COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS ...

COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS

VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA

DANIEL AUGUSTO MARTÍNEZ VARGAS

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Biología

Bogotá D.C., Colombia

2016

COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS


DANIEL AUGUSTO MARTÍNEZ VARGAS

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias - Biología

Director:

MD., MSc., Ph.D., Carlos A. Guerrero Fonseca

Codirectora:

Bacterióloga, MSc., Dioselina Peláez Carvajal

Grupo de Investigación:

Grupo de Virología, Instituto Nacional de Salud

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Biología

Bogotá D.C., Colombia

2016

En memoria de mi madre, siempre presente

Necesitamos otra educación para otra

sociedad y otra sociedad para otra educación.

Karl Marx

Agradecimientos

A la Dra. Dioselina Peláez por todo el apoyo antes, durante y después de la realización

del proyecto. Gracias por ser un pilar en mi formación académica de posgrado y

profesional, además del cariño y la amistad brindada.

A Mariel Palacios, por TODO.

Al Grupo de Virología del Instituto Nacional de Salud, por permitirme crecer

profesionalmente, y facilitar las instalaciones para la realización del trabajo.

Al Dr. Carlos Guerrero por su dirección y aportes para el desarrollo del trabajo.

A mis profesores de Seminario de Investigación, Luis Fernando García y Nubia Matta,

aportaron valiosos consejos.

A la Universidad Nacional de Colombia y el programa de Biología, por la formación

personal y profesional.

A COLCIENCIAS por el financiamiento del proyecto, a través del contrato de cooperación

INS-ACAC-COLCIENCIAS No. 710-2013, Código No. 2010456935048.

Resumen y Abstract IX

Resumen

El virus de la hepatitis E (VHE) causa 20 millones de infecciones al año y cerca de 60000

muertes, aunque por lo general causa una infección autolimitada, puede llegar a

provocar una falla hepática aguda con tasas de mortalidad entre 0,5% y 4%.

Algunos estudios realizados en Colombia han demostrado la circulación del VHE en el

país, sin embargo no se ha estudiado a fondo el comportamiento del virus.

El presente trabajo estudió la evidencia de coinfección VHE y virus de la hepatitis A

(VHA), B (VHB) y/o C (VHC), y la caracterización de genotipos del VHE, en 1097

muestras de suero obtenidos de pacientes con diagnóstico de hepatitis viral remitidos al

Instituto Nacional de Salud en el periodo 2004 – 2014 de los 32 departamentos de

Colombia, con marcadores serológicos de infección VHA, VHB y VHC.

Se analizó la presencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE en los 1097 sueros y

posteriormente se detectó el genoma del VHE mediante nRT-PCR y se secuenciaron los

productos. Se detectaron anticuerpos IgM e IgG anti-VHE en muestras de pacientes con

hepatitis A (16,1 y 33,6%, respectivamente), hepatitis B (8,1 y 23,4%) y hepatitis C (5,8 y

35,4%). Este porcentaje resulta alto teniendo en cuenta que el VHE tiene diferente ruta

de transmisión (fecal-oral) respecto al VHB y VHC (parenteral). Por nRT-PCR resultaron

positivas 33,3% de muestras IgM anti-VHE (+) y 40% en las muestras IgG anti-VHE (+).

Mediante esta técnica se logró establecer la presencia del VHE en la mayoría de los

departamentos del país. Con el análisis filogenético de las secuencias se determinó que

el VHE subtipo 3a es el que circula en país. Estos resultados abren la puerta a futuros

estudios sobre el VHE, determinar la prevalencia en el país en población general,

investigar la relevancia epidemiológica del genotipo y plantear la necesidad que se

incluya a la hepatitis E dentro del diagnóstico de las hepatitis virales en el país.

Palabras clave: Coinfección, VHE, VHA, VHB, VHC, genotipos, filogenético.

X COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA

Abstract

Hepatitis E virus (HEV) causes 20 million infections per year and about 60000 deaths,

although usually causes a self-limited infection can even cause acute liver failure with

mortality rates between 0.5% and 4 %. Previous studies in Colombia have demonstrated

the circulation of HEV in the country, but has not been thoroughly studied the behavior of

the virus.

This paper studied the evidence HEV coinfection with HAV, HBV and HCV viruses, and

characterization of HEV genotypes, in 1097 serum samples obtained from patients

diagnosed with viral hepatitis sent to Instituto Nacional de Salud in the period 2004 - 2014

of the 32 departments of Colombia, with serological markers of HAV, HBV and HCV

infection.

The presence of anti-HEV IgG and IgM antibodies HEV was analyzed in the 1907 sera

and subsequently HEV genome was detected by nRT-PCR and products were

sequenced. Anti-HEV IgM and IgG antibodies were detected in samples from patients

with hepatitis A (16.1 and 33.6%, respectively), hepatitis B (8.1 and 23.4%) and hepatitis

C (5.8 and 35.4%). This percentage is high considering that HEV has different

transmission route (fecal-oral) with respect to HBV and HCV (parenteral). By nRT-PCR

were positive 33.3% anti-HEV IgM (+) samples and 40% in the anti-HEV IgG (+) samples.

It was possible to establish the presence of HEV using this technique, in most

departments from Colombia. Phylogenetic analysis of the sequences showed that HEV

subtype 3a is circulating in the country. These results open the door to future studies on

HEV, to determine the prevalence in the country in general population, investigate the

epidemiological relevance of genotype and raise the need to include hepatitis E in the

diagnosis of viral hepatitis in the country.

Keywords: Coinfection, HEV, HAV, HBV, HCV, genotypes, phylogenetic.

Contenido XI

Contenido

Pág.

1. Justificación ............................................................................................................... 5 1.1 Hipótesis de trabajo .............................................................................................. 6 1.2 Objetivos ............................................................................................................... 6

1.2.1 General ............................................................................................................. 6 1.2.2 Específicos ........................................................................................................ 6

2. Marco Teórico ............................................................................................................ 7 2.1 Historia del Virus de la Hepatitis E ....................................................................... 7 2.2 Taxonomía ............................................................................................................ 7 2.3 Propiedades físico-químicas y biológicas ............................................................. 8 2.4 Organización del genoma ................................................................................... 10 2.5 Heterogeneidad genética del VHE ..................................................................... 11 2.6 Ciclo de replicación ............................................................................................. 13 2.7 Proteínas del VHE .............................................................................................. 14

2.7.1 ORF1 ............................................................................................................... 14 2.7.2 ORF2 ............................................................................................................... 15 2.7.3 ORF3 ............................................................................................................... 16

2.8 Patogénesis ........................................................................................................ 17 2.9 Hepatitis E y embarazo ....................................................................................... 19 2.10 Respuesta Inmunológica .................................................................................... 20 2.11 Epidemiología ..................................................................................................... 20 2.12 Diagnosis de la infección por el VHE .................................................................. 22 2.13 Seroprevalencia de la infección por el VHE ....................................................... 24

3. Materiales y métodos .............................................................................................. 25 3.1 Tipo de estudio ................................................................................................... 25 3.2 Selección de las muestras .................................................................................. 25 3.3 Pruebas serológicas ........................................................................................... 25

3.3.1 Detección de anticuerpos IgG anti-VHE ......................................................... 26 3.3.2 Detección de anticuerpos IgM anti-VHE ......................................................... 26

3.4 Pruebas moleculares .......................................................................................... 27 3.4.1 Extracción del ARN viral ................................................................................. 27 3.4.2 nRT-PCR ......................................................................................................... 27 3.4.3 RT-PCR en tiempo real ................................................................................... 29 3.4.4 Secuenciación y análisis filogenético .............................................................. 30

4. Resultados ................................................................................................................ 33 4.1 Coinfección y seroprevalencia del VHE en pacientes con diagnóstico de hepatitis viral .................................................................................................................. 33

XII COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA

4.2 Detección del genoma del VHE mediante nRT-PCR ......................................... 37 4.3 Detección cualitativa del ARN del VHE mediante RT-PCR en tiempo real ........ 40 4.4 Caracterización genotípica del VHE ................................................................... 42

5. Discusión ................................................................................................................... 47

6. Conclusiones y recomendaciones .......................................................................... 53 6.1 Conclusiones ...................................................................................................... 53 6.2 Recomendaciones .............................................................................................. 54

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág. Figura 2-1: Micrografía electrónica mostrando partículas del VHE aisladas de heces (39). ............................................................................................................................................ 9 Figura 2-2: Diagrama esquemático de partículas del VHE “envueltas” y “desnudas” (40). 9 Figura 2-3: Organización genómica del VHE. Adaptada de la referencia (1). .................. 10 Figura 2-4: Modelo propuesto de la replicación del VHE (3). ........................................... 13 Figura 2-5: Papel de la proteína ORF3 en la patogénesis del VHE (35). ......................... 17 Figura 2-6: Principales eventos patogénicos (virología, serología, enfermedad) durante la infección aguda con el VHE (67). ...................................................................................... 18 Figura 4-1: Porcentaje de seroprevalencia a IgM anti-VHE por departamento, según el número de muestras procesadas por ELISA. ................................................................... 36 Figura 4-2: Porcentaje de seroprevalencia a IgG anti-VHE por departamento, según el número de muestras procesadas por ELISA. ................................................................... 37 Figura 4-3: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del ARN del VHE. ................................................................................................................... 38 Figura 4-4: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del ARN del VHE. ................................................................................................................... 38 Figura 4-5: Amplificación por nRT-PCR de algunas muestras de suero para las regiones MeT (izquierda) y ORF2 (derecha). .................................................................................. 40 Figura 4-6: Amplificación por triplicado del estándar del VHE. ......................................... 41 Figura 4-7: Sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real para la detección del ARN del VHE. .......................................................................................................................................... 42 Figura 4-8: Análisis filogenético de las secuencias del VHE obtenidas en este estudio. . 43 Figura 4-9: Región del genoma del VHE utilizada para la genotipificación del virus. ....... 44 Figura 4-10: Árbol filogenético construido mediante inferencia bayesiana basado en la región ORF2 del VHE. ...................................................................................................... 45 Figura 6-1: Flujo de trabajo del proceso de secuenciación (Tomado de Applied Biosystem BigDye® XTerminatorTM Purification Kit Protocol) ............................................................. 57

XIV COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS VIRALES EN COLOMBIA Y SU CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA

Contenido XV

Lista de tablas

Pág. Tabla 3-1: Primers utilizados para la detección del ARN del VHE por nRT-PCR, descritos previamente en (91, 92). ................................................................................................... 28 Tabla 3-2: Secuencias de la región ORF2 del VHE utilizadas para la construcción de los arboles filogenéticos. ........................................................................................................ 31 Tabla 4-1: Muestras procesadas según el departamento de procedencia y el diagnóstico de hepatitis viral. ............................................................................................................... 33 Tabla 4-2: Resultados de las pruebas ELISA para la determinación de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE en sueros positivos para la presencia de marcadores serológicos para VHA, VHB y VHC. ............................................................................................................. 35 Tabla 4-3: Resultados serológicos positivos para anticuerpos anti-VHE según el grupo de edad. ................................................................................................................................. 35 Tabla 4-4: Amplificación de las regiones ORF1 y ORF2 del VHE mediante nRT-PCR en sueros positivos para anticuerpos anti-VHE. .................................................................... 39 Tabla 4-5: Amplificación del ARN del VHE en sueros positivos para anticuerpos anti-VHE. .......................................................................................................................................... 39

Contenido XVI

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviaturas

Abreviatura Término ALAT ARN ASAT ELISA FHA GTR HBsAg Hel HNANB IgG IgM IME INS MeT min OMS ORF pb PCP RdRp RIBA rpm RT-PCR s VHA VHB VHC

Alanina-aminotransferasa Ácido Ribonucleico Aspartato-aminotransfera Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Falla Hepatica Aguda General Time Reversible Antígeno de superficie de la hepatitis B Helicasa Hepatitis No A No B Inmunoglobulina G Inmunoglobulina M Inmunomicroscopía Electrónica Instituto Nacional de Salud Metiltransferasa Minutos Organización Mundial de la Salud Open Reading Frame Pares de bases Papain-like Cysteine Protease ARN polimerasa dependiente de ARN Recombinant Immunoblot Assay Revoluciones por minuto Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Segundos Virus de la Hepatitis A Virus de la Hepatitis B Virus de la Hepatitis C

VHE Virus de la Hepatitis E

Introducción

El virus de la hepatitis E (VHE) es el agente causal de la hepatitis E y la principal causa

de hepatitis transmitida por vía enteral en el mundo, siendo responsable de más del 50%

de los casos de hepatitis aguda en los países endémicos. Se estima que alrededor de

dos mil millones de personas están en riesgo de infección con el VHE por el hecho de

vivir en áreas endémicas. En países en vía de desarrollo el virus es transmitido

principalmente a través del agua causando brotes epidémicos graves, mientras que en

países desarrollados se presentan casos esporádicos en personas que habitan en

regiones con factores de riesgo para la transmisión. Sin embargo, el uso combinado de

técnicas serológicas y moleculares ha permitido confirmar una incidencia y prevalencia

mucho mayor que la esperada en países desarrollados (1).

Aunque el VHE fue descubierto desde 1983, muchas de sus características

epidemiológicas y clínicas hasta ahora se están elucidando. El VHE es transmitido

principalmente por la ruta fecal-oral y a través de alimentos, sin embargo se han

documentado otras rutas de transmisión incluyendo la transmisión persona a persona,

transmisión vertical y la infección a través de transfusiones de sangre (2). En la mayoría

de casos la hepatitis E aguda se presenta como un cuadro asintomático y se resuelve

espontáneamente, pero en algunos pacientes la infección puede progresar a falla

hepática aguda, estimándose unas tasas de mortalidad entre 0,5% y 4%. Es de especial

cuidado si se da una infección durante el embarazo, ya que provoca cuadros de falla

hepática aguda en mujeres embarazadas alcanzando hasta un 20%-25% de letalidad (3).

El VHE pertenece a la familia Heperividae, la cual está dividida dentro de los géneros

Orthohepevirus y Piscihepevirus. Las especies dentro del género Orthohepevirus están

designadas como Orthohepevirus A (aislados de humanos, cerdos, jabalíes, venados,

mangostas, conejos y camellos), Orthohepevirus B (aislados de aves), Orthohepevirus C

2 Introducción

(aislados de ratas, bandicuts, musarañas, hurones y visones) y Orthohepevirus D

(aislados de murciélagos) (4).

El VHE posee un genoma ARN de cadena simple de sentido positivo, con un tamaño de

7,2 kb y cuenta con tres marcos abiertos de lectura (5, 6). Se han reportado cuatro

genotipos que infectan a humanos, todos dentro de la especie Orthohepevirus A: los

genotipos 1 y 2 (VHE-1 y VHE-2) se encuentran exclusivamente en humanos; el genotipo

3 (VHE-3) infecta a humanos, cerdos, conejos, venados y mangostas; el genotipo 4

(VHE-4) hasta el momento solo se ha reportado en humanos y cerdos (4). El VHE-1 es la

principal causa de hepatitis E esporádica y epidémica en regiones en vía de desarrollo de

Asia y África, mientras que en Suramérica se han reportado casos aislados en

Venezuela, Uruguay y Argentina (7). El VHE-2 ha sido identificado en pacientes en

México, Chad y Nigeria (6, 8, 9). El VHE-3 ha sido encontrado en casos de hepatitis

esporádica en países desarrollados y se ha descrito una alta prevalencia en población

porcícola alrededor del mundo (10). El VHE-4 ha sido identificado en pacientes y cerdos

en Japón, China, Taiwán e India (11), y en Europa central (12-14). Aunque se han

definido varios subgenotipos dentro de estos cuatro genotipos, análisis recientes

sugieren que no es posible establecer límites concretos que los distinga con consistencia

(15, 16), sin embargo tales categorías pueden llegar a ser útiles para estudios

epidemiológicos (17).

La infección por el VHE puede ser diagnosticada indirectamente mediante la detección

en suero de anticuerpos anti-VHE o directamente por la detección del genoma del VHE

en la sangre o en materia fecal. Después de un periodo de incubación de 2-6 semanas,

una respuesta de anticuerpos IgM de corta vida es seguida por una respuesta de

anticuerpos IgG de larga duración. La presencia de IgM anti-VHE es un marcador de

infección aguda, mientras que la presencia de IgG anti-VHE es un marcador de infección

pasada (18). El ARN del VHE llega a ser indetectable en sangre después de tres

semanas del comienzo de los síntomas, pero puede ser detectado en heces durante las

dos semanas siguientes.

La coinfección del VHE con múltiples virus hepatotropos ocurre en varias combinaciones

de casos de hepatitis viral (hepatitis A, B y C), donde hay evidencia en torno a que la

infección simultánea con múltiples virus hepatotropos puede causar un curso clínico más

Introducción 3

severo (19). Un estudio en India reportó que la coinfección del VHE con el virus de la

hepatitis B (VHB) llega a ser del 18% detectada por ELISA (HBsAg e IgM anti-VHE

positivos) y un 6,25% detectando el genoma del VHB y el VHE por PCR en tiempo real,

indicando que la coinfección del VHE+VHB puede ocurrir (20). Por otro lado, algunos

estudios han reportado que la tasa de coinfección del VHE con el virus de la hepatitis A

(VHA) llega al 11,5% (21), haciendo necesaria la detección del VHE para la planeación

de estrategias de vacunación y mejores programas sanitarios. La coinfección entre el

VHC y el VHE ha sido documentada desde hace varios años, mostrando desde entonces

una asociación llamativa entre los dos virus (22), debido a sus características

epidemiológicas tan diferentes.

En Colombia hasta el momento es poca la información que se tiene sobre la presencia

del VHE, solo algunos estudios regionalizados (23-25) y otro en algunos departamentos

del país (26), además no existen datos sobre la coinfección con otros virus hepatotropos

a nivel nacional. Por esta razón se planteó detectar serológica y molecularmente la

coinfección del VHE y otros virus hepatotropos (VHA, VHB, VHC), en sueros

provenientes de pacientes con diagnóstico de hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C, y

caracterizar el genotipo del VHE que circula en Colombia.

1. Justificación

El virus de la hepatitis E ha sido identificado desde 1997 como el principal agente

etiológico de hepatitis entérica en seres humanos, este hallazgo se logró en la epidemia

del valle de Cachemira (India), la cual fue importante para demostrar que el causante de

dicha infección no era el virus de la hepatitis A sino un agente de tipo no A, no B

(HNANB), indicando finalmente la existencia de otro virus de la hepatitis humana (27). De

otro lado se considera que los cerdos son un importante reservorio, siendo el primer

animal donde se encontraron cepas del VHE pertenecientes al genotipo 3. La incidencia

de la enfermedad en países desarrollados de América como Estados unidos es

desconocida; sin embargo varios estudios realizados en muestras de suero reportadas

negativas para virus de la hepatitis A, B, C revelaron la presencia de anticuerpos anti-

VHE considerándose como un indicador de exposición al virus (28).

Debido a que la coinfección del VHE con otros virus hepatotropos ha sido poco

documentada y en la mayoría de los casos está relacionada con falla hepática Aguda

(FHA) y un aumento de ALAT (alanina-aminotransferasa) y ASAT (aspartato-

aminotransfera) (29), al alto porcentaje reportado de anticuerpos IgG anti-VHE (56.7%)

encontrados en pacientes con hepatitis B (HBsAg), 52.0% en pacientes con hepatitis C y

34.1% en pacientes con hepatitis A (30); y que hay evidencias de infección dual y

coinfección en algunas regiones de Colombia (25, 26), se hace indispensable realizar un

estudio para determinar un porcentaje de seroprevalencia y coinfección que incluya todo

el territorio colombiano.

Con la determinación de la presencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE y la búsqueda

de ARN del VHE por RT-PCR en muestras de suero obtenidos de pacientes procedentes

de diferentes departamentos de Colombia se detecta la circulación, se establece el

genotipo del virus, y la incidencia de infecciones mixtas virales por virus hepatotropos en

nuestro país. Los resultados obtenidos permitirán aportar datos importantes sobre la

6 COINFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS E CON OTRAS HEPATITIS


coinfección de virus hepatotropos clásicos con el VHE. A nivel de Salud Pública esta

información es relevante para lo toma de decisiones y la actualización del protocolo de

vigilancia epidemiológica.

1.1 Hipótesis de trabajo

Con la evidencia de circulación del VHE en Colombia, y teniendo en cuenta que el país

presenta incidencias intermedias del VHA y en algunas regiones de VHB, es posible

establecer casos de coinfección del VHE con otros virus hepatotropos.

1.2 Objetivos

1.2.1 General

Determinar los casos de coinfección del Virus de la Hepatitis E en sueros provenientes

de pacientes con diagnóstico de hepatitis A, B o C, atendidos en el periodo 2004-2014 en

los 32 departamentos de Colombia.

1.2.2 Específicos

Establecer el porcentaje de seroprevalencia y coinfección entre VHE y otros virus

hepatotropos mediante ELISA de tercera generación, en sueros de pacientes con

diagnóstico de hepatitis virales causadas por VHA, VHB y/o VHC.

Establecer el genotipo y subtipo del VHE que circula en Colombia mediante RT- PCR

convencional en la población de estudio.

Estandarizar la técnica de RT-PCR en tiempo real para detectar el genoma del VHE

en sueros.

2. Marco Teórico

2.1 Historia del Virus de la Hepatitis E

Estudios realizados en India de grandes epidemias de hepatitis transmitidas por agua en

los años 50 del siglo XX, atribuidas inicialmente a hepatitis A, sugirieron la existencia de

otro agente etiológico de hepatitis viral de transmisión entérica NANB, la cual fue

nombrada tiempo después hepatitis E (27, 31). El VHE fue descubierto en 1983 cuando

se estaba investigando un brote de HNANB en soldados soviéticos en Afganistán,

identificando las partículas virales en las heces de un investigador que ingirió una mezcla

de extractos fecales del personal militar afectado, mediante inmunomicroscopía

electrónica (IME) (32). Hasta 1990 la IME y la infección a primates eran la única forma de

estudiar el virus de la hepatitis E, posteriormente el genoma viral fue clonado y

secuenciado usando muestras de bilis obtenidas de macacos infectados

experimentalmente (6, 33). La primera cepa animal del VHE, designada como VHE

porcino, fue identificada y caracterizada en 1997 en cerdos de Estados Unidos,

estableciendo por análisis filogenéticos que la cepa del VHE porcina estaba

estrechamente relacionada con las cepas del VHE humanas, reconociendo por primera

vez un problema potencial de salud pública por zoonosis (34).

2.2 Taxonomía

Basados en los estudios de IME y del genoma del VHE, al principio se clasificó dentro de

la familia Picornaviridae (32). Años más tarde se demostró que el VHE no compartía

características físicas ni antigénicas con los Picornavirus, pero compartía características

morfológicas con el virus Norwalk, siendo de esta manera clasificado provisionalmente en

la familia Caliciviridae en el género Hepevirus. De acuerdo a esta clasificación el VHE

compartía características similares con los Calicivirus tales como: no poseían envoltura,

presentaban semejanza en la organización del genoma en donde las proteínas no



estructurales se encuentran codificadas en el extremo 5’ y las proteínas estructurales en

el extremo 3’. Sin embargo el orden de los genes del VHE difería de los Calicivirus, y

apoyados en análisis filogenéticos comparativos, se excluyó al VHE de esta familia (35).

Como la secuencia del VHE no tenía una relación cercana con ninguno de los virus

identificados, se realizó la clasificación filogenética mediante el análisis de genes no

estructurales del VHE. Después de muchos estudios basados en la biología molecular

del VHE, el Comité Internacional de Taxonomía de Virus en mayo de 2005 clasificó el

VHE como único miembro del género Hepevirus en la familia Hepeviridae (36). Sin

embargo, las descripciones publicadas sobre divisiones taxonómicas dentro de la familia

Hepeviridae continuaban siendo contradictorias en relación a la definición de especies y

genotipos. Siguiendo la información existente de secuencias del VHE, a través de

análisis filogenéticos más rigurosos, la familia se dividió dentro de los géneros

Orthohepevirus y Piscihepevirus, ubicando al VHE humano y al VHE porcino en la

especie Orthohepevirus A dentro del género Orthohepevirus (4), clasificación aceptada

por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus.

2.3 Propiedades físico-químicas y biológicas

Con los estudios de IME se observó que el VHE presenta una simetría icosaédrica, con

forma esférica y un diámetro de 27-32 nm, presencia de picos en la superficie en forma

de copa y muescas similares a los Calicivirus (37). A pesar de que las micrografías

electrónicas muestran que los viriones encontrados en materia fecal son no envueltos

(Figura 2-1), algunos análisis filogenéticos indican que el VHE está estrechamente

relacionado con la familia Togaviridae, una gran familia de virus envueltos (38). Aunque

aún no han sido visualizados por microscopia electrónica, los virus circulantes en la

sangre durante la hepatitis E aguda tienen una densidad de flotación aproximada de 1,15

g/cm3 en gradientes de sucrosa y están asociados con lípidos (39), diferentes de los

viriones excretados en heces que presentan una densidad aproximada de 1,27 g/cm3. La

proteína ORF3 se encuentra en los virus derivados de suero pero no en los viriones

desnudos aislados de heces. Estos datos indican que las partículas del VHE que circulan

en la sangre muy probablemente son virus envueltos, por lo cual se ha propuesto

nombrar a estas partículas virales como VHE envuelto (VHEe) (40).

Marco Teórico 9

Figura 2-1: Micrografía electrónica mostrando partículas del VHE aisladas de heces (40).

Las partículas del VHE son liberadas del hepatocito como viriones asociados a lípidos de

la membrana celular acompañados por la proteína ORF3 sobre su superficie. Los lípidos

y la proteína ORF3 son disociados del virión una vez este entra en el ducto biliar, el cual

contiene detergente (ácido deoxicolico), y en el duodeno que contiene proteasas

(tripsina) secretadas desde el páncreas (41). Así, las partículas del VHE se encuentran

como virus envueltos en la sangre y como virus no envueltos o desnudos en heces

(Figura 2-2), clasificando al VHE no como un virus desnudo, si no como un virus “cuasi-

envuelto”, similar al VHA (40).

Figura 2-2: Diagrama esquemático de partículas del VHE “envueltas” y “desnudas” (41).



2.4 Organización del genoma

El VHE posee un genoma de ARN de sentido positivo, cadena sencilla y un tamaño de

7,2 kb, el cual tiene una 7-metil guanina en el extremo 5’ y una cola poli-A en el extremo

3’ (6, 33). En los extremos 5’ y 3’ tiene regiones no traducidas (UTR), una región

conservada de 58 nucleótidos después de la región 5’ UTR y una secuencia que es

homologa a los alfavirus. El genoma contiene tres marcos abiertos de lectura (ORF) que

codifican para proteínas estructurales y no estructurales (Figura 2-3).

Figura 2-3: Organización genómica del VHE. Adaptada de la referencia (1).

El ORF1 se encuentra entre los nucleótidos 28-5107, donde se presenta una gran

heterogeneidad entre las secuencias de diferentes aislados del VHE (42). Codifica una

poliproteína no estructural de 1693 aminoácidos, que sufre modificaciones post-

traduccionales para producir cuatro proteínas funcionales: una metiltransferasa (MeT),

una cisteína proteasa similar a la papaína (PCP), una helicasa (Hel), y una ARN

polimerasa dependiente de ARN (RdRp). También contiene dos dominios (X, Y) y una

región rica en prolina hipervariable (V), con una alta variación nucleotídica entre

Marco Teórico 11

diferentes aislados del VHE. Estos dominios podrían estar involucrados en la replicación

del ARN viral y/o la transcripción, mediante el reclutamiento de factores celulares del

complejo de replicación (43).

El ORF2 se extiende desde el nucleótido 5147 hasta el 7127, separado por 38 pb

después del ORF1 en la dirección 3’. Codifica una proteína estructural proORF2, de 660

aminoácidos, que después de la escisión del péptido señal pasa a su forma madura que

es capaz de auto-ensamblarse y glicosilarse para convertirse en la cápside viral (1). La

proteína ORF2 presenta tres dominios lineales: el dominio S, y los dominios M y P que

están involucrados en la interacción del virus con la célula huésped (44). El dominio P

está expuesto hacia el exterior, siendo el sitio de unión de anticuerpos neutralizantes así

como el blanco para algunas de las vacunas que están siendo desarrolladas actualmente

(1).

El ORF3 está comprendido entre los nucleótidos 5128-5497, se solapa con ORF1 y

ORF2, comenzando un nucleótido antes de la finalización de ORF1 y totalmente

solapado con ORF2. La proteína ORF3 tiene una longitud de 114 aminoácidos y es

traducida de un ARN subgenómico bicistrónico (45). ORF3 es una fosfoproteína

estructural que interactúa con el citoesqueleto del hepatocito, contiene dos dominios

hidrofóbicos (D1 y D2), y dos ricos en prolina (P1 y P2). Esta proteína está relacionada

con la patogenicidad del VHE afectando tres procesos biológicos del hepatocito:

promueve la supervivencia celular y la proliferación, modula la respuesta inmunológica en

la fase aguda, y actúa como inmunosupresora (46).

2.5 Heterogeneidad genética del VHE

Un solo serotipo se ha descrito para el VHE, pero existe una gran diversidad genética

entre las diferentes cepas del virus (47). Las variantes del VHE han sido detectadas en

diferentes poblaciones humanas y en animales domésticos y salvajes tales como cerdos,

jabalíes, venados, conejos y mangostas. Las variantes que infectan humanos han sido

clasificadas dentro de cuatro genotipos: los genotipos 1 (VHE-1) y 2 (VHE-2) son

transmitidos fecal-oralmente entre humanos, los genotipos 3 (VHE-3) y 4 (VHE-4) pueden

ser transmitidos a humanos de una manera zoonótica desde cerdos, venados y jabalíes



infectados. Estos genotipos han sido subdivididos dentro de numerosos subtipos, aunque

los criterios para realizar dicha clasificación aún son controversiales (15).

A pesar de contar con una estructura genómica conservada, los análisis filogenéticos

dentro de la familia Hepeviridae son complicados por la dificultad en la alineación de las

secuencias genómicas de muchas variantes divergentes. Las identidades en las

secuencias de aminoácidos entre el virus de la trucha (género Piscihepevirus) y otros

miembros de la familia son solo del 26-27% (ORF1), 18-21% (ORF2) y 13-16% (ORF3).

En contraste, las identidades entre el VHE aislado de aves, ratas y del humano están en

42-49%, 42-55% y 20-29%, respectivamente (4). Comparaciones de secuencias

genómicas completas del VHE revelan una diferencia inter-genotípica de 23,6-27,7%,

entre los cuatro genotipos del VHE que afecta a humanos el VHE-1 tiene hasta un 11,8%

de diversidad intra-genotípica, mientras que el VHE-3 y VHE-4 muestran un amplio rango

de diversidad intra-genotípica (0-19,3% y 0,1-17%, respectivamente) (15). Para el VHE-2

solo se ha determinado la secuencia del genoma completo para la cepa mexicana, las

cepas de África se han secuenciado parcialmente (regiones del ORF2), mostrando que el

VHE-2 puede ser menos heterogéneo que el VHE-3 y VHE-4, pero puede ser más

heterogéneo que el VHE-1 (15).

La comparación de 75 secuencias del genoma completo del VHE evidencia que la

diferencia inter-genotípica de la secuencia deducida de aminoácidos para ORF2

(cápside) está entre el 6,5-11,7%, mostrando un alto grado de conservación entre los

distintos genotipos, correlacionándose con la poca diversidad antigénica; por lo que se

explica que solo exista un solo serotipo del VHE. Sin embargo, a pesar de la limitada

heterogeneidad en aminoácidos, existe un grado significativo de variabilidad en las

secuencias nucleotídicas entre diferentes cepas aisladas de diferentes partes del mundo

(15). Basados en diferentes análisis filogenéticos de varias cepas del VHE, los cuatro

genotipos se han dividido dentro de diferentes subtipos (11): de tal manera el VHE-1 ha

sido dividido en cinco subtipos (a-e), el VHE-2 en dos subtipos (a-b), el VHE-3 en diez

subtipos (a-j), y el VHE-4 en siete subtipos (a-g).

Marco Teórico 13

2.6 Ciclo de replicación

El VHE es muy difícil de replicar en sistemas de cultivo celular in vitro, sin embargo ha

habido infecciones y replicaciones exitosas en células derivadas de carcinoma

hepatocelular humano (PLC/PRF/5) y células derivadas de cáncer de pulmón humano

(A549) (41). Debido a esto, el modelo propuesto para la replicación del VHE está basado

en las similitudes y homología de la secuencia con otros virus ARN de sentido positivo

bien caracterizados de la súper-familia de los alfavirus, traducción mediada por la 7-metil

guanina en el extremo 5’ del genoma, traducción parcial del genoma (ORF1) (48),

síntesis de un ARN subgenómico para la traducción del ORF2 y ORF3 (49) (Figura 2-4).

Figura 2-4: Modelo propuesto de la replicación del VHE (3).

Las principales células blanco para la replicación del VHE son los hepatocitos, aunque

otros sitios de replicación se han sugerido en cerdos y monos Rhesus (50). Las

partículas virales se concentran en la superficie de las células blanco a través de

proteoglicanos heparin-sulfato (HSPG, HSC70, y otros), que actúan como factores de

unión (1). Los receptores específicos de la célula para el VHE aún son desconocidos, sin

embargo caracterizaciones recientes evidencian que las proteínas HSP90 y Grp78



podrían estar involucradas como receptores (51). De tal manera el VHE se une a las

células susceptibles del hospedero mediante receptores específicos de alta afinidad y

entra al citoplasma mediante endocitosis mediada por clatrina (52). Una vez en el

citoplasma, el virión libera el ARN genómico que es traducido en las proteínas no

estructurales del ORF1. La RdRp sintetiza un ARN intermediario de sentido negativo a

partir del ARN genómico del VHE, que sirve como molde para la síntesis del ARN

subgenómico de 2,2 kb y para los transcritos del ARN genómico de sentido positivo (53).

El ARN subgenómico es traducido en las proteínas estructurales ORF2 (cápside) y ORF3

(54), una vez traducida ORF2 es transportada del retículo endoplasmático al aparato de

Golgi donde sufre modificaciones post-traduccionales, principalmente glicosilaciones

(55), y posteriormente empaca el ARN genómico en el citoplasma para ensamblar

nuevos viriones. Estos viriones son transportados a la membrana celular, donde la

proteína ORF3 asociada con endomembranas, recubre las partículas virales

ensambladas y participa en el egreso del virus de la célula (41).

2.7 Proteínas del VHE

La cinética de la expresión de las proteínas del VHE (ORF1, ORF2, ORF3) durante el

ciclo de replicación viral aún no está completamente dilucidada, pero su expresión

durante la infección es confirmada por la presencia de anticuerpos específicos para cada

proteína en muestras obtenidas de pacientes y en modelos animales experimentales

(56).

2.7.1 ORF1

No es del todo claro si la poliproteína ORF1 es procesada en unidades bioquímicas

distintas. Se han detectado anticuerpos anti-MeT, anti-Hel y anti-RdRp (57), aunque otros

estudios de expresión en E. coli y líneas celulares HepG2 no evidencian el

procesamiento (58). En general se habla que la poliproteína contiene cuatro dominios

funcionales, que también están presentes en las proteínas no estructurales de otros virus

ARN de cadena positiva (59):

Marco Teórico 15

Metiltransferasa: los alineamientos de ORF1 sugieren que los residuos amino

terminal 60-240 pueden actuar como la MeT viral (59), que cataliza la formación de la

modificación 5’ del ARN viral al mostrar actividad guanina-7-metiltransferasa y

guaniltransferasa (60).

Proteasa: los alineamientos predicen la presencia de una PCP con una similitud

moderada a la proteasa del virus de la rubeola (59), en la región de aminoácidos 433-

592 de ORF1. Sin embargo, no se ha descrito ninguna actividad funcional para este

dominio.

Helicasa: este dominio contiene siete motivos conservados encontrados en las

helicasas SF-1, además tiene dominios NTPasa y de unión-ARN (59). Evidencia

experimental muestra una actividad helicasa de desenvoltura en la dirección 5’→3’,

como también una actividad ARN 5’-trifosfatasa que ayuda a la MeT en la

catalización del primer paso de la formación de la caperuza 5’ (61, 62).

RdRp: la región del VHE que comprende la RdRp está entre los nucleótidos 3546-

5106. Es usada para replicar el ARN genómico a través de un ARN intermediario anti-

genómico. La RdRp se une al extremo 3’ del ARN genómico para comenzar la

síntesis de la banda complementaria de ARN. Se ha sugerido que la RdRp estaría

localizada en las membranas intracelulares del retículo endoplasmático, donde

también se llevaría a cabo la replicación del ARN (63).

2.7.2 ORF2

La proteína ORF2 es subunidad estructural de la cápside viral. Contiene un péptido señal

N-terminal que transloca la proteína dentro del retículo endoplasmático donde sufre N-

glicosilación, que puede ser una ventaja para que el virus utilice las membranas celulares

de la célula huésped en su proceso de replicación y la maduración de la partícula viral.

La estructura de una partícula viral fue resuelta mediante microscopia electrónica,

mostrando que la cápside está compuesta principalmente por dímeros. ORF2 posee tres

dominios: S (Shell), M (Middle) y P (Protruding) (64), donde los epítopes neutralizantes

del VHE se ubican en el dominio P, de tal manera que los estudios inmunológicos sobre

ORF2 dan bases para el desarrollo de una vacuna contra el VHE (65). La caracterización

bioquímica y estructural de ORF2 también permite estudiar las interacciones del VHE con

las células blanco, con lo cual se ha evidenciado la interacción de ORF2 con proteínas

tales como Grp78/BiP, alfa-tubulina, HSPGs y HSP90 (66), aunque no se ha logrado



identificar el receptor celular del VHE y caracterizar completamente la toma del virus y las

vías de liberación del ARN viral en las células infectadas.

2.7.3 ORF3

ORF3 funciona como una proteína accesoria para el VHE, y existe evidencia que afecta

la respuesta del hospedero a la infección (Figura 2-5). Está fosforilada en un residuo de

serina y se asocia con el citoesqueleto de la célula huésped (67), donde se ha

evidenciado que su distribución intracelular se localiza en los endosomas de reciclaje

interactuando con los microtúbulos de la célula. Varios estudios de los distintos dominios

de ORF3 sugieren que esta proteína cumple un papel fundamental en la optimización del

ambiente celular para la infección viral y la replicación. ORF3 activa la quinasa Erk, cuya

activación prolongada genera una señal de supervivencia y proliferación celular. Las

células que expresan la proteína ORF3 también muestran altos niveles de hexoquinasa y

formas oligoméricas de un canal aniónico dependiente de voltaje, que conduce a la

atenuación de la señalización de muerte mitocondrial (45). Mediante su interacción con

los endosomas de reciclaje retrasa la internalización del receptor del factor de

crecimiento epidermal (EGFR), reduciendo los niveles del factor de transcripción

fosforilado pSTAT3 que activa la transcripción de los genes involucrados en la respuesta

inflamatoria del hospedero en la fase aguda (36).

La proteína ORF3, a través de su dominio P2, se une a la proteína celular Tsg101 (gen

de susceptibilidad tumoral 101) lo que incrementa la secreción de la alfa-1-microglobulina

por la célula huésped. Ya que la alfa-1-microglobulina es una proteína inmunosopresora,

se ha propuesto que el VHE utiliza a ORF3 para proteger a las células infectadas en el

hígado de la respuesta inmune del hospedero.

Marco Teórico 17

Figura 2-5: Papel de la proteína ORF3 en la patogénesis del VHE (36).

2.8 Patogénesis

La infección experimental en humanos y primates ha provisto datos con respecto a los

eventos patogénicos de la infección por el VHE, resultantes de la administración intra-

gastrica o intravenosa del virus. Se conoce que la principal ruta de entrada del virus al

hospedero es oral, pero no existen suficientes datos clínicos o experimentales que

documenten que el VHE alcanza el hígado desde el tracto gastrointestinal a través de la

circulación portal hepática (68). El VHE es detectado en heces aproximadamente una

semana antes del comienzo de los síntomas y hasta por dos semanas después, mientras

que el ARN viral se ha encontrado en suero en casi todos los pacientes dentro de las dos

semanas siguientes al comienzo de los síntomas y continua siendo detectado en heces

por cerca de dos semanas (69), aunque ha habido reportes de periodos prolongados de

positividad para el ARN del VHE en suero desde 4 hasta 16 semanas (Figura 2-6).



Figura 2-6: Principales eventos patogénicos (virología, serología, enfermedad) durante la

infección aguda con el VHE (68).

La respuesta de anticuerpos anti-VHE es detectada generalmente al tiempo del comienzo

de los síntomas. La IgM anti-VHE aparece en la fase temprana de los síntomas clínicos y

hasta por 4-5 meses, y la respuesta por la IgG comienza a desarrollarse poco después

de la respuesta por IgM, continuando con títulos altos desde 1 hasta 4 años después de

la fase aguda de la enfermedad (Figura 2-6). La aparición de anticuerpos anti-VHE en

suero es concordante con el comienzo de la elevación de la ALAT en suero y con

cambios histopatológicos en el hígado (68).

El periodo de incubación del VHE es aproximadamente de 21 días, la síntesis de

proteínas virales en los hepatocitos comienza 7 días después de la infección y alcanza su

máximo nivel coincidiendo con el pico de ALAT, detectando el virus en 70-90% de los

hepatocitos. Entre los factores que determinan la severidad de la enfermedad causada

por el VHE están: embarazo, uso de anticonceptivos, edad, pre-existencia de alguna

enfermedad hepática, la respuesta inmune del hospedero, genotipo del VHE, la dosis

infecciosa, entre otros (1). De acuerdo a los estudios patológicos, virológicos y

serológicos, el mecanismo patogénico de la enfermedad puede ser mediado por la

respuesta inmune del hospedero en vez de estar relacionado con los efectos citopáticos

causados por el VHE (68). La patología del hígado en la hepatitis E aguda es similar a la

observada en otras hepatitis virales agudas, presentando un desorden lobular con

Marco Teórico 19

distorsión reticular y la expansión del tracto portal con infiltración de linfocitos

inflamatorios y polimorfo-nucleares (70).

2.9 Hepatitis E y embarazo

El VHE tiene un comportamiento especial en mujeres embarazadas en ciertos países.

Estudios en India, Etiopía y Angola han mostrado que la incidencia de la infección por el

VHE en embarazadas es alto y una proporción significativa puede progresar a hepatitis

fulminante, con una tasa de mortalidad variando del 30–100% (71). La hepatitis E tiene

una alta incidencia y un curso severo en mujeres embarazadas en algunas regiones

geográficas de países endémicos para el VHE, tal como en el norte de India (72), sin

embargo en otros países endémicos la enfermedad presenta un curso benigno con poca

o ninguna morbilidad (73). Las diferencias en el desarrollo de la enfermedad en mujeres

embarazadas en distintas regiones puede ser el resultado de la exposición temprana al

virus durante la niñez, produciendo una inmunidad duradera y/o modificando las

respuestas posteriores a la exposición al virus, o debido a los genotipos predominantes

en cada área geográfica que pueden presentar diferencias en la virulencia (71). El daño

hepático severo por el VHE durante el embarazo puede estar relacionado con los

cambios inmunes y hormonales que ocurren durante este, así como también a factores

genéticos y ambientales.

Durante el embarazo el sistema inmune de la madre es alterado para tolerar al feto

genéticamente diferente, también se incrementan los niveles de hormonas esteroides

que pueden promover la replicación viral. Esto también inhibe directamente las células

hepáticas, lo que puede predisponer a falla hepática cuando se exponen a patógenos

infecciosos (74). Las hormonas esteroides también son inmunosupresoras y median la

apoptosis de los linfocitos a través del NF-κB, factor de transcripción que está

involucrado en el desarrollo y regeneración del hígado y sus efectos sobre el sistema

inmune. La ausencia de la proteína p65, componente del complejo NF-κB, produce daño

fulminante en el hígado, esta ausencia en pacientes embarazadas es probablemente la

responsable de una FHF (75). Las mujeres embarazadas infectadas con VHE y con FHF

presentan un conteo menor de células CD4 y un conteo mayor de células CD8, niveles

mayores de estrógeno, progesterona y β-HCG que pacientes VHE-negativos (76). Estos



resultados dan una explicación probable de la interacción del VHE con el sistema inmune

y sus efectos acentuados durante el embarazo.

2.10 Respuesta Inmunológica

La respuesta inmune celular ante la infección aguda por el VHE aún no está totalmente

caracterizada. Se ha observado una expansión de células CD4 en pacientes con VHE

comparados con controles (77). Un descenso en las células T productoras de IFNγ y

TNFα en pacientes con hepatitis E, seguido por una activación policlonal con ionomicina,

sugieren un defecto inherente en la activación de células T en individuos infectados con

VHE. La limitada reactividad inmune observada en el compartimento periférico puede ser

resultado de la migración y secuestro de células inmunes en el hígado (36).

Se han encontrado mayores títulos de anticuerpos anti-VHE y niveles más altos de

citoquinas pro-inflamatorias en pacientes con falla hepática aguda comparados con

pacientes con una hepatitis E aguda auto-limitada, mostrando que la estimulación de la

respuesta inmune tipo Th1 y Th2 puede jugar un papel en la falla hepática causada por la

infección con el VHE (78). Las células natural killer (NK) pueden estar involucradas en la

mediación de la respuesta inmune a la infección por VHE, ya que el aumento observado

en células CD4 puede reflejar un incremento en la población de células NK, que a su vez

produce la elevación de los niveles de IFNγ visto en pacientes con hepatitis E,

contribuyendo a la muerte de los hepatocitos (79). La actividad de NF-κB parece estar

alterada por el VHE (75), y ya que este factor nuclear está involucrado en la regulación

de la transcripción durante la respuesta a la infección, esta alteración puede sugerir

mecanismos por los cuales el VHE puede alterar y evadir la respuesta inmune del

hospedero (79).

2.11 Epidemiología

El VHE es considerado hiperendémico en países en vía de desarrollo como India,

Bangladesh y China, donde ocurren grandes brotes transmitidos por el agua asociados a

los genotipos VHE-1 y VHE-2. En estas regiones los brotes ocurren con frecuencia

separados por pocos años, con un comportamiento unimodal que puede durar unas

Marco Teórico 21

pocas semanas o epidemias prolongadas con varios picos que permanecen durante un

año, indicativo de una contaminación continua del agua. Los brotes son frecuentemente

posteriores a lluvias intensas e inundaciones lo que facilita la mezcla de excreciones

humanas con fuentes de agua potable, o a meses de verano secos y calientes donde los

contaminantes fecales aumentan su concentración por la reducción de los flujos y

corrientes de agua. Estudios sobre la seroprevalencia de IgG anti-VHE en la mayoría de

niños menores de 10 años en estas regiones muestran que no han sido expuestos al

VHE, incrementando dramáticamente entre los 15 y 30 años, con una meseta alrededor

de los 30 (18). En países con una alta endemicidad las tasas de prevalencia de

anticuerpos anti-VHE son mayores que las de los países de baja endemicidad, pero son

mucho menores que las esperadas de acuerdo a las frecuentes apariciones de brotes.

Además, las diferencias en las tasas de prevalencia de anticuerpos entre los países, a

veces no encajan bien con otros datos disponibles. Por ejemplo, las tasas de

seroprevalencia en la India son más bajas que las de Egipto, a pesar de que los brotes

de hepatitis E son comunes en los primeros y son prácticamente desconocidos en el

segundo, la razón de esto aún no es clara (80).

En regiones de baja endemicidad (Europa, Estados Unidos, Canadá, Australia, Nueva

Zelanda, Japón, Taiwán, Hong Kong, entre otros) son desconocidos grandes brotes y

solo se han reportado unos pocos brotes limitados a la transmisión por alimentos, donde

la enfermedad esporádica debida a la infección por VHE no es frecuente, formando solo

una minoría de todos los casos de hepatitis viral aguda (80). En general, en los países de

baja endemicidad la infección por el VHE se presenta en un rango de edad mayor que en

los de alta, y los pacientes infectados frecuentemente presentan otras enfermedades al

mismo tiempo como diabetes, enfermedades cardiovasculares y problemas hepáticos

previos (81). Varios estudios también han reportado tasas de seroprevalencia altas de

VHE (5 - 20%) en población de países industrializados, lo que sugiere una infección de

amplia difusión, que muy probablemente se produce en un nivel subclínico (82). La gran

mayoría de las infecciones que ocurren en regiones de baja endemicidad parecen ser

asintomáticas, por lo que se observan altas tasas de seroprevalencia en relación con el

bajo número de casos reportados. A diferencia de los genotipos VHE-1 y VHE-2, las

infecciones causadas por los genotipos VHE-3 y VHE-4 parecen causar hepatitis clínica

en sujetos de mediana edad y en adultos mayores, que es un comportamiento atípico ya

que la exposición al VHE es independiente de la edad y el sexo, y sugiere la presencia



de factores de riesgo del hospedero que pueden ser cruciales para la manifestación

clínica de la enfermedad (80).

Los modos de transmisión del VHE en casos esporádicos aún no son entendidos

completamente, y son de los aspectos más discutidos con respecto al VHE, existiendo

marcadas diferencias entre diferentes áreas geográficas (1). Además de la ingestión de

agua y comida contaminada, y la transmisión persona-persona, la transmisión vertical del

VHE de madre a hijo está documentada, mientras que no hay evidencia de transmisión

sexual (83). El contacto directo con animales infectados con VHE es otra posible ruta de

transmisión, donde estudios de seroprevalencia han mostrado que los veterinarios y

personal que maneja cerdos son más propensos a ser IgG anti-VHE positivos que la

población general (84). La transmisión parenteral también ha sido documentada en varios

países, pero su significancia aún no es clara (85-87).

2.12 Diagnosis de la infección por el VHE

Los síntomas de infección por el VHE en humanos son casi indistinguibles de otras

hepatitis virales, excepto por las características epidemiológicas y los factores de riesgo.

En áreas de alta endemicidad, muchos pacientes presentan un pródromo corto, seguido

por orina oscura e ictericia. Muchos pacientes se recuperan espontáneamente, pero

algunos desarrollan hepatitis aguda sintomática, y puede llegar a progresar en una

hepatitis crónica y falla hepática en pacientes inmunocomprometidos y en mujeres

embarazadas, respectivamente. En áreas con baja endemicidad los síntomas son más

variables, y algunos pacientes no presentan los síntomas típicos de hepatitis y/o valores

anormales en los parámetros del hígado (88).

Las pruebas de laboratorio para detectar la infección por el VHE incluyen pruebas

serológicas para la detección de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE y técnicas moleculares

para la detección del ARN viral. Actualmente la mayoría de laboratorios usan como

diagnóstico de una hepatitis E aguda la presencia de anticuerpos IgM anti-VHE en suero,

detectados mediante pruebas ELISA durante la fase aguda de la enfermedad y hasta por

5 meses. Los anticuerpos IgG anti-VHE son detectables después del aumento de IgM

con un incremento en sus títulos desde la fase aguda hasta la fase de convalecencia

Marco Teórico 23

(Figura 2-6), lográndose detectar hasta después de 5 años del comienzo de la fase

aguda de la enfermedad, por lo que un resultado IgG anti-VHE positivo es indicativo de

una exposición previa al VHE. Los ensayos ELISA usan como blanco proteínas

recombinantes o péptidos sintéticos del VHE correspondientes a epítopes de antígenos

de las proteínas estructurales ORF2 y/o ORF3 de las cepas México y/o Burma, sin

embargo los antígenos recombinantes derivados de ORF2 han mostrado mayor

sensibilidad y especificidad que los de ORF3. Varios kits ELISA comerciales usan

antígenos virales recombinantes unidos a la superficie de la fase sólida, en ensayos

indirectos o tipo sándwich de doble antígeno. Sin embargo, el desempeño de algunos kits

comerciales es considerado sub-optimo ya que varios estudios han demostrado

resultados discordantes, donde la sensibilidad varía en el rango del 17% al 100% y

algunos no detectan anticuerpos IgM en pacientes infectados con VHE-2 a VHE-4 (88).

La detección de anticuerpos IgM puede verse enmascarada por la competencia con los

anticuerpos IgG, que generalmente presentan mayores niveles. De tal manera, las

pruebas serológicas disponibles actualmente varían considerablemente en sensibilidad y

especificidad, complicando la interpretación y comparación de los resultados presentados

en diferentes estudios.

El virus puede ser detectado en heces una semana antes del comienzo de los síntomas y

puede ser excretado por cerca de dos semanas, encontrándose en algunos casos hasta

52 días después del comienzo de los signos clínicos; además, está presente en la sangre

alrededor de tres semanas después del comienzo de los síntomas. Teniendo en cuenta

que los niveles del ARN viral en heces y suero son transitorios, la ventana para detectar

el ARN es muy corta, requiriendo que la técnica aplicada para detectar el ARN viral sea

muy sensible y especifica (18). Las pruebas moleculares se utilizan como métodos

directos de diagnóstico de la infección con el VHE, mediante la detección del ARN del

virus en heces y suero. Aunque existen otros métodos basados en biología molecular, la

RT-PCR es el método más usado para la detección del ARN viral, usando tanto la

convencional como la RT-PCR en tiempo real. Se han desarrollado varios protocolos que

varían en la posición y longitud del genoma del VHE que se amplifica, donde en la

mayoría se utilizan primers que flanquean secuencias conservadas, por lo que la

identificación y caracterización del genotipo del VHE es llevada a cabo generalmente

mediante la secuenciación de los productos amplificados.



2.13 Seroprevalencia de la infección por el VHE

Las tasas de positividad para IgG en zonas endémicas son las que reflejan la frecuencia

de la infección por VHE en estas regiones. Aunque existen varios estudios sobre la

prevalencia de anticuerpos anti-VHE en diferentes grupos poblacionales, la sero-

epidemiologia de la hepatitis E en los países en desarrollo no es uniforme y por lo

general no sigue los patrones del curso clínico de la enfermedad. En zonas rurales del

sur de China donde la mayoría de infecciones por VHE producidas por el genotipo 4 son

zoonóticas, los anticuerpos IgG anti–VHE son raramente detectados en niños, pero tiene

un aumento significativo con la edad en jóvenes y adultos mayores (60-80%). La

seroprevalencia en mayores de 30 años ocurre en mayor proporción en hombres que en

mujeres (89).

En los países desarrollados la diferencia entre la seroprevalencia y la incidencia de la

hepatitis E es aún más marcada, a pesar de la alta seroprevalencia en muchos países

europeos y de Estados Unidos, la ocurrencia de la enfermedad generalmente es baja

(81). La prevalencia de los anticuerpos IgG anti-VHE es relativamente baja (3%) en la

población de países desarrollados (Tokio, Japón), en Francia (3.2%), en Cataluña,

España (7.3%), en el suroeste de Francia (16.6%), en el suroeste de Inglaterra (16%), y

un 21.3% en donantes de sangre en EE.UU. Estos datos en poblaciones donde se

diagnostica la infección aguda, hacen pensar en un curso de la infección de forma

subclínica. Así mismo la hepatitis E aguda no es diagnosticada en la mayoría de los

casos, bien sea porque no se realiza la serología o es diagnosticada como otras causas

de hepatitis (90).

3. Materiales y métodos

3.1 Tipo de estudio

Se llevó a cabo un estudio descriptivo retrospectivo donde se analizaron sueros

recolectados durante el periodo 2004 – 2014, almacenados en la seroteca del Grupo de

Virología del Instituto Nacional de Salud (INS) a -25 °C y con diagnóstico positivo para

hepatitis viral.

3.2 Selección de las muestras

Después de la revisión de los libros de registro y las bases de datos del laboratorio de

hepatitis del Grupo de Virología, se recolectaron 1097 muestras de suero que cumplían

los siguientes criterios de inclusión: sueros con diagnóstico clínico de hepatitis

confirmado por laboratorio positivo para hepatitis A, B y/o C; pacientes con un rango de

edad de 2 – 70 años; presencia de ictericia; cantidad suficiente para realizar las pruebas

serológicas y la extracción de ARN viral; y ausencia de características lipémicas y

hemólisis en las muestras. La infección por un virus de la hepatitis se evaluó por la

presencia de marcadores serológicos: IgM anti-VHA (hepatitis A), HBsAg (hepatitis B) y

RIBA para VHC (hepatitis C). Los sueros seleccionados se remitieron al INS para el

diagnóstico de hepatitis virales procedentes de los 32 departamentos de Colombia.

3.3 Pruebas serológicas

Los 1097 sueros fueron analizados para detectar anticuerpos IgG e IgM anti-VHE

mediante ELISA de tercera generación usando los kits comerciales DIA.PRO (Diagnostic

BioProbes s.r.l, Milán – Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante.



3.3.1 Detección de anticuerpos IgG anti-VHE

Se utilizó el kit ELISA de tercera generación HEV IgG de DIA.PRO para la determinación

cualitativa de anticuerpos IgG anti-VHE en los sueros. Las microplacas estaban

recubiertas con antígenos codificados recombinantes específicos del VHE derivados de

las cepas de México y Burma, que permiten identificar los determinantes

inmunodominantes y conservados de todos los genotipos del VHE (VHE-1, VHE-2, VHE-

3, VHE-4). La fase sólida se trató con la muestra diluida para la captura de los

anticuerpos IgG anti-VHE por el antígeno. Después de lavar para eliminar otros

componentes de la muestra, en la segunda incubación los anticuerpos IgG anti-VHE

unidos a la fase sólida se detectaron por la adición de anticuerpos policlonales

específicos anti-IgG humanos (anti-hIgG), marcados con peroxidasa de rábano (HRP). La

enzima capturada sobre la fase sólida, actúa sobre la mezcla sustrato/cromógeno,

generando una señal óptica que es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgG anti-

VHE presentes en la muestra. Un valor de corte permite que las densidades ópticas sean

interpretadas como resultados anti-VHE IgG positivos o negativos.

3.3.2 Detección de anticuerpos IgM anti-VHE

Para la detección de estos anticuerpos se utilizó el kit ELISA HEV IgM de DIA.PRO. Las

microplacas estaban recubiertas con antígenos sintéticos específicos del VHE

codificados para identificar determinantes conservados e inmunodominantes derivados

de las regiones ORF2 y ORF3 de los cuatro genotipos. Si los anticuerpos estaban

presentes en el suero, al agregarse la muestra diluida sobre la fase sólida los anticuerpos

IgM anti-VHE eran capturados por los antígenos adsorbidos en los pozos. Después de

los lavados, el resto de componentes presentes en la muestra que no se hayan unido a la

fase sólida son eliminados. En la segunda incubación los anticuerpos IgG anti-VHE

unidos a la fase sólida se detectaron por la adición de anticuerpos policlonales

específicos anti-hIgM, marcados con HRP. La enzima peroxidasa unida ahora a la fase

sólida de la placa, reacciona con el sustrato/cromógeno, generando una señal óptica que

es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgM anti-VHE presentes en la muestra.

Posteriormente, mediante un valor de corte calculado, las densidades ópticas pueden

interpretarse como resultados anti-VHE IgM positivos o negativos. La neutralización de

Materiales y métodos 27

IgG anti-VHE y el factor reumatoide se llevó a cabo directamente en el pozo, esto se

realizó para bloquear este tipo de interferencias.

3.4 Pruebas moleculares

Los sueros positivos para los marcadores serológicos IgM anti-VHE e IgG anti-VHE se

seleccionaron para la detección del ARN viral en suero mediante una RT-PCR anidada

(nRT-PCR) estandarizada en el laboratorio, y la genotipificación del virus.

3.4.1 Extracción del ARN viral

La extracción del ARN del VHE se realizó usando el kit comercial QIAamp® Viral RNA

Mini Kit (QIAGEN®, Brazil) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se adicionaron

140 µL de suero a 560 µL de buffer de lisis AVL que contenía ARN carrier (poli A),

mezclándolos mediante vortex durante 15 s e incubando la mezcla a temperatura

ambiente durante 10 min, tiempo suficiente para completar la lisis de la muestra. Una vez

completada la lisis, se adicionaron 560 µL de etanol (96-100%) y se homogenizó la

mezcla mediante vortex por 15 s. Se tomaron 630 µL de esta solución y se colocaron en

la columna QIAamp Mini que contenía la membrana de sílica donde se adsorbe el ARN

viral, y se procedió a centrifugar a 8000 rpm durante 1 min. Después de la centrifugación

se descartó el filtrado y se repitió el procedimiento anterior. Posteriormente, se

adicionaron 500 µL del buffer de lavado AW1 a la columna y se centrifugo nuevamente a

8000 rpm durante 1 min, y para asegurar una extracción eficiente y con un ARN de alta

pureza se volvió a lavar la columna con el buffer de lavado AW2 y se centrifugo a 14000

rpm durante 3 min. Para eluir el ARN unido a la membrana se colocó la columna en un

tubo para microcentrifuga de 1,5 mL, se le adiciono 60 µL de buffer AVE (agua libre de

RNasa con 0,04% de azida de sodio) incubando a temperatura ambiente por 1 min y se

centrifugo a 8000 rpm durante 1 min. El ARN extraído se almaceno a -30 °C hasta su uso

posterior en la amplificación por nRT-PCR.

3.4.2 nRT-PCR

La estandarización para la detección del ARN del VHE se realizó mediante nRT-PCR

usando dos sets de primers que amplificaban fragmentos de las regiones del ORF1 y



ORF2 (91), y adicionalmente un set de primers que amplificaba una región del ORF1

(92). Los primers externos para ORF1 (91) flanquean las posiciones 56-79 y 451-473 del

genoma según la cepa prototipo Burma (Código de acceso Gen Bank M73218) y

corresponden a la región que codifica para la MeT amplificando un fragmento de 418 pb,

mientras que los primers internos amplifican un fragmento de 287 pb. Los primers para

ORF1 (92) amplifican la región correspondiente a la RdRp de una longitud de 307 pb. Los

primers para ORF2 (91) amplifican un segmento de la cápside del VHE, los primers

externos amplifican un producto de 197 pb en la primera PCR, y los primers internos

amplifican un producto de 145 pb en la segunda PCR. El resumen de los primers usados

se presenta en la Tabla 3-1.

Tabla 3-1: Primers utilizados para la detección del ARN del VHE por nRT-PCR, descritos

previamente en (91, 92).

Primer Sentido Secuencia (5’ – 3’) Posición en el

genoma1

ConsORF1-s1 Sentido (Externo) CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC 56 – 79

ConsORF1-a1 Anti-sentido (Externo) CCATCRARRCAGTAAGTGCGGTC 451 – 473

ConsORF1-s2 Sentido (Interno) CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG 104 – 124

ConsORF1-a2 Anti-sentido (Interno) GGCAGWRTACCARCGCTGAACATC 367 – 389

ConsORF2-s1 Sentido (Externo) GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG 6289 – 6321

ConsORF2-a1 Anti-sentido (Externo) CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC 6470 – 6494

ConsORF2-s2 Sentido (Interno) GTYGTCTCRGCCAATGGCGAGC 6347 – 6368

ConsORF2-a2 Anti-sentido (Interno) GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG 6466 – 6490

MJC1 RdRp Sentido (Externo) CATGGTAAAGTGGGTCAGGGTAT 4213 – 4235

MJC2 RdRp Anti-sentido (Externo) AGGGTGCCGGGCTCGCCGGA 4576 – 4595

MJC3 RdRp Sentido (Interno) GTATTTCGGCCTGGAGTAAGAC 4232 – 4253

MJC4 RdRp Anti-sentido (Interno) TCACCGGAGTGYTTCTTCCAGAA 4561 – 4583

1 La posición de los nucleótidos está asignada de acuerdo a la cepa Burma (M73218).

En la primera ronda de PCR se utilizó el kit QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN,

Brazil) con un volumen final de reacción de 25 μL: 5 μL de Buffer 5x RT-PCR, 1 μL de

dNTPs 10 mM, 1 μL de cada primer externo 10 μM, 1 μL del mix de enzimas y 3 μL del

ARN extraído. La segunda PCR tenía un volumen final de 25 μL y contenía los siguientes

reactivos: 2,5 μL de Buffer 10x PCR (Invitrogen); 0,5 μL de dNTPs 10 mM (Invitrogen); 1


U de Platinum Taq polymerase (Invitrogen); 1 μL de cada primer interno 10 μM; 0,75 μL

de MgCl2 50 mM (Invitrogen) y 2 μL del producto de la primera amplificación.

Las condiciones para la primera PCR fueron las siguientes: un ciclo de transcripción

reversa a 50 °C por 30 min seguido por un paso de inactivación/activación a 95 °C por 15

min; 35 ciclos de desnaturalización (94 °C por 30 s), anillamiento (50 °C por 30 s),

extensión (72 °C por 30 s) y una extensión final a 72 °C por 6 min. La segunda PCR tuvo

las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial a 94 °C por 2 min, 35 ciclos de

desnaturalización (94 °C por 30 s), anillamiento (50 °C por 30 s), extensión (72 °C por 30

s) y una extensión final a 72 °C por 6 min.

Para detectar los productos de la nRT-PCR, 8 μL del amplificado se adicionaron a 1 μL

de buffer de carga BlueJuiceTM (Invitrogen) y se separaron por electroforesis en gel de

agarosa UltraPureTM (Invitrogen) al 2% teñido con SYBR® Safe (Invitrogen). El corrido

electroforético se realizó a 100 V durante 60 min. Se utilizó como marcador de peso

molecular escaleras de ADN de 100 pb y 123 pb (Invitrogen) y las bandas se visualizaron

en un fotodocumentador (Bio-Rad, Gel DocTM XR+ System) mediante el programa

Quantity One® 4.6.7 (Bio-Rad).

3.4.3 RT-PCR en tiempo real

Esta técnica se estandarizo siguiendo el protocolo desarrollado por Jothikumar y

colaboradores (93), con algunas modificaciones adaptadas a las condiciones del

laboratorio. Se utilizó el kit SuperScipt® III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR

System (Invitrogen) para realizar las mezclas de reacción (25 µL): 0,5 µL de SuperScipt®

III RT/Platinum® Taq Mix, 12,5 µL de mix de reacción 2X, y primers y la sonda a una

concentración de 250 y 100 nM respectivamente. El primer delantero (JVHEVF; 5’-

GGTGGTTTCTGGGGTGAC-3’) y el primer reverso (JVHEVR; 5’-

AGGGGTTGGTTGGATGAA-3’) amplifican la región correspondiente a la posición 5261-

5330 del genoma de la cepa Burma, detectada por la sonda TaqMan® JVHEVP: 5’ FAM-

TGATTCTCAGCCCTTCGC-BHQ1 3’, todos sintetizados por BioSearch Technologies.

El perfil térmico de la RT-PCR consistió en un ciclo de transcripción reversa y

desnaturalización a 50 °C por 30 min y 95 °C por 15 min, respectivamente; seguido por la



amplificación con 40 ciclos a 95 °C por 10 s, 55 °C por 20 s y 72 °C por 15 s, en un

termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems).

3.4.4 Secuenciación y análisis filogenético

Los productos de la RT-PCR positivos para ARN-VHE fueron purificados mediante

QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN, Brazil) de acuerdo a las instrucciones del

fabricante: se añadió 85 µL de buffer PB a 17 μL de amplificado, la mezcla se colocó en

la columna QIAquick y se centrifugo a 13000 rpm por 60 s. Para lavar el ADN unido a la

columna, se agregó 750 μL de Buffer PE y se centrifugo a la misma velocidad y tiempo

que el paso anterior. El ADN se eluyó adicionando 30 μL de buffer EB (10 mMTris·Cl, pH

8.5) a la columna, incubando durante 1 min y centrifugando con las mismas condiciones

anteriores. El ADN purificado se cuantifico utilizando el espectrofotómetro NanoDrop®

(Thermo Scientific) y fue almacenado a -25 °C hasta su secuenciación.

Los productos purificados se secuenciaron usando BigDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) de acuerdo a las instrucciones del

fabricante. Se preparó la mezcla de reacción adicionando 2 µL de Ready Reaction

Premix 2,5X, 1 µL de buffer BigDye Sequencing 5X, 3,2 pmol de primer específico (Tabla

3-1), 1-3 ng de producto purificado y agua hasta un volumen final de 10 µL. Las

condiciones de la reacción de secuenciación fueron: 96 °C por 1 min; 25 ciclos de 96 °C

por 10 s, 50 °C por 5 s y 60 °C por 4 min. La reacción se purifico mediante el kit BigDye®

XTerminator (Applied Biosystems, CA, USA) y la secuenciación se llevó a cabo en un

secuenciador ABI 3130 (Applied Biosystem).

Cada electroferograma fue analizado y editado usando el programa BioEdit (v. 7.2.5)

para obtener la secuencia consenso a partir de las secuencias delantera y reversa. De la

base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) se seleccionaron 63

secuencias de 141 pb correspondientes a la región ORF2 del VHE de distintos genotipos

y diferentes partes del mundo (Tabla 3-2) y se alinearon junto con las secuencias

obtenidas utilizando el programa Clustal Omega disponible en la página web del EMBL-

EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). No se encontraron secuencias de VHE-3


de la región ORF2 amplificada con los primers utilizados en este estudio de ninguno de

los países de Suramérica.

El análisis filogenético fue realizado mediante el método estadístico Neighbor-joining en

el programa MEGA6 (v. 6.06) utilizando un modelo de distancias-p con un bootstrap de

1000. Un análisis filogenético Bayesiano adicional fue llevado a cabo, usando el

programa MrBayes (v. 3.2.5) muestreando a lo largo de todo el espacio GTR (General

Time Reversible) en un total de diez millones de generaciones.

Tabla 3-2: Secuencias de la región ORF2 del VHE utilizadas para la construcción de los

arboles filogenéticos.

Número de Acceso

País

Fecha de Presentación

Número de Acceso

País

Fecha de Presentación

AB073912 Japón 2001 AB248521 Japón 2006 AB074915 Japón 2001 AB248522 Japón 2006 AB074917 Japón 2001 AB253420 Japón 2006 AB074918 Japón 2001 AF051830 Nepal 1998 AB074920 Japón 2001 AF060668 EE.UU 1998 AB080575 Japón 2002 AF060669 EE.UU 1998 AB089824 Japón 2002 AF076239 India 2001 AB091394 Japón 2002 AF082843 EE.UU 1998 AB091395 Japón 2002 AF185822 Paquistán 1999 AB097811 Japón 2002 AF444003 EE.UU 2001 AB097812 Japón 2002 AF455784 Kirguistán 2004 AB099347 Japón 2003 AF459438 India 2001 AB108537 China 2003 AJ272108 China 2000 AB161717 Japón 2004 AP003430 Japón 2001 AB189070 Japón 2004 AY115488 Canadá 2002 AB189071 Japón 2004 AY204877 Chad 2003 AB189072 Japón 2004 AY230202 Marruecos 2003 AB193176 Japón 2004 AY575857 EE.UU 2004 AB193178 Japón 2004 AY594199 China 2004 AB197673 China 2004 AY723745 India 2004 AB197674 China 2004 D10330 Japón 1992 AB220971 Japón 2005 D11092 Japón 1992 AB220972 Japón 2005 D11093 Japón 1992 AB220974 Japón 2005 DQ279091 China 2007 AB220976 Japón 2005 DQ450072 China 2006 AB222182 Japón 2005 L08816 China 1993 AB222183 Japón 2005 L25547 China 2005 AB222184 Japón 2005 M73218 EE.UU 1991 AB236320 Japón 2005 M74506 México 1992 AB246676 Japón 2006 M80581 Paquistán 1992 AB248520 Japón 2006 X98292 India 1996

X99441 India 1996

4. Resultados

4.1 Coinfección y seroprevalencia del VHE en pacientes

con diagnóstico de hepatitis viral

El total de sueros procesados mediante ELISA para la búsqueda de anticuerpos IgG e

IgM anti-VHE se muestra en la Tabla 4-1.

Tabla 4-1: Muestras procesadas según el departamento de procedencia y el diagnóstico

de hepatitis viral.

Departamento VHA VHB VHC Muestras Totales

Amazonas 5 14 0 19

Antioquia 15 1 12 28

Arauca 1 1 0 2

Atlántico 18 2 14 34

Bogotá 4 1 50 55

Bolívar 0 3 5 8

Boyacá 32 16 8 56

Caldas 3 35 0 38

Caquetá 13 27 8 48

Casanare 10 2 6 18

Cauca 43 13 21 77

Cesar 52 1 5 58

Choco 0 1 0 1

Córdoba 15 25 8 48

Cundinamarca 41 1 25 67

Guainía 0 4 0 4

Guajira 13 8 3 24

Guaviare 7 75 0 82

Huila 60 1 4 65

Magdalena 9 5 8 22



Tabla 4-1: (Continuación)

Departamento VHA VHB VHC Muestras Totales

Meta 0 6 23 29

Nariño 3 0 6 9 Norte de

Santander 9 8 7 24

Putumayo 68 8 1 77

Quindío 5 0 3 8

Risaralda 7 10 4 21

San Andrés 2 0 0 2

Santander 16 8 11 35

Sucre 53 17 12 82

Tolima 0 8 7 15

Valle del Cauca 11 0 6 17

Vaupés 5 1 0 6

Vichada 13 5 0 18 Muestras

totales 533 307 257 1097

Se determinó que 278 sueros fueron positivos para IgG anti-VHE, 62 para IgM anti-VHE y

64 para ambos marcadores. El análisis de resultados serológicos mostró que el marcador

IgM anti-VHE se encontró en mayor frecuencia en el grupo de sueros con diagnóstico de

VHA (8,2%) mientras que el más bajo se presentó en grupo de sueros con diagnóstico de

VHC (1,2%). Los anticuerpos tipo IgG anti-VHE se encontraron en mayor frecuencia en el

grupo de sueros con diagnóstico de VHC (30,7%) y el de menor frecuencia en el grupo

de sueros con diagnóstico de VHB (20,2%). La presencia simultánea de anticuerpos IgG

e IgM anti-VHE se demostró en todos los grupos de sueros con diagnóstico de hepatitis

viral. En la Tabla 4-2 se muestran los resultados serológicos discriminados según el

grupo de sueros estudiados.

Considerando que 342 sueros fueron positivos para IgG anti-VHE y 126 para IgM anti-

VHE, la seropositividad general para IgG anti-VHE fue 31,2% y 11,5% para los

anticuerpos IgM anti-VHE. La infección dual VHE + VHA determinada por IgG anti-VHE

fue 33,6% (179/533) y 16,1% (86/533) por IgM anti-VHE; para VHB fue 23,4% (72/307) y

8,1% (25/307) y para VHC de 35,4% (91/257) y 5,8% (15/257) respectivamente (Tabla 4-

2).

Discusión 35

Tabla 4-2: Resultados de las pruebas ELISA para la determinación de anticuerpos IgG e

IgM anti-VHE en sueros positivos para la presencia de marcadores serológicos para

VHA, VHB y VHC.

Marcador serológico

otras hepatitis virales

Marcador serológico VHE positivo Total anticuerpos

anti-VHE

IgG anti-VHE

n (%)

IgM anti-VHE

n (%)

IgG+IgM anti-VHE

n (%)

IgG

n (%)

IgM

n (%)

VHA (n=533) 137 (25,7) 44 (8,2) 42 (7,9) 179 (33,6) 86 (16,1)

VHB (n=307) 62 (20,2) 15 (4,9) 10 (3,2) 72 (23,4) 25 (8,1)

VHC (n=257) 79 (30,7) 3 (1,2) 12 (4,7) 91 (35,4) 15 (5,8)

Total (n=1097) 278 (25,3) 62 (5,6) 64 (5,8) 342 (31,2) 126 (11,5)

El análisis de la variable edad, mostró que 48,8% de la coinfección VHA + VHE,

determinada por la presencia de IgM anti-VHA e IgM anti-VHE se produjo antes de 16

años de edad, 9,3% entre 16 a 30 años de edad y 41,9% de casos no registró

información de edad. La coinfección VHB + VHE, determinado por la presencia del

HBsAg e IgM anti-VHE, mostró que 28% de los casos se produjo en el grupo de 2-15

años de edad, 32% de 16-30 años, 8% de 46 a 70 años y 32% de los casos no tenía

información con respecto a la edad (Tabla 4-3).

Tabla 4-3: Resultados serológicos positivos para anticuerpos anti-VHE según el grupo de

edad.

IgG anti-VHE positivoTotal

Positivo

IgG n (%)

IgM anti-VHE positivo Total

Positivo

IgM n (%)

Grupos

de Edad

(años)

VHA

n (%)

VHB

n (%)

VHC

n (%)

VHA

n (%)

VHB

n (%)

VHC

n (%)

2 – 15 81 (45,2) 2 (2,8) 1 (1,1) 84 (24,6) 42 (48,8) 0 (0,0) 0 (0,0) 42 (33,3)

16 – 30 15 (8,4) 21 (29,2) 6 (6,6) 42 (12,3) 8 (9,3) 8 (32,0) 4 (2,7) 20 (15,9)

31 – 45 1 (0,6) 19 (26,4) 5 (5,5) 25 (7,3) 0 (0,0) 7 (28,0) 1 (6,7) 8 (6,3)

46 – 70 0 (0,0) 13 (18,0) 4 (4,4) 17 (5,0) 0 (0,0) 2 (8,0) 2 (13,3) 4 (3,2)

Sin Dato 82 (45,8) 17 (23,6) 75 (82,4) 174 (50,9) 36 (41,9) 8 (32,0) 8 (53,3) 52 (41,3)

Total

general 179 72 91 342 86 25 15 126

La coinfección con el VHA solo se presentó en el grupo de edad de 2-15 años y hasta los

30 años, en edades mayores no se presenta la coinfección VHE+VHA. En el grupo de

edad de 16-45 la principal coinfección se da con el VHB, mientras que la coinfección con



el VHC solo llega a ser importante en adultos mayores. Una dinámica diferente se

observa con las muestras de pacientes que han presentado una doble infección

(presencia de IgG anti-VHE), aunque la infección VHA+VHE sigue un comportamiento

similar, en el grupo de 2-15 años también se presentan infecciones duales con los otros

dos virus, aunque en una pequeña proporción.

La población con mayor frecuencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE corresponde a

pacientes provenientes de los departamentos de Putumayo, Guaviare, Boyacá y

Cundinamarca, aunque corresponde a los departamentos que más muestras de suero

aportaron al estudio. En general el porcentaje de positividad es similar para los dos

marcadores, pero puede estar asociado al número de muestras procesadas por

departamento. En las Figuras 4-1 y 4-2 se muestra el porcentaje de positividad según el

marcador serológico discriminado por departamento.

Figura 4-1: Porcentaje de seroprevalencia a IgM anti-VHE por departamento, según el

número de muestras procesadas por ELISA.

Discusión 37

Figura 4-2: Porcentaje de seroprevalencia a IgG anti-VHE por departamento, según el

número de muestras procesadas por ELISA.

4.2 Detección del genoma del VHE mediante nRT-PCR

Siguiendo el protocolo de la nRT-PCR descrito en la sección de materiales y métodos, se

logró estandarizar esta prueba para la detección del ARN del VHE, utilizando como

control positivo una muestra de materia fecal de cerdo genotipo 3, donada al grupo de

virología del INS por el Dr. Robert H. Purcell del NHI (National Institutes of Health),

Estados Unidos. Los resultados de la amplificación de estas extracciones para las

regiones MeT y ORF2 se muestran en el gel de electroforesis de la Figura 4-3, donde se

observa la amplificación de la región MeT en los carriles 1 y 3 correspondiente a un

tamaño de 287 pb y de la región ORF2 en los carriles 6-9 con un tamaño de 145 pb.

De igual manera se estandarizo la nRT-PCR para amplificar la región RdRp (ORF1) del

genoma del VHE de un tamaño de 307 pb. En la Figura 4-4 se observa el gel de

electroforesis con la amplificación de esta región a partir del control positivo de materia

fecal (carriles 2-4), con el control negativo en el carril 1.



Figura 4-3: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del

ARN del VHE: En los carriles 1-3 (amplificación de la región MeT) y 6-8 (amplificación de

la región ORF2) se colocaron los productos de la amplificación del ARN extraído del

control positivo, carriles 4 y 9 controles de reacción, y en los carriles 5 y 10 controles

negativos.

Figura 4-4: Electroforesis de la estandarización de la nRT-PCR para la detección del

ARN del VHE: Visualización de la amplificación de la región RdRp (307 pb) en la

extracción de ARN del control positivo (carriles 2-4), en el carril 1 control negativo.

Discusión 39

Para la detección del ARN del VHE se procesaron todos los sueros positivos para IgM

anti-VHE (62 IgM anti-VHE y 64 IgG + IgM anti-VHE) y 129 sueros positivos para IgG

anti-VHE, para un total de 255 sueros procesados mediante nRT-PCR. En total se logró

la amplificación en 94 (37%) de estos sueros de las regiones MeT, RdRp y ORF2: 51

muestras la región MeT, en 49 muestras la región ORF2 y en 25 muestras la región

RdRp. Solo en 12 sueros se logró la detección de las tres regiones del genoma del VHE,

y en ninguna muestra en la que se haya amplificado la región RdRp se logró amplificar

alguna de las otras dos regiones. El genoma viral se detectó en el 33,3% (42/126) de

muestras positivas para el anticuerpo IgM anti-VHE y en el 40% (77/193) de sueros

positivos para IgG anti-VHE (Tabla 4-4).

Tabla 4-4: Amplificación de las regiones ORF1 y ORF2 del VHE mediante nRT-PCR en

sueros positivos para anticuerpos anti-VHE.

Región

Amplificada IgM anti-VHE (+)

IgM+IgG

anti-VHE (+)IgG anti-VHE (+)

Total

General

MeT 9 7 16 32

MeT/ORF2 1 3 3 7

MeT/ORF2/RdRp 2 6 4 12

ORF2 4 4 22 30

RdRp 1 5 7 13

Total general 17 25 52 94

La positividad de la amplificación para MeT fue del 22,2% (28/126) para los sueros

positivos IgM anti-VHE y del 20,2% (39/193) para los IgG anti-VHE positivos; para ORF2

del 15,9% (20/126) para IgM anti-VHE positivos y del 21,8% (42/193) para los IgG anti-

VHE positivos; y para RdRp del 7,2% (14/193) para las muestras IgM anti-VHE positivas

y del 11,4% (22/193) en las positivas IgG anti-VHE (Tabla 4-5).

Tabla 4-5: Amplificación del ARN del VHE en sueros positivos para anticuerpos anti-VHE.

Región amplificada IgM anti-VHE (+) (n=126) IgG anti-VHE (+) (n=193) Total

MeT 28 39 67

RdRp 14 22 36

ORF2 20 42 62



En la Figura 4-5 se muestra la aplicación de la técnica nRT-PCR estandarizada, a las

extracciones de ARN de los sueros seleccionados, para las regiones MeT y ORF2. Se

muestra este gel en específico, ya que el producto de amplificación de la región ORF2 de

la muestra 67284 (Vichada 2007) fue el primero en ser secuenciado.

Figura 4-5: Amplificación por nRT-PCR de algunas muestras de suero para las regiones

MeT (izquierda) y ORF2 (derecha): Electroforesis de los productos amplificados en las

extracciones de ARN de sueros IgM anti-VHE (+) (identificados en cada carril mediante el

código interno del INS), para las regiones MeT y ORF2. Muestra 67284 positiva para

ORF2 (145 pb).

4.3 Detección cualitativa del ARN del VHE mediante RT-

PCR en tiempo real

En la estandarización se utilizó el Primer Estándar Internacional de la Organización

Mundial de la Salud (OMS) para el VHE: “1st World Health Organization International

Standard for Hepatitis E Virus RNA Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT)-Based

Assays”. Este estándar fue desarrollado específicamente para ser usado en la

145 pb

Discusión 41

estandarización de la técnica de amplificación de ácidos nucleicos del VHE, y fue

adquirido para este estudio a través del Paul-Ehrlich-Institut bajo el código PEI 6329/10.

La efectividad del protocolo en la detección del ARN viral se evaluó mediante la

comparación de la amplificación del estándar por triplicado. La detección de la sonda

TaqMan® en las tres replicas fue reproducible, como se observa en la Figura 4-6, donde

las tres amplificaciones presentan el mismo valor de CT y se logra una amplificación

eficiente de las tres muestras, en este caso el CT para las tres replicas fue de 27.

Figura 4-6: Amplificación por triplicado del estándar del VHE: Detección cualitativa del

genoma del VHE por RT-PCR en tiempo real. Amplificación del estándar de la OMS por

triplicado, detectándose el ARN del VHE en el ciclo 27 en todas las réplicas.

Teniendo en cuenta que el estándar de la OMS presenta una concentración de 125.000

UI/mL, se determinó que el límite de detección del genoma del VHE mediante la RT-PCR

en tiempo real estandarizada es de 1.250 UI/mL (1,25 UI/µL) (Figura 4-7). Ya que el

objetivo de la estandarización era la detección cualitativa del genoma, no se realizaron

las diluciones seriadas suficientes para establecer la eficiencia del protocolo, teniendo

solo tres puntos para la elaboración de la curva estándar.

Negativo



Figura 4-7: Sensibilidad de la RT-PCR en tiempo real para la detección del ARN del VHE:

Amplificación de diluciones seriadas del estándar del VHE para estimar la sensibilidad del

método. El estándar sin diluir (1) se detecta a partir del ciclo 27, mientras que la dilución

1:1000 no presenta amplificación.

4.4 Caracterización genotípica del VHE

De las 129 muestras positivas para IgG anti-VHE, 62 para IgM anti-VHE y 64 con ambos

marcadores, analizadas por nRT-PCR para la detección del ARN viral, 94 mostraron

resultados positivos, de los cuales nueve fueron secuenciados y se encontró que

correspondían al genotipo VHE-3 subgenotipo 3a agrupados con cepas norteamericanas

de origen porcino (Figuras 4-8 y 4-9). Estos nueve virus caracterizados fueron detectados

en sueros de pacientes procedentes de los departamentos de Boyacá, Cauca,

Cundinamarca, Putumayo y Vichada recolectados en los años 2006, 2007 y 2009.

Discusión 43

Figura 4-8: Análisis filogenético de las secuencias del VHE obtenidas en este estudio:

Relación filogenética de las secuencias de la región ORF2 obtenidas en este estudio,

deducida usando el método Neighbor-Joining. Se muestran los porcentajes mayores al

60% mediante la prueba bootstrap (1000 réplicas). Las longitudes de las ramas están en

las mismas unidades que las de las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol

filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de distancias-p

expresadas como el número de diferencias de bases por sitio. El análisis incluyó 71

secuencias de nucleótidos, de un total de 141 posiciones en el alineamiento final.



El árbol filogenético de la Figura 4-8 ilustra como las nueve secuencias correspondientes

a la región ORF2 (Figura 4-9) identificadas en este estudio pertenecen al VHE-3 y están

más relacionados filogenéticamente con la cepa Meng (AF082843), el primer aislado del

VHE porcino. Los triángulos representan cepas de origen porcino y los cuadrados cepas

de origen humano, mientras que no se especifican en los genotipos 1 y 2 ya que estos

virus solo infectan humanos. También es de notar que existe variabilidad en las

secuencias entre departamentos e incluso entre años dentro del mismo departamento,

para los aislados de Colombia.

El análisis bayesiano (Figura 4-10) de las mismas secuencias confirma que el VHE

circulante en Colombia pertenece al VHE-3, estrechamente relacionado con cepas de

origen porcino subgenotipo 3a, pero no es tan clara la relación del subgenotipo como en

el análisis por neighbor-joining (Figura 4-8).

Figura 4-9: Región del genoma del VHE utilizada para la genotipificación del virus: Mapeo

de las secuencias de la región ORF2 del VHE utilizadas para los análisis filogenéticos.

Se encuentran entre las posiciones 6347-6490 del genoma del VHE.

Discusión 45

Figura 4-10: Árbol filogenético construido mediante inferencia bayesiana basado en la

región ORF2 del VHE: Árbol filogenético consenso para el análisis por inferencia

bayesiana. Los valores en los nodos representan la probabilidad posterior de cada clado.

Las secuencias de la región ORF2 del VHE de Colombia están identificadas mediante el

código interno del INS, el departamento de procedencia de los sueros y el año de

recolección. Las demás secuencias están identificadas por el código de acceso al

GenBank (Tabla 3.2).

5. Discusión

En estudios previos ya se había detectado la circulación del VHE en el departamento de

Antioquia (94) y en otros departamentos de Colombia (26), sin embargo no existían

estudios sobre la coinfección del VHE con otros virus hepatotropos en el país. En nuestro

estudio se logró detectar la coinfección del VHE con los virus hepatotropos VHA, VHB y

VHC mediante detección de IgM anti-VHE, así como una infección dual con dichos virus

determinada por la presencia de IgG anti-VHE.

Ya que la IgM es un marcador serológico que indica una infección aguda, y generalmente

su periodo de detección coincide con el periodo de detección del genoma viral, se puede

hablar de una coinfección cuando se detecta este anticuerpo. Por otro lado la presencia

de anticuerpos IgG es un marcador de infección pasada y su detección nos muestra una

infección dual o co-circulación de los dos virus.

Los resultados muestran que uno de los mayores porcentajes de coinfección (16,1%) y

de infección dual (33,6%) se da entre el VHE y el VHA, explicado por las características

epidemiológicas similares de ambos virus y que comparten la misma vía de transmisión,

de tal manera los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de un posible origen común

de transmisión a través de aguas o alimentos contaminados (95). Esta tasa de

coinfección resulta un poco más alta que la detectada en un estudio en India, donde se

analizaron 958 sueros y obtuvieron un porcentaje de coinfección del 11,5% (96), algo

para tener en cuenta ya que India está catalogado como un país hiperendémico para el

VHE. A pesar de que en Latinoamérica los estudios sobre coinfección también son

escasos, en Cuba investigaron sueros de brotes de hepatitis viral y encontraron un

porcentaje de coinfección VHA+VHE del 13% (33/258) (95), evidenciando

comportamientos similares a los obtenidos en este estudio.



En países en vía de desarrollo endémicos para VHA y VHE, muchas complicaciones

asociadas con la coinfección pueden contribuir a tasas de mortalidad asociadas con

estos virus (97). También se ha demostrado que en población pediátrica la mezcla de

infecciones VHA+VHE está asociada con FHF (98); así al establecer que en Colombia se

presenta la coinfección entre el VHE y el VHA se hace necesario investigar las

implicaciones clínicas que podrían tener en nuestro medio este tipo de coinfecciones.

Resulta sorpresivo el alto porcentaje de infección dual entre el VHE y los virus VHB

(23,5%) y VHC (35,4%) (Tabla 4-1), teniendo en cuenta que las principales vías de

transmisión de estos virus son diferentes: entérica para el VHE, contacto con sangre o

fluidos corporales para el VHB y parenteral para el VHC. Sin embargo algunos estudios

en India han reportado que la coinfección con múltiples virus hepatotropos ocurre en

varias combinaciones, entre 7 – 24%, de todos los pacientes con una hepatitis viral

aguda (99), en Egipto del 52% (30), y en Italia del 27% (22). A partir de estos resultados

pueden plantearse varias hipótesis: la infección por el VHE puede ocurrir en un paciente

en recuperación de una infección previa por el VHB; una infección por el VHE puede

activar una infección por el VHB; una infección previa con el VHE, puede favorecer una

nueva infección con el VHC; o una transmisión simultánea de ambos virus por transfusión

sanguínea. La transmisión del VHE a través de transfusiones sanguíneas ha sido

documentada en varios continentes (85, 100-104), por lo que es posible una transmisión

parenteral simultanea VHB+VHE y VHC+VHE, apuntando a rutas similares o

coincidentes de transmisión de estos virus.

El porcentaje de coinfección VHB+VHE (8,1%) determinado en el estudio se debe

analizar con precaución, teniendo en cuenta la características epidemiológicas y

moleculares tan distintas de los dos virus. Considerando que la infección aguda

simultánea con dos virus con vías de transmisión diferentes es muy rara, no existe un

consenso en los diferentes estudios sobre cómo explicar los resultados de esta

coinfección. La detección simultanea de los virus VHB y VHE en pacientes con

diagnóstico de hepatitis aguda en el Reino Unido lleva a plantear a los autores que puede

ocurrir una superinfección con el VHE en pacientes con una infección crónica previa con

el VHB (105). En un estudio que se llevó a cabo en India donde se encontró un

Discusión 49

porcentaje de coinfección VHB+VHE del 2,8% (26/927) (106), también plantean la

anterior hipótesis. Por otra parte, existe bastante evidencia sobre la infección del VHE a

través de transfusiones sanguíneas (84-86, 98-102), haciendo posible que la coinfección

VHB+VHE se presente simultáneamente de forma parenteral. A pesar de haberse

detectado la coinfección VHB+VHE en Colombia, los resultados obtenidos no llegan a ser

concluyentes acerca del modo en que se llegó a dar la coinfección, haciendo

indispensable una investigación más profunda para llegar a establecer la verdadera

dinámica de la coinfección.

Hasta el momento los datos de seroprevalencia del VHE en la población general en

Colombia son inexistentes, y solo se ha determinado en algunas poblaciones con

factores de riesgo, de tal manera que se cuenta con una serie de reportes con datos de

seropositividad variando desde el 7,5 – 11,25% para IgG anti-VHE y el 1,74 – 46% para

IgM anti-VHE entre los diferentes estudios (23, 26, 94). Los resultados de este estudio

muestran una seropositividad del 31,2% para IgG anti-VHE y 11,5% para IgM anti-VHE,

indicando que la exposición al VHE es alta en la población de estudio y que la infección

subclínica por el VHE en Colombia puede llegar a ser común. Con el porcentaje de

hepatitis E aguda detectada se puede afirmar que esta enfermedad no es reconocida en

nuestro país, probablemente porque la infección del VHE no es considerada una

posibilidad de diagnóstico en pacientes con hepatitis no-A, no-B, no-C.

Según el rango de edad, 48% de la coinfección VHA + VHE se produjo antes de 16 años

de edad y 9% entre 16 a 30 años de edad; la gran mayoría de estas infecciones fueron

detectadas en regiones con mala calidad del agua y pobres prácticas de higiene,

convirtiéndose en un riesgo potencial de infección a una edad temprana. En varias partes

del mundo se ha documentado la exposición temprana al VHE (30, 95, 99), esto sumado

a que en zonas de saneamiento y prácticas de higiene deficientes la mayoría de los niños

(90%) han sufrido la infección por el VHA antes de los 10 años (107), dan validez a que

se haya encontrado la mayor parte de coinfección VHA+VHE en el rango de edad de 2-

15 años.

La coinfección VHB + VHE mostró que 60% de los casos se produjo en el grupo de 16-45

y el 8% de 46 a 70 años. La hepatitis B afecta a la población general, sin embargo es

más frecuente en los jóvenes, adultos y grupos poblacionales con factores de riesgo para



la enfermedad y según los estudios más recientes, en Colombia se han encontrado

prevalencias de HBsAg de 5,66% (108), lo que concuerda con los grupos de edades que

presentan mayor porcentaje de coinfección VHB + VHE en este estudio, y mostrando que

debido a esta endemicidad del VHB de moderada a alta es muy probable que una

persona que presente el VHB se pueda infectar también con el VHE (30, 105).

La estandarización de la nRT-PCR tenía como fin dos objetivos, la detección del ARN del

VHE y lograr la genotipificación del virus. Los sets de primers utilizados para la

estandarización fueron diseñados en estudios previos (90, 91), con base en

alineamientos de regiones conservadas identificadas en varias secuencias del genoma

completo del VHE, permitiendo la amplificación de estas regiones en todos los genotipos.

Debido a que los niveles de ARN del VHE pueden a llegar a ser bajos en algunos casos y

su ventana de detección es muy corta, la no detección de ácidos nucleicos en las

muestras no descarta una infección reciente por el VHE (18). La detección del ARN del

VHE en el 37% de los sueros positivos para anticuerpos anti-VHE muestra que la sola

detección del genoma no asegura la positividad o negatividad de una infección por el

VHE, sin embargo se debe tener en cuenta que en este caso las muestras remitidas al

INS no venían para diagnóstico de hepatitis E, por lo que la toma oportuna de la muestra

no estaba asegurada.

En el caso de la infección aguda por el VHE, encontrar que el 33,3% de todas las

muestras positivas para IgM anti-VHE fueron positivas por nRT-PCR indica que el

protocolo estandarizado presenta una efectividad aceptable si se compara con otros

resultados; en Venezuela detectaron el ARN del virus en el 14% de los pacientes

positivos para IgM anti-VHE (109), y en India se detectó en el 9,4% de los positivos por

serología (110). En Latinoamérica otros estudios muestran la detección del ARN en

pacientes con resultados IgM positivos: 1/1 en Brasil, 3/3 y 9/6 en Argentina, y 9/9 en

Uruguay (7); pero la cantidad de muestras IgM positivas no es significativa para

establecer una comparación con el presente estudio. De los tres protocolos

estandarizados y aplicados a las muestras, el que mostro mayor porcentaje de

positividad fue el que amplifica la región MeT (22,2%) y el de menor la amplificación de la

región RdRd (7,2%). Si bien la detección del ARN viral en muestras biológicas es el “gold

standar" para la confirmación de una hepatitis E aguda (2), factores como los ya

Discusión 51

mencionados de carga viral baja y una ventana de detección corta, sumados a los

problemas inherentes del manejo, recolección y almacenamiento de muestras, afectan la

sensibilidad de las pruebas de detección de ácidos nucleicos. Aunque se trató de

conservar de la mejor manera los sueros estudiados, se debe tener en cuenta que para

el procesamiento serológico y molecular fue necesario someterlos a procesos de

congelación-descongelación, además de tener algunos ya un tiempo considerable de

recolección (sueros desde 2004), el ARN del VHE presente pudo haber sufrido alguna

degradación, lo que no permitió una mayor detección del genoma viral de la obtenida en

el trabajo, especialmente con la región RdRp.

Con respecto a la amplificación del ARN del VHE en las muestras positivas para IgG anti-

VHE, llama la atención que se haya podido detectar. El ARN del VHE puede llegar a

detectarse en suero en los comienzos de la respuesta inmune con IgG anti-VHE, pero los

niveles pueden a llegar a ser muy bajos para su detección (67). Sin embargo en heces la

excreción del virus y su detección es más prolongada, llegando hasta el pico de IgG anti-

VHE (Figura 2-6). La positividad general (40%) de amplificación del ARN viral en estos

sueros podría ser un indicador de que la sensibilidad de la nRT-PCR es buena, ya que es

capaz de detectar el ARN del virus incluso en las etapas finales de la viremia. No

obstante, evaluando la efectividad de los protocolos individualmente, la positividad es

similar a la obtenida para las muestras positivas para IgM anti-VHE, solo que en este

caso el mayor porcentaje de positividad se da para la amplificación de la región ORF2

(21,8%).

La caracterización genotípica del VHE es de gran importancia ya que la severidad de la

hepatitis E está relacionada directamente con el genotipo del VHE (15): la falla hepática

aguda en mujeres embarazadas y las manifestaciones extra-hepáticas de la enfermedad

como la pancreatitis, están asociadas con el genotipo 1; la hepatitis crónica en pacientes

inmunodeficientes se ha observado principalmente en infecciones con el VHE genotipo 3

(18). Además, todos los casos de transfusión relacionados con la hepatitis E han sido

causados por cepas del VHE de los genotipos 3 y 4, sugiriendo un potencial de

transmisión parenteral de estos genotipos (111). Por otra parte, estudios en Colombia

han demostrado la presencia del VHE genotipo 3 en agua para consumo humano (112),

lo que restaría argumentos para pensar en una posible coinfección por vía parenteral del

VHE con los virus VHB y VHC. Sin embargo, es necesaria una mayor investigación en



nuestro país enfocada hacia otras rutas de transmisión del VHE, además de la entérica,

como lo han reportado estudios previos (86, 87).

En Latinoamérica el genotipo predominante es el VHE-3: Venezuela, Bolivia, y Uruguay;

además algunos reportes han llegado hasta caracterizar el subgenotipo: 3a en Cuba, 3a

y 3b en Brasil; 3a, 3b y 3i en Argentina (7). Otros genotipos están presentes en la región:

genotipo 2a en México, y VHE-1 en Venezuela y Cuba. Con la caracterización del VHE-3

subgenotipo 3a en Colombia, se va completando el mapa de distribución del VHE en

Latinoamérica, faltando establecer los genotipos en los demás países del área. La

información disponible hasta el momento, deja entrever un patrón sobre la distribución

geográfica del VHE en Sur América, observándose como desde el norte del continente

empieza la aparición del genotipo 3a y a medida que se avanza hacia el sur aparecen los

genotipos 3b y 3i, advirtiendo que aún es escasa la información sobre el VHE en nuestro

continente y donde sería interesante llevar a cabo esta investigación.

El análisis filogenético de la región ORF2 (141 pb) muestra como las secuencias del VHE

obtenidas en Colombia se agrupan dentro del genotipo VHE-3, subgenotipo 3a, junto con

la cepa Meng (código de acceso GenBank AF082843). La cepa Meng fue el primer VHE

porcino caracterizado, identificado en cerdos de granjas de Estados Unidos (34). Esto

indica que el VHE-3 en Colombia puede ser mantenido dentro de la población porcina del

país, y de hecho ya se ha comprobado la circulación del VHE en cerdos en Antioquía

(24).

Por último, los departamentos con mayor presencia de anticuerpos IgG e IgM anti-VHE

fueron Putumayo, Guaviare, Boyacá y Cundinamarca (Figuras 4-1 y 4-2). Estas regiones

han tenido históricamente pobre suministro de agua potable (113, 114) lo que explicaría

la alta seroprevalencia no solo para anticuerpos anti-VHE sino también las altas tasas de

infección de hepatitis A (115). Son también departamentos que tradicionalmente

presentan producción porcícola (http://www.dane.gov.co/index.php/agropecuario-

alias/estadisticas-de-sacrificio-de-ganado-esag), lo que estaría favoreciendo el ciclo

zoonótico de la enfermedad.

6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

Se logró determinar la infección dual y la coinfección del VHE con otros virus

hepatotropos (VHA, VHB y VHC), con porcentajes de infección dual VHB+VHE y

VHC+VHE sorpresivamente altos, si se tiene en cuenta que las principales rutas de

transmisión de estos virus son muy diferentes (entérica para VHE y parenteral para VHB

y VHC).

Los casos de coinfección entre los virus VHA y VHE pueden llegar a ser más comunes

debido a que ambos virus comparten una ruta de transmisión entérica, además del déficit

que existe en el tratamiento del agua para consumo humano en algunos departamentos

del país, donde se ha detectado la presencia de ambos virus en agua para consumo

humano.

El alto porcentaje de seropositividad de IgG anti-VHE hace pensar que el VHE es

endémico en Colombia, además de indicar que la infección subclínica por el VHE puede

ser muy común en Colombia. La hepatitis E aguda generalmente no es reconocida en

nuestro país, probablemente porque la infección por el VHE no es considerada una

posibilidad de diagnóstico en pacientes con hepatitis no-A, no-B, no-C.

Se estandarizó un protocolo para la detección del ARN del VHE mediante RT-PCR en

tiempo real y mediante nRT-PCR, esta última apuntando a la amplificación de tres

regiones del genoma: MeT y RdRp (ORF1) y ORF2. Donde la mayor tasa de positividad

se alcanza con la amplificación de las regiones MeT y ORF2.



Con la detección del VHE-3 en varios departamentos del país sumado a los hallazgos de

otros estudios realizados en Colombia, se puede confirmar que este es el genotipo que

está circulando, concordante con el genotipo que predomina en Suramérica. La

identificación del subgenotipo 3a por primera vez en Colombia, abre la puerta para

futuras investigaciones sobre las posibles implicaciones epidemiológicas asociadas a

este subgenotipo en nuestro país.

6.2 Recomendaciones

Una vez establecida la circulación del VHE en Colombia, se hace necesario profundizar

el estudio del virus en el país, donde se logre establecer: su incidencia en la población,

las rutas de transmisión y los efectos de la infección dual con otros virus causantes de

hepatitis, con el fin de crear estrategias de control y prevención de la infección.

La hepatitis E debería ser incluida en el diagnóstico diferencial de las hepatitis virales en

Colombia. Este diagnóstico se debe basar tanto en pruebas serológicas como su

confirmación por alguna prueba de detección de ácidos nucleicos.

Anexo 1: Publicaciones y eventos científicos

donde se han expuesto los resultados del

estudio

VI Simposio Colombiano de Virología: Infección concomitante con el virus de la

hepatitis E y otros agentes de hepatitis virales en Colombia. 27 – 29 de Mayo de

2015. Universidad de la Salle. Bogotá.

Memorias VI Simposio Colombiano de Virología: Martínez-Vargas DA, Usme-Ciro

J, Escalante MP, Palacios-Vivero M, Contreras Gómez L, Peláez-Carvajal D.

Infección concomitante con el virus de la hepatitis E y otros agentes de hepatitis

virales en Colombia. Biómedica. 2015;35(Supl.1):41-2.

Peláez-Carvajal D, Martínez-Vargas D, Escalante-Mora M, Palacios-Vivero M,

Contreras-Gómez L. Coinfección del virus de la hepatitis E con otras hepatitis

virales en Colombia y su caracterización genotípica. Biomédica. 2016;36(Supl.1).

Anexo 2: Uso del kit BigDye® XTerminatorTM

Purification dentro del proceso de

secuenciación Figura 6-1: Flujo de trabajo del proceso de secuenciación (Tomado de Applied Biosystem

BigDye® XTerminatorTM Purification Kit Protocol)

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