ) no inferir su presencia en las vesículas aisladas. Por último, como homogeneización celular promueve inevitablemente vesiculación membrana y la fragmentación, el aislamiento de fracciones de membrana enriquecidas en uno marcador podría reflejar su concentración en microdominios de un sistema de membrana continua, en vez de su presencia en las vesículas.

Tres estudios recientes han proporcionado argumentos a favor de la desaparición de los dominios de la membrana nuclear en la mitosis por la difusión de sus proteínas integrales específicas a través de una ER continuo ( . Fig. 2b ). Ellenberg et al. 7 utiliza la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) para demostrar que difunde LBR-GFP rápida y libremente dentro de las membranas del ER de células en metafase y la inmoviliza en regiones ER que contactan cromatina en anafase y telofase. Aunque estos datos se basan en la sobreexpresión de LBR-GFP, lo que podría plantear cuestiones relacionadas con la distribución de LBR endógena, que favorecen fuertemente el punto de vista de una red ER continua en la mitosis en las células cultivadas. Estudios de imagen confocal de inmunofluorescencia y de Yang et al. 5 mostraron además que las proteínas de la MNI LAP1 y LAP2, y la proteína de membrana gp210, APN colocalize con marcadores de ER en la mitosis. Por lo tanto, en este nivel de resolución, parece que los marcadores de todos los dominios de la membrana nuclear se dispersan a lo largo de las membranas ER durante la mitosis. Por último, Bodoor et. al 6 mostró que dos marcadores de la membrana APN, POM121 y gp210, se dirigen de forma secuencial a los cromosomas después de la metafase, lo que hace improbable la existencia de un conjunto de membrana específico de la APN de vesículas mitóticas.Estos datos recientes favorecen el modelo de un sistema de membrana del RE-NE interconectado de forma permanente, en el que las proteínas integrales de la membrana de la NE inmovilizan tanto en la interfase y la anafase-telofase por el contacto con proteínas de la cromatina y / o laminas, o componentes de la APN ( . Fig. 2b ) . La fosforilación y / o la desfosforilación de estas proteínas integrales podría permitir que se disocian reversiblemente desde sus ligandos durante la mitosis 8  y  9 . Curiosamente, NE montaje por coalescencia de elementos ER fue el modelo preferido por las observaciones ultraestructurales primeros 1 .

Extractos de huevo: un mundo diferente

Una gran cantidad de información sobre el conjunto de las membranas nucleares se ha originado en el uso de extractos libres de células derivadas en particular a partir de huevos de Xenopus o erizo de mar, yDrosophila embriones 10 . En general, estos estudios promueven una vía de la membrana nuclear reensamblaje de la cromatina de metas, la unión y la fusión de las "vesículas de membrana nuclear.Los datos obtenidos a partir de ensayos de reconstitución de huevo y de los estudios de células somáticas que a menudo se han combinado para presentar un modelo unificado de NE reensamblaje. Sin embargo, los huevos y las células somáticas representan dos mundos diferentes en varias formas. En primer lugar, a diferencia de las células somáticas, los huevos se cargan con las existencias de moléculas y membranas necesarios para soportar divisiones celulares rápidas sin la necesidad de síntesis de nuevas membranas.Por lo tanto, los huevos pueden contener vesículas que podrían contribuir a la asamblea NE 11 . En segundo lugar, las divisiones de células de embriones no mamíferos a menudo ocurren mucho más rápido que los de las células somáticas, lo que podría implicar a las vías alternativas de distribución NE y montaje. En tercer lugar, la reconstitución nuclear en los extractos de huevo comúnmente implica cromatina de los espermatozoides como un sustrato para la unión a las membranas, por lo que los sobres pronuclear, en lugar de los NE somática, se ensamblan. Existen diferencias estructurales y bioquímicas entre pronúcleos y núcleos somáticos en el nivel de organización de la cromatina y la composición de lámina que pueda afectar a la naturaleza de las proteínas de membrana específicas para cromosomas.Aunque la terminología de 'vesícula de la membrana nuclear' se ha utilizado ampliamente en el campo de montaje NE in vitro , la evidencia de tales vesículas sigue siendo circunstancial. Observaciones ultraestructurales de fertilizados huevos de erizo marino han informado de que "vesículas" y "membranosa cisternas ' 12 se acumulan en la periferia de decondensing cromatina espermática. Evaluaciones detalladas de la formación de las membranas nucleares en los extractos de huevo se han basado en las observaciones de microscopía electrónica y mostrar constantemente la agregación de vesículas en la superficie de la cromatina 10 . Las poblaciones de vesículas con capacidades diferentes para unirse a la cromatina o fusionarse entre sí se han aislado de Xenopus y erizo de mar huevo extractos 13  y  14 . La identificación de marcadores de membrana nucleares con anticuerpos de reacción cruzada (p56/LBR 15 , LRBx 16 ), anticuerpos específicos (NEP-B78 16 , gp210 D 

17 , Xenopus gp210 18 ) o por clonación ( Xenopus Xp58/LBR18 y LAP2 19  y  20 ) ha permitido la recuperación de fracciones de membrana enriquecidas en proteínas de la membrana nuclear externa, interna o poro. El uso de estos marcadores, la orientación secuencial de proteínas del INM y de la membrana de la APN a la cromatina espermática se demostró 15  y  18 . Estos datos se interpretaron como que muestra la existencia de varias poblaciones de vesículas en el citoplasma de huevo ( Fig.. 2a ), algunos de los cuales podrían contribuir a las membranas nucleares. Independientemente de si existen tales

vesículas o como resultado de ER fragmentación durante la preparación del extracto de huevo, estas observaciones indican que las proteínas de la membrana nuclear no se distribuyen de manera uniforme dentro de las membranas citoplasmáticas de huevo.Sigue siendo posible que las proteínas de la membrana nuclear se dispersan inicialmente en todo el ER huevo del huevo no fertilizado y se vuelven secuestradas desde el RE para formar el sobre pronuclear en la fertilización. Esto sería coherente con el conjunto de la ER-como las estructuras membranosas en Xenopusextractos de huevo y el mar erizo, la continuidad de la sala de emergencia con la NE en los huevos y el reclutamiento dramática de una red de la membrana ER-como alrededor de los erizos de mar en desarrollo pronúcleo masculino en huevos fecundados 21 .

Una distribución no uniforme de las proteínas de la membrana nuclear en el ER mitótico?

Aumento de la evidencia obtenida por localización directa de marcadores de membrana en las células somáticas intactas indica claramente que, durante la mitosis, las proteínas integrales de las membranas nucleares se difunden a lo largo de la sala de emergencias, que permanece como una red cisternal tubular intacto en muchos tipos de células 1 ( . Fig. 2b ). Esto favorece en gran medida un modelo en el que las membranas nucleares no vesicular durante la mitosis. Ya sea que las proteínas derivadas de un dominio membrana particular dispersan completamente ( Fig. 2b. ; modelo de difusión al azar) o permanecen asociados en microdominios de la membrana del RE ( Fig. 2b. ; modelo de dominio) podría resolverse mediante el uso de inmunomarcaje (FRIL) técnicas de congelación-fractura 22 o la tecnología de fluorescencia en células vivas de transferencia de energía de resonancia (FRET). El último método ya ha demostrado tener éxito en la detección de las interacciones moleculares entre las proteínas etiquetadas con variantes espectrales de GFP o GFP y con un segundo fluoróforo 23 y se ha demostrado la existencia de microdominios en la membrana plasmática 24 .Es de suponer que debido al grosor de intacta Xenopus , Drosophila o huevos de erizo de mar, ningún estudio de "en vivo" NE desmontaje y montaje se ha informado hasta la fecha en estos sistemas. El uso de microscopía de excitación multifotónica, que proporciona una resolución en tres dimensiones de hasta varios cientos de micrómetros de profundidad y minimiza photobleaching y fotodaño, junto con FRET permitiría estudios de dinámica de NE en los huevos y los embriones vivos, similares a las realizadas en las células somáticas 25 . Con este tipo de herramientas, el grado en que la membrana nuclear de desmontaje y montaje de los procesos son similares a, o diferentes de, los de las células somáticas puede ser desenredado.