Proyecto: Comparación de la producción de hortalizas en 3 diferentes tipos de suelo
Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS ...
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Universidad de La Salle Universidad de La Salle Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería 1-1-2011 Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS a Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS a partir de lactosuero en polvo y lactosa en polvo usando partir de lactosuero en polvo y lactosa en polvo usando Aspergillus oryzae y enzima B galactosidasa libre Aspergillus oryzae y enzima B galactosidasa libre Natalia Avella Hurtado Universidad de La Salle, Bogotá Nelly Constanza Solano Mojica Universidad de La Salle, Bogotá Follow this and additional works at: https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos Citación recomendada Citación recomendada Avella Hurtado, N., & Solano Mojica, N. C. (2011). Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS a partir de lactosuero en polvo y lactosa en polvo usando Aspergillus oryzae y enzima B galactosidasa libre. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos/331 This Trabajo de grado - Pregrado is brought to you for free and open access by the Facultad de Ingeniería at Ciencia Unisalle. It has been accepted for inclusion in Ingeniería de Alimentos by an authorized administrator of Ciencia Unisalle. For more information, please contact [email protected].
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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería
1-1-2011
Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS a Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS a
partir de lactosuero en polvo y lactosa en polvo usando partir de lactosuero en polvo y lactosa en polvo usando
Aspergillus oryzae y enzima B galactosidasa libre Aspergillus oryzae y enzima B galactosidasa libre
Natalia Avella Hurtado Universidad de La Salle, Bogotá
Nelly Constanza Solano Mojica Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Avella Hurtado, N., & Solano Mojica, N. C. (2011). Comparación de la producción de galactooligosacáridos GOS a partir de lactosuero en polvo y lactosa en polvo usando Aspergillus oryzae y enzima B galactosidasa libre. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos/331
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COMPARACION DE LA PRODUCCION DE GALACTOOLIGOSACARIDOS (GOS) A
PARTIR DE LACTOSUERO EN POLVO Y LACTOSA EN POLVO USANDO Aspergillus
oryzae Y ENZIMA β-GALACTOSIDASA LIBRE.
NATALIA AVELLA HURTADO
NELLY CONSTANZA SOLANO MOJICA
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERÍA-INGENIERÍA DE ALIMENTOS
BOGOTÁ
2011
COMPARACION DE LA PRODUCCION DE GALACTOOLIGOSACARIDOS (GOS) A
PARTIR DE LACTOSUERO EN POLVO Y LACTOSA EN POLVO USANDO Aspergillus
oryzae Y ENZIMA β-GALACTOSIDASA LIBRE.
NATALIA AVELLA HURTADO
NELLY CONSTANZA SOLANO MOJICA
Trabajo de grado para optar por el título de Ingeniera de
Alimentos
Dirigido por:
GERMAN ANDRES CASTRO
Ingeniero Químico
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA INGENIERÍA DE ALIMENTOS
BOGOTÁ DC
2011
Nota de aceptación:
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
__________________________
Alfredo López Molinelo
Jurado
__________________________
Lena Prieto Contreras
Jurado
Bogotá, Enero 24 de 2011
DEDICATORIAS
A Dios todo poderoso infinitas gracias por el don de la vida y las capacidades que me han llevado hasta este objetivo.
A la Virgen y Juan C por darme la fortaleza de levantarme y siempre seguir. A mis padres por el apoyo y confianza que siempre han depositado en mí.
A mis profesores y formadores porque su siembra da frutos. A mis compañeros porque con su ayuda se lograron éxitos.
A mi abuelo y demás familiares por el respaldo que me ofrecieron. A todos muchas gracias y en su honor dedico este trabajo.
Natalia Avella Hurtado
Doy gracias a Dios por la sabiduría y el conocimiento que me dio y que hoy hace posible alcanzar este logro.
A mis padres y hermanos por su apoyo incondicional que me permitió seguir adelante. A mis compañeros, ya que con trabajo en equipo se facilita el camino.
A todos aquellos que hicieron parte de esta etapa agradezco y dedico este trabajo.
Nelly Constanza Solano Mojica
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Germán Andrés Castro Moreno nuestro director de tesis por su constante
interés y apoyo con el desarrollo de este trabajo.
A Juan Carlos Poveda por sus sugerencias y ayuda en la parte experimental de la
investigación.
Al departamento de Ciencias Básicas por facilitar sus laboratorios y personal humano.
Al programa de Ingeniería de Alimentos por brindar las herramientas necesarias para
realizar los proyectos de investigación e incentivar el espíritu investigativo en los
estudiantes.
6
TABLA DE CONTENIDO
Contenido INTRODUCCION ........................................................................................................................... 11
RESUMEN....................................................................................................................................... 14
JUSTIFICACION ............................................................................................................................ 15
OBJETIVOS .................................................................................................................................... 17
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................... 17
OBJETIVOS ESPECIFICOS .................................................................................................... 17
GLOSARIO ...................................................................................................................................... 18
1. GENERALIDADES ................................................................................................................. 20
1.1 PREBIOTICOS ............................................................................................................... 20
1.3 FISIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA ................................................................................... 21
1.4 PRINCIPALES EFECTOS DE LOS PREBIÓTICOS ..................................................... 22
1.5 PROCESOS DE PRODUCCION ...................................................................................... 23
1.5.1 Lactosa. ......................................................................................................................... 23
1.5.2 La hidrólisis enzimática de la lactosa ........................................................................ 23
1.5.3 β-galactosidasa............................................................................................................. 24
1.5.4 Reacción de trasgalactosilación ................................................................................ 25
1.6 GALACTOOLIGOSACARIDOS ......................................................................................... 25
1.7 SUERO DE LECHE ............................................................................................................. 27
1.7.1 Aplicaciones del suero de leche ................................................................................ 28
2. METODOLOGIA ..................................................................................................................... 30
2.1 CARACTERIZACION DE LAS MATERIAS PRIMAS: .................................................. 30
2.2 MANEJO DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCION DE ESPORAS ............... 30
2.3 METODOLOGIA DE CONTEO DE ESPORAS ......................................................... 32
2.4 METODOLOGIA DE PREPARACION DE MEDIOS ................................................. 32
2.4.1 Características del medio para la reacción enzimática con β-galactosidasa
comercial libre ......................................................................................................................... 32
2.4.2 Características del medio para fermentación con ................................................... 33
7
2.5 PREPARACION DE LA MUESTRA PARA LA REACCIÓN ENZIMÁTICA Y
FERMENTACION ....................................................................................................................... 33
2.5.1. Características de la muestra para la reacción enzimática .................................. 33
2.5.2. Características de la muestra para la fermentación .............................................. 33
2.6 METODOLOGIA DE CUANTIFICACION DE GOS (DNS): ........................................... 34
2.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO: ................................................................................................. 35
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS .............................................................. 36
3.1 CARACTERIZACIÓN DE MATERIAS PRIMAS ............................................................. 36
3.1.1 Determinación de lactosa (DNS) método espectrofotométrico ............................. 36
3.1.2 Determinación de proteína (Kjeldahl) ........................................................................ 38
3.1.3 Determinación de grasa (Soxhlet). ............................................................................ 40
3.2 CUANTIFICACIÓN DE GALACTOOLIGOSACARIDOS GOS .................................... 41
3.2.1 Cuantificación de azúcares reductores durante la transgalactosilación .............. 41
3.3 CONTEO DE ESPORAS DE A. ORYZAE ....................................................................... 42
3.4 ANALISIS ESTADISTICO .................................................................................................. 47
3.4.1 Análisis descriptivo del efecto de la enzima β-galactosidasa sobre los dos
tratamientos lactosuero en polvo y lactosa en polvo. ....................................................... 47
3.4.2 Análisis descriptivo del efecto del microorganismo ................................................ 53
3.5 ANÁLISIS DE EFECTOS DE TRATAMIENTOS ........................................................... 59
3.5.1 Determinación de posibles diferencias entre efecto de la lactosa en polvo y el
lactosuero en polvo. ............................................................................................................... 59
3.5.2 Comparación entre los tratamientos con β-Galactosidasa .................................... 60
3.5.3 Determinación de tiempo de máximo crecimiento con ........................................... 61
3.5.4 Aplicación de los tratamientos con el microorganismo .......................................... 63
3.5.5 Comparación entre efectos de tratamiento con A. oryzae. ................................... 63
3.5.6 Ajuste de polinomio ..................................................................................................... 64
4. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 72
5. RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 74
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................... 75
8
LISTA DE ILUSTRACIONES
FIGURA 1. CEPA DE A. ORYZAE VAR. EFFUSSUS ............................................................................................. 31
FIGURA 2. CEPA DE A. ORYZAE VAR. EFFUSSUS EN ESTADO DE ESPORULACIÓN. .......................................... 31
TABLA 1. DATOS PARA CURVA DE CALIBRACIÓN ............................................................................................. 36
TABLA 2. DATOS ECUACIÓN DE LA RECTA ....................................................................................................... 36
TABLA 3. RESULTADOS DE CONCENTRACIÓN DE LACTOSA EN EL ANALITO (LACTOSUERO EN POLVO) .......... 37
GRAFICA 2.CONCENTRACIÓN INICIAL DE LACTOSA EN EL LACTOSUERO EN POLVO ........................................ 38
TABLA 4. DATOS PARA DESARROLLO MATEMÁTICO DEL MÉTODO KJELDAHL ................................................. 38
TABLA 5. CONTENIDO DE PROTEÍNA EN LA MUESTRA DE LACTO SUERO EN POLVO ........................................ 39
GRAFICA 3.CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN EL LACTOSUERO EN POLVO .................................................. 39
TABLA 6. CONTENIDO DE GRASA EN LA MUESTRA DE LACTO SUERO EN POLVO ............................................. 40
GRAFICA 4.CONCENTRACIÓN DE GRASA EN EL LACTOSUERO EN POLVO ....................................................... 40
TABLA 7.TRANSGALACTOSILACION CON Β-GALACTOSIDASA ......................................................... 43
TABLA 8. TRANSGALACTOSILACION CON A. ORYZAE ........................................................................... 45
TABLA 9. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA DE LOS DOS TRATAMIENTOS (LACTOSA EN POLVO Y LACTOSUERO EN
POLVO) ...................................................................................................................................................... 48
GRAFICA 5. PERFILES DE CRECIMIENTO DE GALACTOOLIGOSACARIDOS CON Β-GALACTOSIDASA ................. 49
GRAFICA 6. DIAGRAMA DE CAJAS DEL COMPORTAMIENTO DE CRECIMIENTO DE GALACTOOLIGOSACARIDOS
GOS. ........................................................................................................................................................ 50 GRAFICA 7. DIAGRAMA DE DENSIDADES DEL COMPORTAMIENTO DE CRECIMIENTO DE
GALACTOOLIGOSACARIDOS GOS. ........................................................................................................... 51
TABLA 10. MATRIZ DE CORRELACIONES PARA EL TRATAMIENTO CON LACTOSA EN POLVO Y Β-
GALACTOSIDASA. ...................................................................................................................................... 52 TABLA 11. MATRIZ DE CORRELACIONES PARA EL TRATAMIENTO CON LACTUOSUERO EN POLVO Y Β-
GALACTOSIDASA. ...................................................................................................................................... 52 TABLA 12. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA DE LOS DOS TRATAMIENTOS (LACTOSA EN POLVO Y LACTOSUERO EN
POLVO) CON A. ORYZAE. .......................................................................................................................... 54
GRAFICA 8. DIAGRAMA DE CAJAS DEL COMPORTAMIENTO DE CRECIMIENTO DE GALACTOOLIGOSACÁRIDOS
GOS CON A. ORYZAE. ............................................................................................................................ 55
GRAFICA 9. PERFILES DE CRECIMIENTO DE GALACTOOLOGOSACÁRIDOS (GOS) CON A. ORYZAE. .............. 56
GRAFICA 10: DIAGRAMA DE DENSIDADES DEL COMPORTAMIENTO DE CRECIMIENTO DE
GALACTOOLIGOSACARIDOS GOS CON A. ORYZAE. ................................................................................. 57
TABLA 13. MATRIZ DE CORRELACIONES PARA EL TRATAMIENTO CON LACTOSA EN POLVO Y A. ORYZAE. .... 58 TABLA 14. MATRIZ DE CORRELACIONES PARA EL TRATAMIENTO CON LACTOSUERO EN POLVO Y A. ORYZAE.
.................................................................................................................................................................. 58
TABLA 15. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA ORGANISMO B-GALACTOSIDASA .................................................... 60
TABLA 16. ESTIMACIONES DE EFECTOS .......................................................................................................... 61
GRAFICA 11. AJUSTE DE CURVA DE CRECIMIENTO PARA EL COMPORTAMIENTO DE GOS ............................. 62
GRAFICA 12. AJUSTE DE CURVA DE CRECIMIENTO PARA EL COMPORTAMIENTO DE GOS ............................. 63
TABLA 18. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA LOS TRATAMIENTOS CON EL MICROORGANISMO A. ORYZAE. ......... 64
TABLA 19. ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS EN ORGANISMO A. ORYZAE. ......................................................... 64
TABLA 20. ESTIMACIONES ............................................................................................................................... 65
9
GRAFICA 13. AJUSTE POLINOMIAL PARA EL EFECTO DE CRECIMIENTO DE GALACTOOLIGOSACARIDOS (GOS)
.................................................................................................................................................................. 66
GRAFICA 14. AJUSTE POLINOMIAL PARA EL CRECIMIENTO DE GOS ............................................................... 67
TABLA 21. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSA EN POLVO-ENZIMA) ..................... 67
GRAFICA 15. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSA EN POLVO-ENZIMA) ................. 68
TABLA 22. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSUERO EN POLVO-ENZIMA) .............. 68
GRAFICA 16. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSUERO EN POLVO-ENZIMA) .......... 69
TABLA 23. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSA EN POLVO-HONGO) ..................... 69
GRAFICA 17. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSA EN POLVO-HONGO) ................. 70
TABLA 24. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (LACTOSUERO EN POLVO-HONGO) .............. 70
GRAFICA 18. COMPORTAMIENTO DEL SUSTRATO VS PRODUCTO (SUERO-HONGO) ...................................... 71
TABLA 1. DATOS PARA CURVA DE CALIBRACIÓN ............................................................................................. 94
GRAFICA 1. CURVA PATRÓN (TÉCNICA DNS) ................................................................................................. 94
10
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A: DETERMINACIÓN DE LACTOSA (DNS)MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO (16051, AOAC, 1984)
.................................................................................................................................................................. 78
ANEXO B: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA (KENDAHL) A.O.A.C. OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS 13 TH
EDITION, 1984 .......................................................................................................................................... 79
ANEXO C: DETERMINACIÓN DE GRASA (SOXLETH) .REFERENCIA: OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS
A.O.A.C. 15TH EDITION, U.S.A.(1990) ................................................................................................. 81
ANEXO D: METODOLOGÍA DE CONTEO DE ESPORAS (CÁMARA DE NEUBAUER) ............................................ 82
ANEXO E: FICHA TÉCNICA, ENZIMA Β-GALACTOSIDASA MAXILACT L200 .................................................. 83
ANEXO F: METODOLOGIA DE PREPARACION DE TAMPÓN FOSFATO(SÖRENSEN) .......................................... 84
ANEXO G: FICHA TÉCNICA AUTOCLAVE VERTICAL ......................................................................................... 85
ANEXO H: FICHA TÉCNICA AGAR DEXTROSA DE PAPA .......................................................................... 89
ANEXO I: FICHA TÉCNICA AGAR DEXTROSA SABOURAUD ................................................................... 90
ANEXO J: FICHA TÉCNICA SUERO EN POLVO ........................................................................................... 91
ANEXO K: FICHA TÉCNICA LACTOSA EN POLVO ...................................................................................... 92
ANEXO L: PROTOCOLO DE ACTIVACIÓN DEL A. ORIZAE SEGÚN LA USDA (DEPARTAMENTO DE
AGRICULTURA DE ESTADOS UNIDOS) ...................................................................................................... 93
ANEXO M:CURVA DE PATRÓN MÉTODO DNS ................................................................................................ 94
11
INTRODUCCION
Los prebióticos son definidos como ingredientes alimenticios no digeribles que benefician
la salud del hospedero estimulando selectivamente el crecimiento y/o actividad de un
número limitado de bacterias intestinales que son beneficiosas 1 . Los
galactooligosacáridos (GOS) se encuentran dentro de este grupo de sustancias, en donde
estos azúcares se hallan de forma natural en la leche de mamíferos y en algunos
productos procesados en los que se pueden obtener mediante reacciones de
transgalactosilación2, usando la enzima β-galactosidasa.
La β-Galactosidasa, también conocida como lactasa, es una hidrolasa que ataca el grupo
O-glucosilo de lactosa, su fuente son hongos como el Aspergillus niger y Aspergillus
oryzae que a menudo se utilizan para la hidrólisis de la lactosa en el suero. Durante la
reacción, los azúcares que no sean los monosacáridos, glucosa y galactosa, también se
forman. Estos disacáridos contienen uno o más galactósidos que están formados por
transgalactosilación produciendo GOS3.
La lactosa es el principal sustrato para la síntesis, este disacárido está presente en el
suero de la leche en un alto porcentaje, además de que se puede adquirir con su
concentración total en polvo luego de ser sometido a ciertos procesos químicos. Se
conoce que los GOS son producidos de la lactosa hace más de 50 años y sin embargo el
interés comercial de los mismos solo se da con el descubrimiento de la bifidogenia en
1 HUERTA SANCHEZ, Leopoldo. Síntesis Enzimática de Galacto-oligosacáridos a partir de residuos de la
industria láctea: Desafíos tecnológicos y oportunidades. En: Desarrollos tecnológicos. No. 14 (Marzo de 2005); p. 2. 2 FIGUEROA GONZALEZ IVONNE. “Estudio de agentes selectivos en el crecimiento de bacterias probioticas”.
Iztapalapa. México. Mayo de 2004, p. 3. 3
DEY-CHYI Shey, Shin-Yi. Production of galactooligosaccharides by b-galactosidase immobilized onglutaraldehyde-treated chitosan beads. En: Biotechnology Techniques. No. 4,( April 1998); p. 273–276.
12
donde este tipo de productos es clasificado como ingrediente alimenticio prebiótico4 de
gran impacto industrial.
Además, los antecedentes mencionan los microorganismos benéficos desde la primera
década del siglo XX, el término prebiótico fue introducido hasta el año 1980 luego de
hacer varias investigaciones 5 , dichas sustancias que aún se están investigando y
conociendo y que son usadas principalmente en Japón, Estados Unidos y Europa.
En la actualidad y ya desde hace algunos años se ha notado el interés por los
consumidores en tener mejores hábitos alimenticios, incluyendo en su dieta alimentos
enriquecidos y funcionales que mejoren la digestión y que tengan efectos positivos sobre
la flora bacteriana, además de aumentar el crecimiento de bacterias intestinales
beneficiosas. Los microorganismos llamados probióticos mejoran estas funciones, pero
necesitan a su vez fuentes nutritivas suficientes, estas sustancias son proporcionadas por
los prebióticos, de forma tal que en conjunto son capaces de mejorar la salud en los seres
humanos.
Además de esto los GOS representan gran importancia industrial y funcional, y al mismo
tiempo el suero representa un problema ambiental ya que por cada kg de queso que se
elabora se producen 9 kilogramo de lactosuero, por lo que se desarrollan investigaciones
acerca de la síntesis enzimática de galactooligosacáridos a partir de residuos de la
industria láctea para la producción y/u obtención de prebióticos galactooligosacáridos
GOS6.
Es por esto que el objeto de este estudio, es producir prebióticos, galactooligosacáridos
GOS, a escala de laboratorio (erlenmeyer de 500 ml), por medio de la fermentación y/o
4FIGUEROA, Op. cit.
5 FAO. Probióticos en los alimentos. Propiedades saludables y nutricionales y directrices para la evaluación
[en línea]. <ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0512s/a0512s00.pdf> [citado en 28 de diciembre de 2010]. 6FIGUEROA, Op. cit.
13
reacción enzimática de la lactosa en polvo y lactosuero en polvo, subproducto de la
industria quesera, partiendo de la caracterización de los sustratos lactosuero en polvo y
lactosa en polvo (Cimpa SAS) por medio de pruebas de cuantificación del contenido de
grasa, proteína y lactosa, seguida por la preparación de medios y muestras para el
desarrollo de las fermentaciones y reacciones enzimáticas. Además, dentro de este
documento se encuentra la evaluación de la obtención de galactooligosacáridos (GOS)
utilizando la enzima β-galactosidasa comercial (libre) y el microorganismo A. oryzae, a
partir de lo cual se determinan las condiciones del proceso de fermentación y reacción
enzimática por medio de pruebas de laboratorio, evaluando así las mejores condiciones
de producción de los mismos en cuanto a tiempo, sustrato (lactosa en polvo o lactosuero
en polvo) y medios de fermentación con la ayuda de un análisis estadístico descriptivo
para cada uno de los tratamientos lactosa en polvo y lactosuero en polvo tanto para la
fermentación con A. oryzae como para la reacción enzimática con β-galactosidasa y
ulteriormente un modelo estadístico para determinar diferencias significativas entre los
mismos, con lo que no solo se pretende mejorar las características de producción de GOS
sino que también se contribuye a la solución de la problemática ambiental que representa
este subproducto.
14
RESUMEN
Por medio de esta investigación se desarrolla la producción de prebióticos
galactooligosacáridos (GOS) a escala de laboratorio en erlenmeyer de 500 ml por medio
de la fermentación y/o reacción enzimática de la lactosa en polvo y el lactosuero en polvo
subproducto de la industria quesera por medio de la enzima β-galactosidasa comercial
(libre: MAXILAC L 2000) adquirida en Interenzimas SAS y un microorganismo reconocido
por la producción de los mismos A. oryzae var. effussus proporcionado por el
departamento de agricultura de Estados Unidos servicio de investigación agrícola (USDA),
partiendo de la caracterización del lactosuero en polvo mediante la identificación
cuantitativa del contenido grasa (Soxhlet), proteína (Kjendahl) y lactosa (DNS), a partir de
lo cual se preparan los diferentes medios utilizados tanto para la fermentación como para
la reacción enzimática de acuerdo al tratamiento. Ulteriormente se procede a desarrollar
la fermentación de la lactosa en polvo y el lactosuero en polvo por medio del
microorganismo A. oryzae con una concentración inicial de 11% de lactosa en los dos
casos y 2.9*107 esporas por mililitro y una duración total en el proceso de 24 horas,
mientras que para la reacción enzimática de la lactosa en polvo y el lactosuero se usa la
enzima β-galactosidasa (2000 U) con una concentración inicial de lactosa de 11%,
proceso desarrollado en 12 horas. Posteriormente para la cuantificación de GOS
producidos en los cuatro casos se desarrolló la determinación de azúcares totales y
reductores por DNS para de esta manera por medio de un balance obtener el porcentaje
de GOS resultante. Finalmente mediante el análisis estadístico descriptivo y el modelo a
dos filas de clasificación con interacción entre el grupo y el tiempo con anidamiento de
individuos entre grupos, mediante los programas R y SAS fue posible determinar que no
se encontraron diferencias significativas en la producción de GOS a partir de la lactosa
en polvo y el lactosuero en polvo para los cuatro casos, además de esto que se presenta
una mayor producción con el uso de la enzima (4.828% con lactosa y 4.894 con suero)
frente al uso del microorganismo (4.546% con lactosa y 4.758 con suero).Sin embargo se
determinó que en cuanto al tiempo la mejor producción en la fermentación se da en la
15
hora 16 para los dos tratamientos, mientras que para la reacción enzimática se da en la
hora 10.
JUSTIFICACION
La industria quesera ha demostrado que uno de sus principales problemas es la alta
producción de lactosuero ya que este es considerado como un agente contaminante y por
ende problema ambiental debido a su alto contenido en sólidos y sin embargo de acuerdo
a su composición es un subproducto rico en lactosa de gran valor en la industria
alimentaria 7 . Por lo que se hace inminente la necesidad del desarrollo de procesos
industriales que conlleven no solo al aprovechamiento de dichos productos sino que
también, a partir de estos, se desarrollen nuevas alternativas de acuerdo a las exigencias
del consumidor.
Por otro lado las tendencias en cuanto a la forma de alimentarse han tenido un giro y
evolución que conlleva al consumo y búsqueda de alimentos funcionales, naturales, de
fácil preparación y costo accesible8. De acuerdo a esto se sabe que día tras día el
consumidor ha incrementado su interés en mantener una salud apropiada mediante la
modificación de su dieta, con la finalidad de mejorar la micro flora intestinal9, lo que
conlleva a un gran beneficio para el consumidor, por lo que aparecen los productos
funcionales los cuales no solo presentan beneficios nutricionales sino que también
contribuyen a la mejora de la salud pública.
Finalmente en cuanto al aspecto económico, los productores asociados a la industria
quesera presentan grandes pérdidas económicas con el lactosuero, debido a que este es
7 FIGUEROA, Op. cit.
8PEREZ Diego, LOPEZ Gabriel. Principales prebióticos y sus efectos en la alimentación. En: Revista
Universitaria Murcia. No. 22 (Marzo 2007); p. 34. 9GARIS Jelinek, JERCK Stahl. Prebióticos en Fórmulas Lácteas. En: Journal of Clinical Gastroenterology. No. 38
(Julio de 2004); p.76-78.
16
un subproducto que no solo es producido de forma inherente al desarrollo quesero sino
que también es desperdiciado a pesar de que cuenta con un gran valor en cuanto a su
contenido de lactosa, por lo que se justifica el uso de microorganismos para la
fermentación de la misma con el objeto de producir galactooligosacáridos GOS,
prebióticos de gran demanda industrial.
17
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Obtener galactooligosacáridos (GOS), mediante la fermentación de la lactosa presente en
dos sustratos (lactosuero en polvo y lactosa en polvo) a escala laboratorio usando A.
oryzae y β-galactosidasa libre.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Caracterizar el lactosuero en polvo mediante la determinación del contenido de lactosa,
proteína y grasa.
Evaluar la obtención de galactooligosacáridos (GOS) utilizando enzima (β-galactosidasa
libre) y el hongo A. oryzae.
Comparar los resultados obtenidos en la experimentación aplicando un análisis
estadístico descriptivo y un modelo para la verificación de la existencia de diferencias
significativas en los procedimientos.
18
GLOSARIO
BIOTECNOLOGIA: la biotecnología consiste en la utilización de microorganismos así
como de células vegetales y animales para producir materiales tales como alimentos,
medicamentos y productos químicos útiles a la humanidad.
ENZIMA: las enzimas son proteínas que catalizan todas las reacciones bioquímicas lo
que hace que se realicen de forma más rápida. Además de su importancia como
catalizadores biológicos, tienen muchos usos médicos y comerciales.
FERMENTACION: la fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta,
totalmente anaeróbico, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos
finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones.
GALACTOOLIGOSACARIDOS (GOS): los GOS son clasificados como carbohidratos no
digeribles (NDOs) los cuales resisten las enzimas digestivas gastrointestinales; son
además solubles, actuando de esta manera como fibra dietaría soluble (SDF).
LACTOSA: la lactosa (beta-D-galactopiranosil-D-glucopiranosa) es un disacárido formado
por la unión de una molécula de glucosa y otra de galactosa. Concretamente intervienen
una ß-galactopiranosa y una ß-glucopiranosa unidas por los carbonos 1 y 4
respectivamente. Al formarse el enlace entre los dos monosacáridos se desprende una
molécula de agua. Además, este compuesto posee el hidroxilo hemiacetálico.
LACTOSUERO: es un líquido obtenido en el proceso de fabricación del queso y de la
caseína, después de la separación de la cuajada o fase micelar. Sus características
corresponden a un líquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco,
débilmente dulce, de carácter ácido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del
5.5% al 7% provenientes de la leche.
PREBIOTICO: son una especie de alimentos funcionales, definidos como: "Ingredientes
no digestibles que afectan beneficiosamente al organismo mediante la estimulación del
19
crecimiento y/ actividad de una/o varias cepas de bacterias en el colon, mejorando la
salud".
20
1. GENERALIDADES
1.1 PREBIOTICOS
Los prebióticos son un ingrediente alimentario no digerible que afecta de modo
beneficioso al huésped estimulando selectivamente el crecimiento y / o la actividad de una
o de un limitado número de bacterias del colon10.
Los prebióticos apuntan a estimular el crecimiento de uno o de un número limitado de
microorganismos endógenos con actividad benéfica para la salud, modulando de este
modo el ecosistema.
En este sentido el criterio para definir a los prebióticos será la resistencia a la digestión en
intestino delgado, hidrólisis y fermentación por la flora del colon con estimulación selectiva
de las bacterias del mismo.
De allí surge el interés, al saber que cierto tipo de fibra estimula durante su fermentación
el crecimiento de ciertas bacterias, y por lo tanto incluirla en los alimentos.
Numerosos trabajos científicos apuntan a establecer una relación entre ingesta adecuada
de fibra con efectos prebióticos a través de su fermentación bacteriana en colon e
identificar sus efectos nutraceúticos.
La mayoría de estos efectos están asociados a optimizar la función de colon y su
metabolismo, tales como aumento en la expresión o cambios en la composición de ácido
grasos de cadena corta, aumento de peso fecal, un moderada reducción en pH
intraluminal del colon, una disminución de productos finales nitrogenados y enzimas
10
GIBSON, George, ROBERFROID, Miller. Dietary modulation of the human colonic microbiote: Introducing the concept of prebiotics. Ediciones Paidos, 1993. 1650p.
21
reductoras, y aumento en la expresión de cadenas de proteínas o transportadores activos
asociados con la absorción mineral, y modulación del sistema inmune11.
1.3 FISIOLOGIA Y FISIOPATOLOGIA
Una característica distintiva de los prebióticos es que, al contrario del almidón, no son
hidrolizados por la amilasa salival ni el ácido clorhídrico del estómago y son resistentes a
la acción de las disacaridasas y de la alfa-glucoamilasa de la mucosa intestinal; tampoco
son susceptibles a la acción de los enzimas pancreáticos; por lo tanto, los prebióticos
llegan en una proporción muy alta al ciego, colon ascendente y transverso, donde sirven
de sustrato a la microbiota residente, que los somete a un proceso de fermentación.
Además, los prebióticos funcionan como un factor de selección, ya que estimulan de
manera selectiva el crecimiento de bacterias beneficiosas para la salud, como es el caso
de las bífidobacterias y los lactobacilos.
Los prebióticos no son afectados durante su paso por la cavidad bucal, el estómago y el
intestino delgado y en los pacientes ileostomizados es posible recuperar alrededor de
90% de un prebiótico ingerido; en la orina se detecta aproximadamente 1% del prebiótico,
pues una cantidad traza es capaz de atravesar la barrera representada por el epitelio del
intestino delgado; adicionalmente 8% a 9% de la cantidad total del prebiótico ingerido
sufre un fenómeno de fermentación en el ileon, segmento del intestino delgado que tiene
una flora formada por aproximadamente diez mil (104) unidades formadoras de colonias
(UFC) por mililitro de contenido. Por lo tanto, 90% de la fermentación total de los
prebióticos se producirá en el intestino grueso, que es el lugar donde tiene lugar la
actividad funcional de estos hidratos de carbono.
La síntesis, y por lo tanto la estructura química de los prebióticos se deriva de dos
moléculas:
La inulina, que es sintetizada en la raíz de vegetales, especialmente de la achicoria, a
partir de una molécula de sacarosa; como este disacárido está formado por una unidad de
11
INAN, Michel. The luminal short chain fatty acid butyrate modulates activity in human colonic epithelial cell line. Gastroenterology. 2000. 913p.
22
glucosa y una de fructosa, y como a esta última se agregan sucesivamente unidades de
fructosa en número variable, se forma una cadena lineal de hasta cincuenta unidades de
fructosa unidas entre sí por enlaces beta 2—1 que incluye una unidad de glucosa en un
extremo. Para el enlace beta 2—1 no existe a nivel del tubo digestivo humano ningún
enzima con capacidad para hidrolizarlo y por esta razón la inulina y los demás prebióticos
son capaces de transitar por el intestino delgado sin sufrir modificaciones.
Otros prebióticos son sintetizados a partir de una molécula de fructosa a la que, al igual
que en el caso de la inulina, se unen sucesivamente otras unidades de fructosa mediante
el mismo enlace beta 2—1 dando origen a una cadena lineal de polifructosa llamada un
fructopolisacárido12.
Tanto la inulina como los fructopolisacáridos pueden ser hidrolizados mediante procesos
industriales que resultan en productos con cadenas de seis a nueve unidades de fructosa,
los fructooligosacáridos (FOS).
En los individuos que ya albergan una microbiota madura, los prebióticos ingeridos son
sometidos a la acción de las bacterias cuando llegan al colon, donde se produce el
proceso de fermentación a que nos hemos referido anteriormente. Los prebióticos no son
las únicas moléculas que llegan indigeridas al colon; otras moléculas que sufren igual
proceso en el colon incluyen los almidones retrogradados y resistentes a la digestión,
mucinas de diversos tipos y proteínas y péptidos resistentes a la digestión por la tripsina,
quimotripsina y demás enzimas proteolíticos. De manera que la microbiota residente del
colon recibe una variedad de moléculas que le sirven de fuente de nitrógeno y de energía
y que permiten su persistencia en dicho ambiente13.
1.4 PRINCIPALES EFECTOS DE LOS PREBIÓTICOS
Acción inmunomoduladora: la flora microbiana con mayor cantidad de bifidobacterias
favorecida por los oligosacáridos/prebióticos se asocia a una menor prevalencia de atopia.
12
BRUNSER, Oscar. Fisiopatología y Mecanismos de Acción de los Prebióticos. Manual de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INTA).2000.354 p. 13
BRUNSER, Op. cit.
23
Acción metabólica: fermentación colónica con producción de AGCC (propiónico, butírico y
acético).
Acción nutricional: las bifidobacterias favorecen la síntesis de algunas vitaminas como la
Vit B6, B12, Ac. fólico, Ac. Nicotínico y favorecen a través de la fermentación colónica la
absorción de calcio, magnesio, hierro y zinc14.
1.5 PROCESOS DE PRODUCCION
Los prebióticos se obtienes principalmente por hidrólisis de la lactosa, mediante el uso de
la enzima β-galactosidasa, ya sea industrial u obtenida mediante algún microorganismo
que sea capaz de producirla.
1.5.1 Lactosa. Es un disacárido constituido por β-D-Galactosa y D-Glucosa. La galactosa
es el epimero C-4 de la glucosa. En otras palabras la única diferencia entre la glucosa y la
galactosa es la inversión de la configuración en el C-4. Hay un enlace glucosidico β (1-4),
Entre el carbono anomérico C -1 de la forma β de la galactosa y el carbono C-4 de la
glucosa. Como el carbono anomérico de la glucosa no participa en el enlace glucosidico,
puede tener forma α o β. Las dos formas anoméricas de la lactosa pueden especificarse,
y la designación se refiere al residuo de la glucosa; la galactosa debe estar presente
como anómero β, Ya que la forma β de la galactosa es necesaria en la estructura de la
lactosa. La lactosa es un azúcar reductor porque el carbón o anomérico de la porción de
glucosa no participa en el enlace glucosidico, de modo que queda libre para reaccionar
con los agentes oxidantes.15
1.5.2 La hidrólisis enzimática de la lactosa. La hidrólisis de la lactosa se puede realizar
ya sea por tratamiento con ácido de alta temperatura (150 ° C), o por catálisis enzimática
llevado a cabo con β-galactosidasa. La hidrólisis enzimática de la lactosa ofrece algunas
14
MARTINEZ, Benjamin. Puesta al día: alimentos funcionales: prebióticos, probióticos. En: Sociedad Española en Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica. No. 11 (Abril de 2005); p. 22. 15
CAMPELL, Mary. FARRELL, Shawn. Bioquímica: disacáridos. Colombia: Editorial Thomson. 2000. 448p
24
ventajas, principalmente en tres áreas: la salud, tecnología alimentaria y el medio
ambiente. Es bien sabido que el consumo de leche y otros productos lácteos es limitado
para la mayoría de la población adulta del mundo (75%). Las personas son incapaces de
digerir la lactosa presente en estos productos debido a la falta de β-galactosidasa en la
mucosa del intestino delgado. El consumo de los productos lácteos causa dolor
abdominal, diarrea, calambres o flatulencia. Este problema se elude si la lactosa en los
productos es hidrolizada por la β-galactosidasa a los azúcares fácilmente utilizables, la
glucosa y la galactosa16.
Otra ventaja de la de la hidrólisis enzimática de la lactosa es la formación simultánea de
galactooligosacáridos (GOS), utilizados como ingrediente prebiótico en los alimentos.
Estos compuestos promueven el crecimiento de bifidobacterias intestinales, con el
subsiguiente efecto saludable en el intestino y el hígado. Hoy en día, de la demanda para
la producción de GOS, así como el desarrollo de una eficaz y barata fabricación de estos
compuestos ha aumentado considerablemente17.
1.5.3 β-galactosidasa. La β-galactosidasa es una enzima industrial importante en la
hidrólisis de la lactosa de la leche y suero de leche. La hidrólisis enzimática de la lactosa
permite evitar problemas sanitarios y medioambientales que plantea este disacárido.
Además, esta enzima cataliza la formación de galactooligosacáridos, que son aditivos
prebióticos para los llamados "alimentos sanos". La enzima no se ha utilizado a gran
escala, tanto libre como inmovilizada.
Una de las principales aplicaciones de las enzimas en la industria es la preparación de
lactosa hidrolizada leche y suero de leche, con β-galactosidasa. Esta enzima se produce
ampliamente en la naturaleza y ha sido aislada de animales, plantas y microorganismos.
En comparación con los animales y las plantas, la microbiana se produce en mayores
rendimientos y es más importante tecnológicamente. Las enzimas más importantes de
16
GROSOVÁ Zynd, ROSENBERG Marcus. Perspectivas y Aplicaciones de la β-galactosidasa inmovilizada en la Industria Alimentaria. En: Aplicaciones biotecnológicas. No.11 (Chile de 2008). 17
Ibíd.
25
interés comercial se encuentran aisladas principalmente de la levadura Kluyveromyces
lactis, K. fragilis, K. marxianus, Kefyr Candiday el hongo Aspergillus niger o A. oryzae18.
1.5.4 Reacción de trasgalactosilación. Los Galactooligosacáridos son los productos de
las reacciones catalizadas por transgalactosilación a galactosidasas cuando se utiliza la
lactosa u otros relacionados estructuralmente galactósidos como sustrato. Las
galactosidasas se clasifican generalmente como hidrolasas. De hecho, la hidrólisis del
enlace glicosídico es un caso especial de transgalactosilación en la que el galactosil
aceptor es el agua. Se cree que está implicado reacciones intermoleculares así como las
reacciones intramoleculares.
El enlace glucosídico de lactosa se escinde y de inmediato forma de nuevo en una
posición diferente de la molécula de glucosa antes de que se difunda fuera del sitio activo.
Esta es así como la lactosa, es el presunto inductor natural de las galactosidasas en
ciertos microorganismos, se puede formar, incluso en ausencia de cantidades
significativas de D-glucosa. Por transgalactosilación intermolecular,
di-, tri-y tetrasacáridos y oligosacáridos posiblemente se producen en mayor cantidad.
Cualquier molécula de azúcar en la reacción puede ser el nucleófilo a aceptar la fracción
galactosil del complejo galactosil-enzima19.
1.6 GALACTOOLIGOSACARIDOS
Los GOS son clasificados como carbohidratos no digeribles (NDOs) los cuales resisten
las enzimas digestivas gastrointestinales; son además solubles, actuando de esta manera
como fibra dietaría soluble (SDF). Varios estudios demuestran que estos oligosacáridos
pueden aliviar problemas de constipación, mejorar la absorción de minerales tales como
calcio y magnesio y retardar el desarrollo de cáncer de colon en modelos probados de
ratas. Estos pueden ser aislados también en forma natural del grano de soya.
18
Ibíd. 19
STEINBO MARLENE. Production of Prebiotic Galacto-Oligosaccharides from Lactose Usin Galactosidases from Lactobacillus reuteri. En: Agricultural and food chemistry. Austria. No. 54 (Febrero de 2006); p. 44.
26
Luego del descubrimiento de su actividad bifidogénica, los GOS han sido clasificados
como ingredientes alimenticios prebióticos, tomando su producción industrial un mayor
interés comercial. Los GOS son principalmente formados por síntesis enzimática a partir
de lactosa como sustrato utilizando β-galactosidasa para producir varios oligómeros de
longitudes de cadena diferentes. Por lo general tienen un grado de polimerización entre 2
y 10 con una molécula de glucosa terminal20.
Los GOS han sido reconocidos como un aditivo alimentario Generally Recognized as Safe
(GRAS) debido a que son componentes de la leche materna y yogures tradicionales y son
producidos de la lactosa ingerida por las bacterias residentes en el intestino. Según
estudios realizados no se ha demostrado ninguna toxicidad ni mutagenicidad. El único
efecto adverso conocido hasta ahora es la diarrea transitoria que ocurre cuando se
consume un exceso de GOS; la cantidad de GOS que no induce este tipo de diarrea es
de aproximadamente 0,3-0,4 g/kg de peso corporal, o cerca de 20g por persona.
En la actualidad existen productos comerciales en forma de sólido o líquido que contienen
GOS en su formulación, siendo la gran mayoría producidos en Japón y algunos en
Holanda, a partir de lactosa como sustrato.
Respecto a sus aplicaciones en alimentos, estas sustancias son totalmente permitidas en
formulaciones infantiles y bebidas para deportistas en diferentes países. Además son
empleados en productos lácteos, bebidas fermentadas, panadería y repostería entre
otros. A diferencia de los fructo-oligosacaridos, inulina y otros oligosacáridos, los GOS son
estables a pH ácido (pH entre 2.5 a 8) y temperaturas de procesamiento de
pasteurización y horneo.
Los GOS pueden ser producidos de la lactosa encontrada en la leche, siendo ésta la
materia prima principal para la producción de este producto comercial, que es por lo
general obtenida del suero
.
El suero es formado en gran cantidad como un subproducto de la industria láctea, y
además debido al aumento de la producción de queso hay una necesidad de métodos
20
HUERTA, Op. cit.
27
más eficientes y prácticos para reducir esta sustancia catalogada como desecho. Como
una alternativa se podría utilizar éste en la producción de GOS.
Como ya se mencionó, los GOS son producidos por β-galactosidasas, glicosidasas que a
condiciones apropiadas de reacción tienen actividades de transgalactosilación, la cual
origina la formación de cadenas 4´ o 6´-galactosil-lactosa, entre cadenas más largas de
oligosacáridos y algunos disacáridos transgalactosilados.
La cantidad y la naturaleza de los GOS dependerán del origen de la enzima,
concentración y naturaleza del sustrato, grado de conversión de sustrato y las condiciones
de reacción.
1.7 SUERO DE LECHE
El suero es la parte liquida que queda posterior a la separación de la cuajada al elaborar
el queso. También se puede definir como el líquido resultante de la coagulación de la
leche en la fabricación del queso, tras la separación de la mayor parte de la caseína y de
la grasa de la leche.
En la producción de mantequilla o de caseína a partir de la leche desnatada, también se
obtiene un suero, por lo que una definición más general del mismo seria, el líquido
formado por partes de los componentes de la leche (lactosa, sales minerales, vitaminas
solubles, proteínas solubles y algo de grasa), que resulta de diversos procesos de
elaboración de productos lácteos.
La composición del suero varia con la leche utilizada y con el tipo de queso a fabricar.
Además depende del sistema de coagulación:
Por coagulación al cuajo, se obtiene un suero dulce que apenas contiene calcio. Su pH
es de 6 a 6.6.
28
Por acidificación, se obtiene un suero acido con un pH más bajo que varía de 4.3 a 4.721.
El suero se queda con el 15% del contenido total de la proteína de la leche cruda y con el
90% del contenido total de la lactosa de la leche cruda, además una parte importante de
los sólidos solubles de la leche cruda pasan al suero lácteo.
La composición del suero lácteo fresco, referido a materia seca nos da un 80% de lactosa,
13% de proteínas y el 7% restante entre minerales y lípidos.
El nivel y calidad vitamínico y enzimático que tiene el suero fresco es muy superior al que
se puede obtener del suero en polvo, ya que éste último ha sido sometido a una elevada
temperatura y a oxidaciones debido a los procesos y manipulaciones propias del proceso
de secado y envasado.
A pesar de ello el suero en polvo es igualmente un producto nutritivo, ya que los
modernos sistemas y procesos de secado que utilizan las distintas empresas que se
dedican a esta actividad, son cada vez más eficientes y preservan de manera razonable
un poder nutritivo aceptable22.
1.7.1 Aplicaciones del suero de leche. La aplicación de la lactosa en alimentos es
limitada, ya que existe un gran número de personas que muestran intolerancia,
produciendo en algunos casos deshidratación, pobre absorción del calcio, diarreas,
flatulencia. Su baja solubilidad y la tendencia a cristalizar en agua a bajas temperaturas la
convierten en un problema como parte de la formulación de algunos derivados lácteos
tales como leche condensada, leche evaporada, helados, etc.
En la actualidad existen cuatro fuentes enzimáticas disponibles en el mercado; las
provenientes de hongos filamentosos (A. oryzae y A. niger), y de levaduras
(Kluyveromyces marxianus varlactisy, Kluyveromyce smarxianus varmarxianus), teniendo
las fungales un pH óptimo de 2,5 a 4,5 y de 6,0 a 7,0 para las levaduras. Las enzimas
fungales son particularmente adecuadas para ser usadas en suero ácido, pero presentan
inhibición por galactosa mucho mayor que las de levadura que son adecuadas para
21
MADRID, Antonio. Nuevo manual de industrias alimentarias: composición de la leche. Madrid: ediciones Iragra S.A, 2001. 350p. 22
UNIVERSO PORCINO. Explorando las propiedades del suero lácteo fresco [en línea]. < http://www.universoporcino.com/articulos/nutricion_porcina_12-2010_> [citado en 16 de febrero de 2011].
29
hidrolizar sueros dulces; por ello no pueden alcanzar el grado de hidrólisis obtenido con
estas últimas; ejemplo, la β-galactosidasa de A. oryzae posee un valor de pH óptimo ácido
(4,5) y una temperatura óptima de reacción entre 50º y 55ºC, siendo apta en la hidrólisis
de suero ácido y permeado de suero.
Paralelamente a ello existe un gran interés en darle un uso no alimenticio, siendo
entonces utilizada como excipiente en la formulación de tabletas en la industria
farmacéutica, como sustrato para la fermentación de varios productos tales como metano,
etanol, ácidos orgánicos, exopolisacáridos como goma xantana, entre otros.
Se sabe además que puede ser utilizada como sustrato en la síntesis de derivados
alimenticios como lactitol, lactulosa, lactosacarosa y galactooligosacáridos (GOS), estos
últimos con propiedades prebióticas, lo que sería su aplicación más novedosa y la que
está teniendo en los últimos años mayor interés23.
23
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE GASTROENTEROLOGIA. Probióticos y prebióticos [en línea]. <http://www.universoporcino.com/articulos/nutricion_porcina_12-2010_> [citado en 16 de febrero de 2010].
30
2. METODOLOGIA
Durante el desarrollo metodológico, para la obtención de galactooligosacáridos (GOS), es
necesaria la caracterización de las materias primas (lactosa en polvo y lactosuero en
polvo) mediante la cuantificación del contenido de lactosa, grasa y proteína.
Posteriormente se lleva a cabo la preparación de los medios para la fermentación y
reacción enzimática que tienen una duración de 24 y 12 horas respectivamente. Vale la
pena aclarar que para la fermentación se usa el hongo A. oryzae, mientras que la
reacción enzimática se lleva a cabo por la acción de la enzima β-galactosidasa.
2.1 CARACTERIZACION DE LAS MATERIAS PRIMAS
Para la caracterización del sustrato suero en polvo se determinó el contenido de proteína,
grasa y lactosa mediantes las técnicas:
Determinación de lactosa (DNS) método espectrofotométrico (16051, AOAC,
1984) (Anexo A)
Determinación de proteína (Kjeldahl) A.O.A.C. Official Methods of Analysis 13
th Edition, (1984) (Anexo B)
Determinación de grasa (Soxhlet) .Referencia: Official Methods of Analysis
A.O.A.C. 15th Edition, U.S.A.(1990) (Anexo C)
2.2 MANEJO DEL MICROORGANISMO Y PRODUCCION DE ESPORAS
La cepa de A. oryzae var. effussus usada durante el desarrollo de esta investigación, fue
proporcionada por Departamento de agricultura de Estados Unidos (USDA servicio de
investigación agrícola) y se encontraba liofilizada por lo que fue necesario llevar a cabo la
activación de dicha cepa. Para la activación, USDA envió un protocolo (Anexo L), sin
31
embargo dicho procedimiento carece de especificaciones del medio (caldo de activación)
por lo que se desarrolla la siguiente metodología:
En un ambiente estéril (Cámara de bioseguridad) se llevó a cabo la siembra de la cepa A.
oryzae var. effussus en cajas de petri con agar papa dextrosa (PDA) y agar sabouraud
(medios precursores del crecimiento de hongos) por punción para ulteriormente incubar a
30 °C durante 7 días para activación y crecimiento de la cepa.
Figura 1. Cepa de A. oryzae var. effussus
La figura 1 muestra el crecimiento del hongo A. oryzae el cual presenta una apariencia y
textura algodonosa blanca luego de 7 días de incubación.
Posteriormente para el desarrollo de esporulación fue necesario el uso de una solución
tensoactiva estéril (15% p/v de glicerol, 0.1% p/v tween 80 y buffer acetato 0.1 M pH 6.0),
(Sanchez, et al, 2008) a la cual se le adicionó la cepa de A. oryzae var. effussus que fue
sembrada en los agar papa dextrosa (PDA) (MCD LAB SA) y agar sabouraud (MCD LAB
SA). Este permaneció en agitación a 100 rpm durante siete días con la obtención de una
concentración de esporas de 2.9*107 esporas por mililitro (ml). (Figura 2)
Figura 2. Cepa de A. oryzae var. effussus en estado de esporulación.
32
Pasados siete días y tras el seguimiento del medio durante la esporulación en la solución
tensoactiva, mediante la cuantificación de esporas con la cámara de Neubauer se alcanzó
la concentración deseada por ml (2.9x107).
2.3 METODOLOGIA DE CONTEO DE ESPORAS
La cuantificacion o conteo de esporas se desarrolla por medio de la camara de Neubauer.
(Anexo D).
2.4 METODOLOGIA DE PREPARACION DE MEDIOS
Para el desarrollo de la producción de galactooligosacáridos GOS por vía fermentativa y
enzimática, se hace necesaria la preparación de medios distintos para cada proceso
como se describe a continuación:
2.4.1 Características del medio para la reacción enzimática con β-galactosidasa
comercial libre. (Maxilac l 2000) (Anexo E). Para el desarrollo y preparación de las
muestras a procesar con los diferentes sustratos (lactosa en polvo y lactosuero en polvo)
fue necesaria la elaboración de los medios que para las dos reacciones enzimáticas
propias a la enzima β-galactosidasa corresponden a un total del 89 % de tampón fosfato y
11 % p/v de lactosa en polvo o lactosuero en polvo24.
Para la preparación del tampón fosfato son necesarios fosfato sódico monobásico y
fosfato sódico bibásico, Ver especificaciones en el Anexo F, Además, se requiere que el
medio sea ajustado a un pH igual a 6.5 para su posterior esterilización en autoclave
vertical.
24
SÁNCHEZ, Oscar. Producción de galactooligosacáridos empleando células libres de Aspergillus oryzae UA1.
Universidad de los Andes. Departamento de Ingeniería Química, Departamento de Ciencias Biológicas, Colombia.
33
2.4.2 Características del medio para fermentación con A. oryzae var. effussus. Para
el desarrollo y preparación de las muestras a fermentar con los diferentes sustratos
(lactosa en polvo y lactosuero en polvo) fue necesaria la elaboración de los medios
estériles que para las dos fermentaciones propias al hongo A. oryzae var. effussus
corresponden a un total del 89 % de una solución constituida por (K2HPO4 0.84%,
MgSO4•7H2O 0.102%, KCl 0.088%, FeSO4•7H2O 0.007%, NaNO3•4H2O 0.085%, extracto
de levadura 2.0%, CaCO3 0.136%))25 y 11% p/v de lactosa en polvo y suero en polvo.
2.5 PREPARACION DE LA MUESTRA PARA LA REACCIÓN ENZIMÁTICA Y
FERMENTACION
Durante el desarrollo experimental se preparan cuatro muestras, dos para la reacción
enzimática por acción de la β-galactosidasa y dos para la fermentación por efecto del
hongo A. oryzae con los respectivos sustratos lactosa en polvo y lactosuero en polvo de la
siguiente manera: lactosa en polvo- β-galactosidasa y lactosuero en polvo- β-
galactosidasa para la primera y lactosa en polvo - A. oryzae y lactosuero en polvo - A.
oryzae para la segunda.
2.5.1. Características de la muestra para la reacción enzimática. Se parte de 300 ml
de muestra en erlenmeyer de 500 ml, la cual está constituida por 89% de tampón fosfato
(Sorensen), 11% de sustrato (lactosa en polvo o lactosuero en polvo) y 2000 U (1 gramo
de β-galactosidasa libre lactasa MAXILAC L 2000), ajustando el pH a 6.5 e incubando a
55 °C por 12 horas, tomando muestras por triplicado cada dos horas, las cuales son
sometidas a inactivación de la enzima por acción de temperatura a 100 °C por 5 minutos,
posteriormente se lleva a cabo centrifugación de las muestras a 1000 rpm durante 10
minutos y se almacena a congelación a -18 °C .
2.5.2. Características de la muestra para la fermentación. Al igual que en la reacción
enzimática, la muestra inicial corresponde a 300 ml y está constituida por 89% de
(K2HPO4 0.84%, MgSO4•7H2O 0.102%, KCl 0.088%, FeSO4•7H2O 0.007%,
25
Ibid
34
NaNO3•4H2O 0.085%, extracto de levadura 2.0%, CaCO3 0.136%), 11% de sustrato
(lactosa en polvo o lactosuero en polvo) y 2.9*107 esporas por ml de A. oryzae var.
effussus (1 ml)26, ajustando el pH a 5.5 e incubando a 30 °C y 200 rpm durante 24 horas
en agitador orbital GENESIS®, tomando muestras por triplicado cada cuatro horas, las
cuales son sometidas a inactivación de la enzima por acción de temperatura a 100 °C por
5 minutos. Posteriormente se lleva a cabo centrifugación de las muestras a 1000 rpm
durante 10 minutos y se almacena a congelación a -18 °C.
2.6 METODOLOGIA DE CUANTIFICACION DE GOS (DNS)
Ulterior al proceso de fermentación y reacción enzimática e inactivación a que fueron
sometidas las diferentes muestras correspondientes a: Lactosa en polvo- β-galactosidasa,
lactosuero en polvo- β-galactosidasa, Lactosa en polvo- A. oryzae y lactosuero en polvo-
A. oryzae para la cuantificación de la producción de GOS de dichas muestras es
necesario el desarrollo del siguiente protocolo:
Descongelar las muestras a temperatura ambiente, diluir y aforar la muestra en balones
aforados de 25 ml, en donde 100 µl de muestra se aforan con agua destilada,
posteriormente en tubos de ensayo se mezclan 500 µl de muestra diluida con 500 µl de
reactivo DNS. Por otro lado el blanco se prepara con 500 µl de reactivo DNS y 500 µl de
agua destilada en un tubo de ensayo. El total de las muestras se llevan a ebullición por 5
minutos y posteriormente se les adiciona 1000 µl de agua destilada y se enfrían con hielo
por 10 minutos, estas deben estar en un lugar oscuro debido a la sensibilidad del reactivo
DNS a la luz. Finalmente se introducen las muestras en las celdas para la tomar las
correspondientes lecturas en el espectrofotómetro.
Para identificar la concentración del analito (muestra problema) espectrofotométricamente
se hace necesaria la elaboración de una curva patrón ya que se debe relacionar la
concentración de dicho analito con la cantidad de luz que absorbe del haz que le incide27,
sabiendo que generalmente esta relación es aproximadamente lineal por lo que se
26
Ibid 27
MARTÍNEZ, Martha Aurora. DNS: Una técnica de cuantificación de azucares reductores. TESE. 2001.
35
prepara una solución estándar con una concentración conocida del analito y diversas
diluciones de la misma. Sin embargo para obtener dicha relación, se debe expresar
matemáticamente con ayuda de la ecuación de la recta Y=mX+b. En donde Y equivale a
la absorbancia por cada concentración, m la pendiente, X la concentración del analito y b
el punto de corte. (Anexo M)
Finalmente por medio de un balance se calcula el porcentaje de GOS obtenida para cada
tratamiento de la siguiente manera:
Debido a que los galactooligosacáridos GOS son los azúcares no reductores de acuerdo
a la ecuación anterior se puede decir que:
2.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para concluir la investigación se desarrolla un análisis estadístico descriptivo tanto para el
comportamiento de producción de GOS en la fermentación de los dos sustratos lactosa y
lactosuero en polvo con A. oryzae como para las reacciones enzimáticas de los mismos
sustratos pero con la enzima β-galactosidasa, debido a que con este tipo de análisis no se
pueden afirmar diferencias significativas. Posteriormente se desarrolla un modelo a dos
filas de clasificación con interacción entre el grupo y el tiempo con anidamiento de
individuos entre grupos, mediante los programas R y SAS.
36
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
3.1 CARACTERIZACIÓN DE MATERIAS PRIMAS
3.1.1 Determinación de lactosa (DNS) método espectrofotométrico (16051, AOAC,
1984). Anexo M.
En la Tabla 1 y 2 están determinados los valores a partir de los cuales se establece la
curva patrón para el método de cuantificación de azúcares DNS.
Tabla 1. Datos para curva de calibración
TUBO AGUA PATRON CONCENTRACION ABSORBANCIA
μl μl g/ml
1 450 50 0.0915 0.1
2 400 150 0.2745 0.3
3 250 310 0.567 0.58
4 100 450 0.8235 0.86
5 0 500 0.915 1.01
Tabla 2. Datos ecuación de la recta
R 0.9962
PENDIENTE 1.0745
CORTE -0.0042
37
De acuerdo a la ecuación de la recta se desarrollan los cálculos matemáticos de
concentración de lactosa presente en el analito (lactosuero en polvo) para lo cual se
emplea la siguiente ecuación:
A partir de la ecuación se observan los resultados de concentración de lactosa para el
analito en la Tabla 3.
Tabla 3. Resultados de concentración de lactosa en el analito (lactosuero en polvo)
FACTOR DILUCIÓN ABSORBANCIA CONCENTRACIÓN
1 0.83 0.7763611
1 0.848 0.79311308
1 0.867 0.81079572
1 0.83 0.7763611
1 0.843 0.78845975
1 0.831 0.77729176
PROMEDIO 0.78706375
38
Grafica 2.Concentración inicial de lactosa en el lactosuero en polvo
De acuerdo a la gráfica 2 se determina que el contenido de lactosa presente en el analito
(lactosuero en polvo) equivale a 78%, por lo que para llevar a cabo la preparación de los
medios para los diferentes tratamientos fue necesario calcular a cuanto suero equivalía
11% de lactosa inicial.
Acorde a la ficha técnica del lactosuero en polvo (Anexo J) se evidencia claramente que
el contenido de lactosa coincide con el que se obtuvo experimentalmente mediante el
método DNS (Grafica 2), por lo que se deduce que la técnica usada es la apropiada para
la cuantificación de azúcares en subproductos como el lactosuero en polvo.
3.1.2 Determinación de proteína (Kjeldahl) A.O.A.C. Official Methods of Analysis
13th Edition, 1984. (Anexo B). Para la determinación de proteína dentro de la muestra
de suero en polvo es necesario el uso de ciertos datos necesarios para el desarrollo del
cálculo matemático que este implica, el cual se ve reflejado en la Tabla 4.
Tabla 4. Datos para desarrollo matemático del método Kjeldahl
NORMALIDAD HCL 0.1
PESO NITROGENO 14
FACTOR DE PROTEINA (LECHE) 6.38
Fuente: INSTITUTO DE SALUD PUBLICA DE CHILE. Determinación de proteínas [en línea].
<http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/gdoc/ambiente%20pdf/proteina.pdf> [citado en 25 de noviembre de 2010].
0,74 0,76 0,78 0,8 0,82
1
2
3
4
5
6
Concentracion (g/ml)
Nu
me
ro d
e m
ue
stra
spromedio
Concentracion de lactosa
39
Tabla 5. Contenido de proteína en la muestra de lacto suero en polvo
MUESTRA W MUESTRA (g) Vol. HCl (ml) % PROTEINA
1 0.1397 1.57 10.038
2 0.1357 1.66 10.926
3 0.1426 1.88 11.776
Promedio 10.913
Grafica 3.Concentración de proteína en el lactosuero en polvo
De acuerdo a la Grafica tres el contenido de proteína dentro del suero en polvo
corresponde al 10% sin embargo en la ficha técnica de este producto (Anexo J) el
contenido de proteína equivale al 15 % en un valor máximo, lo que nos indica que el
procedimiento es adecuado ya que se encuentra dentro del límite de aceptación para este
producto, que difiere de acuerdo al tratamiento y/o proceso industrial del que proviene, ya
sea producto de quesos frescos o madurados, es decir sueros ácidos o dulces.
9.000 10.000 11.000 12.000
1
2
3
% de proteina
Nu
me
ro d
e m
ue
stra
s
promedio
Contenido de proteina en el lactosuero en polvo
40
3.1.3 Determinación de grasa (Soxhlet). Referencia: Official Methods of Analysis
A.O.A.C. 15th Edition, U.S.A. (1990). (Anexo C)
Tabla 6. Contenido de grasa en la muestra de lacto suero en polvo
W MATRAZ
VACIO (g)
W MUESTRA (g) W MATRAZ +
MUESTRA (g)
W FINAL
MATRAZ (g)
% GRASA
110.8219 3.0675 113.8894 110.9627 4.590
107.0473 3.0448 110.0921 107.1784 4.306
110.1516 2.7246 112.8762 110.2818 4.779
PROMEDIO 4.558
Grafica 4.Concentración de grasa en el lactosuero en polvo
De acuerdo a la gráfica 4 el contenido promedio de grasa en el lactosuero en polvo es de
4.558%, sin embargo en la ficha técnica de dicho producto (Anexo J) se establece que el
valor máximo para la misma equivale al 2%, lo que nos lleva a pensar que se presentaron
errores en el momento de llevar a cabo dicho análisis, los cuales pueden ser atribuidos a
al pesaje de la muestra inicial, además de no ser este método de cuantificación el más
apropiado para dichas muestras debido al bajo contenido de grasa en las mismas. Por lo
que se recomienda la búsqueda de un mejor método de cuantificación de grasa para este
tipo de producto.
4 4,5 5
1
2
3
% de Grasa
Nu
me
ro d
e m
ue
stra
s
promedio
% de Grasa presente en el lactosuero en polvo
41
3.2 CUANTIFICACIÓN DE GALACTOOLIGOSACARIDOS GOS
3.2.1 Cuantificación de azúcares reductores durante la transgalactosilación. Para los
dos tipos de fermentación y dos tipos de reacción enzimática se hace uso de los mismos
datos de curva de calibración ya que se busca cuantificar los azucares reductores
presentes dentro de cada muestra.
Datos de curvas de calibración: (Anexo N)
Punto de corte: -0.046
Pendiente: 1.654
Por otro lado en las Tablas 7 y 8 se evidencia el comportamiento presentado durante la
fermentación a la que fueron sometidas las diferentes muestras para los diferentes
sustratos (lactosa en polvo y lactosuero en polvo), en donde se denota claramente la
absorbancia para cada una de las fermentaciones y el posterior cálculo de concentración
de azucares para cada una de ella, además de esto también es posible ver la
concentración final de GOS obtenido para cada una de las tomas y cada una de las
muestras.
42
3.3 CONTEO DE ESPORAS DE A. ORYZAE
De acuerdo a antecedentes se establece que se debe contar con un mínimo inicial de
1x107 esporas por ml, sin embargo dentro de esta investigación se partió de una
concentración inicial de 2.9x107 esporas por ml.
Al realizar el conteo, se encontró que en los cuatro cuadrantes había un total de 118
células visibles por cada 0.1 µl. Aplicando la ecuación se obtiene el siguiente valor:
43
Tabla 7.TRANSGALACTOSILACION CON β-GALACTOSIDASA
REACCION ENZIMATICA ABSORBANCIA LACTOSA EN POLVO LACTOSA EN POLVO SUERO EN POLVO SUERO EN POLVO LACTOSA SUERO
MUESTRAS MUESTRAS DE LACTOSA MUESTRAS DE SUERO concentración en mg/ml concentración en % concentración en mg/ml concentración en % GOS EN % GOS EN %
TOMA 0
(HORA 0)
A1 0,689 0,679 0,444 11,109 0,438 10,958 -0,109 0,042
B1 0,690 0,682 0,445 11,125 0,440 11,004 -0,125 -0,004
C1 0,691 0,684 0,446 11,140 0,441 11,034 -0,140 -0,034
PROMEDIO 0,69 0,682 0,445 11,125 0,440 10,999 -0,125 0,001
TOMA 1
(HORA 2)
A1 0,738 0,718 0,474 11,85 0,462 11,548 -0,85 -0,548
B1 0,751 0,708 0,482 12,047 0,456 11,397 -1,047 -0,397
C1 0,74 0,75 0,475 11,88 0,481 12,031 -0,88 -1,031
PROMEDIO 0,743 0,725 0,477 11,926 0,466 11,659 -0,926 -0,659
TOMA 2
(HORA 4)
A2 0,618 0,666 0,401 10,036 0,43 10,762 0,964 0,238
B2 0,618 0,678 0,401 10,036 0,438 10,943 0,964 0,057
C2 0,61 0,687 0,397 9,915 0,443 11,079 1,085 -0,079
PROMEDIO 0,615 0,677 0,4 9,996 0,437 10,928 1,004 0,072
TOMA3
(HORA 6)
A3 0,577 0,545 0,377 9,417 0,357 8,933 1,583 2,067
B3 0,578 0,567 0,377 9,432 0,371 9,265 1,568 1,735
C3 0,57 0,579 0,372 9,311 0,378 9,447 1,689 1,553
PROMEDIO 0,575 0,564 0,375 9,386 0,369 9,215 1,614 1,785
TOMA 4
(HORA 8)
A4 0,402 0,479 0,271 6,771 0,317 7,935 4,229 3,065
B4 0,486 0,447 0,322 8,041 0,298 7,452 2,959 3,548
C4 0,498 0,459 0,329 8,222 0,305 7,633 2,778 3,367
PROMEDIO 0,462 0,462 0,307 7,678 0,307 7,673 3,322 3,327
TOMA 5
(HORA 10)
A5 0,39 0,373 0,264 6,59 0,253 6,333 4,41 4,667
B5 0,37 0,368 0,252 6,288 0,25 6,258 4,712 4,742
C5 0,328 0,346 0,226 5,653 0,237 5,925 5,347 5,075
PROMEDIO 0,363 0,362 0,247 6,177 0,247 6,172 4,823 4,828
TOMA 6
(HORA 12)
A6 0,39 0,359 0,264 6,59 0,245 6,122 4,41 4,878
B6 0,328 0,357 0,226 5,653 0,244 6,091 5,347 4,909
C6 0,369 0,358 0,251 6,273 0,244 6,106 4,727 4,894
PROMEDIO 0,362 0,358 0,247 6,172 0,244 6,106 4,828 4,894
44
La Tabla 7 muestra los porcentajes de lactosa y los porcentajes de los GOS producidos en cada uno
de los triplicados de las seis tomas recogidas durante la reacción enzimática producida tanto en el
lactosuero en polvo como para la lactosa en polvo por acción de la β-galactosidasa.
De acuerdo a los resultados establecidos en la Tabla 7 se evidencia que la relación sustrato (lactosa
en polvo o lactosuero en polvo) producto (GOS), es inversamente proporcional, ya que con el paso
del tiempo a medida que la enzima empieza la reacción de transgalactosilación la concentración de
lactosa disminuye y la concentración de prebióticos GOS aumenta. Se observa de la misma forma
que la producción de galactooligosacáridos se da en mayor cantidad en el suero que en la lactosa,
aunque esta diferencia es mínima (0.066).
En cuanto al mejor tiempo de producción para la reacción enzimática la Tabla 7 muestra como en la
hora 12 se presenta el mayor porcentaje de GOS producidos, sin embargo también es posible
observar que a partir de la hora 10 su comportamiento es prácticamente constante, por lo que se dice
que la producción luego de este tiempo no es significativa.
45
Tabla 8. TRANSGALACTOSILACION CON A. oryzae
FERMENTACION ABSORBANCIA LACTOSA EN POLVO LACTOSA EN POLVO SUERO EN POLVO SUERO EN POLVO LACTOSA SUERO
MUESTRAS MUESTRAS DE LACTOSA MUESTRAS DE SUERO concentración en mg/ml concentración en % concentración en mg/ml concentración en % GOS EN % GOS EN %
TOMA 1 (HORA 0)
A1 0,691 0,684 0,446 11,140 0,441 11,034 -0,140 -0,034
B1 0,699 0,687 0,450 11,261 0,443 11,079 -0,261 -0,079
C1 0,698 0,683 0,450 11,245 0,441 11,019 -0,245 -0,019
PROMEDIO 0,696 0,685 0,449 11,215 0,442 11,044 -0,215 -0,044
TOMA 2 (HORA 4)
A2 0,565 0,561 0,369 9,235 0,367 9,175 1,765 1,825
B2 0,520 0,593 0,342 8,555 0,386 9,658 2,445 1,342
C2 0,518 0,538 0,341 8,525 0,353 8,827 2,475 2,173
PROMEDIO 0,534 0,564 0,351 8,772 0,369 9,220 2,228 1,780
TOMA3 (HORA 8)
A3 0,465 0,461 0,309 7,724 0,307 7,663 3,276 3,337
B3 0,420 0,493 0,282 7,044 0,326 8,147 3,956 2,853
C3 0,418 0,438 0,281 7,013 0,293 7,316 3,987 3,684
PROMEDIO 0,434 0,464 0,290 7,260 0,308 7,709 3,740 3,291
TOMA 4 (HORA 12)
A4 0,400 0,419 0,270 6,741 0,281 7,028 4,259 3,972
B4 0,420 0,416 0,282 7,044 0,279 6,983 3,956 4,017
C4 0,440 0,420 0,294 7,346 0,282 7,044 3,654 3,956
PROMEDIO 0,420 0,418 0,282 7,044 0,281 7,018 3,956 3,982
TOMA 5 (HORA 16)
A5 0,390 0,375 0,264 6,590 0,255 6,363 4,410 4,637
B5 0,382 0,374 0,259 6,469 0,254 6,348 4,531 4,652
C5 0,375 0,361 0,255 6,363 0,246 6,152 4,637 4,848
PROMEDIO 0,382 0,370 0,259 6,474 0,252 6,288 4,526 4,712
TOMA 6 (HORA 20)
A6 0,383 0,370 0,259 6,484 0,252 6,288 4,516 4,712
B6 0,392 0,364 0,265 6,620 0,248 6,197 4,380 4,803
C6 0,371 0,369 0,252 6,303 0,251 6,273 4,697 4,727
PROMEDIO 0,382 0,368 0,259 6,469 0,250 6,253 4,531 4,747
TOMA 7 (HORA 24)
A6 0,371 0,369 0,252 6,303 0,251 6,273 4,697 4,727
B6 0,380 0,365 0,258 6,439 0,248 6,212 4,561 4,788
C6 0,392 0,367 0,265 6,620 0,250 6,242 4,380 4,758
PROMEDIO 0,381 0,367 0,258 6,454 0,250 6,242 4,546 4,758
46
La Tabla 8 muestra los porcentajes de lactosa y los porcentajes de los GOS producidos
en cada uno de los triplicados de las siete tomas recogidas durante la fermentación
producida tanto en el lactosuero en polvo como para la lactosa en polvo por acción del
hongo A. oryzae.
De acuerdo a los resultados establecidos en la Tabla 8 se evidencia que la relación
sustrato (lactosa en polvo o lactosuero en polvo) producto (GOS), es inversamente
proporcional, ya que con el paso del tiempo a medida que el hongo empieza la reacción
de transgalactosilación la concentración de lactosa disminuye y la concentración de
prebióticos GOS aumenta. Se observa de la misma forma que la producción de
galactooligosacáridos se da en mayor cantidad en el suero que en la lactosa, aunque esta
diferencia es pequeña (0.212).
En cuanto al mejor tiempo de producción para la fermentación la Tabla 8 muestra como
en la hora 24 se presenta el mayor porcentaje de GOS producidos, sin embargo también
es posible observar que a partir de la hora 20 su comportamiento es prácticamente
constante, por lo que se dice que la producción luego de este tiempo no es significativa.
47
3.4 ANALISIS ESTADISTICO
El tratamiento estadístico aplicado dentro este trabajo de grado se dividió en un análisis
estadístico descriptivo y en un modelo a dos vías de clasificación con interacción entre el
grupo y el tiempo con anidamiento de individuos entre grupos.
Además de esto, el desarrollo experimental descriptivo fue subdividido en dos partes en
donde en primer lugar se desarrolla el efecto de la enzima β-galactosidasa sobre los dos
tratamientos lactosuero en polvo y lactosa en polvo y en segundo lugar el del
microorganismo A. oryzae usando los mismos sustratos.
3.4.1 Análisis descriptivo del efecto de la enzima β-galactosidasa sobre los dos
tratamientos lactosuero en polvo y lactosa en polvo. En este experimento se evalúa
la obtención de GOS utilizando la enzima β-galactosidasa, en donde se pretende hallar
diferencias entre los dos tratamientos, lactosa en polvo y lactosuero en polvo, luego se
determinan las condiciones del proceso de fermentación por medio de pruebas a nivel de
laboratorio en erlenmeyer de 500 ml, cada uno es aplicado sobre tres unidades
experimentales en seis tiempos distintos en intervalos de 2 horas, para un total de 12
horas de fermentación.
Se plantean las siguientes hipótesis:
: No existen diferencias significativas entre el tratamiento que usa lactosa en polvo
como sustrato y el que usa lactosuero en polvo como sustrato para la producción de GOS.
Si existen diferencias significativas entre el tratamiento que usa lactosa en polvo como
sustrato y el que usa lactosuero en polvo como sustrato para la producción de GOS.
48
Tabla 9. Estadística descriptiva de los dos tratamientos (lactosa en polvo y lactosuero en
polvo)
Observando las estadísticas, diagramas de cajas, perfiles y densidades que se tienen
para los dos tratamientos a analizar (lactosa en polvo y lactosuero en polvo) se puede
decir que no existe una diferencia significativa entre tratamientos, por ejemplo, la media
de cada uno de estos no difiere significativamente la una de la otra, el promedio de la
lactosa es de 2.444 % y el del suero es de 2.374%. Igualmente se tiene una similitud
entre las demás medidas, el mínimo valor que toma la lactosa es -1.047% y el suero -
1.037%, claramente son valores bastante similares; las demás medidas como la mediana,
el máximo, primer y tercer cuartil también son valores muy cercanos entre estos
tratamientos. (Tabla 9)
Este mismo comportamiento de similitud entre los tratamientos se puede observar en el
gráfico de perfiles (Grafica 5), ambas tendencias describen perfectamente el
comportamiento de cada tratamiento en los diferentes tiempos, se tiene que en el
segundo tiempo es cuando existe mayor diferencia entre tratamientos, se observan
diferencias marcadas en los tiempos 2 y 5 aunque en general se pude decir que no existe
una diferencia marcada entre los dos tratamientos vistos a la luz de las unidades medidas.
Estadísticas lactosa
Mínimo 1er cuartil Mediana Media 3er cuartil Máximo
-1.047 0.994 2.234 2.444 4.41 5.347
Estadísticas Suero
Mínimo 1er cuartil Mediana Media 3er cuartil Máximo
-1.031 0.102 2.566 2.374 4.723 5.075
49
Grafica 5. Perfiles de crecimiento de galactooligosacáridos con β-galactosidasa
En el diagrama de cajas (Grafica 6) se observa la variabilidad del tratamiento de lactosa
en polvo a través del tiempo e igualmente se observa que el lactosuero en polvo tiene un
comportamiento homogéneo durante el desarrollo de toda la reacción, este
comportamiento se observa con más claridad en la gráfica de perfiles (Grafica 5), los
datos muestran como a través del tiempo el lactosuero en polvo crece más rápido en un
intervalo de tiempo menor, sin embargo a partir de la hora 6 y casi hasta la 12, la
producción de GOS se iguala teniendo un comportamiento constante y análogo para los
dos sustratos usados. Se observa claramente que en la hora 10 se alcanza el pico de
producción con 5.3% contra uno del 5.05% de la lactosa en polvo y el lactosuero en polvo
respectivamente.
50
Grafica 6. Diagrama de cajas del comportamiento de crecimiento de
galactooligosacáridos GOS.
Por último se reafirma la similitud en el comportamiento de los tratamientos observando la
gráfica de las densidades (Grafica 7), la cual muestra un comportamiento distribucional
similar entre los datos. Con este grafico se complementa la respuesta en cuanto a la no-
discrepancia significativamente marcada entre los dos grupos tratamiento, debido a esto
descriptivamente no es posible confirmar la existencia o no de diferencias significativas
entre el tratamiento que usa lactosa en polvo y el de lactosuero en polvo.
51
Grafica 7. Diagrama de densidades del comportamiento de crecimiento de
galactooligosacáridos GOS.
Otro factor que se puede analizar es la correlación que existe entre los tiempos de cada
tratamiento, se puede observar que en 4 casos se presentan altas correlaciones tanto
para la lactosa en polvo como para el suero en polvo (Tabla 10 y Tabla 11). La
superposición de la gráfica permite ver esta tendencia, sin embargo es necesario analizar
cada tiempo de forma independiente para poder comprobar las diferencias significativas
entre el uso de los dos sustratos.
52
Tabla 10. Matriz de correlaciones para el tratamiento con lactosa en polvo y β-
galactosidasa.
MATRIZ DE CORRELACIONES (Lactosa en polvo)
Tabla 11. Matriz de correlaciones para el tratamiento con lactuosuero en polvo y β-
galactosidasa.
MATRIZ DE CORRELACIONES (Suero en polvo)
T2 T4 T6 T8 T10 T12
T2 1.000 0.670 0.605 0.086 -0.919 0.209
T4
1.000 0.996 -0.680 -0.908 -0.584
T6
1.000 -0.740 -0.869 -0.651
T8
1.000 0.311 0.992
T10
1.000 0.190
T12
1.000
T2 T4 T6 T8 T10 T12
T2
1,000
0.372 0.475 0.523 0.060 -0.980
T4
1,000 0.993 -0.595 0.948 -0.183
T6
1,000 -0.500 0.906 -0.294
T8
1,000 -0.818 -0.680
T10
1,000 0.136
T12
1,000
53
Los valores resaltados permiten ver la similitud de los datos, siendo estos muy cercanos.
3.4.2 Análisis descriptivo del efecto del microorganismo A. oryzae sobre los dos
tratamientos lactosuero en polvo y lactosa en polvo. En este tratamiento se evalúa la
obtención de GOS utilizando el microorganismo A. oryzae, de la misma manera lo que se
pretende es hallar diferencias entre los dos tratamientos, lactosa en polvo y lactosuero en
polvo, determinando las condiciones del proceso de fermentación por medio de pruebas
realizadas en el laboratorio en erlenmeyer de 500 ml, cada uno es aplicado sobre tres
unidades experimentales en siete tiempos distintos tomando muestras cada 4 horas, para
un total de 24 horas de fermentación.
Al igual que para el comportamiento de la enzima β-galactosidasa, para el
microorganismo A. oryzae se analizaron estadísticas como la media y mediana, en las
cuales se tiene que los dos tratamientos a analizar (Lactosa en polvo y Suero en polvo) no
difieren significativamente entre sí. Se supone que no existe una diferencia significativa
entre tratamientos, dado que estas estadísticas toman valores muy similares, por
ejemplo la mediana de la lactosa es de 3.987 % y la del suero es de 3.972%, el
promedio para la lactosa es 3.33% y para el suero es 3.318%, claramente son datos muy
similares, igualmente se tiene para las demás medidas, por ejemplo, el máximo valor que
llega a tomar la lactosa es 4.697% y el suero 4.848%. Se puede identificar la cercanía de
otras medidas que nos ayudan a describir el comportamiento de estos tratamientos en la
Tabla 12.
Se plantean las siguientes hipótesis:
: No existen diferencias significativas entre el tratamiento que usa lactosa en polvo
como sustrato y el que usa lactosuero en polvo como sustrato para la producción de GOS.
54
Si existen diferencias significativas entre el tratamiento que usa lactosa en polvo como
sustrato y el que usa lactosuero en polvo como sustrato para la producción de GOS.
Tabla 12. Estadística descriptiva de los dos tratamientos (lactosa en polvo y lactosuero en
polvo) con A. oryzae.
Al analizar el diagrama de cajas (Grafica 8) se observa que el comportamiento de ambos
tratamientos en los diferentes tiempos, es bastante parecido en su mayoría, solo se
presenta una pequeña diferencia en el segundo y tercer tiempo, en los mismos que se
muestra el comportamiento asimétrico positivo que tienen los datos de la lactosa en polvo
y la variabilidad de los datos para el suero en polvo. Se observa adicionalmente una
reducción de variabilidad en los periodos finales de medición, razón por la cual se podría
pensar en una estabilización hacia el periodo de las 16 horas de fermentación, implicando
que el crecimiento de prebióticos se empieza a estabilizar.
Estadísticas lactosa
Mínimo 1er cuartil Mediana Media 3er cuartil Máximo
-0.261 2.475 3.987 3.33 4.516 4.697
Estadísticas Suero
Mínimo 1er cuartil Mediana Media 3er cuartil Máximo
-0.079 2.173 3.972 3.318 4.727 4.848
55
Grafica 8. Diagrama de cajas del comportamiento de crecimiento de
galactooligosacáridos GOS con A. oryzae.
En la gráfica de perfiles (Grafica 9), los datos nos muestran como a través del tiempo la
lactosa en polvo y el lactosuero en polvo crecen aparentemente a la misma velocidad
aunque tampoco es posible identificar que tratamiento crece más que otro. En los
diferentes tiempos se muestra como los dos tratamientos toman casi el mismo
comportamiento, tienen la misma tendencia, no se puede mencionar una diferencia
notable entre los dos tratamientos en este gráfico.
56
Grafica 9. Perfiles de crecimiento de galactoologosacáridos (GOS) con A. oryzae.
Por último se reafirma el comportamiento similar de los tratamientos observando la gráfica
de las densidades (Grafica 10), claramente se muestra que ambos tratamientos lactosa
en polvo y lactosuero en polvo tienen un mismo comportamiento, por lo tanto
descriptivamente se puede asegurar que aplicando cualquiera de los dos tratamiento ya
sea usando lactosa en polvo o lactosuero en polvo se van a obtener cantidades
prácticamente iguales de GOS, sin embargo es necesaria la comprobación de esto
aplicando un modelo adecuado para los datos.
57
Grafica 10: Diagrama de densidades del comportamiento de crecimiento de
galactooligosacáridos GOS con A. oryzae.
Al igual que para el tratamiento con la enzima β-galactosidasa, un factor que se puede
analizar y proporciona más información para concluir que en los dos tratamientos con
lactosa en polvo y lactosuero en polvo y A. oryzae la producción de GOS es muy similar
es la correlación que existe entre los tiempos de cada tratamiento, se puede observar en
las siguientes matrices que en 8 casos se presentan altas correlaciones para la lactosa
en polvo y 9 para el lactosuero en polvo, por ejemplo el tiempo 2 está muy correlacionado
con el tiempo 3 en ambos tratamientos, para el caso de la lactosa el tiempo 4 y el 5 se
encuentran altamente correlacionados negativamente, en cuanto al suero el tiempo 1 y el
4 tienen una alta correlación negativa; debido a esto se puede dar otra explicación del
comportamiento similar en ambas fermentaciones.
58
Tabla 13. Matriz de correlaciones para el tratamiento con lactosa en polvo y A. oryzae.
MATRIZ DE CORRELACIONES(Lactosa en polvo)
T0 T4 T8 T12 T16 T20 T24
T0 1.000 -0.987 -0.987 0.799 -0.821 0.040 0.746
T4
1.000 0.999 -0.884 0.901 0.118 -0.842
T8
1.000 -0.885 0.901 0.120 -0.843
T12
1.000 -0.999 -0.568 0.996
T16
1.000 0.537 -0.992
T20
1.000 -0.634
T24
1.000
Tabla 14. Matriz de correlaciones para el tratamiento con lactosuero en polvo y A. oryzae.
MATRIZ DE CORRELACIONES(Suero en polvo)
T0 T4 T8 T12 T16 T20 T24
T0 1.000 0.982 0.982 -0.999 0.646 -0.922 -0.713
T4
1.000 0.999 -0.984 0.777 -0.834 -0.570
T8
1.000 -0.985 0.776 -0.834 -0.572
T12
1.000 -0.656 0.917 0.704
T16
1.000 -0.300 0.073
T20
1.000 0.929
T24
1.000
59
3.5 ANÁLISIS DE EFECTOS DE TRATAMIENTOS
Los objetivos de esta parte del análisis son identificar posibles diferencias significativas en
los efectos que produce la enzima B-Galactosidasa y el microorganismo A. oryzae
sobre la lactosa en polvo y el lactosuero en polvo en el crecimiento de prebióticos, Y
determinar tanto para la lactosa en polvo, el lactosuero en polvo
5, la enzima y el microorganismo el tiempo en donde se obtuvieron mayores mediciones
de prebióticos. El experimento realizado, según autores, fue tomar tres unidades
experimentales para cada tratamiento y observar su evolución en diferentes tiempos
igualmente espaciados. Este tipo de estudios es denominado longitudinal, debido a la
presencia del tiempo.
3.5.1 Determinación de posibles diferencias entre efecto de la lactosa en polvo y el
lactosuero en polvo. El modelo usado para determinar si existen diferencias
significativas entre lactosa en polvo y el lactosuero en polvo es un modelo a dos vías de
clasificación con interacción entre el grupo y el tiempo con anidamiento de individuos
entre grupos.
En donde:
Representa la respuesta, que para este caso corresponde al crecimiento del
prebióticos en la condición , ya sea lactosa en polvo o lactosuero en polvo, para la
unidad experimental =1,2,3 en el tiempo, es decir cada triplicado, el cual va a variar:
para el primer caso de B-galactosidasa en seis tiempos con intervalos de medición de dos
horas comenzando en la hora 2 y para el segundo caso de A. oryzae con siete tiempos
con intervalos de medición de cuatro horas comenzando en la hora 0.
60
Se plantean las siguientes hipótesis:
: No existen diferencias significativas entre el tratamiento que usa lactosa en polvo
como sustrato y el que usa lactosuero en polvo como sustrato para la producción de GOS.
Si existen diferencias significativas entre el tratamiento que usa lactosa en polvo como
sustrato y el que usa lactosuero en polvo como sustrato para la producción de GOS.
3.5.2 Comparación entre los tratamientos con β-Galactosidasa. De acuerdo a la
aplicación del modelo sobre B-Galactosidasa arrojo los siguientes resultados:
Tabla 15. Análisis de varianza para organismo B-Galactosidasa
En la Tabla 15 se puede determinar que a un nivel de significancia del 5% no se rechaza
la hipótesis nula. Por lo tanto se podrá decir que los efectos en la aplicación de la lactosa
en polvo y el lactosuero en polvo producen el mismo crecimiento de prebióticos para la β-
galactosidasa, se podrá usar cualquiera de los dos tratamientos.
Parámetro Estimación Error estándar Valor t Valor-p
Tratamiento lactosa en polvo 4.841500000 0.24753168 19.56 <.0001
Tratamiento suero en polvo 4.815722222 0.24753168 19.45 <.0001
61
Tabla 16. Estimaciones de efectos
Luego de la interpretación de estos resultados (Tabla 16) se puede decir que el medio que
tiene como sustrato lactosa en polvo producirán un 4.84% de GOS en promedio. Mientras
que los tratados con suero en polvo un 4.81% en promedio. Así se puede ver que no
existen grandes diferencias entre los efectos de cada uno de los tratamientos.
3.5.3 Determinación de tiempo de máximo crecimiento con β-Galactosidasa. Para
determinar cómo es el crecimiento de los individuos a través del tiempo se ajusta una
recta para cada uno de los tratamientos permitiendo identificar en que tiempo se produce
un crecimiento mayor de prebióticos. Este tipo de curvas es denominado curvas de
crecimiento, las cuales tienen en cuenta el tiempo para su desarrollo.
A continuación se muestran las estimaciones de los parámetros para cada uno de los
tratamientos:
Parámetro Estimación Error estándar Valor t Valor-p
Intercepto Lactosa -0.141956667 0.00193647 -73.31 <.0001
Suero -3.572913333 0.00193647 -1845.1 <.0001
Pendiente Lactosa 0.3791800000 0.00070581 537.22 <.0001
Suero 0.7646833333 0.00070581 1083.41 <.0001
62
Tabla 17. Estimación de parámetros de la curva de crecimiento
En la Tabla 17 se observa que la velocidad de crecimiento de la lactosa en polvo es
menor que la del lactosuero en polvo, este ha sido el comportamiento general de los datos
a través del tiempo. Para este caso se tiene que el punto máximo de producción de
prebióticos ocurre en el tiempo 12: donde el tratamiento que usa lactosa alcanza una
producción de 4.40% y el lactosuero en polvo un 5.62%. Las curvas además permiten
determinar que el suero en polvo tiene un efecto menor en el comienzo del experimento
pero que para el tiempo 10 ha superado a la lactosa en polvo en la producción de GOS.
Los siguientes gráficos (Grafica 11 y Grafica 12) muestra la tendencia de la reacción
enzimática.
Grafica 11. Ajuste de curva de crecimiento para el comportamiento de GOS
63
Grafica 12. Ajuste de curva de crecimiento para el comportamiento de GOS
3.5.4 Aplicación de los tratamientos con el microorganismo A. oryzae. La variante
presentada en este experimento con respecto al anterior (β-galactosidasa) es la aparición
de un nuevo tiempo lo que hace que las curvas de crecimiento no se ajusten bien ya que
puede haber una gran influencia de correlaciones que impidan que no se estimen
adecuadamente los parámetros por esto para la parte de la búsqueda del tiempo en que
se da mayor producción de prebióticos se usa una regresión polinomial.
3.5.5 Comparación entre efectos de tratamiento con A. oryzae. Análogamente a lo
presentado para la enzima se implementa el modelo presentado anteriormente para este
caso. Los resultados se muestran a continuación (Tabla 18):
64
Tabla 18. Análisis de varianza para los tratamientos con el microorganismo A. oryzae.
En la Tabla 18 se puede determinar que a un nivel de significancia del 5% el tratamiento
con lactosa en polvo y lactosuero en polvo no son significativamente diferentes. Esto se
pudo apreciar previamente en la descripción inicial de los datos donde los perfiles no
presentaban una estructura particular en cada uno de los tratamientos, permitiendo
determinar de ante mano que posiblemente no existía diferencia alguna.
Las estimaciones de cada uno de los efectos de tratamiento de interés se muestran a
continuación (Tabla 19).
Tabla 19. Estimación de parámetros en organismo A. oryzae.
Parámetro Estimación Error estándar Valor t Valor-p
Tratamiento lactosa en polvo 4.604166667 0.16755295 27.48 <.0001
Tratamiento lactosuero en polvo 4.897388889 0.16755295 29.23 <.0001
La interpretación que se le da a los parámetros es análoga a la presentada en el caso
anterior. Luego se tiene que la producción que usa lactosa en polvo aumenta en promedio
a 4.60% y por otro lado la aplicación del suero en polvo aumenta un 4.89% para el
crecimiento de prebióticos
3.5.6 Ajuste de polinomio. Para este caso se usa una regresión polinomial es decir el
modelo usado para el ajuste de los datos en este caso en la determinación del máximo
65
asociado a la producción de prebióticos, el orden será dos asociado a una parábola ya
que el comportamiento de los datos implica un cierto tipo de comportamiento que se
describirá a través de este modelo. Luego el modelo es:
Los coeficientes y son los coeficientes lineales y es el coeficiente cuadrático
para cada uno de los tratamientos.
Luego las estimaciones en cada caso están dadas a continuación (Tabla 20):
Tabla 20. Estimaciones
Coeficientes Estimación Error
estándar
Valor-t Valor-p
Lactosa 0.093 0.1606 0.579 0.566
Suero 0.012 0.1606 0.076 0.940
Tiempo*Lactosa 0.514 0.0313 16.410 <0.001
Tiempo*Suero 0.487 0.0313 15.55 <0.001
Tiempo2*Lactosa -0.014 0.0012 -11.24 <0.001
Tiempo2*Suero -0.0122 0.0012 -10.16 <0.001
Entonces el modelo para el tratamiento con lactosa en polvo será:
Y para el suero en polvo es:
Entonces para encontrar el máximo se deriva y se iguala a cero, dando como resultado:
66
Luego se observa que el punto máximo es alcanzado por el tratamiento que usa
lactosuero en polvo alrededor del tiempo 20. Las siguientes graficas (Grafica 13 y Grafica
14) muestran el comportamiento del modelo frente a los datos.
Grafica 13. Ajuste polinomial para el efecto de crecimiento de galactooligosacáridos
(GOS)
67
Grafica 14. Ajuste polinomial para el crecimiento de GOS
Tabla 21. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosa en polvo-Enzima)
LACTOSA EN POLVO B-GALACTOSIDASA
% A REDUCTORES % GOS
9.996 1.004
9.386 1.614
7.678 3.322
6.177 4.823
6.172 4.828
68
Grafica 15. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosa en polvo-Enzima)
De acuerdo a la gráfica 15 se observa un comportamiento inversamente proporcional
debido a que el sustrato (lactosa) es hidrolizado y por ende se producen trisacáridos y
tetrasacáridos que corresponde al % de prebióticos galactooligosacáridos GOS. En donde
en la primera y segunda toma se observa que la producción de GOS es cero ya que no se
ha empezado la reacción enzimática, esta empieza solo hasta la toma tres, mostrando
una mayor producción en las tomas seis y siete, siendo estas dos últimas muy parecidas,
por lo que se dice que tienen a tener un comportamiento constante.
Tabla 22. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosuero en polvo-Enzima)
LACTOSUERO EN POLVO - B-GALACTOSIDASA
% A REDUCTORES % GOS
10.999 0.001
10.928 0.072
9.215 1.785
7.673 3.327
6.172 4.828
6.106 4.894
0 5.000 10.000 15.000
CONCENTRACIONES (%)
NU
MER
O D
E TO
MA
S A
PA
RTI
R
DE
LA T
RES
% de GOS
% de Azucares reductores
69
Grafica 16. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosuero en polvo-Enzima)
Al igual que en la gráfica 15 en la gráfica 16 se observa un comportamiento inversamente
proporcional debido a que el sustrato (lactosa presente en el lactosuero) es hidrolizado y
por ende se producen trisacáridos y tetrasacáridos que corresponde al % de prebióticos
galactooligosacáridos GOS. En donde en la primera toma se observa que la producción
de GOS es cero ya que no se ha empezado la reacción enzimática, al igual que en la
toma cero ya que en este caso no se ha adicionado la enzima dentro de la muestra.
Tabla 23. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosa en polvo-Hongo)
LACTOSA EN POLVO - A. oryzae
% A REDUCTORES % GOS
8.772 2.228
7.26 3.74
7.044 3.956
6.474 4.526
6.469 4.531
6.454 4.546
0 5.000 10.000 15.000
1
2
3
4
5
6
CONCENTRACIONES (%)
NU
MER
O D
E TO
MA
S
% GOS
% de Azucares reductores
70
Grafica 17. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosa en polvo-Hongo)
En la gráfica 17 se observa un comportamiento inversamente proporcional debido a que el
sustrato (lactosa) es hidrolizado y por ende se producen trisacáridos y tetrasacáridos que
corresponde al % de prebióticos galactooligosacáridos GOS, al igual que en la gráfica 15
y 16. En donde en la toma cero se observa que la producción de GOS es cero ya que no
se ha empezado la reacción enzimática y por ende no hay presencia de prebióticos, por
otro lado la toma uno muestra que el hongo ha empezado a actuar sobre la lactosa
produciendo a si los galactooligosacáridos GOS.
Tabla 24. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosuero en polvo-Hongo)
LACTOSUERO EN POLVO - A. oryzae
% A REDUCTORES % GOS
9.22 1.78
7.709 3.291
7.018 3.982
6.288 4.712
6.253 4.747
6.242 4.758
0 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000
1
2
3
4
5
6
CONCENTRACIONES (%)
NU
MER
O D
E TO
MA
S
% de GOS
% de azucares reductores
71
Grafica 18. Comportamiento del sustrato Vs producto (Lactosuero en polvo-Hongo)
La grafica 18 muestra un comportamiento inversamente proporcional entre el sustrato y la
producción de prebióticos en donde en las tomas cero y uno no se cuenta con una
producción de GOS mientras que de la dos en adelante se ve como al aumentar los GOS
disminuye la lactosa, y en las dos últimas tomas el comportamiento en cuanto a la
producción de prebióticos tiende a ser constante.
0 2000 4000 6000 8000 10000
1
2
3
4
5
6
CONCENTRACIONES (%)
NU
MER
O D
E TO
MA
S% de GOS
% de Azucares reductores
72
4. CONCLUSIONES
La cantidad de lactosa obtenida experimentalmente fue del 78%, que corresponde al
mismo valor dado en la ficha técnica y es el componente de mayor importancia para el
desarrollo de la metodología, lo que asegura que se prepararon medios adecuados para
la experimentación.
Los resultados de este trabajo arrojan que no es necesario el desarrollo industrial y
tecnológico que implica la extracción de lactosa para la producción de GOS ya que no se
presentan diferencias significativas si el proceso es desarrollado a partir de lactosuero en
polvo; la muestras que contienen lactosa y suero con β-galactosidasa produjeron un
4.82% y 4.89% respectivamente, además la velocidad de producción con el suero es
mayor que la lactosa observando el comportamiento entre las horas 4 y 8, que son
mayores que la lactosa variando de 0.07% a 3.32%, mientras que en la lactosa la
producción en este tiempo es del 2.3%.
En el tratamiento de lactosa en polvo y lactosuero en polvo con el microorganismo A.
oryzae el punto máximo alcanzado esta alrededor de la hora 20 con un 4.8% y en cuanto
al uso de la enzima β-galactosidasa y el microorganismo A. oryzae la mejor producción
de prebióticos galactooligosacáridos GOS se da con la enzima a la hora 10 con un 4.87%
contra un 4.54% producido por el hongo.
El comportamiento del sustrato frente a la producción de galactooligosacáridos es una
relación inversamente proporcional ya que cuando se hidroliza la lactosa la formación de
estos aumenta.
73
De acuerdo al análisis estadístico aplicado con un nivel de significancia de 5% para el
tratamiento de lactosa en polvo y lactosuero en polvo en presencia del microorganismo A.
oryzae y enzima β-galactosidasa se concluye que no existen diferencias estadísticamente
significativas entre los sustratos, también se observa que en el tratamiento de lactosa y
lactosuero en polvo con enzima β-galactosidasa el punto máximo de producción de
prebióticos ocurre en la hora 12 en donde la lactosa alcanza una producción de 4.40% y
el suero un 5.62%.
Debido a que no se presentan diferencias significativas entre los tratamientos usados se
puede aplicar cualquiera de estos para la producción de galactooligosacáridos, sin
embargo basándose en la experimentación se recomienda usar el medio que está
compuesto por lactosuero en polvo como sustrato, usando enzima β-galactosidasa, con
un tiempo total de 10 horas de reacción.
74
5. RECOMENDACIONES
Para próximos trabajos realizar comparaciones entre suero líquido y suero en polvo, para
verificar si se puede omitir el cambio de estado y de esa manera reducir costos.
Realizar la cuantificación de galactooligosacáridos en HPLC, ya que es el equipo que
tiene una mayor precisión para este tipo de muestras, obteniendo datos mucho más
confiables.
Cuando se realice la toma de muestras, se deben tomar más de las necesarias es caso
de que alguna se pierda o dañe durante el procedimiento.
Se deben tener más datos por cada intervalo de tiempo en las muestras realizadas para
que el desarrollo del análisis estadístico sea más confiable.
75
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febrero de 2010].
78
ANEXOS
ANEXO A: Determinación de lactosa (DNS) método espectrofotométrico (16051,
AOAC, 1984)
Para la cuantificación de dichos azucares es necesaria la elaboración del reactivo DNS y
posterior determinación de la curva patrón con la cual se determinara la concentración del
analito en la muestra problema a partir de la ecuación de la recta.
Preparación del reactivo DNS: Para la preparación de 500 ml es necesario el uso de: 5g
de hidróxido de sodio granular, 5 g de ácido dini-trosalicilico, 0.5 g de sulfito de sodio
anhidro y 0.1 g de fenol, los cuales serán totalmente disueltos.
Todas las muestras, tanto las que componen a la curva patrón como las que constituyen
el problema, deberán tratarse utilizando el procedimiento que se describe a continuación:
Se deberá tener un ml total de muestra. Cuando se requiera de una dilución, se
pondrá una cantidad adecuada (menor a un ml) de la muestra que contiene el
azúcar, y se complementará a un ml utilizando agua destilada. De tal forma que, si
se utilizan 0.5 ml de muestra, se deberá agregar 0.5 ml de agua, para completar
un ml.
Una vez completado el volumen, se agregarán 3 ml de reactivo DNS y se
someterán a ebullición durante cinco minutos. Los tubos se podrán enfriar al
chorro del agua o bien podrán dejarse enfriar por si solos hasta que alcancen la
temperatura ambiente.
Se deberán agregar 6 ml de agua, para completar un volumen final de 10 ml, y se
agitaran en el vórtex.
Los tubos deberán leerse a 550 nanómetro, calibrando con el blanco, el cual
contiene todos los reactivos, excepto el problema. Es decir, contiene un ml de
agua, tres ml de DNS y seis ml de agua.
79
ANEXO B: Determinación de proteína (Kjendahl) A.O.A.C. Official Methods of
Analysis 13th Edition, 1984
a.- Digestión:
Añadir 25 ml (sueros de leche) e introducirlos en los tubos de digestión.
Añadir 2 pastillas de catalizador.
Añadir 15 ml de H2SO
4 concentrado.
Para el ensayo en blanco, operar de la misma manera sin añadir muestra.
Colocar los tubos de digestión en el bloque digestor bajo campana de extracción
de humos, conectar la trompa de vacío y el extractor. Ajustar la temperatura del
bloque digestor a 420o
C (para sueros precalentar 45 min a 150ºC para evaporar
agua) y digerir durante 90 min. Pasado este tiempo, sacar los tubos del digestor y
dejarlos enfriar en una gradilla bajo la campana de extracción de gases.
Añadir suavemente 70 ml de agua destilada a cada tubo antes de su destilación.
b.- Destilación - Valoración:
Comprobar que el equipo está listo para realizar la destilación y asegurarse de que
ha sido anotado el valor obtenido previamente.
Abrir la trampa frontal del destilador, introducir el tubo de inyección de vapor en el
tubo de digestión y ajustarlo a la boca de destilación. Cerrar la trampa frontal y
comprobar que se realiza la descarga de la cantidad de NaOH en exceso
previamente fijada (75 ml).
Esperar hasta que se complete el volumen del vaso de valoración, para asegurar
que se ha destilado todo el amonio contenido en la muestra, comprobando que se
produce el viraje de color verde a rojo-grisáceo. El equipo debe detener
automáticamente la destilación cuando se haya completado el volumen fijado de
destilación.
80
Anotar el volumen de HCl de la valoración y proceder a continuación a retirar la
muestra analizada (utilizar un guante de protección para calor), levantando la
trampa frontal del destilador. El equipo realizará la descarga automática del vaso
de valoración.
A continuación se muestra la ecuación empleada para la determinación de % de proteína
en el analito.
81
ANEXO C: Determinación de grasa (Soxleth) .Referencia: Official Methods of
Analysis A.O.A.C. 15th Edition, U.S.A.(1990)
Preparación de la muestra:
Pesar en duplicado 2 a 5 gramos de muestra preparada en el dedal de extracción o papel
filtro previamente pesado, sellarlo y registrar el peso.
Pesar el matraz de extracción previamente tarado y registrar el peso.
Adicionar 150ml de éter de petróleo en el matraz.
Poner el matraz de extracción en el sistema soxhlet, el dedal en el tubo de
extracción.
Extraer la muestra con el solvente por 3 horas.
Una vez terminada la extracción eliminar el solvente por destilación.
Secar el matraz con la grasa en estufa a 103+ 2°C por 10 min, enfriar en
desecados y pesar. Registrar el peso.
A continuación se muestra la ecuación empleada para la determinación de % de grasa en
el analito.
En donde:
W final del matraz: Equivale al peso final del matraz
W del matraz vacio: Equivale al matraz vacio
W de la muestra: Equivale al peso inicial de la muestra
82
ANEXO D: Metodología de conteo de esporas (cámara de neubauer)
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo
claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula
como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre
dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida
0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste
dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie
L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
Si se cuentan las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las
cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: Concentración en la
suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
83
ANEXO E: Ficha técnica, enzima β-Galactosidasa MAXILACT L200
84
ANEXO F: Metodologia de preparacion de tampón fosfato(sörensen)
Soluciones Stock:
A: Solución 0.2M de fosfato sódico monobásico (27.8g en 1000ml de agua destilada)
B: Solución 0.2M de fosfato sódico dibásico (53.65g de Na2HPO4·7H2O
o 71.7g de Na2HPO4·12H2O en 1000ml de agua destilada)
x ml de A + y ml de B y diluido a un total de 200 ml con agua destilada:
x y pH x y pH
93.5 6.5 5.7 45.0 55.0 6.9
92.0 8.0 5.8 39.0 61.0 7.0
90.0 10.0 5.9 33.0 67.0 7.1
87.7 12.3 6.0 28.0 72.0 7.2
85.0 15.0 6.1 23.0 77.0 7.3
81.5 18.5 6.2 19.0 81.0 7.4
77.5 22.5 6.3 16.0 84.0 7.5
73.5 26.5 6.4 13.0 87.0 7.6
68.5 31.5 6.5 10.5 90.5 7.7
62.5 37.5 6.6 8.5 91.5 7.8
56.7 43.5 6.7 7.0 93.0 7.9
51.0 49.0 6.8 5.3 94.7 8.0
85
ANEXO G: Ficha técnica autoclave vertical
AUTOCLAVE VERTICAL
1. Panel de control
2. Interruptor de encendido
3. Canastillas internas
4. Tanque de desechos
5. Válvula de drenado
6. Tapa
7. Cámara de esterilización
8. Manómetro
9. Sistema de refrigeración
1. ESPECIFICICACIONES TECNICAS
Función Esterilización por calor húmedo
Marca SANYO
Modelo MLS-3781L
Serial 780050
Dimensiones Externas 478An X 632Pr X 748 Al
Dimensiones Cámara 370 (dia) X 630 (Pr)
2
1
3
4
6
5
8
9
7
86
Capacidad Interna: 80L. Efectiva: 75L
Peso 71 kg
Consumo 4 kW
Suministro de poder: 220V unit: 220VAC (50/60Hz), 18.2A
Fluctuaciones de corriente: +/- 10% del voltaje nominal
Temperatura de esterilización: 115ºC - 135ºC
Altitud máxima de operación: 0 – 3000m
Rango de Tº ambiente: 5 a - 40ºC
Ambiente de uso Bajo techo
Humedad relativa máxima: 50 – 80%
Material de construcción Cámara: Acero inoxidable. Tanque: polietileno
Termómetro: Display digital (25-141ºC)
Activación válvula seguridad: 240kPa (34.8psi, 2.4bar)
Cronómetro Año, mes, día, hora y min. Esterilización:1min–5hrs
Requisitos hidráulicos: 2 litros
Tanque de descargue: 2 litros.
Advertencias y seguridad: Válvula de presión de seguridad, sobrecalentamiento,
secado, presión excesiva.
Accesorios
Tres canastillas en acero inoxidable
Manguera de desagüe.
Tanque de desechos
87
AUTOCLAVE VERTICAL
2. PROTOCOLO BASICO DE MANEJO
2.1. Prepare e Instale el Tanque de desechos
Retire el tanque y colóquele agua limpia hasta el nivel bajo.
Instálelo nuevamente asegurándose de haberlo conectado correctamente.
2.2. Prenda el equipo presionando ON;los displays del panel de control se iluminarán.
2.3. Abra la tapa.
Para abrirla tapa el equipo debe estar en ON
El indicador de presión debe indicar 0
La luz indicadora del seguro de la puerta debe estar apagada (COVER LOCK)
La tapa se abre presionando la cara interna de la manija.
2.4. Coloque el agua de calentamiento
2.5.Cierre la válvula de drenaje
2.6. Coloque el material a esterilizar y cierre la puerta
2.7. Presione el botón selector de ciclo
2.8. Presione el botón de arranque
2.9. Espere a que termine el ciclo
2.10. Saque el material
2.11. Presione OFF
2.12. Retire el agua de calentamiento
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Precauciones:
Nunca introduzca productos inflamables, explosivos, oxidantes o combustibles
dentro del equipo.
Evite colocar sustancias corrosivas dentro del equipo.
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ANEXO H: ficha técnica AGAR DEXTROSA DE PAPA
90
ANEXO I: ficha técnica AGAR DEXTROSA SABOURAUD
91
ANEXO J: ficha técnica SUERO EN POLVO
92
ANEXO K: ficha técnica LACTOSA EN POLVO
93
ANEXO L: Protocolo de activación del A. oryzae según la USDA (Departamento de
agricultura de Estados Unidos)
94
ANEXO M:Curva de patrón método DNS
Tabla 1. Datos para curva de calibración
TUBO AGUA PATRON CONCENTRACION ABSORBANCIA
μl μl g/ml
1 450 50 0,0915 0,1
2 400 150 0,2745 0,3
3 250 310 0,567 0,58
4 100 450 0,8235 0,86
5 0 500 0,915 1,01
Grafica 1. Curva Patrón (Técnica DNS)
y = 1,0687xR² = 0,9962
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ab
sorb
anci
a
Concentracion (g/ml)
Curva Patron
Series1
Lineal (Series1)
95
ANEXO N: Curvas de patrón método DNS para cuantificación de GOS
