¿Cómo obtenemos los cromosomas?
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OBTENCIÓN DE PLACAS METAFÁSICAS PARA EL ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS A PARTIR DE SANGRE PERIFERICA
Ignacio A. Maureira C
Universidad de ChileFacultad de MedicinaDepartamento de Tecnología Médica
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En los organismos eucariontes, las fibras cromatínicas del núcleo interfásico se condensan durante la división celular generando los cromosomas.
Se realizó un cambio en el contraste (aumentando de 0 a 22) y en el color (realizando pequeños cambios)
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Las organizaciones y variaciones estructurales del cromosoma metafásico constituyen un tema de gran interés.
Alteraciones cromosómicas numéricas o estructurales están involucradas en diversos trastornos de la reproducción, desarrollo y la viabilidad de muchos organismos.
¿Por qué estudiar los cromosomas?
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PROCEDIMIENTO
Antes Después
Se realizó un cambio en el tono y la saturación, aumentando levemente ambos.
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CULTIVO
Una vez obtenida la muestra de sangre, se realiza un cultivo con: Medio RPMI (3ml), Suero bovino fetal (0.5 ml), fitohemaglutinina (0.2 mL), antibiótico (0.1 mL).
Se deja incubando por 72 horas a 37°C
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COSECHA
3 horas antes del termino del tiempo de incubación se agrega 0.1 ml de colcemid al cultivo.
Una vez finalizado el tiempo de incubaciónse realiza una centrifugación durante 7 minutos a 1700 rpm
Eliminar el sobrenadante. Agregar solución hipotónica de KCL 0.05M a 37°C
Volver a centrifugar a 1700 rpm por 12 minutos.
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COSECHA Eliminar el sobrenadante y agregar al pellet 6 ml de ácido
acético 4%.
Centrifugar a 1700 rpm por 7 minutos. Eliminar el sobrenadante.
Agregar 3ml de fijador frío (metanol/ ácido acético , proporión 3:1) y dejar el tubo a 4°C durante 30 minutos.
Centrifugar a 1700 rpm por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar hasta 1 ml de fijador.
Chequear al microscópio de contraste de fase la calidad y concentración de placas metafásicas.
Realizar el goteo en un portaobjeto limpio.
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BANDEO G Y TINCIÓN DE LOS CROMOSOMAS.
Soluciones para el bandeo y la tinción con Giemsa:
Tripsina Solución Salina isótonica (Cloruro de sodio al
0.9%) Buffer Fosfato (0,025M, pH:6.7) Colorante Giemsa (disuelto en buffer Fosfato)
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BANDEO G Y TINCIÓN DE LOS CROMOSOMAS.
Colocar los portaobjetos en una solución de tripsina a 0.05% de 30 a 90 segundos, a 37°C.
Lavar en solución salina isotónica fría (4°C). 3 lavados de dos minutos.
Teñir con Giemsa, de 2 a 3 minutos.
Lavar con agua destilada y secar al aire.
Observar las placas al microscópio óptico de luz.
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Se realizó un cambio en la luminosidad (aumentándola) y en el brillos y contraste (aumentando el brillo y disminuyendo el contraste)
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