Primer puesto:César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González

Segundo puesto: Renata Helena Candido Pocente

4

Comité Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCTPresidenta: María Eugenia González R.Móvil: (57) (3) 3104991949Email: premio.poct@alere.net.cohttp://www.alere.net.co

El Premio Alere, en reconocimiento al esfuerzo de los profesionales de la salud que están en constante actualización e innovación, galardona a quienes en su incansable búsqueda de nuevos horizontes logran resultados positivos en beneficio de la humanidad.

El Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014 pretende

incentivar la investigación, la capacitación y la actualización enfocadas a

mejorar la calidad de vida de los pacientes.

Con la participación obtenida se superaron las expectativas. Nos sentimos

orgullosos de haber contado con la producción intelectual de tantos

profesionales latinoamericanos que pusieron a consideración del comité

del Premio sus trabajos de investigación. El rigor de la evaluación rindió

sus frutos, se encontraron trabajos de mucha importancia, relevancia y

trascendencia para el área de la salud. Todos somos ganadores en el

Premio Alere. El interés mostrado y la persistente labor por un mejor futuro

hacen descollar a estos investigadores hasta el nivel de la excelencia.

El jurado, por su parte, estuvo a la altura del Premio. Profesionales de talla

mayor como Gustavo Méndez (México), María Belén Bouzas (Argentina)

y Luisane Marie Falci Vieira (Brasil), tuvieron la ardua tarea de evaluar los

proyectos y tomar la decisión de elegir al número uno.

A los participantes, gracias por dar lo mejor de ustedes. Al jurado, gracias

por la entrega y por la responsabilidad que le imprimieron a su meritoria

misión.

En 2015, el Premio Alere continuará incentivando la labor investigativa en

POCT, y espera contar con una amplia y representativa participación de

profesionales de los países de América.

Presentación

Presidenta Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT

Presentación 3

Sección Citometría de Flujo, Servicio de Laboratorio, Hospital G. Rawson, Ministerio de Salud de la Provincia de Córdoba, Argentina. Tel: 0054-0351-156245311, e-mail: cesarcollino2013@gmail.com

Evaluación metodológica del equipamiento pima para la cuantificación de linfocitos t cd4

césar J. G. collino Pérez, Fernando Gallego González

Primer puesto

Primer puesto 5

Introducción

La valoración confiable de los niveles de linfocitos CD3+CD4+ (LTCD4)

resulta indispensable para el monitoreo de la progresión de la infección por

el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). Además, esta cuantificación

tiene un impacto definitorio en la conducta terapéutica y evaluación del

tratamiento antirretroviral (TAR) en este tipo de pacientes.

En la actualidad, la metodología considerada como referencia (gold standard) para el recuento de LTCD4 es la citometría de flujo (CF) de simple

plataforma, principalmente debido a que es una técnica precisa, exacta y

reproducible. Sin embargo, es mandatorio la aplicación de estrategias de

evaluación de métodos (EM) de forma previa a la aplicación en rutina de

un sistema de medición, no siendo la CF una excepción a esta regla. En

este sentido, es necesario establecer también una estrategia de control

de calidad interno que permita realizar un seguimiento de la estabilidad del

sistema de medición a lo largo del tiempo.

En la realidad de nuestro país, los laboratorios que disponen de citómetros

de flujo para hacer recuento de LTCD4, poseen desde una mediana hasta

una alta complejidad, y están ubicados en grandes ciudades y requieren

de personal altamente capacitado para la operación correcta de los

mismos. Esto obliga a que pacientes que residen en pequeñas ciudades

o en regiones geográficas periféricas, tengan que trasladarse grandes

distancias para su atención; por otro lado, las muestras tomadas en centros

de menor complejidad deben ser transportadas hacia los centros donde

realicen la determinación considerada de alta complejidad, con todo el

costo que esto conlleva. La primera situación planteada atenta contra

la adherencia del paciente frente al seguimiento y tratamiento de esta

patología, lo cual incrementa la barrera para la expansión y descentralización

de los programas de Tratamiento Anti Retroviral (TAR) y adherencia de los

pacientes a los mismos. En el segundo caso, y teniendo en cuenta factores

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 20146

importantes como las distancias en nuestro país, el lapso de tiempo que

transcurre desde la toma de la muestra primaria hasta su procesamiento,

podrían afectar la integridad de las mismas, comprometiendo la calidad del

resultado emitido.

Una solución alternativa a la problemática descrita, es la aparición de

las nuevas tecnologías de tipo Point of Care (POC) para efectuar la

cuantificación de LTCD4. Pima CD4 Analyzer (Alere) es uno de estos equipos

de tipo POC. Entre sus ventajas se tienen: a) es portátil, su tamaño y peso

permiten un fácil transporte; b) utiliza un sistema de medición compuesto

por cartuchos donde se realiza la reacción, estos son estables en

condiciones ambientales variables en cuanto al calor y humedad; c) puede

utilizarse con una fuente de energía externa o con una batería recargable,

lo cual permite acceder a lugares sin fuentes de electricidad y medir por un

periodo de tiempo establecido (6 a 8 horas); d) utiliza muestras de sangre

capilar obtenidas por punción digital (pequeñas fracciones de ensayo),

lo que hace posible independizarse de la necesidad de utilizar materiales

para una venopunción convencional; e) la información del resultado de la

cuantificación de LTCD4 se obtiene en un tiempo promedio de 20 minutos

por muestra; f) finalmente, no requiere un operador altamente especializado

para la operación de la metodología de medición establecida.

Por lo mencionado en los párrafos precedentes, el objetivo de este trabajo

fue llevar a cabo una exhaustiva EM del sistema de medición PIMA (Alere),

evaluando el desempeño de este método en términos de precisión,

linealidad y veracidad, para establecer finalmente la aceptabilidad del mismo

en función de los requerimientos de calidad establecidos para los analitos

implicados (LTCD4).

Primer puesto 7

Métodos y materiales

Muestras

Se recolectaron un total de 101 muestras de pacientes que acudieron

al servicio de laboratorio del Hospital Rawson; 60 de pacientes de sexo

masculino y 41 de sexo femenino, con una mediana global de 39 años,

y un rango de edad entre 20 y 72 años. En todas las muestras se realizó

la cuantificación de las subpoblaciones linfocitarias por CF de simple

plataforma utilizando el sistema TruCount (BD Bioscience, USA); además

se efectuó la medición de la totalidad de las muestras con el sistema PIMA

(Alere Pima Analyser, Germany).

El tipo de muestras utilizadas fueron: a) sangre venosa entera anticoagulada

con EDTA K3 (tubos comerciales DVS 2,5 ml volumen final); b) sangre

arterial capilarizada (pulpejo del dedo); c) material control comercial

provistos por la empresa Alere (cartuchos comerciales); y d) muestra

control estabilizada immunotrol (Coulter Corporation, Miami, Florida 33196,

EE.UU.).

Equipamiento utilizado

Se aplicó el Método POC Alere Pima AnalyserTM; este es un sistema de

medición basado en reacciones antígenos-anticuerpos que utiliza la sangre

tomada (de 1 a 2 gotas) directamente por digitopunción, y es introducida

en lo cartuchos diseñados para tal fin, en un volumen de 25ul, de los

cuales solo se utilizan 5ul para el análisis posterior. En este proceso de

medición la sangre se mezcla con anticuerpos monoclonales conjugados

con fluorocromos (anti-CD3 y anti-CD4) contenidos dentro del cartucho de

reacción; esta reacción se transfiere a la cámara de detección donde se

toman imágenes (fotos), se integra la información y se calcula el valor de

LTCD4 por µL de sangre.

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 20148

Por otro lado, todas las muestras medidas por el sistema PIMA se

valoraron mediante CF de simple plataforma con un citómetro de flujo

BD FACSCaliburTM (BD Bioscience), y se utilizaron tubos trucount para el

recuento absoluto y la clasificación relativa de cada población celular. Se

trabajó con el reactivo Multitest para la evaluación del perfil linfocitario T

(CD3/CD8/CD45/CD4). La calibración diaria de este equipamiento y el

control de calidad interno fueron realizados acorde a las recomendaciones

del fabricante. Este equipamiento participa además del Programa de

Evaluación Externa de la Calidad del CEMIC, ProgBA.

Análisis estadístico

En los ensayos de precisión se siguieron los lineamientos y análisis

estadísticos propuestos en las guías EP15-A2 y EP5-A2 del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA), utilizando el programa Microsoft Office Excel ver. 2007. Para evaluar la linealidad de esta metodología se realizó

un análisis de regresión polinomial aplicando el protocolo descrito en la

guía EP6-A del CLSI, usando el programa estadístico InfoStat ver. 2011p. Con respecto al estudio de la concordancia clínica, se construyeron

3 tablas de 2 x 2, en las cuales se tomaron como valores de corte los

niveles de decisión médica de 200, 350 y 500 LTCD4/µL, y a partir de

ellas se calcularon sensibilidad diagnóstica, especificidad diagnóstica, valor

predictivo positivo y valor predictivo negativo.

Aspectos éticos

No se requirió consentimiento informado, ya que los datos suministrados se

destinaron a fines clínicos y se garantizó el anonimato.

Primer puesto 9

Resultados y discusiones

Evaluación de la precisión (Preliminar e intermedia)

Experiencia con cartuchos control Alere PimaTM Bead Standard, provistos por el fabricante. Para esta experiencia se valoró cada uno de

los dos cartuchos control (uno con valor asignado bajo, y otro con valor

asignado normal de LTCD4) veinte veces en una misma corrida analítica,

con la finalidad de establecer el límite de outliers. Acto seguido, se realizó

una estimación de la precisión intermedia midiendo el recuento de LTCD4

de los dos cartuchos control durante veinte días, efectuando dos corridas

diarias por duplicado cada una. Los resultados se encuentran expresados

en la Tabla 1, donde también se expresan los requerimientos de calidad

establecidos para este analito en función de variabilidad biológica individual

y grupal (únicos requerimientos de calidad disponibles para recuento de

LTCD4).

Experiencia con muestras de sangre entera venosa (SEV). Esta

experiencia se llevó a cabo de la misma forma que la realizada con los

cartuchos comerciales, utilizando dos muestras de SEV, una de las cuales

poseía un recuento de LTCD4 bajo y la otra, un recuento de LTCD4 normal.

Estas muestras se valoraron en cinco corridas analíticas por triplicado. Los

resultados se pueden observar en Tabla 1.

Experiencia con muestras controles estabilizadas (MCE). En esta

experiencia se determinó el recuento de LTCD4 a la MCE durante veinte

corridas analíticas. Se realizó para obtener información respecto a la

precisión intercorrida de la metodología de medición. Estos resultados se

muestran en la Tabla 1.

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 201410

Media (*)

Imprecisión (*)

CV (%)V.B. Min

(%)V.B. Des

(%)

Precisión preliminar cartuchos comerciales

142,9 1,5 (DS) (**) 1,0 18,8 12,5

947,0 16,9 (DS) (**) 1,8 18,8 12,5

Precisión intermedia cartuchos comerciales

141,3 2,2 (St) (***) 1,6 18,8 12,5

940,2 19,8 (St) (***) 2,1 18,8 12,5

Precisión intermedia muestras Sangre Entera

Venosa

176,9 18,2 (St) (***) 10,3 18,8 12,5

1040,5 65,9 (St) (***) 6,3 18,8 12,5

Precisión intermedia MCE 489,5 62,3 (DS) (**) 12,7 18,8 12,5

tabla 1. Resultados de la evaluación de la precisión

(*) Unidades: Células/µL. (**) Valor de desviación estándar. (***)Valor de precisión intermedia.

Linealidad

Para evaluar este aspecto se aplicó un análisis de regresión polinomial

empleando el programa informático InfoStat V. 2011. Se evaluó la

distribución de los distintos niveles de concentración mediante modelos

polinomiales de primer, segundo y tercer orden, de acuerdo con los

lineamientos de la guía EP6-A del CLSI. Para la preparación de los

distintos niveles de concentración se siguieron los lineamientos publicados

previamente (H26-A2 CLSI); se partió de una muestra de SEV con un

valor alto de LTCD4, que se puso en posición vertical, y se dejó en reposo

durante 2 horas, aproximadamente, de manera que sedimentaran los

elementos formes celulares.

Primer puesto 11

Luego, utilizando el plasma sobrenadante de esa misma muestra, se

realizaron las correspondientes diluciones para obtener 6 puntos de

concentración equidistantes entre sí. Cada nivel de concentración se

midió por duplicado. La concentración teórica del nivel más alto se

estableció como el promedio del duplicado medido, y las restantes

concentraciones teóricas se determinaron en función de los volúmenes

de plasma adicionados (Tabla 2). Los resultados obtenidos se encuentran

representados en la Tabla 3 y en la Figura 1.

Dilución 1° Medición(*) 2° Medición(*) Rec. Teórico(*)

15% 194 262 261

30% 414 565 520

45% 851 864 781

60% 1062 1016 1041

85% 1438 1487 1478

100% 1742 1728 1735

(*) Unidades: Células/µL.

tabla 2. Resultados de la evaluación de la linealidad

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 201412

Orden polinomial

CoeficienteValor coef.

(1) E.E. Coef (2) t (3) p-Valor (4) G.L. (5)Des. Est.

Residual (6)

Primer b0 -9,68 34,88 -0,28 0,7870 8 56,66

Primer b1 1,01 0,03 31,75 <0,0001 8 56,66

Segundo b0 -75,86 66,25 -1,15 0,2817 7 55,66

Segundo b1 1,19 0,16 7,64 <0,0001 7 55,66

Segundo b2 -8,80E-05 7,50E-05 -1,17 0,2731 7 55,66

Tercero b0 -164,74 127,99 -1,29 0,2341 6 56,72

Tercero b1 1,60 0,53 3,03 0,0163 6 56,72

Tercero b2 -5,80E-04 6,10E-04 -0,95 0,3675 6 56,72

Tercero b3 1,70E-07 2,10E-07 0,82 0,4374 6 56,72

(1) Valor coef.: Coeficiente del polinomio; (2) E.E.: Error Estándar; (3) t: Valor obtenido del test-t; (4) p-Valor: valor p asociado al resultado del test-t; (5) G.L.: Grados de Libertad; (6) Des. Est. Residual: Desviación Estándar Residual de la regresión.

tabla 3. Resultados del Análisis de Regresión Polinomial

Primer puesto 13

Recuento Teórico

Rec

uent

o M

edid

o

1800

1800

1375

1375

950

950

525

525

100

100

* Regresión lineal: en el eje Y se graficaron las concentraciones medidas, y en el X las teóricas (calculadas). Ambas concentraciones se expresan en cel./µL. Rango de linealidad teórico evaluado: 261 - 1735 LTCD4/µL

Concordancia clínica

Se establecieron los parámetros sensibilidad diagnóstica, especificidad

diagnóstica, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo para

distintos niveles de recuento de LTCD4. La metodología de referencia

empleada este ensayo fue la Citometría de Flujo Simple Plataforma

(FACSCalibur, BD); en la cual se consideró la primera determinación de los

duplicados realizados por el sistema PIMA, y se actuó de la misma forma

para las determinaciones elaboradas por FACSCalibur; esto se llevó a cabo

sobre la totalidad de las muestras (101) de SEV que se valoraron. Los

resultados obtenidos están representados en la Tabla 4.

Figura 1. Regresión Primer Orden Recuento LTCD4*

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 201414

(*) Unidades: Células/µL.

Recuento LTCD4 de corte (células/µL)

Sensibilidad (%)

Especificidad (%)

VPP (%)

VPN (%)

200 (*) FACSC. ≤ 200(*)FACSC. >

200(*)96 97,37 92,31 98,67PIMA ≤ 200

PIMA > 200

24

1

2

74

350 (*) FACSC. ≤ 350(*)FACSC. >

350(*)100 98,55 96,97 100PIMA ≤ 350

PIMA > 350

32

0

1

68

500 (*) FACSC. ≤ 500(*)FACSC. >

500(*)97,37 88,89 84,09 98,25PIMA ≤ 500

PIMA > 500

37

1

7

56

Veracidad - Comparación de métodos

En esta experiencia se siguieron los lineamientos de la guía EP9-A2 del CLSI; se

hizo una comparación de métodos entre los resultados obtenidos por el sistema

PIMA (contemplado como método en estudio) y por FACSCalibur (contemplado

como método de referencia). Para ello se consideró la media de los duplicados

de los valores cuantificados en cada uno de los sistemas de medición. De las

101 muestras de SEV valoradas en ambos equipos, se descartaron 2 muestras

que poseían recuentos superiores a 2000 LTCD4/µL, esto respeta estrictamente

el estudio precedente de linealidad realizado en este trabajo. No se encontró

ningún valor anómalo dentro de las 99 determinaciones que se tuvieron en

cuenta. Con el fin de establecer la ecuación de la recta que mejor se ajusta a la

tabla 4. Resultados del Análisis de Concordancia Clínica

Primer puesto 15

distribución de los datos, se aplicó la regresión de Passing-Bablok utilizando

el programa MedCalc V.12.7.0.0. Los resultados alcanzados fueron 11,72

para la ordenada al origen, y 0,876 para la pendiente; sus respectivos

intervalos de confianza (95%) fueron de 4,45 a 16,77 y de 0,857 a 0,892;

y se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,9897 (Figura 2). También se

aplicó el análisis de Bland-Altman (MedCalc V. 12.7.0.0.) para calcular el BIAS

promedio con el cual se cuantifica el sistema PIMA respecto al sistema de

medición FACSCalibur, y se determinó que el mismo tiene una magnitud

de -74,1 LTCD4/ µL, con su respectivo intervalo de confianza (IC 95%) de

-264,0 a 115,8 (Figura 3).

0 500

PIMA = 0,876 X FACSCalibur + 11,72

1000 1500 2000

Rec

uent

o LT

CD

4 -

PIM

A

Recuento LTCD4 - FACSCalibur

2000

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

Figura 2. Estudio de Regresión - Passing Bablock

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 201416

Media de PIMA y FACSCalibur

+ 1.96 SD

115,8

- 1.96 SD

- 264,0

Mean

-74,1

Dife

renc

ia (P

IMA

- F

AC

SC

alib

ur)

0 500 1000 1500 2000 2500

-600

-700

-500

-400

-300

0

200

100

-100

-200

Comparación Sangre Capilar vs. Sangre Entera Venosa (SEV)

También se hizo una comparación de métodos para evaluar posibles

diferencias que puedan establecerse al realizar el recuento de LTCD4 en

sangre capilar obtenida por punción capilar utilizando el equipo PIMA, y

la cuantificación de LTCD4 a partir de SEV. Se compararon 18 muestras

de individuos adultos sanos, de quienes se adquirieron simultáneamente

la muestra de SEV y la de sangre capilar obtenida por punción digital. La

regresión efectuada por Passing-Bablok arrojó una pendiente de 1,026

(I.C. 95% de 0,778 a 1,382), una ordenada al origen de 9,73 (I.C. 95%

de -323,94 a 234,50) y un coeficiente de correlación r = 0,900 (Figura

4). Respecto a los resultados arrojados por la comparación mediante

Bland-Altman, se encontró que el BIAS promedio del sistema PIMA (Sangre

Capilar) en comparación con PIMA (SEV) es de 28,3 LTCD4/ µL, con un I.C.

95% de -151,3 a 207,9 (Figura 5).

Figura 3. Estudio de Bland - Atlman. Diferencias absolutas

Primer puesto 17

PIMA (S. capilar) = 1,026 x PIMA (S. venosa) + 9,73500

400

400 500

PIMA - Sangre Venosa

PIM

A -

San

gre

Cap

ilar

600

700

800

900

1000

1100

1200

600 700 800 900 1000 1100 1200

Media de PIMA con S. Capilar y S. Venosa

+ 1.96 SD

207,9

- 1.96 SD

- 151,3

Mean

28,3

Dife

renc

ia (P

IMA

s.C

apila

r -

PIM

A S

. Ven

osa)

0

-150

-200

-100

-50

50

100

150

200

250

400 600 800 1000 1200

Figura 4. Estudio de Regresión - Passing Bablock (Sangre Capilar vs. SEV)

Figura 5. Estudio de Bland - Atlman (Sangre Capilar vs. SEV). Diferencias absolutas

Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 201418

Se demostró que para todos los casos en los que se evaluó la precisión,

con sus diferentes componentes, el sistema PIMA cumple con los

requerimientos deseables de calidad basados en la variabilidad biológica.

En el caso de la MCE, cumplió con los requerimientos mínimos estipulados

según variabilidad biológica. Es importante destacar que las magnitudes de

los valores de imprecisión obtenidos con muestras de SEV y con MCE son

similares entre ellos, pero los mismos difieren ampliamente de los obtenidos

con cartuchos control Alere PimaTM Bead Standard. Esto puede ser explicado

por el hecho de que en el caso de los cartuchos control, en realidad no se

procesa una muestra de SEV, sino que se hace una determinación sobre

un cartucho control que viene cerrado con un contenido fijo, y lo esperable

es que la dispersión que se obtenga en este sea mucho menor en

comparación con la dispersión obtenida a partir de varias determinaciones

de una misma muestra utilizando varios cartuchos Alere PimaTM CD4, con la

manipulación previa que esto conlleva (variables preanalíticas a considerar).

Lo anterior deja de manifiesto que los cartuchos control Alere PimaTM Bead Standard son de gran utilidad para evaluar el funcionamiento del equipo

Alere Pima AnalyserTM, pero no son aptos para evaluar en términos analíticos

(precisión, veracidad, linelidad) el funcionamiento del sistema en su

totalidad, que también incluye los cartuchos Alere PimaTM CD4.

Una forma de controlar el sistema en su totalidad sería con muestras

de sangre entera estabilizadas (como es el caso de MCE). Utilizando

estrategias de control de calidad interno se puede evaluar el funcionamiento

del sistema de medición en su totalidad (inclusive los cartuchos Alere PimaTM

CD4) en términos de precisión y veracidad, y de esta forma se puede

demostrar el correcto funcionamiento del equipo a lo largo del tiempo.

Conclusiones y recomendaciones

Primer puesto 19

En términos de linealidad, se demostró que el recuento de LTCD4 del

equipo PIMA tiene un comportamiento lineal, y el modelo de medición

es explicado por un polinomio de primer orden, en el rango reportable

evaluado.

En cuanto a la concordancia clínica, los resultados obtenidos permiten

afirmar que la determinación de LTCD4 mediante la utilización del

equipo Alere Pima AnalyserTM, al tener una alta sensibilidad y especificidad

diagnóstica para los niveles descritos previamente, es una herramienta útil

para tomar decisiones médicas en pacientes de reciente diagnóstico de

poseer el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), y que los cuales por

diferentes situaciones no pueden acceder a metodologías convencionales

para determinar sus niveles de LTCD4.

Respecto al desempeño obtenido en términos de veracidad, observando

los resultados de la regresión realizada, podemos asumir que el equipo

Alere Pima AnalyserTM, en comparación con FACSCalibur, tiene un error

sistemático constante positivo (ordenada al origen positiva de 11,72), y

un error sistemático proporcional negativo (pendiente menor a uno, de

0,876), lo cual coincide con trabajos previos. Esto da aún más respaldo

a los resultados de nuestro trabajo, y dejan en evidencia que dichos

errores sistemáticos no son producto de la aleatoriedad. Al analizar y

utilizar la ecuación de la recta obtenida en la regresión, encontramos que

el punto en el cual el recuento entre un equipo y otro serían “equivalentes”

es a 94 LTCD4/µL. Esto implicaría que por debajo de esa concentración

el equipo PIMA sobreestima (error por exceso), y que por encima de

esa concentración subestima (error por defecto), respecto al equipo

FACSCalibur; así se demuestra el bajo impacto clínico de estos errores en

estos niveles de concentración en este analito (LTCD4).

Imunoensaio cromatográfico rápido no diagnóstico diferencial de tuberculose e micobacteriose não tuberculosa em um serviço de referência terciária

Renata Helena candido Pocente*, Margarida Maria Passeri do Nascimento, Sandra Mara Nunes Moroti , Livia Maria Pala Anselmo, cinara Feliciano, Roberto Martinez, Rodrigo c. Santana, Valdes Roberto Bollela.

*Autor principal: Renata Helena Candido Pocente. Endereço: Laboratório de Micobactérias do Hospital sas Clínicas da Faculdade se Medicina se Ribeirão Preto. Campus Universitário S/N 14048-900 Ribeirão Preto-São Paulo. Tel: (16)3602-2747.

Segundo puesto

Segundo puesto 21

Introdução

O Brasil está entre os 22 países que concentram aproximadamente

80% do total de casos de tuberculose (TB), ocupando a 16ª posição

em número absoluto de casos. À semelhança de outros países, o

Brasil tem conseguido avançar no controle da doença nas últimas duas

últimas décadas. Entretanto as elevadas taxas de co-infecção entre o

vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o bacilo da tuberculose (TB)

e a emergência de bacilos resistentes tem sido um limitante para o o

controle de ambas as doenças1. Os pilares para o controle da TB incluem

o diagnóstico precoce e o tratamento efetivo. O aumento da prevalência

global do HIV tem promovido dificuldades adicionais no diagnóstico e,

consequentemente, no controle da TB, especialmente no paciente com

imunodeficiência em fase avançada. Nestes casos observa-se um aumento

na ocorrência de micobactérias não tuberculosas (MNT), cujo diagnóstico

inicial pode ser facilmente confundido com o da TB. Este fato se torna ainda

mais desafiador se considerarmos que existem MNTs colonizando a árvore

respiratória, a região gênitourinária, trato gastrintestinal e região perineal

de pessoas saudáveis. Assim, a presença de baciloscopia e até a cultura

positiva para micobactérias em alguns espécimes clínicos não é suficiente

para garantir o diagnóstico de tuberculose. Além do cultivo é preciso

identificar com acurácia a espécie de micobactéria para que o tratamento

apropriado seja instituído.

O Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

(HCRP) é um hospital terciário com cerca de 700 leitos, referência para

uma macrorregião com cerca de 4 milhões de habitantes. Nele estão

localizados os serviços de referência para TB resistente, co-infecçãoTB/

aids e para pacientes com micobacteriose não-tuberculosa do Nordeste

do estado de São Paulo. Pelo porte, o hospital também é o centro onde se

faz a maioria dos transplantes desta região do estado, o que provoca um

elevada concentração de pacientes imunocomprometidos. Neste contexto,

é fundamental diferenciar as espécies de micobactérias isoladas em cultivo.

Sumário executivo

22 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

Até 2013 a rotina do laboratório para isolamento e identificação de

micobactérias incluia o exame direto (Ziehl-Neelsen) e incubação no sistema

automatizado MGIT 960TM para qualquer amostra, exceto sangue e medula

óssea. Estes dois espécimes são cultivados no sistema BD Bactec 9120TM.

Após sinalizar o crescimento no sistema automatizado, uma alíquota do

meio de cultivo era separada para extração de DNA e amplificação por

meio de técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) “in house” que amplifica um fragmento de 123 pares de bases da região IS6110 do

Mycobacterium tuberculosis2. Na presença da amplificação confirmava-se

M. tuberculosis, e na sua ausência concluia-se pela presença de MNT. O

tempo de execução da identificação das micobactérias pela PCR (extração

do DNA, amplificação, revelação no gel de agarose e fotografia do gel)

variava entre 8 e 10 horas para 6 a 8 isolados/semana, ou um dia de

trabalho da biologista responsável pelo laboratório.

Objetivo deste trabalho

O objetivo deste estudo é avaliar a implantação de um imunoensaio

cromatográfico rápido (IECR), na rotina de identificação de micobactérias do

laboratório de um hospital de referência no Estado de São Paulo.

Materiais e métodos

Desenho do estudo: Estudo transversal, que avaliou os resultados da

incorporação de teste TBAgMPT64TM (Standard Diagnostic Inc-Republic of Korea; distribuido pela Alere S/A no Brasil) na rotina de identificação das

micobactérias isoladas em cultura no hospital.

Obtenção de amostras: as amostras coletadas por ocasião da

investigação diagnóstica rotineira de TB e MNT em pacientes internados no

HCRP.

Segundo puesto 23

Amostras estudadas: Foram analisadas amostras de 237 isolados de

micobactérias em cultura, entre os meses de outubro de 2013 e julho de

2014. A confirmação de M. tuberculosis foi feita através de dois métodos

moleculares: PCR “in house” e resultado do teste molecular rápido

Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience, GmbH, Germany), o qual é feito

de rotina no laboratório e que, além de detectar mutações de resistência do

bacilo, também identifica a espécie. As amostras caracterizadas como MNT

pela PCR foram encaminhadas ao Laboratório de referência do Estado de

São Paulo para identificação da espécie (Instituto Adolfo Lutz-IAL).

Aspectos éticos: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do HCRP,

com número 9586/2011.

Resultados e discussões

Das 237 cepas isoladas em cultura nos 10 meses deste estudo, 143

tiveram resultados positivos no imunoensaio cromatrográfico, identificando

M. tuberculosis, e em 94 isolados o resultado indicou a presença de MNT.

Foram isoladas micobactérias de diferentes sítios, conforme demonstrado

na tabela 1:

Espécime clínica M. tuberculosis MNT

Escarro 107 86Líquido cefalorraquidiano 8 0

Lavado gástrico 6 2Sangue 6 1

Aspirado traqueal/Lav. broncoalveolar 5 3Biópsia (pulmão e linfonodo) 4 0

Abscesso 3 1Líquido pleural 2 0

Fezes 1 1Osso 1 0

Total 143 94

tabela 1. Sítio da infecção da micobactéria isolada nos 237 pacientes estudados

24 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

A seguir apresentamos em uma tabela 2x2 os resultados do IECR quando

comparado com os resultados obtidos com a PCR in house e o Genotype

MTBDRplus para identificar o complexo M. tuberculosis e os resultados do

laboratório de referência do estado, para as cepas identificadas como MNT.

Definição da espécie: PCR in house; Genotype MTBDRplus e resultados do laboratório de referência

Imunocromatográfico POSITIVO NEGATIVO

POSITIVO 143 0 143

NEGATIVO 1 93 94

144 93 237

A sensibilidade e especificidade do IECR foi de 99,3% e 100%,

respectivamente. O valor preditivo positivo foi de 100% e o negativo de

98,9%.O coeficiente kappa entre o IECR e os testes de referência utilizados

foi de 0,99. O tempo necessário para realizar 10 testes de identificação

com o IECR foi de 20 minutos, cerca de 30 vezes menor do que o tempo

gasto para o teste utilizando o PCR in house. Se considerarmos o tempo de

trabalho do biologista mais os insumos utilizados na PCR, o custo/teste do

IECR também foi menor.

Segundo puesto 25

O IECR mostrou elevadas sensibilidade e especificidade quando realizado

no meio líquido do MGIT. Também demonstrou elevada correlação com

os testes de referência (kappa=0,99). Em apenas um, dos 144 isolados

de M. tuberculosis, o IECR não detectou a infecção, o que só foi possível

após resultado do laboratório de referência. Quando utilizamos a PCR

diretamente no líquido de cultura, existe maior risco de contaminação

da reação, consequentemente resultados falsos positivos, além do risco

de contaminação da reação feitas para espécimes clínicos processados

no nosso laboratório, como líquor, líquido pleural ou ascítico. Tal risco

não existe com o uso do IECR. Recentemente, a partir dos trabalhos de

SUTANTANGJAI et al.3, temos considerado utilizar o IECR diretamente

em amostras de escarro com baciloscopia positiva, previamente tratadas

com mucolítico/solvente. Isto poderia encurtar o tempo de detecção e

identificação da espécie presente na amostra clínica.

Desde outubro de 2013, o IECR foi incorporado à rotina de identificação

de micobactérias que creceram no sistema automatizado de cultivo, e esta

prática tem significado maior rapidez e maior confiabilidade, que certamente

impactam na tomada de decisão clínica. É importante destacar que, para

hospitais de referência, continua sendo muito importante contar com a

retaguarda do laboratório de referência, considerando a complexidade dos

casos atendidos neste serviço.†

Conclusões e recomendações

† Agradecemos à equipe do laboratório de Micobactérias do Instituto Adolfo Lutz, parceiros e referência para identificação das MNT e teste de sensibilidade de M. tuberculosis isolados no Hospital das Clínicas da de Ribeirão Preto.

26 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

Bibliografia

1 World Health Organization (WHO). Global tuberculosis report

2013. Geneva: World Health Organization, 2013.

2 Bollela VR, Sato DN, Fonseca BAL. McFarland nephelometer

as simple method to estimate the sensitivity of polymerase

chain reaction using Mycobacterium tuberculosis as a research

tool. Braz. J. Med. Biol. Res. 1999.32(9),1073-1076.

3 Sutantangjai M, Fasksri K, Chaicumpar K, et al. Evaluation

of an immunochromatographic test kit for detecting

Mycobacterium tuberculosis complex in sputum samples and

on solid and in liquid cultures. Southeast Asian J Trop Med

Public Health. 2014, 45(2):357-64.

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