CLONACIÓN DE ADN

ALUMNO: Raúl Jiménez Flores Maestra: Alejandra García Ortiz Materia : Biología Molecular

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Clonación de ADN

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EL método de clonación del ADN en células consiste en unir in vivo fragmentos de ADN de procedencia muy diversa con secuencias de ADN • Capaces de replicarse de manera autónoma

• En esta técnica no se clonan células

• Pero si las utilizan para clonar fragmentos de ADN

• Se les llama células hospedadoras

Introducción• Una técnica en la que una secuencia de ADN es introducida en:

• De forma que cuando esta se reproduzca hará múltiples copias de ese ADN

• Estos son cultivados en condiciones que propicien su máximo crecimiento y tiene básicamente los siguientes pasos

1. Aislamiento inicial o síntesis del fragmento de DNA de interés 2. Acoplamiento de esta secuencia a un vehículo o vector3. Incorporación complejo Vector-DNA en célula hospedadora

TRANSFORMACIÓN 4. Expresión del DNA en la célula hospedadora

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Vector : molécula de DNA que es capaz de replicarse de modo independiente del genoma dentro de un sistema celular.

Usos y aplicaciones • Se utiliza en estudios sobre la regulación de la EXPRESIÓN

GÉNICA• En la regulación de la producción comercial de síntesis de

proteínas como la INSULINA o la GH• Ampliación del ADN … aunque existe una técnica

mejor PCR

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• Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

• Preparación de un vector de clonación

• Formación del ADN recombinante

• Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona

• Propagación del cultivo

• Detección y selección de clones recombinantes 5

Preparación de la secuencia de ADN para su clonación 1. Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas.• Físicos : Baño maría , congelación , descongelación, sonicación

• Químicos : detergentes • Enzimáticos: proteinasa K

2. Proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN3 .El ADN obtenido se concentra y fragmenta por acción de ENZIMAS DE RESTICCIÓN

4.Se aísla el ADN que se desea clonar: Cromatografía líquida o centrifugación .

5. Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores de la expresión génica.

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Por ejemplo, la enzima que se llama EcoR1 (porque se aisló de la bacteria Escherichia coli)• solo corta si encuentra la

secuencia GAATTC.• Si hay una base que está

cambiada ya no corta.

Preparación de un vector de clonación

• El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes características:

• Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.

• Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos.

• Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.• Replicarse de forma independiente al ADN de la célula

anfitriona.• Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y

seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico. 7

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Las etapas del proceso consisten en:Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN que se quiere insertar.Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.

3.Formación del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unión covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa.

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Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o

simplemente, inserto..

4. Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona

• Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.

• Los tipos de células anfitrionas son:• Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una

alta velocidad de replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.

• Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales:• Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la

expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.• Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la

velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.

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Cabe mencionar que los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas.

MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE

• Transformación: es un tratamiento fisico-químico para bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de la membrana.

• Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una micropipeta.

• Lipofección: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeñas vesículas fosfolipídicas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su interior se introduce en la célula.

• Electroporación: método físico activo en el que una solución con células y ADN recombinante es sometida a descargas eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.

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5.Propagación del cultivo

• Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de ADN recombinante y, por ello, la clonación.

• Primero se efectúa una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo.

• Se dejan crecer las colonias. • Cada una de ellas será seleccionada y transferida a distintos

medios líquidos, donde seguirá aumentando el número de individuos de la colonia.

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6. Detección y selección de los clones recombinantes• En los procesos de clonación se utiliza un gran número de

células. Al final del proceso se hace necesario separar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.

• La detección y la selección de colonias se realiza en los medios de cultivo.

• En los procesos de clonación se obtienen células anfitrionas que no han incluido el vector,

• células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN para recombinar

• Y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto.• HIBRIDACIÓN • MÉTODO INMUNOLÓGICO• MÉTODOS GENÉTICOS

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