INTRODUCCIÓN

Los métodos espectroscopios de análisis se basan en la medida de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia. Los métodos de emisión utilizan la radiación emitida cuando un soluto es excitado por energía térmica, eléctrica, o energía radiante. Los métodos de absorción, por el contrario, están basados en la disminución de la potencia (o atenuación) de la radiación electromagnética como consecuencia de la absorción que se produce en su interacción con el soluto.

Los métodos espectroscópicos se consideran como una de las mejores y más utilizadas técnicas instrumentales a disposición del científico, para la adquisición de información tanto cuantitativa como cualitativa.

Los métodos espectroscópicos se clasifican según la región del espectro electromagnético que esté implicada; siendo las más importantes las regiones de rayos X, ultravioleta, visible, infrarroja, microondas y radiofrecuencia.

LA ESPECTROSCOPIA:

Estudio de las interacciones de la radiación electromagnética con la materia, es el mayor y más exacto grupo de métodos instrumentales utilizados en los análisis químicos y en toda la ciencia química. El espectro electromagnético se divide en la siguiente gama de longitudes de onda: rayos gamma, rayos X, ultravioletas, visibles, infrarrojos, microondas y ondas radioeléctricas. Las interacciones electromagnéticas con la materia provocan la absorción o emisión de energía a través de la transición de los electrones entre niveles cuánticos o discretos de energía, vibraciones de enlaces, rotaciones moleculares y transición de electrones entre orbitales de átomos y moléculas (ver Átomo; Teoría cuántica). Todas estas interacciones tienen lugar en instrumentos denominados espectrómetros, espectrofotómetros o espectroscopios. Los espectros generados en esos equipos se graban gráfica o fotográficamente en espectrogramas o espectrógrafos, que permiten el estudio de la longitud de onda y la intensidad de la radiación absorbida o emitida por la muestra analizada.

La absorción espectrofotométrica en las gamas visible y ultravioleta del espectro electromagnético es un método espectral cuantitativo común para sustancias orgánicas e inorgánicas. La disminución que se produce en la transparencia de la disolución es proporcional a la concentración del compuesto analizado.

La espectrofotometría de absorción de infrarrojos es adecuada para análisis orgánicos, pues los enlaces en alquenos, ésteres, alcoholes y otros grupos funcionales tienen fuerzas muy diferentes y absorben la radiación de infrarrojos en una gran variedad de frecuencias o energías. Esta absorción se refleja en el espectrógrafo en forma de picos.

La espectroscopia por resonancia magnética nuclear (RMN) depende de la transición entre estados de energía de rotación nuclear por absorción de energía de radiofrecuencia electromagnética. Por ejemplo, en el espectro de RMN del hidrógeno, los diferentes estados químicos del hidrógeno absorben radiación electromagnética a distintas energías. Por todo ello, los espectros de RMN son una herramienta insustituible en el análisis cualitativo para determinar la estructura de las moléculas orgánicas.

La espectroscopia de fluorescencia es lo contrario de la espectrofotometría por absorción. Con esta técnica se consigue que las moléculas emitan luz, según las características energéticas de su estructura, con una intensidad proporcional a la concentración de la muestra. Este método proporciona resultados cuantitativos muy sensibles en algunas moléculas.

En la espectrofotometría de emisión y absorción atómica se calienta la muestra a alta temperatura, y se descompone en átomos e iones que absorben o emiten radiación visible o ultravioleta, con niveles de energías característicos de los elementos implicados. Estos métodos son sobre todo útiles para bajas concentraciones de elementos metálicos, tanto en análisis cualitativos como cuantitativos.Los fragmentos moleculares se clasifican según su masa respectiva mediante campos magnéticos y eléctricos en un analizador de masas. La forma espectral, o espectro de masas, constituye la huella dactilar de la molécula, pues las moléculas orgánicas presentan modelos de fragmentación exclusivos.

La espectroscopia de fluorescencia de rayos X resulta adecuada para el análisis cualitativo y cuantitativo de elementos metálicos; estos elementos emiten rayos X a energías características al ser bombardeados por una fuente de alta energía de rayos X.Absorción de Radiación Electromagnética:

Se denomina absorción al proceso por el cual una especie, en un medio transparente, capta selectivamente ciertas frecuencias de la radiación electromagnética.

Los métodos de absorción poseen la considerable ventaja de producir poca o ninguna alteración en el sistema estudiado.

1. EL ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

COLORÍMETROS:

Los colorímetros utilizan el ojo humano como detector y el cerebro como transductor. Sin embargo, el ojo y el cerebro solamente pueden comparar colores. Como resultado, los métodos calorímetros requieren siempre la utilización de uno o más patrones en el momento en el que se realiza el análisis. Otras desventajas consisten en que el ojo humano responde a un intervalo espectral relativamente limitado (400 a700 nm), y es incapaz de realizar la comparación requerida si la solución del soluto contiene una segunda sustancia coloreada. Finalmente el ojo no es tan sensible a pequeñas diferencias en la absorbancia como lo es un detector fotoeléctrico; en general, no se pueden discernir diferencias de concentración menores del 5 por 100 aproximadamente.

COLORIMETRÍA:

Procedimiento de análisis químico basado en la intensidad de color de las disoluciones.La intensidad del color de un líquido coloreado contenido en un tubo de vidrio depende del espesor de la disolución (altura de la columna de líquido) y de la concentración de la sustancia colorante en la disolución. Si se dispone de una disolución de referencia cuya concentración es conocida, la concentración de dos disoluciones se puede comparar variando en una de ellas la altura que alcanza el líquido en el tubo, hasta que mirando por transparencia vertical contra un fondo luminoso que atraviese un papel blanco sea igual la intensidad de color en ambas. En este momento, y de acuerdo con la ley de Lambert y Beer, las alturas de las dos columnas líquidas son inversamente proporcionales a las concentraciones de la sustancia colorante contenida en ellas.

FOTÓMETROS:

Un fotómetro es un dispositivo sencillo relativamente barato para los análisis por absorción, posee fácil mantenimiento y resistencia que pueden no tener espectrofotómetros más sofisticados. Además, cuando en el análisis no se necesita una pureza espectral elevada (y frecuentemente es así), el fotómetro proporciona medidas tan precisas como las obtenidas con instrumentos más complejos.

ESPECTROFOTÓMETROS:

Un espectrofotómetro está equipado con un monocromador de prisma o red, que permite la selección de cualquier longitud de onda dentro de la capacidad del instrumento. Los espectrofotómetros son adecuados para realizar medidas en las regiones ultravioleta, visibles e infrarrojas.

Determinación de la relación entre la absorbancia y a la concentración:

Los patrones de calibración para un análisis fotométrico o espectrofotométrico deben ser tan semejantes como sea posible a la composición total de las muestras, y deben abarcar un intervalo razonable de concentraciones del soluto. En raras ocasiones, o casi nunca, se puede suponer que se cumple la Ley de Lambert-Beer y utilizar un patrón único para determinar la absortividad molar; todavía es aún menos prudente basar los resultados de una análisis es un valor de absortividad molar obtenido de la literatura.

RADIACIÓN ULTRAVIOLETA:

Radiación electromagnética cuyas longitudes de onda van aproximadamente desde los 400 nm, el límite de la luz violeta, hasta los 15 nm, donde empiezan los rayos X. (Un nanómetro, o nm, es una millonésima de milímetro). La radiación ultravioleta puede producirse artificialmente mediante lámparas de arco; la de origen natural proviene principalmente del Sol.La radiación ultravioleta puede ser dañina para los seres vivos, sobre todo cuando su longitud de onda es baja. La radiación ultravioleta con longitudes de onda inferiores a 300 nm se emplea para esterilizar superficies porque mata a las bacterias y los virus. En los seres humanos, la exposición a radiación ultravioleta de longitudes de onda inferiores a los 310 nm puede producir quemaduras; una exposición prolongada durante varios años puede provocar cáncer de piel.La atmósfera terrestre protege a los organismos vivos de la radiación ultravioleta del Sol. Si toda la radiación ultravioleta procedente del Sol llegara a la superficie de la Tierra, acabaría probablemente con la mayor parte de la vida en el planeta. Afortunadamente, la capa de ozono de la atmósfera absorbe casi toda la radiación ultravioleta de baja longitud de onda y gran parte de la de alta longitud de onda. Muchas sustancias se comportan de forma distinta cuando se las expone a luz ultravioleta que cuando se las expone a luz visible. Las moléculas de esas sustancias absorben la radiación ultravioleta invisible, adquieren energía, y se desprenden del exceso de energía emitiendo luz visible. Ver Luminiscencia. Algunos vidrios especiales son transparentes para los rayos ultravioleta de mayor longitud de onda, y el cuarzo es transparente a toda la gama de rayos ultravioleta naturales.Uno de estos satélites es el International Ultraviolet Explorer ('Explorador Ultravioleta Internacional'), lanzado en 1978.

2. ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Aparato que convierte moléculas en iones, y que separa estos iones en función de su proporción de masa y carga. Los espectrómetros de masas se utilizan para identificar átomos e isótopos, y determinar la composición química de una muestra.

Francis William Aston El físico británico Francis William Aston fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1922. Aston construyó, en 1919, el primer espectrómetro de masas, con el que demostró que muchos elementos están formados por dos o más isótopos.Cuanto mayor era la masa del Ion, menor era su deflexión.

Espectrómetro de masas

En un espectrómetro de masas se ioniza una muestra de gas mediante un haz de electrones y se aceleran los iones hacia un imán, que los separa según su masa (arriba a la derecha). Los iones con una masa determinada llegan al detector, que suele estar conectado a un ordenador o computadora que procesa los datos (abajo). Todos los espectrómetros de masas cuentan con cuatro características comunes: (1) un sistema para introducir la sustancia que se desea analizar en el instrumento, (2) un sistema para ionizar la sustancia, (3) un acelerador que dirige los iones hacia el instrumento de medida y (4) un sistema para separar los distintos iones analizados y para registrar el espectro de masas de la sustancia.

EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS DE DEFLEXIÓN MAGNÉTICA

Este tipo de espectrómetro de masas crea iones con carga positiva a partir de una muestra y acelera los iones utilizando un campo electrostático. Un campo magnético desvía los iones en función de su masa, y chocan contra el detector aquéllos que tienen una masa determinada. El detector suele estar conectado a un ordenador que procesa toda esta información.

ESPECTRO CONTINUO

La forma de espectro más sencilla, llamada espectro continuo, es la emitida por un cuerpo sólido o líquido que puede ser llevado hasta altas temperaturas. Estos espectros no presentan líneas porque contienen luz de todos los colores, que se suceden sin solución de continuidad como en un arco iris. Los espectros continuos sólo se pueden analizar con métodos espectrofotométricos. En el caso de un emisor ideal, llamado cuerpo negro, las intensidades de los colores del espectro sólo dependen de la temperatura. Dos de las leyes que rigen la distribución de energía en un espectro continuo fueron descubiertas alrededor de 1890 por el físico alemán Wilhelm Wien y los físicos austriacos Ludwig Boltzmann y Josef Stefan. La ley de Stefan-Boltzmann afirma que la energía total por unidad de tiempo radiada por un cuerpo negro es proporcional a la cuarta potencia de la temperatura absoluta; la ley de desplazamiento de Wien afirma que, a medida que aumenta la temperatura, el espectro de radiación de un cuerpo negro se desplaza hacia las frecuencias altas de forma directamente proporcional a la temperatura absoluta. LÍNEAS ESPECTRALES

Espectros característicos Cada elemento químico tiene un espectro característico, es decir, una distribución determinada de la radiación electromagnética. Ese espectro particular permite identificar la composición de una sustancia desconocida; esta técnica se llama espectroscopia. Los espectros de emisión, como los ejemplos que se muestran, están formados por varias líneas de longitud de onda determinada separadas por zonas oscuras. Las líneas indican la estructura molecular, y corresponden a transiciones de los átomos entre estados de energía definidos. Cuando se vaporiza una sustancia y se calienta el vapor hasta que emite luz, es posible que predomine un único color, como el amarillo de las lámparas de vapor de sodio, el rojo de las lámparas de neón o el azul verdoso de las lámparas de vapor de mercurio. En ese caso, el espectro está formado por varias líneas de longitudes de onda determinadas, separadas por regiones de oscuridad total. En el caso del vapor de sodio, el color amarillo es producido por dos líneas cuya longitud de onda aproximada es de 589,0 y 589,6 nm. Estas dos líneas se denominan D2 y D1, y sus longitudes de onda pueden medirse con mayor precisión; por ejemplo, la línea D2 tiene una longitud de onda de 588,9977 nm. Se han realizado medidas aún más precisas de las longitudes de onda de algunas líneas del espectro de mercurio isotópicamente puro.

ESPECTROS DE BANDAS

La mayor parte de la información que tienen los físicos sobre la estructura del átomo se ha obtenido mediante espectroscopia. Los espectros moleculares son igualmente útiles para determinar la estructura de las moléculas, algo que interesa a los químicos aún más que a los físicos. La mayoría de los espectros moleculares son espectros de bandas, es decir, están formados por una serie de bandas brillantes cada una de las cuales es similar a un fragmento del espectro continuo, separadas por zonas oscuras. Estas bandas no son en realidad continuas, sino que están formadas por muchas líneas muy juntas que pueden resolverse mediante espectroscopios de alta resolución. El espaciado de las líneas en cualquier serie de bandas moleculares depende de si el espectro es rotacional o vibracional. Como los niveles de energía rotacionales pueden ser excitados por energías bajas, están poco separados y las líneas de una banda rotacional están muy apretadas, sin apenas espacios intermedios. Los niveles vibracionales, en cambio, están mucho más separados, por lo que las líneas de una banda vibracional están más espaciadas. También es posible excitar los niveles de energía electrónicos de una molécula, y las transiciones de los electrones entre dichos niveles dan lugar a las líneas electrónicas del espectro molecular, muy separadas entre sí.

Igual que los espectros de absorción atómicos, también existen espectros de absorción moleculares, que se obtienen haciendo pasar una radiación continua a través de un líquido o gas molecular. Este tipo de espectro, formado por bandas oscuras separadas por zonas brillantes, es el más usado para estudiar la estructura molecular. Existen otras bandas en los espectros moleculares que no se pueden resolver en líneas ni siquiera con los instrumentos más potentes, y parecen ser regiones continuas de absorción o emisión de energía.

METODOS AL INFRARROJO

La radiación infrarroja es la base del amplio uso de un rápido equipo automático, particularmente para leche y para granos. Las series IRMA de NEI Electronics son absorciómetros de doble rayo, diseñados para la determinación simultánea de proteínas, lactosa y grasa en la leche. La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollo más moderno para el análisis de cereales molidos y otros alimentos sólidos. Tanto el Rank Neotec GQA como el Technicon InfraAlyzer pueden estimar proteínas, aceite y humedad en tan sólo unos pocos minutos. Los instrumentos son calibrados con muestras de composición conocida.Al establecer la confiabilidad de cinco métodos para la determinación de proteínas en la cebada y en la malta (Pomeranz y cols.,1977) encontraron que el método del

Biuret y el del colorante asociado a proteínas fueron los más coincidentes con el de Kjeldahl, los métodos de reflectancia al infrarrojo fueron intermedios y la destilación alcalina directa fue el más pobre.

3. APLICACIONES DE LOS ESPECTRÓMETROS

Los espectrómetros de masas pueden proporcionar un alto grado de resolución como ayuda a los análisis de mezclas complejas. Se consigue una mayor precisión con espectrómetros de masas en serie, que consisten en varios espectrómetros colocados uno tras otro. Los dispositivos más sensibles que pueden emplearse en la espectrometría de masas son los aceleradores electrostáticos en serie, que comprenden varios espectrómetros de masas dispuestos en serie y conectados a un potente acelerador electrostático de partículas.

La investigación de la absorción de radiación ultravioleta y luz visible descubre la estructura de los electrones de enlace; la absorción de rayos infrarrojos proporciona información sobre los movimientos vibratorios y las fuerzas de unión dentro de las moléculas, y la absorción de microondas permite a los científicos deducir la naturaleza de los movimientos giratorios de las moléculas, y a partir de esto, la geometría (distancias ínter nucleares) exacta de las moléculas. El estudio de la interacción de la radiación electromagnética con la materia, cuando esa interacción no produce cambios químicos, se denomina a veces espectro química, y en ese caso, el término fotoquímica sólo se usa para aquellas interacciones que producen cambios químicos. Ejemplos de reacciones fotoquímicas son la decoloración de los tintes cuando están expuestos a la luz solar, la generación de vitamina D en la piel humana por acción de la luz solar y la formación de ozono en la capa superior de la atmósfera por la radiación ultravioleta del Sol.

4. ANÁLISIS ESPECTRAL

La luz se emite y se absorbe en unidades minúsculas o corpúsculos llamados fotones o cuantos. Un átomo está formado por su núcleo, que no contribuye a la emisión y absorción de luz porque es pesado y se mueve con mucha lentitud, y los electrones que lo rodean, que se mueven a bastante velocidad en múltiples órbitas; el átomo emite o absorbe un cuanto de luz de un color determinado cuando uno de sus electrones salta de una órbita a otra. Los componentes de una molécula son los núcleos de los diferentes átomos que la forman y los electrones que rodean cada núcleo. Siempre que cambia el modo de oscilación o rotación de una molécula, también cambian sus movimientos electrónicos y se emite o absorbe luz de un color determinado. APLICACIONES DEL ANÁLISIS ESPECTRAL

Los dos usos principales del análisis espectral se dan en la química y la astrofísica.

Análisis químico El espectro de un elemento determinado es absolutamente característico de ese elemento. Por ejemplo, la línea G de Fraunhofer, situada aproximadamente en 430,8 nm, corresponde a dos líneas diferentes, una debida al calcio, con una longitud de onda de 430,7749 nm, y la otra causada por el hierro, con una longitud de onda de 430,7914 nm Las otras líneas del calcio, sin embargo, son muy distintas de las otras líneas del hierro. Por tanto, la comparación del espectro completo de un elemento con un espectro conocido simplifica su identificación. Los espectros de absorción son muchas veces útiles para identificar compuestos químicos.Los espectros situados más allá de la región ultravioleta (rayos X y rayos gamma) se estudian mediante detectores de ionización adecuados. Los espectros de rayos gamma son útiles para el análisis por activación de neutrones. Los espectros de

estos rayos gamma sirven para identificar cantidades minúsculas de determinados elementos químicos en la muestra. La espectroscopia Raman, descubierta en 1928 por el físico indio Chandrasekhara Venkata Raman, se ha empleado mucho recientemente en química teórica.Estos métodos son la resonancia magnética nuclear (RMN) y la resonancia de espín electrónico (REE); esta última técnica también se denomina resonancia paramagnética de electrones.

Astrofísica

Las llamadas líneas de Fraunhofer fueron descubiertas a principios del siglo XIX en el espectro solar; más tarde se comprobó que esas mismas líneas podían producirse en la Tierra. En general, si todas las líneas del espectro de una estrella se desplazan hacia el rojo, la estrella se está alejando de la Tierra, y la velocidad de alejamiento puede calcularse a partir de la magnitud del desplazamiento de las líneas.

Las líneas espectrales de algunas estrellas distantes se duplican periódicamente. Cuando las dos estrellas se mueven en dirección transversal con respecto a la línea de visión desde la Tierra, los espectros de ambas coinciden.Debido a esta variabilidad de la longitud de onda, cada línea del espectro se ensancha ligeramente. Por tanto, la medida del ancho de determinadas líneas espectrales proporciona una indicación de la temperatura de la fuente, por ejemplo del Sol. El interior produce un espectro de emisión de líneas anchas, y en el exterior se genera un espectro de absorción, con líneas más estrechas al estar más frío. Para que se produzca absorción, el espectro de energías de los rayos gamma del núcleo emisor debe coincidir de forma muy precisa con el espectro de las posibles energías de excitación del núcleo absorbente. Moviendo el núcleo emisor o el núcleo absorbente, los científicos pueden clasificar las energías de los rayos gamma con una precisión muy alta.El físico holandés Pieter Zeeman descubrió en 1896 que cuando se coloca una fuente de luz en un campo magnético, las líneas espectrales se ensanchan o incluso se duplican.

5. PARTE EXPERIMENTAL

Experimento:

Medición cuantitativa del poder reductor de un glúcido con el método de Somogyi-Nelson.

Método: Someter al procedimiento de Somogyi-Nelson soluciones de glucosa de concentraciones diferentes y conocidas y solución de concentración desconocida.

Medir en el foto colorímetro la intensidad del color desarrollado, habiendo seleccionado previamente el filtro apropiado para el instrumento. REACTIVOS - Patrón de glucosa, solución 0.2 g/l. - Solución de glucosa de concentración desconocida - Reactivo de Somogyi - Reactivo de Nelson

Procedimiento: Colocar 1 ml de solución de glucosa de distintas concentraciones de diferentes tubos numerados (rango de 6 tubos aproximadamente). Colocar 1 ml de solución de concentración desconocida (hacerlo en duplicado). Agregar a todos los tubos 1 ml de reactivo de Somogyi, mezclar. Tratar en igual forma el tubo blanco.

Colocar todos los tubos, sumergiéndolo en agua fría de la llave, cuidando de no agitarlos para evitar la reoxidación del Ion cuproso.

Agregar 1 ml de reactivo de Nelson a cada uno de los tubos. Mezclar.

Agregar 7 ml de agua destilada a todos los tubos. Mezclar.

Seleccione el filtro apropiado para el experimento de acuerdo al color desarrollado.

Medir en el foto colorímetro el color desarrollado, ajustando a 100% de absorbancia del instrumento con el blanco de la reacción. Resultados y Conclusión

Registro: Confeccionar una gráfica con los resultados obtenidos, colocando en la abscisa las concentraciones de glucosa y en la ordenada las lecturas del foto colorímetro.

Calcular el factor de calibración. Calcular en microgramos/ml y en micromoles/ml.

Cálculos:

Tubos: Tubo blanco 1 Tubo2 Tubo3 Tubo4 Tubo5 Tubo6 Solución glucosa patrón 0.2 g/l, 0 ml, 0.1 ml, 0.2 ml, 0.4 ml, 0.8 ml, 1.0 mlAgua destilada 1.0 ml, 0.9 ml, 0.8 ml, 0.6 ml, 0.2 ml, 0 mlConcentración de glucosa en ug0, ug20, ug40, ug80, ug160, ug200

Absorbancias a distintas longitudes de onda:

[ ] Glucosa ug/ml Longitud de onda = 480 Longitud de onda = 540Longitud de onda = 600

Tubo blanco 00.1080.0940.110 200.0620.1170.218

400.1210.2470.464 800.2850.5130.899 1600.4650.9081.651 2000.5961.1512.102 X10.2240.4360.796 X20.2290.4400.804

La absorbancia del tubo blanco sirve para restarle la Absorbancia a los demás tubos debido a que en esta no se encuentra la concentración de glucosa.

Constante de calibración:

Longitud de onda = 480 Longitud de onda = 540 Longitud de onda = 600

Concentraciones K1K2K3

20 ug3.1 x 10 –35.8 x 10-30.010 40 ug3.0 x 10 –36.1 x 10-30.011 80 ug3.5 x 10 –36.4 x 10-30.011 160 ug2.9 x 10 –35.6 x 10-30.010 200 ug2.9 x 10 –35.7 x 10-30.011 K promedio K1 : 3.0 x 10 –3K2 : 5.8 x 10 –3K3 : 0.011

Determinación de la concertación de la muestra desconocida: Longitud de onda = 480Longitud de onda = 540Longitud de onda = 600 Concentración 177.2 ug75.2 ug1 ug Concentración 278.9 ug76 ug80.4 ug

Conclusión:

La mejor longitud de onda que pasa por el origen es de 540, registrando la concentración de la muestra problema con los datos de la absorbancia y la constante de calibración promedio de aquella longitud de onda.

Demostrando así la ley de Lambert-Beer que establece una proporcionalidad directa entre la concentración e intensidad del color de una sustancia en solución medida como absorbancia.El papel que cumple los reactivos de Somogyi y Nelson es: el reactivo de Somogyi al actuar este con la glucosa el cual es una azúcar reductora, reduce al Ion cúprico en Ion cuproso, en medio alcalino caliente. El reactivo de Nelson posee ácido arsénico-molibdoso Mo+4 el cual solubiliza al Ion cúprico, reduciéndose a Mo+2 (suboxidomolibdeno), dando un color azul proporcional a la cantidad de glucosa presente.

Bibliografía

Manual de laboratorio de Bioquímica General. Sook/West: Química Analítica, tercera edición.