¿Cómo se calcula m con datos...
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¿Cómo se calcula m con datos
microscópicos?
Gustavo Viniegra González
Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, D.F.
MEXICO ([email protected])
Beauveria bassiana sobre cutícula
de grillo.
Los mohos crecen bien sobre las superficies sólidas.
Es su habitat natural.
Divanery Rodríguez
(2004)
Cultivo en caja Petri
El micelio se separa por filtración del agar licuado por calor.
El peso seco se estima como: rA = mg X/cm2
Macro cinética de A. niger Larralde-Corona et al., (1997)
X = peso seco en caja petri (mg/cm2)
Al principio crece muy rápido con la velocidad, rX.
Finalmente llega a un nivel máximo Xm
Los valores de, r y Xm, dependen del valor de So 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
4
8
12
16
20 120 gL-1
70 gL-1
300 gL-1
40 gL-1
10 gL-1
Bio
mas
s dr
y w
eigh
t, X
(mg/
cm2)
Time (h)
Modelo macroscópico
• La tasa específica de crecimiento se
define como
r = (1/X)dX/dt
• Se supone, que, r, debe reducirse cuando
X, llega al valor, Xm.
Modelo de von Bertanlanffy
r = m{1 – (X/Xm)n}
X << Xm r m; X Xm, r 0
Consecuencias del modelo
• Si n = 1; r vs. X, es
una recta.
• Si n > 1; r vs. X, es
convexa.
• Si n < 1; r vs. X, es
cóncava.
El caso simple, n = 1,
es la ecuación
logística.
Velocidad específ., r, vs. densidad, X
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0 5 10 15 20
X (mg/cm2)
r (1
/h)
n = 1 n = 1/2 n=2
Teoría vs. Experimento
• Datos de la tesis de M. Raimbault (1980).
• Crecimiento de A. niger sobre harina de mandioca.
• No se ajusta con el modelo anterior. El valor de, r, varía con el avance del proceso.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
x = X/Xm
r/r
ma
x
¿Por qué un modelo microscópico?
• Un modelo predictivo (a diferencia de ser
descriptivo), … debe contener un
parámetro microscópico que represente …
a un parámetro biológico, y … al
modificarse … afecte al crecimiento global
y al desarrollo*
• (Se recomienda leer la cita adjunta)
*http://140.136.180.180/Repository/SCO_009/Cyberfungi/Kinetics/Kinetics_o
f_mycelial_growth.pdf
¿Datos microscópicos?
Se pueden medir:
• a) Velocidad máxima de extensión apical,
Umax.
Variación temporal del diámetro de las
colonias
• b) Longitud, L, y diámetro, d, de las hifas y
segmentos.
Medidos con un analizador de imágenes.
Umax = dR/dt
Las hifas se extienden y
ramifican Las más rápidas van afuera
Edelstein, J. Theoret. Biol. 98: 679, 1982
Morfometría
Las longitudes y diámetros de las hifas se
miden por el análisis de imágenes
obtenidas por video y digitalizadas en una
computadora.
Estas mediciones pueden registrarse y
analizarse en forma estadística a diversos
períodos de tiempo.
Germinación de B. bassiana
• Se puede medir la
longitud de las hifas,
L, a diversos tiempos.
• Se usa un analizador
de imágenes.
• A una longitud, Lc, se
ramifican (no
mostrada aquí).
Divanery Rodríguez (2006)
Crecimiento de las hifas de A. niger
Las hifas, al principio, crecen rápidamente
L Loekt.
Cuando la velocidad disminuye, se ramifican (flechas) L = Lc.
Los valores de, Lc, primero aumentan con So y luego disminuyen.
Datos de Larralde et al., (1997) Glucosa: (g/L) 10; 40; 70; 120; 300-
6 8 10 12 14 16 18 20
0
100
200
300
400
500
Hy
ph
al
Le
ng
th,
L (
mm
)
Time (h)
Lc
Estructura de las hifas
Distal Subapical Apical
Dirección del crecimiento Septo
Spitzenkörper
U = velocidad de extensión apical (cm/s)
N = velocidad de formación de nueva pared (cm2/s)
N
Esquema de Patricia Larralde (1997)
Modelo de Bartnicki-García
Predice la forma de las
hifas en función de
dos variables, N, y U
N = formación de nueva
pared por las
vesículas (cm2/s).
U = velocidad de
extensión apical
(cm/s).
Modelo vs. Experimento
• Superposición de la
curva teórica con la
imagen.
• El foco de la curva
está en el
Spitzencörper.
Según: Bartnicki-García et al. Protoplasma
153: 46, (1989)
Modelo conceptual
Las vesículas son acarreadas por kinesina a través de
filamentos de tubulina. En el SPK se descargan y distribuyen
para construir nueva pared. La kinesina se recicla hacia el
retículo endoplásmico, para su recarga
Cuando se acumulan demasiadas vesículas,
en el SPK (L = Lc) la hifa se ramifica.
Modelo Geométrico
NS = número de segmentos
NP = número de puntas
NS = 2Np - 1
Ejemplo: 11 = 2(6) - 1
Biomasa:
X = NSVr
X = NS[rpd2Lc/4]
X = [2Np - 1][rpd2Lc/4]
Si se conoce, Np, se calcula X
P3
P6
S0
P2
P4 P5
S1
S2 S6
S5
S4 S3 S1
0 S9
S8 S7
P1
Las puntas (Np) crecen exponencialmente con tc,
• Np(0) = 1
• Np(tc) = 21
• Np(2tc) = 22
• Np(ntc) = 2n
¿Cómo ligamos Np con dL/dt?
• Se necesita calcular el tiempo, tc,
necesario para un ramificación.
• Necesitamos una función L = L(t) que
provenga de los experimentos
microscópicos.
• De esa forma se podrá ligar el tiempo, tc,
con las medidas microscópicas del
micelio.
Modelo de saturación
La velocidad, dL/dt = U, depende de la tasa
de suministro y distribución de vesículas,
N. Entre más biomasa, más vesículas,
hasta que se satura el SPK
LK
LU
dt
dL
L max
Si L << KL dL/dt UmaxL/KL; Si L >> KL dL/dt Umax
Esta ecuación ajusta los datos de P. Larralde et al. (1997)
Cálculo del tiempo de ramificación
La ecuación cinética se puede integrar
Cuando, t = 0, L = d, porque las hifas se ramifican lateralmente.
Cuando, t = tc, L = Lc, la hifa se ramifica.
max
ln
U
dLd
LK
tc
cL
c
Liga: micro macro
• El numero de ramificaciones promedio esta dado por, n = t/tc
• NP(t) = 2(t/tc)
• Pero como, tc, se puede estimar de la morfometría microscópica.
• Se puede calcular la velocidad macroscópica, m, en función de variables microscópicas.
max
ln
U
dLd
LK
tc
cL
c
dLd
LK
U
cc
L
ln
2ln2 maxm
Modelos microscópicos
Trinci (1971)
µ = Umax/LC
Larralde-Corona et al., (1997)
¿Cuál seguirá mejor los datos?
dLd
LK
U
cc
L
ln
2ln2 maxm
Comparación de modelos
Glucose mobs m1 m1/mobs m2 m2/mobs mcalc mcalc/mob
s (g L-1
) (h-1
) (h-1
) (h-1
) (h-1
)
10 0.3 0.55 1.8 0.44 1.5 0.31 1
40 0.18 0.36 1.9 0.32 1.8 0.16 0.8
70 0.2 0.46 2.3 0.35 1.8 0.2 1
120 0.19 0.45 2.4 0.46 2.4 0.2 1.1
300 0.09 0.21 2.4 0.23 2.6 0.08 0.9
Mean
ratio
2.2 ±
0.3
2.0 ±
0.5
0.97 ±
0.09
% of
error
12% 25% 9%
m1=ln2Umax/2Lav ; m2=ln2Umax/Lmax ; mcalc=Umax{Lavln(Lav/d)}-1
Modelo vs. Experimento
µcalc (microscópica) KL = LC Lav
µc Umaxln2/[Lavln(Lav/d0)] µobs = (1/X)dX/dt (macro) Umax = velocidad de extensión. Lav = longitud media d = diámetro medio Concuerda el modelo con el
experimento. 0.0 0.1 0.2 0.3
0.0
0.1
0.2
0.3
R2=0.98
5
2
3
4
1
mcalc
mobs
Aplicaciones prácticas
Se pueden medir en colonias de cajas Petri:
a) La velocidad de crecimiento, m (análisis de imágenes microscópicas).
b) La producción de la enzima, E (halos
alrededor de la colonia)
c) Se puede automatizar el método.
¿Criterios de selección de mutantes?
FENOTIPOS DE MUTANTES DE A. niger PRODUCTORAS DE PECTINASAS (Petri)
Velocidades de crecimiento
Halos de pectinasa
Loera y Viniegra-González (1998)
Interpretación de los diagramas
No hay correlación directa entre, m, y la producción enzimática, E.
Correlación inversa Si producen mucha enzima crecen más lentamente. ¿Por qué?
¿Competencia entre excreción de proteínas y formación de pared?
Conclusiones
• Se puede estimar la velocidad macroscópica,
m, calculada con la ecuación logística, de los
datos microscópicos, Umax, Lav y d.
• El análisis de imágenes de cultivos en cajas
de Petri, permite la evaluación de cepas
microbianas productoras de enzimas.
Problema 1
Según Trinci (1991) m = Umax/(Lhgu)
Lhgu = (NSLav/Np) = (Longitud Total)/(Np)
Lav → longitud media de los segmentos.
Ns y Np → número de segmentos o puntas.
Demuestre que m = ½(Umax/Lav) si 2NP >> 1
Problema 2
• Un micelio se bifurca, con segmentos de
longitud promedio igual a 500 micrones.
En matraces se observa que el tiempo de
duplicación es de 6 h.
• Use el modelo de Trinci para estimar en
cuánto tiempo se llenará una caja Petri de
9 cm de diámetro, si se siembra la colonia
por picadura central.
Problema 3
• Un hongo crece según el modelo de
Larralde (1997).
• En cajas Petri se mide que Umax = 6x10-2
cm/h; Lav = 0.05 cm y d0 = 3x10-4 cm.
• Calcule en cuánto tiempo se habrá
decuplicado la biomasa inicial.
Problema 4
• Una superficie plana de 1,000 m2 se siembra
homogéneamente, con 107 esporas.
• En cajas Petri se mide Umax = 0.47 mm/h
• Suponga que el micelio se vegetativo se
extiende en forma sincrónica.
• Calcule en cuanto tiempo, la superficie, se
cubre de colonias circulares y equidistantes,
las cuales se tocan unas con otras.