1Tema 29

Tema 29. Mecanismos moleculares de señalización

Jerarquía de la señalización hormonal. Tipos de hormonas. Tipos de receptores hormonales. Mecanismos bioquímicos generales de señalización. Receptores de membrana. Receptores acoplados a proteínas G. Segundos mensajeros hormonales. Proteínas con actividad enzimática ligadas a membrana. Proteínas efectoras. Receptores proteín quinasas y ligados a proteína quinasa. Mecanismo de acción del glucagón y de la insulina. Receptor/efector del óxido nítrico. Mecanismo de acción de las hormonas esteroides y tiroideas. Papel de las principales hormonas implicadas en la regulación del metabolismo energético.

BIOQUÍMICA-1º de Medicina Departamento de Biología Molecular

Javier León

2Tema 29

1. Péptidos y proteínas. - Oligopéptidos: endorfinas, vasopresina, hormona liberadora tiroidea, - Polipeptidos: Glucagón, Insulina, H. de crecimiento, renina, H estimulante de los folículos (FSH), H luteinizante (LH), Horm estimulante del tiroides (TSH), eritropoyetina, factores de crecimiento, interleucinas, etc

2. Derivados de aminoácidos (AA):serotonina (Trp), melatonina (Trp), GABA (Glu), glutamato, histamina (His), catecolaminas(adrenalina, noradrenalina, dopamina) (Tyr), acetil-colina (Tyr)

3. Esteroides y derivados (precursor: colesterol): cortisol, aldosterona, vitamina D, andrógenos, estrógenos, etc.

4. Hormonas tiroideas (derivadas de la Tirosina). Tiroxina (T4) y Triiodotironina (T3)

5. Derivados del ácido araquidónico: prostaglandinas y leucotrienos

6. Oxido nítrico

Clasificación química de las moléculas señalizadoras extracelulares

3Tema 29

Según su localización celular

a) De membrana (de hormonas hidrosolubles)• De siete dominios / Acoplados a proteínas G (GPCR)• Proteín-tirosina quinasas• Asociados a proteín-tirosina quinasas• Ser/Thr quinasas• Canales iónicos

b) Intracelulares (de hormonas liposolubles)• De hormonas esteroideas (receptores nucleares)• De retinoides (receptores nucleares)• De hormonas tiroideas (receptores nucleares)• De oxido nítrico

Clasificación de receptores

4Tema 29

Según su actividad bioquímica

a) Activan proteínas G grandes• Acoplados a proteínas G (GPCR)

b) Activan actividad proteína quinasa (propia o de otra quinasa asociada)• Proteín-tirosina quinasas• Asociados a proteín-tirosina quinasas• Serina/Treonina quinasas

c) Se unen a DNA y regulan genes• Receptores de hormonas esteroideas, tiroideas y retinoides

d) Permiten o impiden el paso de iones• Canales iónicos

e) Receptor=efector: Guanilato ciclasa (receptor de NO)

Clasificación de receptores

5Tema 29

Prot.G

INACTIVA ACTIVA

GDPGTP

“Interruptores” bioquímicos en señalización intracelular

GDP

Prot.G

GTPasa

SEÑAL*GTP

RECEPTOR DEL ESTIMULO

Tyr fosfatasa

Ser/Thr fosfatasaSEÑAL*

P

PINACTIVA

ACTIVA

Proteína Tyr quinasa

Proteína Ser/Thr quinasa

Proteínaseñalizadora

Proteínaseñalizadora

Tyr

Ser Thr

Tyr

PSer Thr

RECEPTORSEGUNDOS MENSAJEROS

RECEPTOR SEGUNDOS MENSAJEROS

6Tema 29

Modificaciones covalentes postraduccionales que afectan la actividad de proteínas

Sumolización

Acetilación (Ej: histonas)

Farnesilación

Anclaje a membranasFarnesil-pirofosfato

Proteína

GDP

α

βγ

Glicosilación (Ej: muchas proteínas de membrana y secretadas)

Ubiquitilación

Fosforilación

Miristoilización (AG-C14) y Palmitoilización (AG-C16)

Metilación

7Tema 29

Hormona

Receptor de membrana

Proteína transductora que interacciona con el receptor

Segundo mensajero

Mecanismo de acción hormonal (hormonas hidrosolubles)

Cambios en la expresión de genes

Efecto Biológico

Proteína(s) transductora(s)

citosólica y nuclear(es Enzimas efectoras

8Tema 29

AMP Cíclico (cAMP)

N

NNH

O

NNH 2

O

H H

O OH

H

O CH2

H-O —P

GMP Cíclico (cGMP)

Cinco principales segundos mensajeros hormonales

cAMPAdenilato Ciclasa Fosfodiesterasa

Ca2+

Iones Calcio

AMP

O

N

N N

N

N H 2

O

H H

O OH

H H-O— P

O

O CH2

PPi H2O

ATP

H2C — O — C — R1

|R2 - C — O — C — H

|H2C — OH

O

1,2- Diacil-glicerol

2-

Inositol 1,4,5 trisfosfato

H

OPO3

2-

2-

141

5H

OHO

HH

OH

H

OHO

HO 3P

PO 3

9Tema 29

Receptores Hormonas/Citocinas

Receptores asociados a Tyr-quinasas (JAKs)

Hormonas y citocinas inductoras de proliferación y

diferenciación celular

Eritropoyetina, trombopoyetina,

GH, IL-6, IL-11, LIF, IL3. IL-5,

GM-CSF, G-CSF, IL-2, IL-4, IL-9

Hormonas y citocinas inductoras de proliferación.

PDGF, EGF, VEGF, FGF, NGF, GDNFReceptores Tyr-quinasa

DE

ME

MB

RA

NA

Guanilato ciclasa citosólica Oxido nítrico

Receptores nuclearesGlucocorticoides, mineralocorticoides, progesterona, estrógenos, andrógenos, retinoico, T3, vit D, eicosanoidesIN

TR

AC

EL

ULA

RE

SReceptores asociados

a proteínas G

Muchas hormonas endocrinas, con efectos en el metabolismo y receptores olfativos.GLUCAGON, ADRENALINA, dopamina, serotonina, histamina,, Glu, GABA, acetilcolina (musc.), quimiocinas

Receptor de Insulina e IGF1 INSULINA, IGF-1, IGF-2

Receptores canales iónicos Angiotensina II, GABA (A), acetilcolina (nicotínico)

Receptores Ser-quinasa

Receptores de TNF

Citocinas y hormonas relacionadas con la diferenciación, apoptosis y metabolismo, pero normalmente no señalizan cambios metabólicos importantes ni inducen proliferación celular: TGFβ, BMPs,TNFs

FISIOLOGIA

10Tema 29

Estructuras de los receptores acoplados a proteínas G

EXTRACELULAR

Citosol

Dominio extracelular(Sitio de unión del ligando)

Dominio intarcellar(interacción con proteínas G)

Ligando

ACTIVACIÓN DE PROTEINAS G

= receptor 7TM= receptor en serpentina

11Tema 29

GDP

α

βγ

GTP

α

βγ

GTP

GDP

ACTIVACIONINACTIVACION

Ciclo de las proteínas G heterotriméricas

Producción de segundos mensajeros

Estructura de una proteína G trimérica inactiva

12Tema 29

Activación de las proteínas G

γβα

GDP

En el estado inactivo la subunidad αestá unida a GDP y formando un complejo con las subunidades βγ

Ligando

La unión del ligando induce la interacción del receptor con la Proteína G, y a su vez estimula el intercambio de GDP por GTP

γβα

GDP

(Modificado de Cooper, “The Cell” Saunders, 1997l, pag 530)

La subunidad G α es desactivada por la hidrólisis del GTP, dando de nuevo la forma inactiva (unida a GDP), la cual se reasocia con complejo βγ para dar el complejo trimérico inactivo

Pi

α

La subunidad G α activada (unida a GTP) se disocia del complejo βγ e interacciona con sus dianas celulares

γβ

GTP

GTP

GDP

PROTEINASDIANA

ANIMACION GPort - PLC

http://entochem.tamu.edu/G-Protein/index.html

13Tema 29

C

N

Gγ

Gα GβProteína GHetero-trimérica

Ligando

H7 H1

Tipos de subunidades Gα

Gαq otrasGαiGαs Gt(Transducina)

EstimulaAdenilatociclasa

InhibeAdenilatociclasa

EstimulaFosfolipasa C

EstimulaGuanilatociclasa

Estimula PLA2, canal deK, etc

Golf

14Tema 29

Activación de adenilato ciclasa y PKA por proteínas Gαs y Gαi

αs

GTPγ

βαs

GDP

Receptor

ATP

AMPc

PPi

Catal.

Proteina quinasa A activa(dímero)

Catal.

Regul. Regul.

Catal. Catal.

RegulRegul. Regul.

Proteina quinasa A inactiva (tetrámero: dos ubunidades reguladoras +Dos subunidades catalíticas

α

GTP

Adenilatociclasaactiva

FOSFORILACION EN SER/THR DE OTRAS

PROTEINAS EFECTORAS

15Tema 29

Actividad de la adenilato ciclasa

Adenilatociclasa

(9 isoformas)C

N

Citosol

Exterior

ATPcAMP

H H

OH OHH H

CH2-O -P-O-P-O-P –O-

O

O-

O O

O-O-

N

N N

N

NH2

O

H H

O OHH H-O— P

O

O CH2

N

N N

N

NH2

PPi

Acumulación de cAMP en una neurona estimulada con 10 nM serotonina 20 seg(Alberts et al. Molecular Biology of the Cell, Garland Pub. 2002)

cAMPFosfodiesterasa

(PDE)

AMP

O

Animación GPCR –PLC-Ca (Keeley) http://entochem.tamu.edu/G-Protein/index.html

16Tema 29

ProteínaQuinasa C

Calmodulina Calcio

Activa

Proteína quinasa C

Inactiva

Activación de PLC por proteínas Gαq

γβ

αqGDP

Receptor

IP3

α

GTP

PIP2 DAG

Fos

folip

asa

C

PKC

Proteina quinasa C activa

Ca++IP3

Salida de Ca++ de vesículas

del retículo endoplásmico

Animación GPCR –PLC-Ca (Keeley) http://entochem.tamu.edu/G-Protein/index.html

17Tema 29

H2C — O — C — R1

|R2— C — O — C — H

|H2C — O— P — O — X

|O

O

O

Fosfolipasa A2

Fosfolipasa C(PLC)

Sitios de corte de los principales tipos de fosfolipasas

Fosfolipasa D (PLD)

Fosfolipasa A1

DAG+IP3

Inositol 1,4,5 trisfosfato

H

O

41

5H

OHO

HH

OH

H

OHO

H

P

P

P

O

Recordatorio

Tema 23

No hace falta aprenderse

la estrutura

18Tema 29

Transducción de la señal olfativa

Depolarización

Receptor

G (olf)

Canal iónico(se abre por cAMP)

Na+

Ca++Adenilato ciclasa

Na+

Ca++

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2004

"for their discoveries of odorant receptors and the organization of the olfactory system"

Howard Hughes Medical Institute University of Washington; Fred Hutchinson Cancer Research Center Seattle, WA, USA. B 1947

Columbia University New York, NY, USA; Howard Hughes Medical Institute b. 1946

Linda B. BuckRichard Axel

http://nobelprize.org/medicine/laureates/2004/

19Tema 29

Isomerizacion Rodopsina: http://www.blackwellpublishing.com/matthews/rhodopsin.html

Transducción de la señal visual

(Berg, Tymoczko and Stryer.Biochemistry. Freeman and Co. 2002)

11-cic-retinal all-trans-retinal

LUZ

Hiperpolarización

FosfodiesterasaRodopsinaLUZ

Na+

Ca++

Canal iónico(abierto por cGMP, se cierra al caer cGMP por la fosfodiesterasa)

TransducinaSe cierra el canal

20Tema 29

Gαs Ad Ciclasa [cAMP]

PKA

Canal de Na/Ca

Otras enzimas*Ej: Adrenalina en adipocitos, TSH en tiroides, ACTH en suprarrenal, etc

* Glucógeno sintasa fosforilasa, Piruvato quinasa, Fosfofructoquinasa, CREB

Gαi Ad. Cicl. [cAMP] PKA

Gαq PLCIP3

DAG PKC

[Ca++] citosol

Ej: Vasopresina en hígado, acetilcolina en músculo liso, trombina en plaquetas,

Otras enzimas

Gα olf

Gαt/transducina

canales de Ca++

Ad. Cicl. [cAMP] Apertura de canales de Ca++/Na+

cGMPfosfodiesterasa

[cGMP] Cierre de canales Ca++/Na+

RESUMEN de proteinas Galfa

21Tema 29

Activación de receptores tirosina-quinasa

Insulina, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, FGF, NGF, GDNF

La unión del ligandoprovoca la dimerizacióndel receptor y activación de su dominio Tyr-quinasa

P P

Los receptores sufren una autofosforilación en una o más tirosinas de la parte intracelular

Tyr Tyr

Centro activo de la actividad protein Tyr-quinasa

22Tema 29

Proteína adaptadoraque reconoce P-Tyr del receptor(hay varias, se expresa una u otra según el tejido)

Señalización por Proteínas G-pequeñas (Ras)

Receptoractivado

Farnesilo, para anclarse a la membrana

RAS RAS

GDPGTP

GDP GTP

Hay tres proteínas Ras y unas 50 proteínas G-pequeñas (superfamilia Ras) en nuestro genoma.

Muchos tumores humanos tienen un gen Ras mutado, que da lugar a una proteína constituvamente unida a GTP (=activa)

Proteína intercambiadorade GDP/GTP (o GEF= GTP Exchange Factor), que es activada por la proteinaadaptadora

P.Ad PI

P. Adaptadora = GRB2P. Intercambiadora de GTP (GEF) = SOS, RALP. G pequeña = RAS, RHO, RAC

PTyr

PTyr

P P

23Tema 29

Señalización por Proteínas G-pequeñas (Ras)

RAS RAS

GDPGTP

GTPRAS RASRAS

Intercambiador de GDP/GTP(GEF)

POr ej: SOS para RAS

GTPasa

GDP

GDP

Mutantes oncogénicos RAS no son sustrato de las GTPasas

24Tema 29

Ruta de señalización por proteínas Ras

La unión del ligando induce dimerización y transfosforilación del receptor en Tyr. Una proteína adaptadora (PA) reconoce estas Tyr-P y activa una proteína intercambiadora de GTP/GDP, que a su vez activa Ras.

PTyr P.Ad.

RAFRASGTP

GEF ATP

La quinasa MAPKK fosforila en Ser y en Tyra la MAPK, que es asíactivada. MAPK se trasloca al núcleo donde activa ciertos factores de transcripción.

La proteína Ras activada une quinasa unida a membrana (Raf) y activa su actividad quinasa. Rafactiva (fosforilando) a la quinasa MAPKKATP

TyrSer

PMAPKK

MAPKPP

Ser

MAPK = ERKMitogen Associated Protein Kinase

MAPKK = MEK

RAS: http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Flash/MAPK.html

PTyr

PTyr

P P

ATPFACTORES DE

TRANSCRIPCION

Núcleo

P P

25Tema 29

PTyr

PTyr

P P

Transmisión de señal por PI3K

PI3K

SubunidadReguladora

SubunidadCatalitica

PI(4,5)P PI(4)P

PP

14

ATP

ADP

PI(3,4,5)trisifosfato = PIP3PI(3,4)bisfosfato = PIP2

P

3PP

PIP2

PP

14

PiPTEN(fosfatasa)

PI(4)P

26Tema 29

H2C — O−

C — O — CH

O

C — O — CH

O

1

P

Fosfatidil-inositol-4-bisfosfato 4OH

O

OH OHO

H

P

OH

H2C — O−

C — O — CH

O

C — O — CH

O

Fosfatidil-inositol-3,4-bisfosfato(PIP2)

4OH

O

OH OO

H

P

OH

P

P

3

Fosfatidil-inositol-3-quinasa(PI3K) PTEN Pi

1

27Tema 29

PTyr

PTyr

P P

Transmisión de señal por PI3K

PI3K

SubunidadReguladora

SubunidadCatalitica

p110

PI(4,5)P PI(4)P

PP

14

ATP

ADP

PI(3,4,5)trisifosfato = PIP3PI(3,4)bisfosfato = PIP2

P

3PP

RASGTP PIP2

Interacción directaRAS-PI3K

PP

14

PiPTEN(fosfatasa)

PI(4)P

Fosfatidilinositol (3,4)-bisfosfato(PIP2)

RECEPTOR

RAS

PI3K reg

PI3K cat

RAF

28Tema 29

Activación de PKB por PI3K

P

P

P

P

PI3K

SubunidadReguladora

SubunidadCatalitica

PI(4,5)P PI(4)P

PKBinactiva

SUPERVIVENCIACELULAR

Tyr Tyr

PP

14

ATP

ADP

PKBactiva

PI(3,4,5)trsisfosfato = PIP3PI(3,4)bisfosfato = PIP2

P3

PP

PKB = AKT

29Tema 29

La transducción de señal implica amplificación de la señal

RAS-domino http://www.learner.org/channel/courses/biology/units/cancer/images.html

Los mecanismos moleculares de señalización basados en múltiples proteínas/enzimas señalizadoras desde el receptor consiguen

1. Mayor especificidad: afinidades altas (Kd ~10-9 - 10-10) y expresión específica de tejido de receptores y proteinas señalizadoras

2. Amplificación de la señal por cascadas enzimáticas3. Mayor capacidad de desensibilización y adapatación al estímulo continuado al

inhibirse proteínas transductoras intermedias4. Integración de señales en la misma célula

http://es.youtube.com/watch?v=L9dsg0wJRR8

30Tema 29

Transducción de señal desde receptores de citoquinas

JAK JAK JAK

P P

P P

STAT

JAK P

STAT

JAK

P P

P

Un tipo factor de transcripción (STAT) se une a Tyr-P del receptor y es a su vez fosforilado en Tyr por JAK.

La unión del ligando provoca su dimerización y la unión de la quinasa JAK. JAK fosforila en Tyr al receptor

DNA

P

P

P

P

Los FT fosforilados son así activadas para dimerizarse y translocarseal núcleo. El dímero activa la transcripción de genes específicos.

Eritropoyetina, Trombopoyetina, GH, IL-6, IL-11, LIF, IL3. IL-5, GM-CSF, G-CSF, IL-2, IL-4, IL-9

ACTIVACION DE LA TRANSCRIPCION DE GENES DE RESPUESTA A LAS CITOCINAS

31Tema 29

Señalización desde receptores de TGFβ y de BMPs

RI

Smad

S/TCo-Smad

P

P

Co-SmadP

RII

BMPTGFβ

La unión del ligando a una cadena del receptor induce la actividad quinasa de la otra

EL receptor fosforila en Ser/Thr un tipo de proteína que es a su vez factor de transcripción (Smad). Este FT fosforiladodimeriza con otra proteína

Núcleo

ACTIVACION DE LA TRANSCRIPCION DE GENES DE RESPUESTA A TGFb y a BMPs

El dímero entra al nucleo y activa genes

Smad

32Tema 29

-S-S- -S-S--S-S-

PP

PP

IRS1

Insulina

Señalización desde el receptor de la insulina

ββα α

PKB

Páncreas, células beta Insulina InsR Otros tejidos IGF1 IGF1ROtros tejidos IGF2 IGF2R

P

Prot. Adaptadora

RAS

MAPK

P

P

Regulad.

PI3K

Catalitica

Otras

-OH

-OHHO-

IRS1-Tirosina fosfatasa

Receptor de insulina: 4 polipéptidos unidos por puentes diusulfuro

Insulin Receptor Substrate 1

TyrTyr

TyrTyr

Tyr

GENES

33Tema 29

PI3KSubunidadReguladora

SubunidadCatalitica

P

P

Transmisión de señal por Insulina – PKB –glucógeno – GLUT4

PI(4)P PI(3,4)P2

3P

P P

ATP

PI(4,5)P2 PI (3,4,5)P3

1

4

PI (3,4,5)P3 = Fosfatildilinositol 3,4,5-trisfosfatoPI3K = Fosfatidilinositol-3-quinasaPKB = Proteína kinasa BGLUT4 = transportador de glucosa

IRS1fosforilado

Tyr-P

GLUT4

Glucosa

Glucosa

GLUT4

GSK3inactiva

P

GSK3activa

GlucógenoSintasaactiva

GlucógenoSintasainactiva

P

Glucosa

Glucógeno

PKBactiva

(PKB = AKT)

P

PKBinactiva

34Tema 29

Síntesis de oxido nítrico

2 NADPH2 O2

+ ·NO

2 NADP+2 H2O

NO sintasa(Hemo-FAD)

NH2

NH2+HN

CH2

CH2

CH2

H2N CH COO-

Arginina

C

Citrulina

HN

CH2

CH2

CH2

H2N CH COO-

C−NH2

O

Receptor del NO = Guanilato ciclasa soluble (citosólico)

Hemo

(Lodish et al. Molecular Cell Biology, Freeman Co. 2000)

GTP cGMP

cGMP

35Tema 29

eNOSArg + O2 Citrulina + NO

sGC

GTP

cGMP RAPIDA RELAJACION DE MUSCULO LISO

VASODILATACIÓN

Acetil-colina

Terminal nerviosa

eNOS: Sintetasa de óxido nítrico (endotelial)sGC: Guanilato ciclasa solublePDE: cGMP fosfodiesterasa

Activación de PKG por cGMP

PDE

Célulaendotelial

Célula de músculo liso

GMP

36Tema 29

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1998

"for their discoveries concerning nitric oxide as a signallingmolecule in the cardiovascular system"

SUNY Health Science Center Brooklyn, NY, USA. b. 1916

University of California School of Medicine Los Angeles, USb. 1941

University of Texas Medical School at Houston ,USA b. 1936

Ferid MuradLouis J. IgnarroRobert F. Furchgott

“Parece una ironía del destino que me hayanprescrito de nitroglicerina como medicina. La hanllamado Trinitrin para no confundir a losfarmacéuticos y al público”.Tu querido amigo,

A. Nobel

http://nobelprize.org/medicine/laureates/1998/illpres/medicine.html

37Tema 29

NO

sGCGTP

cGMP

GMPPDE

Sildenafil: inihibidor de cGMP fosfodiesterasa

Especificidad del sildenafil sobre cGMPfosdodiesterasas (PDEs)

Isozima Organo Actividad

PDE5 Pene 100%

PDE1 Corazón, cerebro, vasculatura 1,25%

PDE3 Corazón 0.02%

PDE11 Corazón, pituitaria, testículos 0.12%

PDE6 Retina 10%

(hay 11 isoenzimas PDE en total)

38Tema 29

sGC

GTP

cGMP

RELAJACION DE MUSCULO LISO

Activación de PKG por cGMP

PDEs

GMP

PKG+

PKG PKG

cGMP

cGMPcGMP

cGMP

• Sube en respuesta a Oxido Nitrico Guanilato ciclasa

• Baja en respuesta a luz Fosfodiesterasa Transducina

• Activa Proteina Quinasa G = PKG

39Tema 29

Las mismas señales y receptores distintas respuestas según la célula

Hay diferencias en los niveles de proteínas señalizadoras intermediarias y/o distintas isoformas según el tejido.

GPCR Adenilato ciclasa cAMP Activacion PKA glucogenolisis en HIGADO

apertura canal iónico impulso nervioso en EPITELIO OLFATIVO

No hay que aprendérselo

RESPUESTAS INDUCIDAS POR HORMONAS MEDIADAS POR AMPc

Tejido Hormona Respuesta

Higado Adrenalina, Glucagón GlucogenolisisMúsculo Adrenalina GlucogenolisisAdiposo ACTH, Adrenalina LipolisisOvario LH Secreción de progesteronaTiroides TSH Secreción de hormona tiroideaCorteza suprarenal ACTH Secreción de cortisolRiñón Vasopresina Reabsorción de agua

RESPUESTAS A HORMONAS MEDIADAS POR IP3/DAG

Tejido Hormona Respuesta

Higado Vasopresina GlucogenolisisPáncreas Acetilcolina Secreción de amilasaMúsculo liso Acetilcolina ContracciónPlaquetas Trombina AgregaciónMastocitos (unión de antígeno) Secreción de histamina