COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS AL ...

Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales

Profesor Patrocinante: Dr. Luis Humberto Vargas Chacoff Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias Universidad Austral de Chile

Profesor Co-patrocinante: Dr. Juan Pablo Pontigo Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias Universidad Austral de Chile

Profesor Informante: Dr. José Luis Varela Fuentes Departamento de Biología Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales Universidad de Cádiz

COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES ASOCIADOS AL METABOLISMO DEL CALCIO DURANTE

LA ESMOLTIFICACIÓN DE Salmo salar

Tesis de Grado presentada en colaboración con la UACh para optar al grado de Licenciado en Ciencias del Mar.

FRANCISCO JAVIER DOMÍNGUEZ MARCHÁN

VALDIVIA- CHILE

2016

Índice General

1.Resumen ................................................................................................................................. 1

2.Abstract .................................................................................................................................. 2

3. Introducción .......................................................................................................................... 3

3.1. La importancia de la acuicultura ..................................................................................... 3

3.2. Consideraciones del cultivo de salmón Atlántico (Salmo salar) ..................................... 3

3.3. Ciclo de vida. Regulación Hormonal de la Esmoltificación ............................................ 4

3.4. Relación del ión calcio con el tejido hepático y muscular ............................................... 7

3.5. Relación entre la producción hormonal y la expresión génica ........................................ 7

3.6. Hipótesis .......................................................................................................................... 8

3.7. Objetivos .......................................................................................................................... 9

3.7.1. General ...................................................................................................................... 9

3.7.2. Específico .................................................................................................................. 9

4. Materiales y Métodos ......................................................................................................... 10

4.1. Selección de genes y Diseño de Partidores (Oligonucleótidos)..................................... 10

4.2. Extracción de ARN total de Salmo salar ....................................................................... 11

A. Extracción de ARN Total en Hígado de Salmo salar ................................................ 11

B. Extracción de ARN Total en Músculo de Salmo salar .............................................. 11

4.3. Síntesis de ADNc ........................................................................................................... 12

4.4. Prueba de Partidores en PCR convencional: Gradiente de Temperatura ....................... 14

4.5. Amplificación fragmento de genes en PCR a Tiempo Real (RT-qPCR) ....................... 14

4.6. Análisis Estadístico ........................................................................................................ 15

5. Resultados ........................................................................................................................... 17

5.1. Hígado ............................................................................................................................ 17

5.2. Músculo ......................................................................................................................... 20

6. Discusión .............................................................................................................................. 23

6.1. Hormona de Crecimiento ............................................................................................... 24

6.2. Metabolismo del calcio .................................................................................................. 25

7. Conclusiones ........................................................................................................................ 29

8. Bibliografía .......................................................................................................................... 30

9. AnexoAnexo I. Determinación experimental de la temperatura óptima de funcionamiento de

oligonucleótidos (Tª de Melting) en electroforesis. .............................................................. 33

Índice de Figuras

Figura 1. Ciclo de vida del salmón Atlántico. ........................................................................... 5

Figura 2. Expresión génica relativa del precursor del receptor de la calcitonina (A), receptor

de la calcitonina (B), calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en hígado durante la

esmoltificación. ........................................................................................................................ 18

Figura 3. Expresión génica relativa de la Hormona de crecimiento (A), Hormona paratiroidea

(B), calmodulina (C) y 17β-Estradiol (D) en hígado durante la esmoltificación. .................... 19

Figura 4. Expresión génica relativa de la hormona paratiroidea (A), receptor de la calcitonina

(B), calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en músculo durante la esmoltificación.. 21

Figura 5. Expresión génica relativa de la hormona de crecimiento (A), 17β-Estradiol (B) y

calmodulina (C) en músculo durante la esmoltificación. ......................................................... 22

Figura 6. Calmodulina. ............................................................................................................ 34

Figura 7. Receptor de la Calcitonina. ...................................................................................... 34

Figura 8. Precursor del Receptor de la Calcitonina. ................................................................ 35

Figura 9. Calcitonina Isoforma. ............................................................................................... 35

Figura 10. Hormona paratiroidea. ........................................................................................... 36

Figura 11. Estaniocalcina 2 ..................................................................................................... 36

Figura 12. Hormona de Crecimiento. ...................................................................................... 37

Figura 13. Hormona 17β-Estradiol .......................................................................................... 37

Índice de Tablas

Tabla 1. Listado de Oligonucleótidos………………………………………………………..11

Tabla 2. Reactivos necesarios para la extracción de ARN. ..................................................... 12

Tabla 3. Disolución A……………..........................................................................................13

Tabla 4. Disolución B. ............................................................................................................. 13

Tabla 5. Reactivos PCR en gradiente de temperatura. ............................................................ 14

Tabla 6. Reactivos RT-qPCR. ................................................................................................. 15

Tabla 7. Perfil Térmico RT-qPCR. .......................................................................................... 15

Agradecimientos

En primer lugar, agradecer a la Universidad de Cádiz por la concesión de una Beca de

Movilidad Internacional que me ha permitido desarrollar mis estudios en la Universidad

Austral de Chile y a mi profesor, Dr. Antonio Medina, por guiarme antes de llegar a Chile.

Agradezco a mis tutores, Dr. Luis Humberto Vargas Chacoff y Dr. José Luis Varela Fuentes

por aceptarme en su grupo de trabajo, por sus consejos y su gran disposición. Al Dr. Juan

Pablo Pontigo y Julia Saravia por sus enseñanzas, pero sobre todo por tener tanta paciencia

conmigo. Por otra parte, también agradezco la ayuda de Danixa, Ricardo, Carolina y Manuel,

así como de Juan José y María José. Todos me habéis acogido como uno más en vuestro

equipo, ofreciéndome una experiencia inolvidable. Os lo agradezco de corazón.

Gracias a todos mis primos, a Daniel e Isaac por preocuparse de mi durante mi estancia y a

mis amigos Fran, Juan Carlos, Juan Luis, Mayte, José Manuel, Jennifer, José, Ana, Iván,

Daniel y Javier por apoyarme en todo momento. Agradezco a mi familia, en especial a mi

pareja Marta, a mis padres, Mª Ángeles y Salvador, y a mi abuela Isabel por haberme animado

a lograr este sueño.

Por último, dar las gracias al Proyecto INNOVA CORFO 13 IDL2-23565, al FONDAP-

INCAR No. 15110027 y al FONDECYT 1160877 por ofrecernos financiamiento, y a la

empresa Marine Harvest Chile por aportarnos los salmones de esta investigación.

Gracias a todos, sin ustedes no hubiera sido posible.

Lista de Abreviaturas

ACTH: Hormona Adenocorticotropina

ADNc: ADN complementario

CaM: Calmodulina

CT: Calcitonina

E2: 17β-Estradiol

e.g.: exempli gratia (por ejemplo)

GAPDH: Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa (EC 1.2.1.12)

GH: Hormona de Crecimiento

i.e.: id est (es decir)

IGF-1: Factor de Crecimiento Insulínico Tipo 1

OIE: Organización Mundial de Sanidad Animal

STC 2: Estaniocalcina 2

Pb: pares de bases

PTH: Hormona Paratiroidea

T: tonelada

T3: Triyodotironina (3,5,3′-Triiodo-L-tironina)

T4: Tiroxina

TSH: Hormona Estimulante del Tiroide

1

1. Resumen

Salmo salar es la especie más representativa y producida por la acuicultura de Chile. Uno de

los procesos más críticos y que requiere especial atención en el cultivo del salmón es la

esmoltificación. Por un lado, porque es el momento en el que los salmones migran de agua

dulce a agua de mar, y por otro, porque es cuando se produce las mayores mortalidades al no

determinarse con certeza el estado fisiológico de los salmones, perjudicando a la industria y al

medio ambiente. Por esto, la finalidad de este estudio fue determinar marcadores que permitan

conocer el momento exacto de la esmoltificación, mediante la variación relativa de la

expresión génica del ARN mensajero, en hígado y músculo, de hormonas que influyen en el

metabolismo del calcio: hormona de crecimiento, 17β-Estradiol, la hormona paratiroidea, la

estaniocalcina 2, la calmodulina, la calcitonina y su correspondiente receptor y precursor del

receptor, usando qPCR en tiempo real.

Los resultados determinaron que en hígado, la acción conjunta de las hormonas seleccionadas,

permitieron producir la energía y las proteínas necesarias para sobrevivir durante la

esmoltificación, usando el calcio de manera controlada, y expulsando así, el exceso al medio

extracelular. Además, estas hormonas estimularon la actividad muscular a través de la

asimilación y la utilización del calcio plasmático.

En un futuro, esta información génica apoyará en la selección de salmones fisiológicamente

preparados para el proceso de esmoltificación, favoreciendo la sustentabilidad y el desarrollo

de la industria de la salmonicultura.

2

2. Abstract

Salmo salar is the most representative and produced specie by aquaculture in Chile.

Smoltification is one of the most critical processes and it requires much special attention in

the salmon farming industry because, on the one hand, it is the moment when they migrate

from freshwater to seawater and, on the other hand, it is the time when the highest mortality

occurs. This time is difficult to determinate the physiological conditions of salmons, and it

harm industry and environment. Therefore, the purporse of this study was to determinate

markers that allowed knowing the appropiate moment to smoltification using the relative

change in gene expression of mRNA of hormones that have influence over calcium

metabolism in liver and muscle: growth hormone, estradiol-17β, parathyroid hormone,

calcitonin, stanniocalcin 2 and calmodulin, as well as calcitonin receptor precursor and

calcitonin receptor using Real Time qPCR.

In liver, the joint action of these hormones produced the neccesary energy and proteins to

survive during smoltification, using calcium ion efficiently. Thus, cells excreted unnecessary

calcium. Nevertheless, these hormones stimulated muscular activity, using plasma calcium

ion efficiently.

In the future, this genetic information could help industry to choose qualified salmons for

smoltification process, and to allow sustainable development of the salmon farming industry.

3

3. Introducción

3.1. La importancia de la acuicultura

El sector acuícola es uno de los sectores alimenticios de mayor crecimiento mundial. Su causa

principal es la generación de productos de alta calidad en nutrientes. A nivel global,

representa casi el 50% de los alimentos procedentes de animales acuáticos (OIE, 2015).

La diversificación del sector es tan alta que se puede diferenciar tanto por el ambiente de

cultivo (continental o marítimo) como por grupos de especies, producción por país,

productores e incluso por especies principales en función del tamaño de su producción (FAO,

2014b). China se clasifica como el país de mayor producción acuícola (incluyendo algas) con

un total de 58.795.275 t. Le sigue Indonesia (14.330.888 t), India (4.884.021 t) y Vietnam

(3.411.391 t) (FAO, 2014a). En relación a los países de mayor producción, los grupos de

especies más cultivadas son los peces de la familia Cyprinidae (28.225.908 t) y las algas rojas

(16.550.837 t). En concreto, la carpa herbívora (Ctenopharyngodon idellus), carpa plateada

(Hypophthalmichthys molitrix), carpa común (Cyprinus carpio) y la tilapia del Nilo

(Oreochromis niloticus) son las especies de peces más cultivadas del mundo (FAO, 2014d).

Por otra parte, es conveniente destacar la preferencia de cada país por cultivar en mayor

medida determinadas especies. Es el caso de la especie Pangasius hypophthalmus en Vietnam

(FAO, 2005), Sparus aurata en España (FAO, 2014f) y Salmo salar en Chile (FAO, 2014e).

3.2. Consideraciones del cultivo de salmón Atlántico (Salmo salar)

Salmo salares la novena especie más producida mundialmente con una cifra de 2.326.288 t

(FAO, 2014d), de las cuales Noruega produce en torno al 54,09% de la producción mundial

(1.258.356 t) y Chile un 27,7% (644.459 t) (FAO, 2014c). En Chile es el segundo producto

más exportado, después del cobre (Asociación de la Industria del Salmón de Chile A.G.,

4

2016). De esta manera, la producción mundial del salmón Atlántico está liderada por ambos

países con una producción acuícola de 81,79%.

Es evidente la necesidad de mejorar el conocimiento de la biología de la especie en cuestión.

Por un lado, para aumentar su productividad mediante la optimización en los métodos de

cultivo (e.g. alta densidad, enfermedades, calidad del alimento, tolerancia a cambios de

salinidad) (Folmar & Dickhoff, 1980) y disminuir la gran cantidad de ejemplares que mueren

o retrasan su crecimiento por ser trasladados al mar, para generar individuos “smolt” de

calidad (Vargas-chacoff et al., 2015). Por otro lado, para favorecer la sostenibilidad

ofreciendo bases para la gestión del recurso natural.

Los estudios fisiológicos han ofrecido beneficios directos a la crianza del salmón, como es la

obtención de un bioindicador del proceso de migración de agua dulce a salada: el incremento

de la actividad de la bomba Na+, K+-ATPasa en branquias (Björnsson & Bradley, 2007). Esto

ha permitido que parte de las toneladas de salmón Atlántico capturado sea abastecida por la

acuicultura, favoreciendo así, la conservación de reservas silvestres.

3.3. Ciclo de vida. Regulación Hormonal de la Esmoltificación

El salmón Atlántico (Salmo salar) es el miembro más representativo y más grande de la

familia Salmonidae. Son considerados peces anádromos, por pasar la primera parte de su ciclo

de vida en agua dulce y la mayor parte de su vida adulta en el mar, solo regresando al río en

épocas de reproducción. El tiempo que residen en el mar antes de volver al río varía de un

individuo a otro, habiéndose documentado desde uno hasta cuatro inviernos para volver al río

y reproducirse (Kennedy, 2004). A pesar de esta incertidumbre, es bien conocido que regresan

entre Mayo y Julio para desovar en los meses de Octubre y Noviembre, pasar el invierno en el

río y volver al mar en los meses comprendidos entre Abril y Junio (Folmar & Dickhoff, 1980;

5

Kennedy, 2004) junto a los nuevos reclutas, que tras dos o tres años post-eclosión, se unen al

grupo adulto para comenzar la migración (Kennedy, 2004).

Figura 1. Ciclo de vida del salmón Atlántico (Extraído y modificado de Øystein, 2011).

Este proceso de migración del salmón “parr” de un medio hipotónico (agua dulce) a un medio

hipertónico (agua salada), en el cual se conoce como salmón “smolt”, está asociado a unos

cambios morfológicos (longitud, peso y coloración), conductuales (alimentación, gregarios,

disminución velocidad de natación) y fisiológicos (hormonales, metabólicos y

osmorregulatorios) que le permite mantener la concentración iónica y un volumen de agua

estable (homeostasis). Este proceso de transformación del salmón se conoce como

“esmoltificación”, y está regulado por el aumento del fotoperíodo y la temperatura del agua

(Folmar & Dickhoff, 1980; McCormick & Björnsson, 1994; McCormick et al., 2007).

Estos cambios ambientales son percibidos como estímulos por los órganos de los sentidos del

salmón, son transformados en señales nerviosas, y posteriormente integrados y procesados por

el cerebro. A continuación, una región nuclear del cerebro conocida como hipotálamo secreta

una serie de factores hipotalámicos (de liberación o inhibición) que alcanzan la hipófisis para

regular la secreción de otras hormonas (neurohipófisis: vasotocina e isotocina; adenohipófisis:

6

hormona de crecimiento, estimulante del tiroides, prolactina) cuyo objetivo es alcanzar los

tejidos diana y generar una respuesta a los estímulos que dependerá del tipo de hormona, su

concentración y su relación con otras hormonas.

Estos tejidos dianas pueden ser órganos como las branquias, el hígado, el riñón, el músculo y

el intestino o glándulas secretoras de otras hormonas [e.g. tejido interrenal (cortisol) y

cromafin (catecolaminas), folículostiroideos (T3, T4), corpúsculos de Stannius (hipocalcina),

cuerpo últimobranquial (calcitonina), urófisis (urotensinas), timo (paratiroidea)]. A este

respecto, en el proceso de esmoltificación, la síntesis y liberación de hormona de crecimiento,

de ACTH y TSH a la circulación sanguínea, fomentará la producción de IGF-1 en el hígado,

de glucocorticoides (cortisol) en la glándula interrenal y hormonas tiroideas (T3, T4) en el

tiroides, respectivamente (Matteri et al., 2000). Estas hormonas, entre otras funciones,

provocarán el incremento en número y tamaño de las células de cloruro en branquias, así

como la actividad de la bomba Na+, K+-ATPasa en branquias, intestino y riñón, para mantener

la concentración interna de iones y aumentar la tolerancia del pez frente al incremento de la

salinidad (McCormick, 2012).

En el proceso de esmoltificación los iones más influyentes son el ión sodio (Na+), potasio

(K+), calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+), cloro (Cl-) y sulfato (SO4-). Esto es por la gran

diferencia de concentración iónica entre el agua dulce respecto a la salada, que afectará al

equilibrio osmótico del pez de tal manera que tiene que modificar sus mecanismos

osmorreguladores para mantener la homeostasis.

En concreto, los peces teleósteos, como el salmón Atlántico, poseen una concentración de

Ca2+ comprendida entre 0,1 y 10 mM (P. M. Guerreiro, 2002), siendo la concentración

intracelular la más baja (Guerreiro, 2002; Velandia et al., 2001). Sus propiedades físicas (i.e.

radio atómico y cargas positivas) permiten que sea captado por proteínas específicas

7

dependientes de él como la calmodulina (CaM), parvoalbúmina y la troponina C, mediante las

cuales la célula regula la concentración del ión, almacenándolo o expulsándolo de la célula.

En el primer caso, se utiliza para activar rutas metabólicas, liberación de neurotransmisores o

síntesis y activación de proteínas. En el segundo caso, activa proteínas como la CaM, para

regular la afinidad por el calcio de una segunda proteína de membrana conocida como

ATPasa de Calcio. Esta proteína se activa con la energía liberada por la hidrólisis del ATP,

para expulsar el ión Calcio al espacio extracelular. Sin embargo, la expulsión de calcio

también puede ocurrir cuando el sodio es impulsado al interior de la célula a favor de

gradiente electroquímico (Velandia et al., 2001).

La modulación del ión calcio es determinada por la acción de diferentes hormonas como la

hormona paratiroidea (PTH), calcitonina (CT), estaniocalcina (STC 2), calmodulina (CaM),

17β-Estradiol (E2), y por vitaminas como la D. Es importante destacar la calcitonina como

estimulador de los osteoblastos, células encargadas del desarrollo y crecimiento de la matriz

ósea de huesos y escamas mediante la deposición de calcio (Wendelaar Bonga, 1982).

3.4. Relación del ión calcio con el tejido hepático y muscular

El hígado y el músculo son tejidos que deben ser considerados en el proceso de

esmoltificación. El primero porque es un órgano potente en la generación de energía, ya que

además de otras funciones, interviene en el metabolismo de los glúcidos, los lípidos

(colesterol, triglicéridos) y las proteínas, además de almacenar el glucógeno, vitaminas

liposolubles (A, D, E, K) y el calcio. Sin embargo, el músculo es importante para este estudio

por el papel fundamental que posee el ión calcio en la contracción del mismo.

8

genes que codifican estas proteínas (McCormick, 2011). Ejemplo que destaca este hecho es el

aumento de la concentración de hormona de crecimiento (GH) en el plasma sanguíneo de

salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) transgénico, debido a la sobreexpresión del gen que

codifica GH (Raven et al., 2008).

La expresión de genes que codifican para unas determinadas proteínas, incluidas las

hormonas, es específica de la función de las células que conforman el tejido (Devlin, 2004).

De esta forma, en glándulas como la tiroidea se expresará en mayor medida, cuando sea

necesario, la región del ADN que codifique la hormona T3 y T4. Sin embargo, la prolactina,

hormona encargada de mantener el balance iónico durante la aclimatación a agua dulce, se

expresa principalmente en la hipófisis, pero se ha demostrado que también en los demás

órganos, variando según la especie (Manzon, 2002). En cambio, los genes constitutivos, como

el gen codificante de la GAPDH, albúmina, actina, tubulina, L32, 28S y 18S, se expresan en

la totalidad de las células nucleadas debido a que su información es esencial para la

supervivencia de la misma (e.g. funciones estructurales, reguladoras) (Thellin et al., 1999).

3.6. Hipótesis

Variaciones fisiológicas de Salmo salar durante la esmoltificación generará cambios en la

expresión génica de las hormonas relacionadas con el metabolismo del calcio.

3.5. Relación entre la producción hormonal y la expresión génica

La posibilidad de producir hormonas, así como de aumentar o disminuir su concentración, y

por tanto, sus efectos en el organismo durante la esmoltificación, radica en la expresión de los

9

3.7.2. Específico

-Desarrollar la técnica de PCR y RT-PCR, desde la extracción hasta la cuantificación

de los genes.

-Identificar y diseñar oligonucleótidos claves para el proceso de esmoltificación de

Salmo salar.

-Caracterizar y validar la eficacia de los oligonucleótidos de genes del metabolismo

del calcio en hígado y músculo.

-Evaluar la expresión de genes influyentes en la aclimatación durante la

esmoltificación.

3.7. Objetivos

3.7.1. General

Determinar la variación relativa de la expresión génica en hígado y músculo del ARN

mensajero de hormonas que influyen en el metabolismo del calcio de Salmo salar para

determinar genes claves en el proceso de esmoltificación.

10

4. Materiales y Métodos

En el presente estudio se realizaron 2 muestreos de salmones Atlántico (Salmo salar,

Linnaeus, 1758) en la piscicultura Calabozo, perteneciente a la empresa Marine Harvest,

Chile. El muestreo 1 se corresponde con salmones en fase parr, mientras que el muestreo 2

con salmones en fase smolt. En cada muestreo se sacrificaron 20 salmones con sobredosis de

anestesia (1 mL/L 2-fenoxietanol, Fluka-77699-500ML), a los cuales se les extrajo una

porción de hígado y de músculo. Las 40 muestras de hígado y las 40 de músculo se guardaron

en tubos de microcentrifuga de 1,5 mL para su análisis molecular. Se conservaron

temporalmente en nitrógeno líquido para su transporte, y posteriormente se almacenaron a -80

ºC hasta su análisis.

4.1. Selección de genes y Diseño de Partidores (Oligonucleótidos)

El siguiente paso fue seleccionar en bancos de genes (GenBank), los genes de Salmo salar

relacionados con la modificación de la osmorregulación durante la esmoltificación y en

concreto con el metabolismo del calcio, que sirvan como marcadores del proceso de

esmoltificación. Los genes seleccionados fueron los que codifican la información para la

Calcitonina Isoforma, Receptor de la Calcitonina, Precursor del Receptor de la Calcitonina,

Calmodulina, Hormona Paratiroidea, Estaniocalcina, Hormona de Crecimiento y 17β-

Estradiol.

Los genes se analizaron en el programa "AmplifX", dónde se diseñaron oligonucleótidos de

18 a 22 pb para generar un transcrito de 100-150 pb para cada gen, con el requisito de que

contengan entre 40-60% de de las bases nucleotídicas "C" y "G".

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Tabla 1. Listado de Oligonucleótidos. La Tª de Melting es teórica. Nombre Forward Reverse TªMelting(ºC) Tamañ

o (pb)

Calmodulina GCACAGATAATCAGCCCACATCCA GCCGTCACCATCCTTGTCGAATAA 54 108 Receptor

Calcitonina TGTCGTGGTAGACGTTCTGGGTAT GCCAGGATGGATGCTAAAGGCATA 55 130

Precursor Receptor

Calcitonina

CTCCATAATGGGCTGAGTACCTGT CAACTAAACGGCTGTGGCCAAA 53 122

Calcitonina Isoforma

TGTCCCAGGACCTGCACAAATTAC GCGGAGGGTTAGATGCTGTCAAA 57 139

Hormona Paratiroidea

CCCAGTGTCTTGTGTCCTCTGTAA CTGAAGGTGGTCACCAAGAGGAAA 55 147

Estaniocalcina 2

TACCTACGGGTCTTCGCAGATA CTCTGACGGGTTGTCATGAACATC 53 129

Hormona de Crecimiento

CCATTAGGCTGTTGGAGATGGTCA TCTGTAACTCGGACTCCATCGTGA 55 147

17β-Estradiol CCTGCAGACCGATGGTTGTCA AAGGGAATCATTGTCCAGAGCGTG 56 133

4.2. Extracción de ARN total de Salmo salar

A. Extracción de ARN Total en Hígado de Salmo salar

Las muestras de hígado se homogeneizaron mediante el homogeneizador Pellet Pestle ®

Kontes. Se utilizó el Total ARN Mini Kit (Geneaid) para extraer el ARN Total, que se

conservó a -80ºC para su posterior utilización.

B. Extracción de ARN Total en Músculo de Salmo salar

La alta cantidad de grasa que contenían las muestras de músculo impedía extraer el ARN

Total mediante el método anteriormente comentado.Por tanto, se recurrió a realizar la

extracción usando Trizol y esferas de Zirconio/Silíceo de 0,1 y 1 mm de diámetro. Se utilizó

un Minibeadbeater (3450 oscilaciones/min) durante 40 segundos para moler y homogenizar el

tejido con Trizol. Después de seguir el protocolo especificado en la Tabla 2, se continuó la

extracción con elTotal ARN Mini Kit (Geneaid) a partir de la etapa correspondiente.

12

Tabla 2. Reactivos necesarios para la extracción de ARN.

El volumen de Etanol 70%depende del volumen de

solución sobrenadante que contiene ARN.

Reactivo Volumen (µL)

Trizol 500 Cloroformo 200 Etanol 70% 200-400

El siguiente paso, consistió para ambos tejidos, en asegurar la calidad del ARN Total

contenido en las muestras. Se midió la concentración de cada muestra en un

espectrofotómetro del tipo MaestroNano y NanoDropThermoScientific, que ofrecen las

concentraciones de ARN Total en ng/µL y las relaciones 260/280 y 260/230. Estas relaciones

permiten determinar si la muestra está contaminada por exceso de proteínas, presencia de

fenoles u otros contaminantes, que absorben cerca de 280 o 230 nm, respectivamente (T009-

Technical Bulletin Nanodrop). Si ambas relaciones poseen un valor cercano a 2,0 o superior,

se acepta que la muestra contiene ARN “puro”.

A su vez, se realizó otros métodos como electroforesis y Bioanalyzer a determinadas muestras

mediante una selección al azar, para asegurar la existencia de ARN en las mismas. La

electroforesis se llevo a cabo en un gel de agarosa al 1,5% en tampón TAE 1X.

4.3. Síntesis de ADNc

La retrotranscipción consiste en la construcción de ADN a partir de ARN mediante el uso de

una retrotranscriptasa, en concreto, la M-MLV (MoloneyMurineLeukemia Virus).

En el primer paso, se realiza una esterilización ultravioleta por 15 minutos a todos los

materiales que se van a usar pipetas y puntas de pipeta (0,5-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL),

13

microplaca para PCR, film transparente, tubos de microcentrifuga (0,2 µL, 0,7 µL, 1,5 µL),

guantes de Nitrilo y agua destilada libre de ARNasa y ADNasa.

A continuación, se preparó la disolución A con Oligo DT y agua libre de nucleasas (Tabla 3).

El Oligo DT contiene ADN sintético compuesto por 15 nucleótidos con base de timina. Estos

nucleótidos se utilizan como “primer” universal en el proceso de retrotranscripción, ya que

son complementarios a la terminación poliadenilada presente en el ARNm de eucariotas

(Boletín Técnico #071).

Después de mezclar la disolución en un Agitador Vórtice ZX3, se añadió 8 µL de disolución a

cada pocillo. A estos se le añadió 2 µL de la muestra de ARN correspondiente. La placa

cubierta previamente con un film transparente, se introduce en el termociclador a 65ºC por 5

minutos. Esta operación se repite para cada uno de los tejidos y estadios.

Tabla 3. Disolución A. Reactivo Volumen 1x (µL)

Oligo DT 1 Agua libre de nucleasas 7

ARN 2

En el siguiente paso, se prepara la disolución B (Tabla 4) para añadirle 14 µL a cada muestra

y comenzar el proceso de síntesis de ADNc mediante una incubación de 1 hora a 42ºC.

Posteriormente, se mantuvo las muestras a 4 ºC de forma indefinida.

Tabla 4. Disolución B. Reactivo Volumen 1x (µL)

5x Buffer 5

dNTPs mix 10 µM 1,25

ARNasaout 40 U/µL 0,5

M-MLV 0,5

Agua libre de nucleasas 7

14

Se comprobó la calidad del ADNc mediante electroforesis (ver detalle más arriba).

4.4. Prueba de Partidores en PCR convencional: Gradiente de Temperatura

Para obtener la temperatura óptima a la que el oligonucleótido elegido se aparea con la región

complementaria del ADNc sintetizado anteriormente, se realizó una PCR en gradiente de

temperatura partiendo desde los 50ºC a 65ºC para cada uno de los partidores (ANEXO I).

Cada PCR en gradiente de temperatura constaba de 40 ciclos y una duración de 2 horas y 38

minutos. Las muestras que se utilizaron fueron elegidas al azar.

El resultado de la amplificación fue visualizado a través de electroforesis (Anexo I), mediante

la cual se puede observar cualitativamente la cantidad y la especificidad del partidor por

determinadas temperaturas.

Tabla 5. Reactivos PCR en gradiente de temperatura.

Reactivo Volumen 1x (µL)

GoTaq 10

Oligo (Forward y Reverse) 1

Agua libre de nucleasas 7

ADNc 2

Conocida la temperatura óptima de funcionamiento de los partidores, se procede a realizar

PCR en Tiempo Real.

4.5. Amplificación fragmento de genes en PCR a Tiempo Real (RT-qPCR)

Para cada tipo de oligonucleótido, incluyendo el del gen 18S se realizó una RT-qPCR en un

termociclador del tipo Mx3000P. A su vez, se ordenó por estadio del pez (“parr” y “smolt”) y

tejido. Cada una de las muestras se preparó por triplicado, para disminuir el error técnico y

humano. Los reactivos utilizados se muestran en la Tabla 6.

15

Tabla 6. Reactivos RT-qPCR. Reactivos Volumen 1x (µL)

2x Brilliant II Syber Green 6

Oligo 1,08

Agua libre de nucleasas 4,92

Se optimizó el proceso de amplificación utilizando varios perfiles térmicos. Sabiendo que los

fragmentos generados son pequeños y que van entre los 100 y 150 pb, se aplicó las etapas de

la Tabla 7, ya que ofrecía una amplificación más eficiente.

Tabla 7. Perfil Térmico RT-qPCR. Etapa Función Temperatura (ºC) Ciclos Tiempo

1 -Desnaturalización ADNc -Activación GoTaq 95 1 10´

2 -Desnaturalización 95

40 30´´

-Alineamiento -Extensión 50-65

1´

3 -Extensión fragmentos rezagados 72 1 4´

4 -Elaboración de la curva de melting 95

1

10´´

25 10´´

70 1´´

4.6. Análisis Estadístico

Los valores de CT obtenidos tras la amplificación de los fragmentos en los genes son

transformados en ΔCT (CT,Gen – C T,18s) y posteriormente en ΔΔCT (ΔCT - ΔCT,parr) según el

método propuesto por Livak & Schmittgen (2001).

Una vez comprobada la aleatoriedad, la normalidad y la homocedasticidad de los datos por

grupos, se evaluaron los ΔCT estadísticamente mediante el test de Welch (n=40) para datos no

homocedásticos, ANOVA de un factor (n=40) para los resultados que cumplían los tres

estadígrafos y el test de Kruskal-Wallis para los resultados no paramétricos. La significancia

16

se determinaba con un p≤0,05. Para obtener los resultados gráficos se utilizaron los valores de

2-ΔΔCT (veces de cambio) y sus correspondientes errores estándar (límite inferior-límite

superior).

17

5. Resultados

5.1. Hígado

En hígado, la abundancia relativa del transcrito del precursor del receptor de la calcitonina

(2A) aumentó 3,14 (2,54-3,89) veces en la fase smolt respecto al parr. A pesar de esto, no

presentó diferencias estadísticamente significativas (p=0,325). En cambio, sí presentó

diferencias estadísticamente significativas la abundancia relativa del transcrito del receptor de

la calcitonina (2B) con una expresión 2,06 (1,71-2,48) veces mayor (p=0,0016). Asimismo, la

calcitonina isoforma (2C) presentó diferencias estadísticamente significativas (p=0,0083) y un

aumento de 1,38 (1,16-1,63) veces. En el mismo caso, se encuentra la hormona de

crecimiento (3A), que se sobreexpresó 7,66 (5,69-10,32) veces con diferencias

estadísticamente significativas (p= 7,597·10-5). Del mismo modo, la calmodulina (3C) ofrece

una sobreexpresión de 5,13 (3,98-6,62) veces y diferencias significativas con un p=5,987·10-5.

La hormona paratioridea (3B) y la 17β-Estradiol (3D) presentaron una sobreexpresión con

valores de 5,04 (4,09-6,22) y 2,08 (1,75-2,48) veces, respectivamente, y ambas fueron

estadísticamente significativas con un p igual a 1,489·10-6 para la primera y 8,362·10-4 para la

segunda.

Sin embargo, la estaniocalcina 2 (2D) se expresó 0,84 (0,64-1,05) veces menos en el estadio

smolt, pero sin diferencias significativas (p=0,7408).

18

A B

C D

Parr Smolt

Est

anio

calc

ina

2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Figura 2. Expresión génica relativa del precursor del receptor de la calcitonina (A), receptor de la

calcitonina (B), calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en hígado durante la esmoltificación.

Estandarización del estadio smolt frente al parr. La expresión génica relativa de cada hormona o receptor

smolt está estandarizada respecto a su expresión en el estadio parr. La abundancia relativa de los ARN

mensajeros se obtuvieron con el método de Livak & Schmittgen (2001). El análisis estadístico que se realizó

para la calcitonina isoforma (C) y la estaniocalcina 2 (D) es el Test de Welch, mientras que para el precursor del

receptor (A) y el receptor de la calcitonina (B) se realizó un ANOVA. La significancia, representada con un

asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados (límites superiores) presentan

diferencia a los inferiores.

Parr Smolt

Pre

curs

or R

ecep

tor

Cal

cito

nin

a

0

1

2

3

4

5

Parr Smolt

Rec

epto

r C

alci

ton

ina

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

*

Parr Smolt

Cal

cito

nin

a Is

ofor

ma

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

*

19

A B

C D

Figura 3. Expresión génica relativa de la Hormona de crecimiento (A), Hormona paratiroidea (B),

calmodulina (C) y 17β-Estradiol (D) en hígado durante la esmoltificación. Estandarización del estadio

smolt frente al parr. La expresión génica relativa de cada hormona o receptor smolt está estandarizada respecto

a su expresión en el estadio parr. La expresión de los ARN mensajeros se obtuvieron con el método de Livak &

Schmittgen (2001). El análisis estadístico que se realizó para las 4 hormonas (A, B, C y D) es el Test de Welch.

La significancia, representada con un asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados

(límites superiores) presentan diferencia a los inferiores.

Parr Smolt

Hor

mon

a C

reci

mie

nto

0

2

4

6

8

10

12

*

Parr Smolt

Hor

mon

a P

arat

iroi

dea

0

1

2

3

4

5

6

7

*

Parr Smolt

Cal

mod

uli

na

0

1

2

3

4

5

6

7 *

Parr Smolt

17B

-Est

rad

iol

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

*

20

5.2. Músculo

En músculo, el único gen que se sobreexpresó en el estadio smolt presentando diferencias

significativas (p=0,0123) fue el que codificante de la calmodulina (5C). Su abundancia

relativa fue 1,85 (1,41-2,42) veces mayor. Un caso particular fue la ausencia de expresión del

gen codificante para el precursor del receptor de la calcitonina.

En cambio, los demás genes se subexpresaron. La expresión del gen codificante de la

hormona paratiroidea (4A) fue 0,35 (0,26-0,47) veces menor y presentaba diferencias

significativas con un p=4,68·10-3. El receptor de la calcitonina (4B) se expresaba 0,18 (0,13-

0,24) veces menos en los peces smolt, con diferencias significativas (p=1,91·10-4) respecto a

los peces parr. La calcitonina isoforma (4C) poseía una subexpresión 0,37 (0,28-0,50) veces

menor, y también se demostró diferencias significativas (p=5,81·10-3) entre ambos estadios.

La estaniocalcina 2 (4D) se expresaba 0,45 (0,34-0,60) veces menos en el estadio smolt, con

diferencias significativas (p=0,0228). La hormona de crecimiento (5A) se expresaba 0,06

(0,04-0,07) veces menos en el estadio smolt, y también presentaba diferencias

estadísticamente significativas (p=3,61·10-6). Sin embargo, la expresión de 17β-estradiol (5B)

fue 0,82 (0,63-1,06) veces menor en el estadio smolt, pero no presentaba diferencias

significativas (p=0,6654).

21

A B

C D

Figura 4. Expresión génica relativa de la hormona paratiroidea (A), receptor de la calcitonina (B),

calcitonina isoforma (C) y estaniocalcina 2 (D) en músculo durante la esmoltificación. Estandarización del

estadio smolt frente al parr. La expresión génica relativa de cada hormona o receptor smolt está estandarizada

respecto a su expresión en el estadio parr. La expresión de los ARN mensajeros se obtuvieron con el método de

Livak & Schmittgen (2001). El análisis estadístico que se realizó para el caso A, B, C y D fue un ANOVA de un

factor, ya que cumplían los criterios de aleatoriedad, normalidad y homocedasticidad. La significancia,

representada con un asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados (límites

superiores) presentan diferencia a los inferiores.

Parr Smolt

Hor

mon

a P

arat

iroi

dea

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

*

Parr Smolt

Rec

epto

r C

alci

ton

ina

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

*

Parr Smolt

Cal

cito

nin

a Is

ofor

ma

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

*

*

Parr Smolt

Est

anio

calc

ina

2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

*

22

A

Parr Smolt

Hor

mon

a C

reci

mie

nto

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

*

B

Parr Smolt

17B

-Est

rad

iol

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

C

Figura 5. Expresión génica relativa de la hormona de crecimiento (A), 17β-Estradiol (B) y calmodulina (C)

en músculo durante la esmoltificación. Estandarización del estadio smolt frente al parr. La expresión

génica relativa de cada hormona o receptor smolt está estandarizada respecto a su expresión en el estadio

parr. La expresión de los ARN mensajeros se obtuvieron con el método de Livak & Schmittgen (2001). El

análisis estadístico que se realizó para la hormona A fue el Test de Kruskal Wallis debido a su falta de

normalidad, test de Welch para la hormona B y es el Test de Welch y un ANOVA de un factor para la C. La

significancia, representada con un asterisco, se determinó para un p≤0,05. Los errores estándar representados

(límites superiores) presentan diferencia a los inferiores.

Parr Smolt

Cal

mod

ulin

a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

*

23

6. Discusión

En el presente trabajo se evaluó la expresión de genes relacionados con el metabolismo del

calcio durante la esmoltificación de Salmo salar. Los registros bibliográficos (e.g. Wendelaar

Bonga, 1982; Wagner et al., 1998; Guerreiro, 2002) permitieron determinar los genes que

influían, tanto directa como indirectamente, en el control del metabolismo del ión calcio.

Entre otros genes, encontramos la calmodulina, el precursor del receptor de la calcitonina, el

receptor de la calcitonina, la calcitonina, la estaniocalcina 2, la hormona de crecimiento, la

hormona paratiroidea y el 17β-Estradiol. Es de gran importancia conocer la variación de la

expresión génica de estos genes durante la esmoltificación, porque permitirán entender los

mecanismos fisiológicos que ocurren durante la misma, y en especial, los mecanismos

osmorreguladores de la concentración iónica de calcio y del balance hidrológico del

organismo. Con esta finalidad, se escogieron 2 tejidos, siendo uno de ellos el hígado, esto

debido a la relación existente entre el calcio y el aporte de energía (e.g. glucólisis,

fosforilación oxidativa) en momentos cruciales de supervivencia y como segundo tejido el

músculo, debido a que la contracción muscular sería imposible sin iones calcio.

En la actualidad, se utiliza la actividad de la bomba N⁺, K⁺-ATPasa branquial como indicador

de que los salmónidos están preparados para el traspaso al agua salada, es decir, son los

llamados “smolt”. Sin embargo, la alta tasa de mortalidad que produce en la industria acuícola

este cambio de ambiente desde agua dulce al agua de mar, hace necesario conocer otros

indicadores más específicos, que ayuden a una mejor toma de decisiones. La variación de la

expresión de genes que regulan el metabolismo del calcio, incluyendo la osmorregulación del

mismo, podrían determinar el momento exacto en el que los salmones estarían

fisiológicamente preparados para la esmoltificación. Por todo esto, la importancia de esta

investigación radica en la posibilidad de otorgar otros marcadores para así conocer el

24

momento más exacto donde el proceso de esmoltificación se esté llevando a cabo con éxito y

con esto, desarrollar una producción de Salmo salar más eficiente y sustentable.

6.1. Hormona de Crecimiento

En la transformación parr-smolt se produce un incremento de la producción de la hormona de

crecimiento para incrementar la tolerancia a la salinidad (McCormick, 2011), además de

estimular el crecimiento somático para poder hacer frente a los grandes cambios osmóticos y

generar glucosa partir de la ruptura del glucógeno (Glucogenolisis) almacenado en el hígado

(Björnsson, 1997). Esto se refleja en el aumento de la expresión de la hormona de crecimiento

(Figura 3A) en el hígado, que induce la producción local de los factores de crecimiento

insulínico tipo 1 (IGF-1). La liberación de IGF-1 al torrente sanguíneo le permite alcanzar las

branquias como tejido diana y así estimular la excreción de iones como cloro y sodio, esto

debido al aumento del tamaño de las células de cloruro y la actividad de la bomba N⁺, K⁺-

ATPasa (McCormick, 2011). Sin embargo, en músculo la expresión de GH es

significativamente menor en la fase smolt (Figura 5A). Esto podría deberse a que en la

transformación parr-smolt, el salmón necesita demandar más cantidad de GH en el tejido

hepático y obtener la energía suficiente para sobrevivir durante el proceso de aclimatación al

agua salada.

En relación a esto, Foster et al. (1991) demostraron la estimulación de síntesis de proteínas en

hígado y la disminución de la concentración de proteínas del músculo blanco, debido al

suministro de GH a ejemplares de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss). Según Björnsson

(1997), esto puede ser porque la redistribución de proteínas musculares a otros órganos,

provee la base para que la GH fomente el rápido crecimiento de dicho órgano. Mientras tanto,

en músculo estas proteínas son reemplazadas por agua hasta que el pez tenga suficiente

proteínas para reponer los músculos.

25

Por tanto, puede que los salmones tengan un mecanismo por el cual evitan degradar proteínas

musculares esenciales para alcanzar el agua salada, sobretodo del músculo blanco, cuya

característica es la contracción rápida.

6.2. Metabolismo del calcio

La calcitonina (CT), la estaniocalcina 2 (STC2) y la hormona paratiroidea (PTH), junto con la

vitamina D3 parecen ser las principales hormonas reguladoras de la circulación extracelular

de calcio, así como el consumo, la excreción y la movilización de calcio de los huesos

(Guerreiro, 2002). Por un lado, la sobreexpresión de la CT (Figura 2C) permite al pez

mantener los niveles internos de calcio, debido a que esta hormona estimula la actividad de

los osteoblastos para formar huesos y escamas previniendo la liberación de iones calcio, y la

excreción de calcio en el intestino y en el riñón (Guerreiro, 2002). De esta forma, impide que

se genere un exceso de calcio en el plasma sanguíneo. Así, es de esperar que aumente la

expresión del precursor del receptor y del propio receptor de la CT en hígado (Figura 2A y

2B), ya que permite captar y activar las células objetivo de la calcitonina. Por el contrario, en

el músculo la ausencia de expresión del precursor del receptor de la CT y la disminución

significativa de la expresión del gen que codifica para el receptor y la CT, puede deberse a

que durante la esmoltificación, el músculo requiere iones calcio disponibles para realizar la

contracción muscular.

Se podría suponer que durante la esmoltificación, el calcio que obtienen las fibras musculares

procede de la circulación sanguínea y esta a su vez del medio externo (agua y dieta). De esta

manera, el consumo de calcio por parte del tejido muscular y el control del ión por la CT,

disminuye la concentración de calcio sanguíneo en el agua salada, manteniendo así la

homeostasis. Además, es por esta razón que los niveles de STC2, hormona que disminuye la

absorción y el transporte de calcio en las branquias y en el intestino ( Wagner et al., 1998;

26

Guerreiro, 2002), está subexpresada tanto en hígado como en músculo (Figura 2D y 4D), ya

que según lo informado por Wagner et al. (1998), una mayor cantidad de calcio, induce la

generación de STC2, con lo que al bajar los niveles de calcio, disminuirán los de STC2.

En concreto, que la expresión del gen que codifica para la STC2 sea estadísticamente

significativa en el tejido muscular, debe ser porque es de vital importancia la obtención de

calcio en este tejido, y una menor expresión de STC2 permitirá la entrada de calcio al tejido

muscular. Además, la diferencia de expresión relativa entre parr y smolt debe ser mayor en

músculo que en hígado, como demuestra la Figura 2D y 4D, debido a que en agua dulce el

salmón necesita más cantidad de calcio en el músculo para hacer frente a las fuertes corrientes

e incrementar la contracción muscular.

Por otro lado, la PTH es una hormona que es secretada por la glándula paratiroidea a la

sangre, para restaurar los niveles de calcio cuando estos poseen una concentración inferior a la

habitual o al rango fisiológico necesario. Para ello, realiza una serie de funciones como,

inducir la liberación de calcio de los huesos activando los osteoclastos, aumentando la

reabsorción de calcio en el intestino y en el riñón y así evitar la pérdida del ión a través de la

orina (Guerreiro et al., 2007). Debido a esto, su producción debe disminuir en peces

adaptados al agua de mar. Sin embargo, se encuentra un aumento significativo de la expresión

génica de PTH en el hígado (Figura 3B) y una disminución significativa en el tejido muscular

(Figura 4A). Para entender esto, hay que entender el funcionamiento de la hormona 17β-

Estradiol (E2). Esta hormona aumenta la producción de vitelogenina en hígado para la

formación de los ovocitos, pero también incrementa hasta 2,5 veces los niveles del ión calcio

en plasma y hasta 10 veces el calcio total (Guerreiro, 2002). El aumento significativo que

presenta la expresión génica de la hormona E2 (Figura 3D), indica que los niveles de calcio en

el tejido hepático deben incrementar. Ahora bien, como afirma Fuentes et al. (2007) el

27

incremento de E2 produce un efecto hipercalcémico que se ve menguado por la presencia de la

PTH, estabilizando el balance de calcio en el pez. Para ello, la PTH podría estar liberando los

iones calcio del citoplasma celular, que a su vez son captados por la calcitonina a nivel renal o

directamente utilizados para la formación de los huesos y las escamas durante el crecimiento

asociado a la esmoltificación.

De esta manera, la acumulación del ión calcio intracelular gracias a la E2, la PTH y la GH

(comentado arriba) permite a hormonas como la CaM (Figura 3C), hormona que forman un

complejo Ca2+-CaM (Carter & Török, 2002), activar rutas metabólicas como la glucólisis (i.e.

rotura de las moléculas de glucosa para obtener energía en forma de ATP), fosforilación

oxidativa (i.e. formación de energía en forma de ATP), lipólisis (i.e. consumo de los ácidos

grasos de reserva o triglicéridos) y la glucogenolisis (i.e. transformación de glucógeno en

glucosa) para la obtención de energía, así como favorecer la síntesis y la activación de

proteínas, como es el caso de la bomba ATPasa de Calcio (Velandia et al., 2001).

Como explica Somlyo et al. (1985) el retículo endoplasmático y las mitocondrias son los

orgánulos hepáticos más importantes en la regulación de calcio citoplasmático, ya que en el

primero se produce procesos tan importantes como la síntesis de proteínas y en el segundo la

fosforilación oxidativa. Ahora bien, conforme a los resultados de este estudio, Velandia et al.

(2001) confirma que la activación de la ATPasa de Calcio por el complejo Ca2+-CaM genera

la entrada en contra de gradiente electroquímico de iones calcio al interior de los orgánulos

como el retículo endoplasmático rugoso y liso.

Por otra parte, la hormona E2 no presenta variaciones significativas (Figura 5B) en el tejido

muscular, mientras que la PTH disminuye significativamente (Figura 4A). Esto quiere decir

que las células musculares no demandan más cantidad de calcio, sino que es suficiente con el

calcio incorporado del medio ambiente (agua y dieta). En relación a esto, una sobreexpresión

28

significativa de CaM (Figura 5C) podría indicar el aumento de la actividad de las proteínas

musculares (Velandia et al., 2001).

29

7. Conclusiones

Las variaciones fisiológicas de Salmo salar durante la esmoltificación generan

cambios de expresión de las hormonas que regulan el metabolismo del calcio, tanto en

hígado como en músculo, por lo que se acepta nuestra hipótesis.

En hígado, la acción conjunta de la hormona de crecimiento, 17β-Estradiol, la

hormona paratiroidea, la calcitonina y la estaniocalcina 2 permiten consumir, de

manera controlada, el calcio celular para activar rutas metabólicas que ofrezcan la

energía y síntesis proteica necesaria para hacer frente al proceso de esmoltificación.

Además de expulsar el exceso de calcio del citosol y mantener la homeostasis.

En músculo, la disminución de la calcitonina, la estaniocalcina 2 y la hormona

paratiroidea, facilita la asimilación y utilización del ión calcio por parte de las células

musculares, favoreciendo la formación del complejo Ca2+-CaM que a su vez estimula

la actividad de proteínas musculares.

En el futuro, el conocimiento de esta de la variación de la expresión génica de genes

que regulan el metabolismo del calcio, y que por tanto, beneficia el proceso de la

osmorregulación durante la esmoltificación, ofrecerá apoyo en la selección de

salmones fisiológicamente preparados para el paso a agua salada, disminuyendo la

gran mortalidad ejemplares cultivados y favoreciendo el desarrollo sustentable de la

salmonicultura.

30

8. Bibliografía

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34

9. ANEXO

Anexo I. Determinación experimental de la temperatura óptima de funcionamiento

de oligonucleótidos (Tª de Melting) en electroforesis.

Figura 6. Calmodulina. PCR en gradiente para

determinar la temperatura óptima de los

oligonucleótidos de la calmodulina.

La temperatura elegida fue 63,8ºC.

Figura 7. Receptor de la Calcitonina. PCR en

gradiente para determinar la temperatura óptima

de los oligonucleótidos del receptor de la

calcitonina. La temperatura elegida fue 63,8ºC.

Ladder Temperatura (ºC) 100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50


35

Figura 8. Precursor del Receptor de la Calcitonina.

PCR en gradiente para determinar la temperatura

óptima de los oligonucleótidos del precursor del

receptor de la calcitonina. La temperatura elegida

fue 63,8ºC.

Figura 9. Calcitonina Isoforma. PCR en gradiente

para determinar la temperatura óptima de los

oligonucleótidos de la calcitonina isoforma.




36

Figura 10. Hormona paratiroidea. PCR en


de los oligonucleótidos de la hormona paratiroidea.

La temperatura elegida fue 62ºC.

Figura 11. Estaniocalcina 2. PCR en gradiente

para determinar la temperatura óptima de los

oligonucleótidos de la estaniocalcina 2.




37

Figura 12. Hormona de Crecimiento. PCR en

gradiente para determinar la temperatura

óptima de los oligonucleótidos de

la hormona de crecimiento. La

temperatura elegida fue 51ºC.

Figura 13. Hormona 17β-Estradiol. PCR en


de los oligonucleótidos de la hormona 17β-Estradiol.

La temperatura elegida fue 51ºC.

Ladder Temperatura (ºC)100 pb 65 63,8 62 59,1 55,7 52,9 51 50


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