Composición de los aceites esenciales de plantas del ... · campe de los aceites esenciales...

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

TESIS DOCTORAL

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR

Pilar María Morera Marante

DIRECTOR:

José Calderón Martínez

Madrid, 2015

© Pilar María Morera Marante, 1981

Composición de los aceites esenciales de plantas del género

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COMPOSICION DE LOS ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS DEL GENERO TEUCRIUM

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Director: Dr. D. José Calderon Martmez Profesor de Investigaciôn del C.S.I.C.

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFacultad de Ciencias

Departamento de Qufmica OrgénicaAno 1981

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE - MADRIDFacultad de Ciencias Quimicas

B I B L I O T E C A

N- Ranistro 0- A-i t ..........

I N S T I T U T O DE Q U I M I C A O R G A N I C A G E N E R A L

Este trabajo ha sido realizado en el - Institute de Qufmica Orgânica General del Censé jo Superier de Investigacienes Cientfficas, en la Unidad Estructural de Investigacidn de - Anâlisis Instrumental, baje la direccidn del - Dr. D. Jesé Calderdn Martinez, Prefeser de Investigaciôn y del Dr. D. Jesds Sanz Perucha, - Celaberader Cientffice, a quienes exprese mi - mas sincere agradecimiente.

Agradezce asimisme a la Direcciôn del Institute las facilidades cencedidas para la realizaciôn del trabaje, y al Censeje Superier de Investigacienes Cientfficas la cencesiôn de una Beca cen este fin.

También hage censtar mi agradecimiente al Dr. D. Enrique Valdés Bermeje y Dr. D. Jesé Berja Carbenell per su ayuda en el aspecto bo- tânice de este trabaje.

I N D I C E

INTRODÜCCION 4I. PLAN DE TRABAJO 17II. PARTE EXPERIMENTAL 20

11.1 ACEITES ESENCIALES ESTUDIADOS 20

11.2 METODOS INSTRUMENTALES 2511.2.1 METODOS DE OBTENCION Y PRACCIONAMIENTO DEL

ACEITE 2511.2.1.1 Obtenciôn del aceite 2511.2.1.2 Fraccionamiento de los aceites 2611.2.2 METODOS DE IDENTIFICATION Y DETERMINACION

CUANTITATIVA 2811.2.2.1 Cromatografia de gases (GC) 28

a) Identificaciôn de componentes 28b) Andlisis cuantitativo 29c) Preparaciôn de las columnas capilares 31

Consideraciones générales 31Métodos de recubrimiento 37Tipos de columnas preparadas 38

d) Condiciones de trabaje 43

11.2.2.2 Espectremetrfa de masas (MS) 44

11.2.2.3 Espectroscopla infrarro.ja (IR) 4511.2.2.4 Resonancia magnética nuclear (RMN) 46

III. RESULT ADOS T DISCUSION 47111.1 IDENTIFICACION DE LOS COMPONENTES DE ACEITES

ESENCIALES DE PLANTAS DEL GENERO TEUCRIUM 47111.2 ANALISIS CUANTITATIVO 113

111.3 COMPARACION DE RESULTADOS 114

CONCLUSIONES 149

BIBLIOGRAPIA 154

I N T R O D Ü C C I O N

El estudio de los productos procedentes de la destilaciôn de las plantas se remonta a la época de la Alquimia. El nombre de aceites esenciales, cômo actualmente se denominan, parece procéder de la misma época, El término aceite indica su insolubilidad en - agua y aspecto oleoso, mi entras que el calificativo de esencial, - debe procéder de que al destilado, se le consideraba como principle active o esencial de la planta.

Estes aceites esenciales vienen aprovechéndose con fines practices desde tiempos inmemoriales en los diverses paises del - mundo. Proceden, en general, de la flora aromâtica localizada prin- cipalmente en el arbus cul e turn o matorral, que en nuestro pals ocupa unes catorce millones de bectâreas (1).

Es de destacar que, en le que se refiere a Europa, debido a las condiciones climatolégicas, las plantas arométicas abundan en los paises de la Cuenca Mediterrénea, ocupando nuestra peninsula un lugar prominente. La diversidad, ri que z a y finura de los aceites - esenciales procedentes de nuestra flora endémica son univers aiment e reconocidas, lo que convierte a nuestro pals, en determinados casos, en el principal y dnico proovedor mundial de alguno de elles.

Como date de referenda con relacién a la importancia de - nuestros aceites esenciales, **La Industrie Qulmica de Espana”, edi-

tada por el Consejo de Câmaras Oficiales de Comercio y Navegaciôn, destaca que la producciôn espahola sobrepasô los 2.000 millones - de pesetas en 1.978# La principal industrie consumidora hoy de estes productos es la perfumerla, siguiéndole en import ancia, las - de alimentaciôn.

Es évidente que, ante una fuente de riqueza tan relevante, se haga ne ce sari o un planteamiento global de investigaciôn en el campe de los aceites esenciales nacionales, en especial de los - procedentes de plantas no estudiadas hasta la fecha, y de las que ya poseen un reconocido interés industrial. Un proyecto que abar- que toda la problemâtica, con la colaboraciôn de distintos especialistas, no ha sido acometido en nuestro pals como se merece, pues, que sepamos, solo existen trabajos muy meritorios, pero limit ado s a aspectos muy particulares.

Si tenemos en cuenta la materia prima, es decir, las plantas aromâticas, es de destacar que no ha sido ni siquiera iniciado hasta ahora un estudio sistemâtico de nuestra flora endémica como fuente potencial de nue vos aceites. La import ancia de esta faceta del conocimiento puede justificarse por el hecho de que, por ejem- plo, el aceite de Thymus mas ti china L. se produce so lamente en - nuestro pals, y es sorprendente el éxito del mismo en un mere ado tan competitivo como los Est ado s Unidos, a pesar de que en opiniôn de Actander (2) su calidad es inferior a la esencia de la "mejorana fina".

Siguiendo en esta direcciôn, tanto en lo que se refiere a los aceites esenciales indus tri alizados como a los no estudiados, una llnea de investigaciôn avanzada debiera tener en cuenta si las variaciones de calidad y rendimiento de las distintas plantas son

debidas a circunstancias de Indole genética, y si se pueden corre- gir o mejorar por tratamientos adecuados. Por otro lado, un estudio de las condiciones edâficas y climatolôgicas sobre las distintas especies, las fechas de recolecciôn, cultives controlados y estado vegetative de la planta podrlan completar esta llnea de trabajo. - Es de destacar, por dltimo, la poca atenciôn que se presta en nuestro pals a una recolecciôn esmerada y selective, sobre todo cuando esta operaciôn se realiza con especies muy parecidas que se prèsen- tan juntas,

Todos estes factores hay que tenerlos muy en cuenta si se quieren conseguir calidades totalmente normalizadas de nuestros - aceites, ya que la enorme competencia de la qulmica de slntesis - puede conducir a una dévaluéeiôn de aquellos.

Si pasamos a considérer los procedimientos industriales de obtenciôn de los aceites, nos encontraremos con que suelen ser bastante primitives, numerosos y variados, con indudable influencia sobre la calidad. S in duda la mayorla de las objeciones que se ha- cen a nue stras esencias obedecen a esta causa, s in olvidar tampoco que, en ocasiones, se deben a manipulaciones de vendedores desa- prensivos. A es cala de laboratorio, los aceites se extraen en general de la planta por arrastre con vapor de agua, empleando aparatos que permiten la reciclaciôn de la misma.

Como se sabe, los aceites esenciales, estén constituldos por mezclas liquidas muy complejas, caracterizadas fundamentaimente por su aroma, relative volatilidad e insolubilidad en agua.

Los componentes de un aceite esencial se hall an en concentraciones muy diverses. En alguno s casos, un components fundamental

puede superar el 80 ^ de la mezcla, mientras que la mayorla de - ellos se presentan en cantidades traza. Entre sus componentes des- tacan los de naturaleza terpénica, casi exclusivamente mono y sesquiterpenes. Pero también aparecen, a veces en gran proporcién, - compuestos no terpénicos, tanto aromâticos como aliféticos. Todos los compuestos presentan funciones quimicas muy variadas, encon- trândose, entre ellos, hidrocarbures, éteres. ésteres, aldehidos, cetonas, alcoholes, fenoles y âcidos (mencionados en orden de - polaridad creciente).

Para una determinada esencia mâs que hablar de "constan- ci a" de composicién, bay que considerar una "elasticidad" de la - misma, porque la composicién y todas las propiedades funciones de aquella varlan incluse en una planta individual segdn el érgano de procedencia (hojas, corteza, fruto, etc.), con la época de recolec- cién, con las condiciones climâticas durante el ciclo vegetative, con el almacenamiento, con el método de destilacién u obtencién, - con la composicién y vejez de la esencia, etc.. Esta elasticidad en la composicién es lo que ha condicionado el e stable cimi ente de limites méximos y minimes de riqueza de los componentes que dan v valor a cada esencia, y de las constantes o caracterlsticas flsicas y quimicas que se determinan en el control analltico comercial.

D entre de una misma ©specie de plantas existen las llama- das variedades quimicas, indiferenciables botanicamente de la - forma "tipo", que se distinguen por proporcionar esencias de composicién diferente (3)* Recordemos que los botânicos han designado como "tipo" al ejemplar a partir del cual fue descrita, por primera vez, la especie o forma. A estas variedades se las denomina formas fisiolégicas de la especie "tipo", y también razas fisiolégicas o quimicas, y "tipos" qulmicos.

Los anâlisis sistemâticos de control y hasta de identifi- cacién de los aceites se han venido realizando durante muchos ano s por medida de sus constantes flsicas e Indices qulmicos, y por la ohservacién de las caracterlsticas organolépticas. La evaluacién de los componentes de interés comercial se basaba en la determina- cién de los Indices adecuados, que tenlan el inconveniente de no haber sido determinados siguiendo métodos y procedimientos anallti- cos dnicos y normalizados.

El gran desarrollo de las técnicas instrumentales mode m a s han contribuido a facilitar el estudio de los aceites esenciales. - La introduccién rut inaria de la cromatografia gas-llquido (CGL) en los laboratorios de estudio y control de aceites esenciales ha conducido a un mejor conocimiento de estas mezclas complejas. Es sin duda la mejor técnica de separacién y determinacién cuantitativa - de los componentes y ayuda eficazmente a su identificàcién, si se dispone de los correspondientes patrones. La cromatografia de gases preparativa permit© ob tener componentes puros en cantidad sufi ci ente para su estudio analltico con otras técnicas complementarias.

La cromatografia en columna (CC) se utiliza especialmente para el enriquecimiento de fracciones, que por destilacién fracci onada podrlan dar lugar a fenémenos de descomposicién, polimeri- zacién o transposicién. Ademâs es posible utilizarla cuando se dispone de mlnimas cantidades de aceite. En general se emplean como - adsorbentes gel de silice o aldmina. En alguno s casos se ha utilizado también la cromatografia en capa fina como método de identifi- cacién, y para determinar sobre todo la complejidad de las fracciones que han de ser refraccionadas por CC, y las condiciones éptimas de separacién. También se han conseguido con ©lia separaciones a - pequena escala de componentes puros en fracciones enriquecidas.

Entre las técnicas espectrométricas se han venido utilizando la infrarro ja (IR), que permite la identificàcién de las funciones quimicas e incluse alguno s componentes a partir del espectro - del aceite total, pero su interés résulta evident© por los datos que suministra cuando se ha conseguido el aislamiento de componentes puros, cuyo espectro puede compararse con los que aparecen en la bibliografla. En el caso de componentes desconocidos los datos aportados pueden ser decisivos a la hora de establecer una ©structura. Lo mismo podemos decir de espectroscopla ultraviolets-visible, cuando se consigne aislar productos puros que adsorben en esta re- gién.

En esta misma llnea, cuando se dispone de cantidades suficientes de productos puros, los datos que puede aportar la resonancia magnética nuclear son imprescindibles también para el estable- cimiento de ©structuras desconocidas.

Pero la novedad de mayor éxito en los dltimos ahos, para - la identificàcién de componentes esencias, es la asociacién de la cromatografia de gases con la espectrometrla de masas, que constituye, sin lugar a dudas, la técnica mâs importante para el estudio de los aceites esenciales, y que hemos utilizado como método fundamental de anâlisis en éste trabajo.

Los espectros de masas obtenidos por este acoplamiento de técnicas sOn suficientes, en la mayorla de los casos, para la iden- tificacién de componentes cenocidos, aunque esten présentés en - cantidades mlnimas en el aceite o en fracciones enriquecidas del mismo, si se dispone de los correspondientes patrones o de espectros recopilados de lasfuentes bibliogrâficas.

Con est os medio s ins t rument al e s se ha conseguido avanzar, pro fundament© en estos lîltimos ahos en el conocimiento de la composicién de muchos aceites esenciales.

Antes de iniciar el present© trabajo j con objeto de conseguir una preparacién adecuada en el manejo de las técnicas mencionadas, nos fue propuesto el estudio del aceite comercial Tomillo Timol de la firma "Destilaciones Garcia de la Fuente" de Granada, que présentâmes como trabajo de Licenciatura en la Universidad de La Laguna y que merecié la calificacién de Sobre s ali ente.

Este trabajo, junto al realizado en equipo en la Unidad - Estructural de Anâlisis Instrumental del Institute de Qulmica Orga- nica General del C.S.I.C., dié lugar a una publicacién titulada: Estudio analltico de aceites esenciales procedentes de plantas espaholas I. Especies del género Thymus, aparecida en una revis ta - italiana (4).

Con este trabajo se inicié un ampli o proyecto de investiga- cién cuya finalidad es la de llegar al conocimiento de la composicién de aceites esenciales de plantas espaholas de la familia de - las Labiadas, agrupadas en génères, con el fin de comprobar si las variaciones de composicién dentro del mismo género se pueden rela- cionar con su clasificacién botânica. En el caso del género Thymus se han estudiado doce especies.

Siguiendo la misma llnea, hemos seleccionado en el present© trabajo como materia de investigacién el género Teucrium, del que existen muy pocos antecedentes bibliogrâficos en lo que se refiere al estudio de sus aceites. Han sido descritas unas très oient as - cuarenta especies del mismo, y se encuentra ampliamente distribuldo

en las regiones templadas y câlidas del mundo, principaimente en el Hemisferio Norte, pero con algunas especies en Australia, America del Sur y Africa, Este género estâ representado en Europa por cuarenta y nueve especies de las cuales treinta y cinco estén présentes en la Peninsula Ibérica y Baléares, siendo veinte de ellas endémicas.

Segdn Valdes Bermejo y Sânchez Crespo (5), las especies - ibéricas pueden agruparse segiin sus similitudes morfolégicas y - genéticas en las siguientes secciones:

SECT. TEUCRim

Flores solitaries en la axila de las hojas superiores, Câ- liz campanulado, con el tubo recto, no giboso y con los dientes - mâs o menos iguales.

Nâmero bâsico cromosémico: x = 15

Especies ibéricas: T. fruticans L., T. pseudochmaepitys L,, T. cam- panulatum L., T. aristatum Pérez Lara.

Especie estudiada en este trabajo : T. pseudochamaepitys L.

SECT. SCORODONIA (Hill) Schreber

Inflorescencia dorsiventral, verticilastros racemosos en - el extremo de las ramas. Câliz bilabiado, campanulado, con el tubo curvado, giboso en la base y con el diente superior mâs ancho que los otros.

Ni5mero bâsico cromosémico: x = 16

Especies ibéricas: T. scorodonia L., T. salviastrum Schreber, T. -oxylepis Pont Quer, T. asiaticum L.

SEPT. SQORDIUM

Inflorescencia dorsiventral, en verticilastros axilares. - Câliz tubular, curvado, giboso en la base y con los dientes mâs o menos iguales.


Especies ibéricas: T. scordium L., T. scordioides Schreber, T. spi-nosum L., T. resupinatum Desf., T. botrys L.

SEPT. CHAMAEDRYS (Miller) Schreber

Inflorescencia dorsiventral. Flores numéro s as en la axila de las hojas superiores. Câliz tubular campanulado, curvado, algo giboso en la base, con los dientes mâs o menos iguales.


Especies ibéricas: T . chamaedrys L., T. webbianum Boiss, T . glaucum Jordan & Fourr, T. intricatum Lange, T. fragile Boiss, T . subspino- sum Fourr et ex Willd.

Especie estudiada en este trabajo: T . chamaedrys L.

SECT. POLIUM (miller) Schreber

Inflorescencia capituliforme, simple o compuesta, nunca - dorsiventral. Câliz campanulado o tubular, actinomorfo.

Ndmero bâsico cromosémico: x = 13

Esta seccién la dividimos a su vez en très subsecciones:

Subseet. Rotundifolia Cohen

Hojas anchas con los mârgenes poco o nada revolutos.

Especies ibéricas: T. rotundifolium Schreber, T. pyrinaicum L., T. buxifolium Schreber, T. freynii Reverchon ex Willk, T . montanum L., T. thymifolium Schreber, T. compactum Clem. ex Lag., T. franchetia- num Rouy & Coincy.

Subs e et. Pumilum Rivas-Mart f ne z

Hojas lineares Intégras, vellosas por el envés.

Especies ibéricas: T . pumilum L., T. libanitis Schreber, T. carolipaui C. Vicioso ex Pau, T. lepicephalum Pau, T . turredanum Losa & Rivas Goday, T. x sagarrae Pont Quer.

Especies estudiadas en este trabajo: T. pumilum L., T. - carolipaùi subsp. fontqueri.

Subsect. Polium

Hojas line ares con el mârgen mâs o menos crenado. Indumen- to de câliz compuesto de pelos grandulosos, pelos simples y pelos ramifieados.

Especies ibéricas: T. polium., T. capitatum L,, T. aragonense - Loscos & Pardo, T. expansum Pau, T. carthaginense Lange, T. aureum Schreber, T. vicentinum Rouy, T . lus it ani cum Schreber, T. belion - Schreber, T. gnaphalodes L'Hér., T. charidemi Sandwith, T. haense- leri Boiss., T. reverchonii Willk., T. chrysotrichum Lange, T. eriocephalum Willk., T . lanigerum Lag., T. cossonii D. Wood, T. majori- cum Rouy, T. T . algarbiense Goutinho.

Especies estudiadas en este trabajo: T. capitatum L., T. -eriocephalum, T . lanigerum, T. charidemi, T. gnaphalodes, T. lusi-t ani cum ( = T . subt ri phyllum Lag. ) , T. aureum.

La subsect. Polium es la que incluye mayor ndmero de especies ibéricas, y es también un grupo bast ante heterogéneo en cuantoa su morfologla. Es posible que despué s de un estudio mâs prof undoen el que ademâs de los caractères morfolégicos y cromosomâticos - se contemplen también los aportados por estudio s qulmicos, se pueden establecer a su vez subgrupos mâs homogéneos. Entre las especies estudiadas de esta subseccién, ateniéndonos a caractères morfolégi- cos, podriamos distinguir dos grupo s t por un lado el T . capitatum,T. lusitanicum y T. aureum (con el indûment o calicinal compuesto - de pelos glandulosos, pelos simples y pelos ramifieados). Por otro lado, T . charidemi, T. lanigerum, y T. eriocephalum (con el indumen- to calicinal sin pelos ramificados).

Algunas especies mencionadas de este género se han utilizado en medicina popular desde tiempos muy remotos, y en una revisién exhaustiva de la bibliografla, hemos encontrado muy pocas citas sobre sus aceites esenciales,

Una de las especies mâs conocidas, la escorodonia T. scorodonia L., cuya infusién se ha utilizado mezclada con vino en especial por sus excelentes cualidades como diurético, produce solo un 0,29 io de aceite esencial (6).

Del T. marum L. de Cércega, que pertenece a la Sect. Chamaedrys, y posiblemente de origen hispénico ( aunque hoy se encuentra raramente en la Peninsula Ibérica), se obtienen unas infusiones - que se emplean desde hace mucho tiempo en medicina popular. En un estudio reciente (7)> se han separado del aceite esencial très fracciones: la primera constituida por hidrocarburos, la segunda es una mezcla que constituye el 80 ^ del total, de dos dolichodiales is6- meros, y de la tercera (17 se ha aislado la dolicholactona por cromatografia de gases preparativa.

El camedrio (T. chamaedrys L.), perteneciente a la misma - seccién, se conoce desde la antigUedad como planta medicinal, en - especial por sus cualidades antipiréticas. De la parte floral se - obtiene un rendimiento en aceite muy bajo (0,07 9 ). Se han identificado como principales componentes el 1 - p-cariof ileno (60 y - el acetato de bomilo (7,84 9) (8). En Yugoslavia se han estudiado las variaciones de los rendimiento s en funcién de las altitudes y las caracterlsticas del suelo (9)*

Se han dado datos sobre el rendimiento en aceite (0,30 - 0,33 vo 1/100) del T. montanum (10), que pertenece a la Sect. Polium,

Se ha estudiado también el aceite de zamarrilla (T. Polium L,), que pertenece a la Sect. Polium, subsect. Polium (11). Se obtiene con un rendimiento muy bajo (0,05 - 0,09 9 ). Se conoce como planta medicinal desde su antigUedad mâs remota para el tratamien- to de enfermedades producidas por hongos, como antiséptico, diafo- rético, ténico y diurético. En plaças de gel de silice y cromatografia de gases se han identificado en el aceite: mirceno, oc -pineno, mentofurano, ocimeno, y pulegona. Se ha aplicado el acoplamiento cromatografia de gases-espectrometria de masas al estudio de un aceite de T. polium de la Arabia S audit a, y se han identificado - diez compuestos terpénicos: los hidrocarburos /^-pineno, limoneno,

-felandreno y y -cadinenos, y los alcoholes linalol, terpinen-4-ol, cedrol, cedrenol, guaiol (12).

De la misma subsect. Polium, Velasco y Negueruela (13) han estudiado por cromatografia de gases y espectroscopla infrarroja, el aceite esencial del T. gnaphalodes l'Hér. Los componentes fundament al es son el -pineno, ^-pineno y cariofileno.

Por âltimo, Miranda y Suhé (14) obtienen del T. eriocephalum Willk, un rendimiento de aceite del 0,54 - 1,10 %.

I. P L A N D E T R A B A J O

Como se ha indicado en la Introduccién, nos proponemos - estudiar en este trabajo la composicién de los aceites esenciales de varias especies nacionales del género Teucrium, cuya relacién aparece en la Tabla I de la Parte Experimental.

De acuerdo con los resultados obtenidos pretendemos agrupar las especies con composiciones del aceite mâs semejantes para ver si los agrupamientos résultantes coinciden con la clasificacién botânica.

Por otra parte estudiamos para determinadas especies la - variabilidad de la composicién con factores climatolégicos, edâfi- C O S , época de la recoleccién.

La marcha a seguir que nos hemos trazado para la primera parte de nuestro estudio estâ esquematizada en la figura 1, que describiremos brevemente a continuacién:

Las plantas una vez secas y molidas, se someten a una - extraccién con vapor de agua, para obtener cl aceite esencial. El cromatograma de este aceite original se utiliza como base de su anâlisis cuantitativo, al tiempo que permite apreciar la complejidad de su composicién.

Para facilitar su identificàcién, dado que el nâmero de

PLANTA

EXTRACCIONPOR ARRASTRE DE VAPOR

ACEITE

CONTROL POR

, CG

C.LIQUIDO-SOLIDO

FRACCIONESC G

IR y RMN(productos. puros)

IDENTIFICAaONANALISIS

CUANTITATIVO DE

COMPONENTES

componentes de un aceite esencial es muy elevado, es necesario - realizar fraccionamientos del mismo. Se utiliza la cromatografia en columna para el enriquecimiento de fracciones, as! como, cuando sea viable, para la separacién y purificacién de al^dn component e. Asimismo, con esta dltima finalidad, résulta imprescindible y de mayor eficacia la cromatografia de gases preparativa.

El control de las fracciones obtenidas se realiza por cromatografia de gases, que ademâs suministra suficiente informacién para poder elegir la técnica instrument al mâs i dé ne a para la iden- tificacién de los distintos componentes.

Cuando se consigne aislar un producto puro, y en cantidad suficiente, se puede aplicar la técnica o técnicas mâs convenientes, que el qulmico orgânico utiliza corrientemente para la determinacién de e structuras, en especial, las espectroscoplas de infrarro jo, visible-ultraviolet a y resonancia magnética nuclear.

En fracciones enriquecidas es especialmente dtil para la identificàcién la cromatografia de gases, cuando se dispone de - patrones. No obstante, en este trabajo se ha utilizado como técnica fundamental el acoplamiento cromatografia de gases-espectrometria de masas, que, sin ninguna duda, es la mâs apropiada para la identificàcién de los componentes en mezclas complejas, como las que constituyen los aceites esenciales.

II P A R T E E X P E R I M E N T A I ,

II.1.- ACEITES ESENCIALES ESTUDIADOS

En la Tabla I se mue s t ran las especies de Teucrium, cuyo s aceites hemos estudiado. En primer lugar aparece una signatura: - la primera cifra indica la dltima del ano de recoleccién, a continuacién una T, después un ndmero que indica la especie, y cuando - se trata de mâs de una muestra, un nâmero de orden. En la segunda columna aparece el nombre de la especie, en la tercera el lugar de recogida, eu la cuarta la fecha de recoleccién y por dltimo el - rendimiento.

Como podemos observar, del T. capitatum *se han obtenido - veintisiete muestras de aceite de diferentes procedencias. Se trata de una especie caracterizada por près ent ar una gran variedad - morfolégica y cariolégica. Es muy posible que parte del material estudiado en este trabajo precedents de la costa méditerrânea per- tenezca a la subsp. gracillimun; Cartagena y Aguilas-Mazarrén (Mu3>- cia) , La Canada y Eliana-Ribarro ja (Valencia) y El Alt et (Alicante) , que se diferencia por el color purpdreo o rosado de sus flores. El resto del material estudiado de esta especie pertenece probablemen- te a los citodemos diploide y tetraploide, pero al no conservar el testimonio dificilmente podemos diferenciarlo.

En el caso del T. carolipaùi, es muy posible que la planta estudiada de San Juan de los Terreros sea el T . carolipaùi C. -

Vicioso ex Pau, subsp, font que ri (Sennen) Rivas-Mart inez. Para - asegurarlo habrfa que estudiar el testimonio.

Del T, gnaphalode s se han estudiado nueve muestras, dos - del T. pseudochamaepitys, y dos del T . chamaedrys, todas ellas de distinta procedencia o fecha de recoleccién.

El T . aureum subsp. lat if olium (Willk.) Pue ch, segdn Val- dés Bermejo es el nombre correcte para la planta que nosotros - habfamos clasificado como T. homo tri cum. Por otra parte, el T. aureum Schreber de la Sierra de Câzulas debe ser casi sin duda el T. aureum subsp. angust if olium (Willk.) Pue ch.

Valdés Bermejo nos aclara también que el T. lusitanicum y el T , subtri phyllum son la misma planta; el prime ro es el nombre correcte.

En la clasificacién botânica que aparece en la Introduccién se exponen dentro de cada seccién las especies estudiadas por nosotros.

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II.2.- METODOS INSTRUMENTALES

En este apartado describiremos, las técnicas y aparatos - que hemos empleado o puesto a punto, las condiciones especificas de trabajo en cada una de las técnicas y les criterios seguidos - en el anâlisis cualitativo y cuantitativo de les componentes de - les aceites esenciales estudiados.

11.2.1.- METODOS DE OBTENCION Y FRACCIONAMIENTO DEL ACEITE

11.2.1.1.- Obtencidn del aceite

Una de las caracterlsticas fundamentales de un aceite esencial es su relativa volâtilidad. Cuando interesa separar de un material los productos causantes de su aroma, un paso necesario a - seguir es una destilacidn, ya que los productos que llegan a producer una sensacidn olfativa, deberân tener una cierta volatilidad, y podrân separarse por esta técnica de los no volâtiles.

Hemos elegido el arrastre de vapor, porque este sistema es el mâs empleado en la obtencidn de aceites esenciales, ya que la mayorla de sus componentes hierven entre 150 - 3009 c.. Si se des- tilaran a tempe raturas muy altas, muchos de los componentes podrian descomponerse, oxidarse o resinificarse. La destilacidn en vapor - de agua, es una forma particular de realizar esta operacidn, que - por ser un proceso mucho mâs suave, ocasiona pocos cambios drâsti- cos en el aceite.

En nuestro caso particular, partîmes de plantas se cas y - de una cantidad pequena. El aparato que hemos empleado es de tipo

Clavenger (fig. 2), aunque modificado por nosotros. Su objetivo es el - de realizar el arrastre en corriente de vapor, con reciclacidn del agua. La pequena cantidad de agua empleada permits recoger el aceite sin tener que introducir ningdn disolvente, - aunque la cantidad obtenida en cada operacidn sea muy pequena.

(fig. 2)

II.2.1.2.- Praccionamiento de los aceites

Uno de los majores procedimientos para la bbtencidn de - fracciones enriquecidas del aceite es la destilacidn al vacfo. - Para esta eventualidad contâbamos con un destilador automâtico - de bada rotatoria PEBKIN-ELMER, modelo 251, de gran eficacia. Como en nuestro trabajo solo podrlamos disponer de pequenas cantidades de planta, que conduclan a rendimientos muy bajos de aceite, el - aparato resuitaba demasiado grande para destilar cantidades del - orden del gramo, en el mejor de los casos.

Por ello, la técnica fundamental que hemos utilizado para la obtencién de fracciones enriquecidas o, en algunos casos de - componentes puros ha sido la cromatograffa en columna. El control de las fracciones se ha realizado por cromatograffa de gases. La columna de tamano apropiado, se carga con 30 g. de gel de sflice de 0,063 - 0,200 mm. (70-230 mall as ASTM) , por gramo de material. Como eluyentes se ha empleado hexano, aumentando gradualmente su

polaridad con cantidades crecientes de éter. Al final se eluye con metanol para arrastrar los materiales mâs polares.

Ademâs de las columnas clâsicas se han utilizado también columnas cortas. Las columnas son de gran diâmetro (45 mm. o mâs) , rellenas con gel de sflice de plaça fina G de Merck, aproximadamen- te unos 30 g. por gramo de material. Se somete la columna a una - sobrepresidn de unos 30 cm. de agua, para facilitar la elucidn.

Para la separacidn de componentes puros la técnica mas eficaz que hemos utilizado, en casi todos los casos, ha sido la cromatograf fa de gases preparative. El aparato, usado por nosotros, ha sido un cromatégrafo de la firma PERKIN -ELMER, modelo P-21 con detector de ionizacién de llama. En la mayor parte del trabajo se - uso como fase estacionaria Carbowax 20 M. Estas columnas se han - preparado con gradients de concentracién de fase liquida de un 4 al 7 ^ sobre Chromo sorb G (60-80 mallas) , en cuatro unidades de - columna en forma de U de 0,95 m.. En otros casos se ha utilizado silicona SE-52 al 5 ^ sobre Chromosorb G en columnas de 2 m. de - longitud. En todos los casos las columnas han sido de acero ino- xidable de 9,5 mm. de diâmetro exterior y 8 mm. de diâmetro interior.

\En general se ha trabajado a temperatura isoterma. Con las columnas de Carbowax 20 M, para compuestos polares 1709 C. y para compuestos menos polares una mâxima de 1409 C.. Con fase estacionaria silicona SE-52, a 1309 C., se ha conseguido la separacién de - algunos compuestos polares.

Se ha utilizado nitrégeno como gas portador, a la presién adecuada segân el tipo de columna empleada.

II.2.2. METODOS DE IDENTIPICACION Y DETSHMINACION CUANTITATIVA

II.2.2.1.- Cromatograffa de gases (GC)

La cromatograf fa de gases es la técnica mas eficiente para la separacién de los componentes de mezclas tan complejas, como son los aceites esenciales. Por ello, ha sido la que fundament aiment e hemos utilizado en este trabajo para la identificacién de los componentes y en especial para su determinacién cuantitativa. También recordaremos su aplicacién para la obtencién de compuestos puros, la cual hemos citado en el apartado II.2.1.2.

Desde un punto de vista prâctico conviens advertir que para conseguir el mâximo rendimiento de la GC, es necesaria la elec- cién del tipo de columna mas adecuado para cada problema particular. En nuestro caso, las columnas que present an la mâxima eficacia son las capilares de vidrio. Entre ellas, basados en consideraciones que expondremos en un préximo apart ado, seleccionamos las mâs idéneas, segân se apliquen para el anâlisis cromatogrâfico rutina- rio 0 para la introduccién de mue stras en el espectrémetro de masas.

a) Identificacién de los cbmponentes

El método clâsico para identificar por GC una sustancia - consiste en comparar su retencién con las retenciones de e species definidas (patrones), siendo fundamental, por consiguiente, la - medida experimental exact a de esta constante. Los cromatograf ist as, se han esforzado en buscar el parâmetro de retencién mâs independiente de las condiciones operatorias, para que la medida sea mâs

facilmente reproductible. De elles, los mâs recomendados son: la "retencién relativa" y el "Indice de retencién o de Kovats". Estes parâmetro s no son muy adecuado s, sin embargo, en nuestro caso, - puesto que junte a los componentes terpénicos, exist en también - alifâticos y aromâticos. Debido a esta complejidad, habrâ numéro-^ sas coincidencias entre las retenciones relativas o Indices de - retencién de "posibles" componentes y las que corresponden a los realmente existentes en el aceite.

Con fines de identificacién, hemos preferido por este motive la técnica del "enriquecimiento de picos", que consiste en mez- clar la muestra, con una pequefîa cantidad de patrén, y comparar - el cromatograma de la mezcla con el de la muestra. Esta técnica, es mucho mâs précisa que el uso de retenciones relativas e Indices de retencién, pero présenta el inconveniente de conducir a identi- ficaciones falsas en el caso de que los dos componentes tengan - exactamente el mismo tipo de retencién. Para confirmer la identificacién, se repite la experiencia utilizando otra fase estacionaria. La ânica limitacién que présenta esta técnica, estriba en la dificultad de disponer de los patrones necesarios, por lo que no ha - sido posible emplearla en todos los casos.

b) Anâlisis cuantitativo

La cromatograf la de gases es una técnica que permit e la - determinacién cuantitativa râpida de los diversos componentes de una mezcla compleja, aunque no hayan sido identificados. Los câl- culos cuantitativo s, se basan siempre en la medida de âreas, admi- tiendo que entre el ârea de un pico y la cantidad de component e - que llega al detector para producirlo existe la siguiente relacién:

donde es la cantidad del componente i, es el Area del pico i y es el factor de sensibilidad que depends de la estructura del compuesto y de la sensibilidad del detector empleado. En nuestro - caso, al utilizar un detector de ionizacién de llama, y, teniendo en cuenta los componentes habitualmente présentes en los aceites esenciales, hemos adopt ado la simplif i cacién de sup oner constante para todos los picos de un cromatograma. Utilizando K para el valor de este factor de sensibilidad, tendrlamos = A^. K, - Qg = Ag. K, etc.. De aqui:

lo que indica que existe una proporcionalidad directa entre las cantidades de los diversos componentes y las Areas de sus picos. - Para un components i podrfamos poner:

Qi \

cuyo primer término es la concentracién de i en el aceite, y el - segundo pue de calcularse a partir del cromatograma. Otra técnica empleada es la del patrén interne. Consiste en anadir al aceite - esencial una cantidad previamente pesada de un patrén, con el fin de obtener una mezcla en la que conocemos, para un compuesto (el patrén), su concentracién relativa. Si en la ecuacién (1) dividimos el numerador y denominador del primer término por Q., obtendremos:

”i *1ô j - i ;

donde C^ y C^ son las concentraciones en el aceite de los compuestos 1 y 2. A partir de esta ecuacién, y, si conocemos la concentracién del patrén, podemos calculer, mediant e la medida de las Areas, los porcentajes de los diferentes componentes en la mezcla y en la muestra original.

La medida de las âreas de los picos se ha realizado por el método general, multiplicando la altura del pico por su anchura a la semialtura.

c) Preparacién de las columnas capilares

Consideraciones générales.- La columna es la parte fundamental del equipo cromatogrâfico, y es el factor mâs importante, - que el qufmico analftico puede variar. Son conocidas las vent a j as de las columnas capilares en la cromatograf la de gases, en su - aplicacién analltica. De ellas las mas utilizadas han sido las columnas capilares de pared recubierta (WCOT). La mayor venta j a es que la fase liquida se aplica en forma de pellcula muy fina sobre la pared interna de la columna, por lo que el gas portador tiens un paso abierto y no restringido a lo largo de toda la columna. - Debido a esta gran permeabilidad, la calda de presién a lo largo de la columna es menor que en las columnas de relleno de la misma longitud y altura équivalente a un plato teérico, lo cual permite el uso de columnas muy largas de muy ait a eficacia. Por otra parte, el tiempo de anâlisis con una columna capilar larga es a menudo - menor que el obtenido en una columna de relleno mâs corta.

Las columnas capilares WCOT, present an dos problèmes z su pequena capacidad y su gran relacién de fases. Ambas estén relacio- nadas con el hecho de que la cantidad de fase liquida en la columna es muy pequena, y no puede aumentarse sin que resuite una pellcula mucho mâs gruesa.

Las columnas SCOT (support-coated open tubular), represen- tan la realizacién de una idea propuesta por Golay (15) en 1.960.En este tipo de columnas una capa de particulas muy fina de un -

material de soporte, sobre la cual se deposita la fase liquida - recubre la pared interna de la columna. Asi, se mantiene tanto la delgadez de la pellcula de fase liquida como la elevada permeabilidad de las columnas capilares de pared recubierta (WCOT), pero gracias al increment o de su ârea superficial pueden contener mayor cantidad de fase estacionaria. De este modo, las columnas SCOT - aceptan sin sobrecarga, mayor cantidad de muestra que las WCOT, lo que facilita el anâlisis de trazas, permite el empleo de detectores de baja sensibilidad, y la combinasi6n con otras técnicas de anâlisis tal como la espectrometria de masas.

En el estado actual de las técnicas cromatogrâficas, el detector de ionizacién de llama présenta la ventaja por una parte de tener una respuesta similar para los diversos compuestos orgânicos, lo que permite utilizarle en anâlisis cuantitativo, y por otra su gran sensibilidad, que permite obtener c romat o g ramas satisfactorios aân en el caso de emplear columnas capilares WCOT.

En el acoplamiento cromatograf la de gases-espectrometria - de masas (GC-MS), el espectrémetro de masas se comporta como un detector de gran sensibilidad. Sin embargo, en los casos de componentes traza, es frecuentemente dificil registrar un espectro satisfac- torio. Cuando se trata de problemas sencillos, suele ser posible - sobrecargar la columna para permitir que llegue al espectrémetro - mayor cantidad de componente. Con mezclas complejas, como los aceites esenciales, la distorsién de los picos creada por la sobrecarga interfiere en el anâlisis del reste de los componentes. Por este - motivo, es del mayor interés para nuestro trabajo utilizar columnas que, sin pérdida importante de su eficacia, permit an el anâlisis de mayores cantidades de .muestra que las WCOT lo que puede conseguirse con las columnas SCOT y de pared atacada.

Los beneficios potenciales de las columnas capilares de vidrio en la cromatograf la de gases no han sido ampliamente explot a- dos debido a sus problemas tecnolégicos e irreproductibilidad aso- ciados con su elaboracién. La no uniformidad e inestabilidad de - las pellculas de fase liquida, especialmente en el caso de fases - polares, cuando recubrimos superficies lisas, constituye una gran limit acién a su eficacia. El mayor problema consiste en sus pobres propiedades de mojabilidad que son una consecuencia de sus altas - tensionss de superficie. Estas dificultades se pueden superar modi- ficando la superficie del vidrio antes del re cubrimi ent o. Esto se puede conseguir tanto por deposicién de una capa adhérente de p articulas (SCOT), como por ataque de la superficie del vidrio.

Desde el punto de vista teérico, se puede llegar a comprender las vent a j as de las columnas SCOT de dos manerasz (A) E s tudi an- do la influencia de la resistencia a la transferencia de mas a en - la fase estacionaria sobre la eficacia, y (B) la influencia de la relacién de fases sobre la eficacia.

A).- En el Segundo Symposium Intemacional de Cromatograf la de Cases, Golay (16) describié la relacién entre la altura équivalente a un plato teérico (HEPT oh), y la velocidad lineal promedio del gas portador ( û ), y otros términos. La ecuacién de Van Deem- ter, que aplicé Golay a las columnas capilares se puede explicar de una forma simplif i cada como

h = ^ (Cg + c^) 5

donde B représenta el termine que describe la difusién longitudinal gaseosa y C^ y C^ la resistencia a la transferencia de mas a en la fase gaseosa y liquida, respectivamente. Segdn Golay estos términos pueden expresarse por

B = 2

1 4 6 k 4 11 T-C„ =

k30, =^ 6 ( 1 + k ®L

donde D_ y D_ son los coeficientes de difusién en la fase gaseosaG ily liquida, respect ivamente, k y K, el factor de capacidad y el coeficiente de reparte, y r, el radio de la columna.

Una de la diferencias mas importantes entre las columnas de relleno y las capilares abiertas se basa en el hecho de que es el término dominante en las de relleno, mi ent ras que en las capilares es C^. En otras palabras, la eficacia de una columna capilar se contrôla por la transferencia de masa en la fase gaseosa, mi entras que en una de relleno estâ controlada por la transferencia de masa en la fase liquida.

Para una columna capilar la relacién entre el coef ici ente de reparte, y el factor de capacidad, relacién de fases (/^), radio interne de la columna ( r ) y espesor de la pellcula de fase liquida ( d^ ) puede expresarse por

= ( 2 ^ >Sustituyendo esta expresién en la ecuacién corre spondi ent e se deducen las siguiente s relac i one s para C^:

K r^C, =^ ( K + /3 6 /î

22 k CC, =^ 3 ( 1 + k

Si se tiene en cuenta esta dltima ecuacién se observa que el valor de es dire et amente proporcional al cuadrado del espesor medio de la pellcula, admit iendo natur aiment e que el valor del factor de capacidad no se reduce de una forma proporcional. Desde el punto de vista teérico, séria deseable reducir el valor del espesor con un aumento simulténeo del factor de capacidad, ya que de este modo deben reducirse loâ dos términos de la dltima ecuacién.

El problema, en el caso de las columnas WCOT (donde la pared interna de la columna estâ recubierta dire et amente con la - fase liquida), es que el valor de k puede aumentarse solo por dis- minucién del diâmetro de la columna o incrementando el espesor medio de la pellcula. Esto âltimo estâ en contradiccién con el deseo previo (es decir, con la reduccién del espesor de la fase liquida), mientras que la primera posibilidad harla imposible la aplicacién prâctica de las columnas.

Como consecuencia, Golay establecié que la ânica posibilidad es incrementar la superficie interna de la columna sin aumentar de una forma significativa el diâmetro de la misma. De acuerdo con esto, la mejor solueién posible séria depositar un soporte inerte poroso sobre la pared interna de la columna, y recubrir ésta nueva superficie con la fase liquida, lo que justifies la introduccién - en la prâctica de las columnas, SCOT.

b ).- Para estudiar la influencia de la relacién de fases -sobre la eficacia, hemos de tener en cuenta dos ecuaciones bâsicas de la cromatograf la de gases. La primera (ya expuesta en el aparta-

do A), express la relacién de fases (p) en funcién del coeficiente de reparte ( K ) y del factor de capacidad ( k ) y la segunda la - relacién entre el ndmero de plates teéricos ( para una reso-lucién ( R ) y la retencién relativa ( <% ) , factor de capacidad del segundo pico ( k ), longitud de columna ( L ) y HETP:

K = (3 k

Recordemos que para las columnas WCOT la relacién de fases puede - calcularse segén:

r(3 =

Se sabe que el coeficiente de reparte es independiente del tipo de columna, y, en el caso de un soluto dado, depende solo de la fase liquida y de la temperatura de la columna. Lo mismo ocurre para la retencién relativa (<x ). De la primera de las ecuaciones se deduce que, si comparâmes dif erentes tipos de columnas que contienen la - misma fase liquida y operames a la misma temperatura, el factor de capacidad de la columna que présente mayor relacién de fases serâ menor. Por otra parte, segdn la segùnda ecuacién estâ claro que en el caso de factores de capacidad mas pequenos, son necesarios mâs plato s teéricos para conseguir la separacién del mismo par de solutés. Asi, para la misma longitud, la resolucién serâ peor en columnas donde el factor de capacidad es menor.

Las columnas capilares tienen la desventaja de que debido a su ait a relacién de fases, el factor de capacidad del mismo soluto serâ una fraccién del observado en una columna de relleno. Este problema se resuelve gracias a su gran longitud. Sin embargo es -

évidente que si se pudieran constrain columnas de mâs pequena relacién de fases sin disminuir su eficacia, se podria conseguir - mejor resolucién con la misma longitud de columna,ola misma reso— lucién en menor tiempo por aumento de la velocidad del gas portador.

El ânico modo de reducir el valor de relacién de fases es aumentar el volumen de la fase liquida con relacién a la fase gaseosa. Como hemos dicho con anterioridad la ânica solueién sin aumentar el espesor de la pelîcula de fase liquida es incrementar la - superficie de r e cubrimi ent o.

Método s de re cubrimi ent o. - Las columnas capilares de vidrio se han construido en nuestro laboratorio, estirando tubos de vidrio Pirex de 7,8 mm. de diâmetro exterior y 2 mm. de diâmetro interior, con un aparato de la firma Hupe. Se ha utilizado el método de re cubrimi ent o dinâmico para cargarlas. Mediante este procedimiento la solueién de la fase liquida o la suspensién de particules porosas se fuerza a través de la columna con la ayuda de una presién de un gas inerte.

En el caso de las columneis SCOT la suspensién se prépara - por el método de Horvath (17) modificado. Para ello, se disuelve - la fase liquida en un disolvente adecuado, y se suspenden en esta solueién las particules de soporte sélido. Despué s de recubierta - la columna por el método dinâmico, el disolvente se évapora con un gas inerte a baja presién. En este proceso, la fase liquida disuel- ta recubre las particules de soporte sélido depositadas. Hay que - conseguir una suspensién est able de particulas, para evitar el peligro de obstruccién durante el proceso de re cubrimi ent o. Para ello es fundamental la eleccién del tipo de disolvente, que ha de ser - de gran densidad, por lo que se suele utilizar cloroformo, el tama-

no de particula que debe ser de graiio muy fino y la eleccién de - una concentracién adecuada de fase liquida y soporte sélido. Un - procedimiento que ha result ado mas prâctico es el r e cubrimi ent o - dinâmico en dos pasos (18), mediante el cual se hace pasar prime- rament e una suspensién formada por la cantidad adecuada del soporte con una pequena proporcién de fase liquida. En un segundo paso la columna se recubre con fase liquida, también mediante el procedimiento dinâmico.

Para reducir los fenémenos de actividad superficial que - présenta la pared del vidrio en el caso de las columnas WCOT y - atacadas, o los soporte s de las columnas SCO% se ahaden a la so lucién de fase liquida, agentes tensoactivos tal como el BTPPC en una proporcién de 0,1 a 0,2

Una vez preparadas las columnas se acondicionan sometiendo- las a una elevacién lent a de temperatura, hast a alcanzar unos 259 - menos que la mâxima de utilizacién de la fase estacionaria.

Tipos de columnas preparadas.- A continuacién exponemos los result ado s obtenido s con las columnas que hemos preparado para nuestro e studio anâlitico. Como ya hemos dicho nuestro trabajo ha ido dirigido a la obtencién de columnas con la mayor resolucién y eficacia posibles para el anâlisis cualitativo y cuantitativo en GC. Estas caracteristicas las present an las columnas capilares de tipo -

‘ WCOT. De estas exponemos tan solo très ejemplos de las que se han preparado con el objeto de comparar resultados. En la prâctica ademas se han utilizado otras columnas de caracteristicas similàres. - Por otra parte hemos t rat ado de conseguir columnas apropiadas para su utilizacién en cromatografia de gases, cuando va acoplada a la espectrometria de masas, es decir, columnas con mayor capacidad de

carga. Con esta finalidad se han ensayado dis tint os tipos de so- portes cromatogrâfico s para la preparacién de columnas SCOT, y, - en algunas ocasiones, se ha procedido a un prêt rat ami ent o de la - pared del vidrio antes de ser recubierta con la fase liquida, con objeto de obtener en ambos casos un increment o del ârea superficial de la columna.

El resultado de este e studio se resume en la tabla II: En el grupo I figuran las caracteristicas de las columnas WCOT, en el grupo II las corre spondi ent es a las SCOT, y en el III, las que se refieren a las de pared pretratadas.

Para estimar el valor de la cantidad de fase estacionaria que queda en la columna, utilizamos la medida del espesor promedio de la pelicula (d^), que se ha cal cul ado por métodos cromatogrâfi- cos. En algunos casos, haremos mencién a la sobrecarga que près en- tan los picos correspondientes a mue stras de hidro carbures, de fo3>- ma solamente cualitativa, cuando la cantidad de fase liquida es ^ pequena.

GRUPO I.- Como se puede observer en la tabla II, contiene las columnas columnas de mâximas eficacias (menores valores de HETP) y con menores espesores de fase liquida (d^). La columna ndmero 1 représenta un caso limite de buena eficacia, sin embargo sus picos presentan gran sobrecarga. Observese el velor de la eficacia de la columna ndmero 3» relativamente bajo, para este tipo de columna, a pesar de haber sido preparada de la misma forma que las ndmero s 1 y 2 lo cual demuestra la dificultad de conseguir los mismo s resultados, adn operando en condiciones similàres,

GRUPO II.- Haremos una descripcién de las columnas de este

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grupo, destacando el tipo de soporte utilizado sobre todo si este no es de los que se utilizan fre cuent ement e en los rellenos de columnas .

En la columna ndmero 4, donde se utilize como soporte el - Chromosorb W molido, se han obtenido los mâximo s espesores de fase estacionaria. La columna présenta ademas buenas caracteristicas en lo que se refiere a su eficacia, y carencia de adsorcién.

El vidrio molido, utilizado para la preparacién de las columnas 5 y 6, ha resultado ser un soporte de malas caracteristicas por no formar buenas suspensiones. Lo hemos utilizado a dif erentes concentraciones, y se observa una disminucién de la eficacia al - aumentar la concentracién, sin que con esto se obtenga el consiguiente aumento de espesor de fase, con lo que se incrementa el riesgo de obstruccién.

La lana de vidrio molida forma buenas suspensiones a concentraciones relativamente bajas de soporte, por lo que no se consiguen grandes mejoras en cuanto a su espesor de fase (ndmero 7). Con este soporte las eficacias obtenidas son muy bajas, en lo que puede influir grandement e el hecho de ser un soporte sobre el cual se mani- fiesta fenémenos de adsorcién. La columna ndmero 8 se ha recubierto utilizando la lana de vidrio tratada con mezcla crémica, y se ha - pas ado varias veces la suspensién de particules por la pared de la columna. Con esto se ha conseguido un increment o de espesor de fase, sin embargo, la eficacia de la columna es muy baja, a lo que puede contribuir considérablement e la escasa uniformidad de la pellcula que se ha podido obtener al haber repetido el proceso de recubrimiento varias veces.

La sepiolita micronizada posee gran ârea superficial y un adecuado tamano de particule. Sin embargo, solo se puede utilizar a concentraciones bajas pues con este soporte aumenta considérablement e el peligro de obstruccién, por acumulacién de particulas en el f rente de la columna. La columna ndmero 9 se ha preparado con - una suspensién de elevada concentracién, dispersada en un bano de ultrasonido y dejada reposar. Las particulas mas pequehas que que- daban en suspensién son las que se han utilizado para el recubri— miento. Las columnas recubiertas con este soporte al igual que las anteriormente citadas, presentan eficacias muy bajas, debido a - fenémenos de adsorcién.

GRUPO III.- En este grupo se incluyen las columnas que han sido sometidas a un tratamiento previo de pared antes del re cubrimi ent o con la fase liquida. Hemos utilizado como agente atacante el fluorure aménico a dif erentes concentraciones y tiempos de ca- lentamiento a la temperatura de 4009 0. Se observa que existe una influencia de estos factores en los result ado s obtenido s. Las columnas asi preparadas presentan me j ore s caracteristicas en cuanto eficacia que las del grupo II, aunque tienen el inconvenient e de su - adsorcién superficial.

En general, el inc rement o de espesor de fase estacionaria conseguido en las columnas SCOT ha llevado consigo una disminucién de su eficacia, en lo que influye, en parte, el propio método de - re cubrimi ent o. Ya se ha comentado la gran limit acién que presentan las columnas capilares, debido a su escasa reproductividad, ya que en el proceso de vaciado de la columna influyen factores diflciles de controlar, que afectan a la uniformidad de pellcula de fase estacionaria obtenida. En columnas, donde el procedimiento de re cubrimi ent o es en dos pasos, sus efectos se suman y la dificultad es

mayor,

Este estudio nos ha valido tanto para el trabajo actual,- para el cual hemos elegido las columnas de me j ore s caracteristicas para cada caso particular, como para posteriores estudios donde - seleccionaremos con mayor conocimiento y experiencia tipos de columnas mas adecuadas.

d) Condiciones de trabajo

En nuestro estudio analltico, hemos utilizado un cromatégrafo de la firma Perkin - Elmer, modelo 990, con detector de ionizacién de llama.

Como gas portador se ha utilizado nitrégeno, en cada caso, a la presién adecuada que corresponds a velocidades de gas portador que conduzcan a eficacias mâximas.

La temperatura, es el otro factor con el que jugamos, para conseguir me j ores separaciones de picos. En general, empleamos temperatura programada, la mayorla de la veces de 802 a 1709 C, a - velocidad de 2 o 39/min. En fracciones con componentes de ait a - volatilidad se mejora la separacién, utilizando températuras mas bajas en condiciones isotérmicas.

Como se ha referido con anterioridad en cromatograf la de - gases analltica se han empleado columnas de tipo WCOT, con Carbowax 20 M como fase estacionaria. Ademâs de las sehaladas en la tabla II se ha utilizado una columna de 45 m. de longitud y 0,2 mm. de - diâmetro interne que ha sido la empleada con mayor frecuencia.

II.2.2.2.- Espectrometria de masas (MS)

La espectrometria de masas, ha alcanzado una gran importancia, como medio de identificacién y es dare cimi ent o de e structuras de compuestos orgânicos. Entre los primeros en reconocer el interés de la MS, estân los qulmicos especialistas en aromas, que disponen de un instrumente insustituible para la identificacién de componentes volâtiles de alimentes, perfumes, etc.. La ventaja que en este campe présenta la MS, f rente a otras técnicas instrumentales, es — su extremada sensibilidad, que permite la obtencién del espectro, en determinadas condiciones, con cantidades de material del orden del microgramo.

En el anâlisis de mezclas complejas, el mayor interés de - la MS, radica en la posibilidad de utilizar un sistema de separacién previo. Hemos visto, que el sistema de separacién mâs eficaz para problemas como el que nos ocupa, es la GC. El acoplamiento de ambas técnicas, estâ considerado como el método ideal para la identificacién de productos existentes en cantidades traza en mezclas complejas, donde se une al poder separador de la GC la gran sensibilidad de la MS.

Al aplicar el acoplamiento GC-MS al caso de los aceites - esenciales, résulta fâcil la identificacién, si se disponde del corre spondi ente patrén. Basta con comparar el espectro de éste, con el obtenido durante la eluciéh del compuesto problema. Ademâs, la identificacién puede complementarse mediante el empleo de los tiempos de retencién.

Si el compuesto es desconocido y su espectro no coincide - con el de ninguno de los patrones de que disponemos o con los repro-

ducidos en la bibliografla, ha de intentarse una interpretacién, lo mâs compléta posible del mismo, para disponer de algunos datos es— tructurales del compuesto. El esclarecimiento de la e structura, po- drâ completarse si se logra separar el compuesto de la mezcla, por alguno de los métodos referido s en d apart ado II.2.1.2. Una vez - aislado, se podrân aplicar los otros métodos instrumentales de que dispone el qufmico orgânico.

Para facilitar la aplicabilidad de esta técnica a nuestro trabajo, hemos intentado conseguir, todos los patrones posibles, y hemos registrado sus espectro s de masas. También disponemos de una coleccién de espectros procedentes de la bibliograffa, que corresponden a productos de carâcter terpénico o de otros que aparecen - frecuentemente en los aceites esenciales.

El espectrémetro de masas utilizado, es un Hitachi Perkin - Elmer, modelo RMÜ-6MG. Posee très sistemas de introduccién de muestras: directa, por sonda; indirecta, mediante un sistema de vidrio que puede c aient arse; y por GO (cromatégrafo de gases de la firma P e rkin-Elme r, modelo 990). Para registrar los espectros de los patrones de pureza comprobada, se ha empleado la introduccién indirecta; para el reste de los patrones, el aceite original o sus fracciones, el cromatégrafo de gases. En el apart ado II. 2.2.1, se han de- tallado ampliamente las caracteristicas de las columnas que hemos utilizado en el acoplamiento GC-MS.

Para conseguir un registre e stable a la luz, hemos repre sen- tado los espectros con un miniordenador Olivetti P6060.

II.2.2.3.- Espectrescopla infrarroja (IR)

La hemos utilizado fundament aiment e para la obtencién de datos estructurales de compuestos desconocidos, aislados en cantidad suficiente para el registre de su espectro. El aparato empleado ha sido un espectrémetro de doble haz de Perkin - Elmer, modelo 257, equipado con dos redes.

II.2.2.4.- Resonancia magnética nuclear (RMN)

La espectrescopla de resonancia magnética nuclear es una - de las técnicas mâs utilizadas en la elucidacién de e structuras de compuestos orgânicos. En el campe de los productos naturales, ésta es una de las técnicas fundament aiment e empleadas, ya sea la resonancia magnética nuclear de protén (^-RMN) o de ^^0 (^^C-RMN). Sin embargo, en anâlisis de aceites esenciales de plantas, cuyo rendimiento en el mismo, gene raiment e no es superior al 0,3 9, encuentra una dificil aplicabilidad, dada la gran dificultad de obtener la - cantidad de muestra necesaria para registrar su espectro.

No obstante, la ^-RMN se ha podido utilizar en algunos - casos, siendo de gran ayuda para la confirmacién de e structuras, - cuyo s espectros de masas e infrarro jo, no identif ican tôt aiment e el compuesto. Cuando no se ha hallado informacién bibliogrâfica de un determinado compuesto, los espectros de ^-RMN con la ayuda de los masas e infrarro jo nos ha conducido a una caracterizacién par- cial de e structuras, casi nunca a una elucidacién compléta.

Los espectros se han registrado en un espectrégrafo Varian XL-100-15PT de 100 Mc/seg o en el Varian EM-390 de 90 Mc/seg.

Ill R E S Ü L T A D O S Y D I S C U S I O N

III.1.- IDENTIPICACION DE LOS COMPONENTES DE ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS DEL GENERO TEÜCRIUM

En este apart ado, describîremos los componentes separado s por cromatografla de gases de los diferentes aceites estudiados, - segdn el orden de elucién en el cromatograma. En cada uno de elles, se indicarân los métodos que han conducido a su identificacién, - cuando se trata de compuestos conocidos. De los componentes que no han podido ser totaimente identificados, se aporta la mayor cantidad de datos estructurales conseguidos por aplicacién de las técnicas analfticas que se han podido emplear en cada caso.

1.- Aldehido Isovalërico. Es el primer compuesto que aparece en el cromatograma, en la mayor parte de los aceites, aunque siempre en muy pequena proporcién. Identificado directemente a partir del aceite por su espectro de masas, cuya secuencia de picos figura en - (19, 20).

2.- Su espectro de masas es idéntico al del -aC-pineno. Sin embargo, dado que su retencién no coincide con la del patrén de que se dispone en el laboratorio, no se ha identificado como tal. Posiblemen- te se trata de un estereoisémero del mismo.

3.- U -Tuyeno. Es un compuesto que solo aparece en cantidades traza

en los aceites. Se ha identificado por su espectro de masas (21).

4.- c<-Pineno. Se eluye con n-hexano por cromatograf ia liquido-s6- lido en las primeras fracciones. Su: retencién y espectro de masas coinciden con las del patrén -pineno. Estâ présente en la mayo- ria de los aceites en cantidades may o ri t ari as, siendo a veces, el componente fundamental.

5.- Canfeno. Aparece en las primeras fracciones correspondientesa hidrocarburos monoterpénicos, obtenidas por cromatografia liquido-sélido. Su espectro de masas coincide con el del patrén. La - identificacién se confirmé por GC. Por lo general la concentracién en los aceites es pequena.

6.- f)-Pineno. Presents también en las primeras fracciones cromatogrâficas. Su espectro de masas coincide con el del correspondiente patrén. Se confirma la identidad por cromatografia de gases. Su - concentracién es importante en todos los aceites, y en algunos casos, es el componente mayoritario.

7.~ Sabineno. Ha sido identificado por comparacién de su espectro de masas con el que figura en (22, 23). Su retencién c romat ogrâfi- ca en las columnas utilizadas es muy cercana a la del ^ -pineno, - por lo que, en algunos aceites no se ha conseguido una buena resolucién de ambos picos y no se ha podido calcular por tanto su concentracién exacta. Sin embargo, se ha podido deducir que estâ siempre por debajo del 55 .

8.- Con esta retencién cromatogrâfica se localiza un compuesto, que solo se ha podido encontrar en la especie 7T1/2, a una concentracién de un 5,5 9. El estudio de su espectro de masas no ha permitido su

identificaci6n. No obstante, los espectros de \m cierto ndmero de compuestos son muy parecidos al de este componente. Como solo se - pudo disponer de muy pequena cantidad de aceite esencial de esta - especie, no ha sido posible su aislamiento para su caracterizacidn por otros métodos instrumentales,

9.- Mirceno. Se eluye con n-hexano por cromatografia llquido-s6lido. Su espectro de mas as coincide con el del correspondiente patrdn, - as! como su retencidn cromatogrâfica. La concentracidn de este componente es elevada en la mayor parte de las especie s.

10.- oi -Terpineno. Se ha podido registrar su espectro de mas as a - pesar de presenter una retencidn muy cercana a la de component es - de elevada concentracidn. Su espectro coincide con el obtenido de una muestra de oC —terpineno y también, su tiempo de retencidn.

11.- Limoneno. De forma anâloga a los anteriores aparece en las - primeras fracciones cromatogrâficas. Su espectro de mas as y su tiempo de retencidn coinciden con el del patrdn. Su concentracidn es - importante en la mayorfa de la especies, en algunas ocasiones es el componente fundamental.

12.- fi -Felandreno. Como los anteriores se eluye con n-hexano por cromatograf£a llquido-sdlido. Ha sido identificado por comparacidn de su espectro de mas as con el del patrdn. Asl mismo, coincide su retencidn cromatogfâfica.

13.- 1,8-Cineol. Se eluye con n-hexano por cromatograf la llquido- sdlido, aunque no en las primeras fracciones. Su espectro de mas as y su tiempo de retencidn coinciden con los del patrdn. Salvo algunas excepciones es un compuesto minoritario en nuestros aceites.

13*.- De este componente tan solo se dispone de su espectro de masas, que corresponde al de un compuesto tipicamente aromâtico. Posée ademâs un grupo hidroxilo. Sus picos mas caracterlsticos coinciden con los de los fenoles, con dos metilos en el ndcleo bencéni- co, Puesto que no se ha podido registrar el espectro de raasas del compuesto totalmente puro, es dificil especificar las posiciones - de los grupos sustituyentes.

14.- ^-Terpineno. Se eluye con n-hexano en las primeras fracciones cromatogrâficas. Su espectro de mas as coincide con el del patrdn.Su identidad se ha confirmado por GC.

Este compuesto se transforma en p-cimeno por simple contacte con el aire, por lo que podemos considerarlo como su precursor.Es un compuesto minoritario en los aceites esenciales de todas las especies estudiadas.

15 y 16.- Estân présentesgiempre en los aceites en cantidades mino- rit arias, y pose en ademâs una retencidn muy similar por lo que no se han podido identificar.

17.- p-Gimeno. Este compuesto aparece en las fracciones de columnas eluidas al aumentar un poco la polaridad del eluyente. Se ha identificado por comparacidn de su espectro de mas as con el de su patrdn. Se confirmd su identidad por GC. Su concentracidn es muy variada - en los diferentes aceites. En algunos casos es el componente fundamental, y en otros aparece en cantidades traza.

18.- Terpinoleno. Su retencidn cromatogrâfica y espectro de mas as coincide con el de su patrdn.

19.- Cetona de artemisia. Se ha registrado su espectro de mas as a partir del aceite, donde aparecia a mayor concentracidn. Coincide con el que figura en la hibliografia (24).

20.- Este compuesto tan solo estâ en cantidades traza en algunos - aceites de los que se disponia de poca cantidad. Por este motivo - no se ha podido registrar su espectro de masas.

21.- Se ha registrado su espectro de masas (fig. 3) a partir de una fraccidn cromatogrâfica de polaridad media. No se observa su idn - molecular. El pico de mayor mas a de intensidad apreciable, aparece a m/z 101, aunque se observan sehales débiles a m/z 112 y 115» que parecen indicar que su peso molecular es I30. Ambas sehales corresponden, respectivamente, a la pérdida de agua y de metilo. La ausencia del ién molecular nos sugiere, en principle, un alcohol de cadena larga. Si se considéra ademâs, que la fragmentacién mâs importante para estes compuestos es la rotura del enlace 0-0 contiguo al grupo funcional del grupo alquilo mayor, y, en mener proporcién la de los grupos alquilo menores, estaria justificada la presencia - abundante de los fragmentes a m/z 59 y 101, de acuerdo con el sigui ente esquema:

°2 ^5 +■” ^ Og H CH = OH 59 (1000= HL^ 1 0 - OH 5 11 :

I Cç H^^ CH = OH 101 ( 21 55)H

Résulta también significative el pico q/z 71 (4»8 #) que - correspondérfa a 0^ ^n*

El pico nv z 56, j^OH^"OH^OH = OH^j puede ser debido a una - pérdida de buteno y agua, lo que nos demuestra la existencia de un

M N O CDH M T- f*) W} C-4

N r-3 <ir f M lON (0 CD O -r- V-

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grupo CHg en posicién 4, CH^-CH^-CHOH -CH^ -R. El resto R de la - cadena debe ser ramificado, ya que el espectro no corresponde totalmente al del 3-Octanol (25), aunque el parecido existente entre - ellos, nos impide descartar esta posibilidad.

22.- Es un componente présente en cantidades traza, en los pocos - aceites en los que aparece. Se ha registrado su espectro de masas (fig, 4), a partir de fracciones enriquecidas en este componente. Su i6n molecular, aunque débil, aparece a n^z 152, el cual se confirma con los fragment os a m/z 137 y 134, procedentes de la pérdida de metilo y agua respectivamente. Este pone de manifiesto que se trata - de un alcohol monoterpénico de férmula H^g 0, posiblemente cl- clico a la vista de los fragment os que se observan en el espectro.

los très picos de mayor intensidad son muy significativos. Primero aparece un ién a m/z 43 muy intense, lo que sugiere la - presencia de un grupo isopropilo, cuya ruptura esta muy favorecida para dar el pico a it/z 109 — M^- 43 • El ién a m/z 91 corresponde a un fragmente tipicamente aromâtico (C^ ) , que puede procéder deuna aromatizacién del anillo por deshidratacién. Estes hechos, y la gran intensidad de los picos a n/z 91 a 95 parecen indicar una estructura de p-mentanodienol. Pero de acuerdo con las relaciones de intensidad entre los picos m "*" y -18 pudiera tratarse de un alcohol monoterpénico biefclico con un doble enlace, si tenemos en - cuenta las consideraciones de la bibliograffa (26) sobre compuestos de estructuras semejantes. Es dificil por tante, con solo estes - dates, precisar un tipo de e structura para este componente.

23.- Bas ado s en algunos dates encontrados en la bibliograff a (20, - 27), y en la observacién y e studio de su espectro de masas (fig, 5), Buponemos que este componente se trate del nonanal.

M.': ÜMT M/Z IMT43•Î3-555?e-3

37.4 1 0 0 .012.5

2 9 . 3 43. *»2 5 . 5

77793191•5293

2 1 . 32 1 . 3 4 2 . : 3 5 . 1 3 1 . 9 2 5 . 5

y 5 î09 î 3

4.âLia

51

B7

53

COMPOMCMTE N. 2 1.M/Z

(fig. 4)

M/2 I HT M/Z IMT M/Z IMT

4143445 556 57.

93.3 83-363.356.761.7 130.0

6763697071 81

26.730.033.340.016.723.3

5556 93114124

33.029.020.0 33.38.05.3

S 7

uBZM

7 3 as52

iniinn|iu]ii

S3M / Z

CGMPOMENTC N.23 ( f ig . 5)

La forma general de su espectro es muy seme jante a la de - los alcanos, con mâximos en las secuencias m/z 43» 57, 71, correspond! ente s a los iones ^2n-l ^ ^n ^2n 1^’ picos de m/z 41,55, 69 de ^2n-l’ ^ correspondientes a los productos pares -de transposicidn de la serie de hidrocarburos m/z 42, 56, 70, de - Cn ^ 2x1* Ahora bien los productos de transposicidn mas importantes, desde el punto de vista del diagndstico estructural son los fragment os pares résultantes de la transposicidn de Me Lafferty que - resultan m/z 44 cuando la carga estâ sobre el oxigeno, y n/z 98 - cuendo la carga se encuentra sobre la mit ad bidrocarbonada.

-fOHHH C

■-S ™

H OHgCH

la/z 98

24.“ No se ha podido conseguir el espectro de masas de este componente totalmente puro, pues siempre ap arec en junto a él trazas de un - hidrocarburo sesquiterpénico, que impiden la interpretacidn correcta del mismo. No obstante, pare ce que se trata de un alcohol o eter monoterpénico.

25.“ De el espectro de masas (fig, 6) de este componente no se deduce de una manera clara el valor de su peso molecular. Con la hipdte- sis de que se trate de un compuesto de peso molecular 128 = 994- 29, y por comparacidn de su espectro con el que se cita en (25) para el l-octen-5 cl po demos casi asegurar que se trata de este compuesto.

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26.- Tuyona y p-cimeneno. Con esta retencii5n cromatogrâfica aparecen dos compuestos. Se han registrado sus espectros de masas en el mismo pico. El primero se ha identificado por comparacidn del espectro con el de un patrdn. El otro espectro parece coincidir con el del p-cimeneno.

27 y 29.- Oxidos de linalilo. Los espectros de masas de estos component es coinciden con los de los dxidos de linalilo trans y cis - de cinco miembros, que poseemos como pat rone s.

28.- -Copaeno. Se eluye en fracciones poco polares. A partir de ellas se ha registrado su espectro de masas. Se trata de un hidrocarburo sesquiterpénico de peso molecular 204. Los picos mas importantes parecen coincidir con los que ap arec en en (28, 29) para el o( -copaeno. Este componente ha sido aislado en un e studio paralelo realizado en nuestro laboratorio y se ha registrado su espectro de ^-RMN, que estâ de acuerdo con los datos oitados en (29).

30.- Estâ presents en el aceite esencial de algunas especies de - Teucrium a concentraciones apreciable s que no llegan a alcanzar - el 1 Tan solo se dispone de su espectro de masas (fig,7). Su - iân molecular M = 1 5 2 indica que se trata de un compuesto monoterpénico de férmula empfrica 0^^ 0, a la que corresponden -très insaturaciones.

La ausencia del pico M - 18 6 M - 17, y la presencia de picos pares importantes, pare ce indicar una funcién oxigenada de tipo carbonilo. La f ragment ac ién del espectro apunta con toda probabilidad hacia una e structura cîclica. Como los picos en los espectros de aldehidos y cetonas biclclicos corresponden a los iones - m/z 81 y 83, en principle, puede desecharse este tipo de e structuras.

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Si tenemos en cuenta una e structura de p-mentenona, donde no cabe que el grupo cetdnico esté en posicién 4 con respecto a los sustituyentes alquflicos, no es factible la eliminacién de cetena.

Por otro lado, en una transposicién de Me Lafferty entre - el grupo carbonilo y el sustituyente isopropilo en posicién conti- gua, se obtendrfa un fragmente M - 42 = 110, que corresponderfaa la pérdida de propileno, segén

X s .

OHm/z = 110

Entre las e structuras posibles que darian este tipo de transposicién tendrfamos las siguientes:

Por otro lado, otras dos e structuras darfan lugar a una - f ragment ac i én retro-Diels-Alder que coincidentemente conducirf an a un fragmente de m/z 110:

Se han encontrado datos bihliogrâficos sobre los espectros de masas de algunos de estos compuestos (30), que no coinciden totalmente con los del nuestro. Sobre otros no se dispone de informa- ci6n, Por este motivo no hemos podido establecer la estructura correct a.

31.- ^ -Bourboneno y alcanfor. Con esta retencién cromatogrâfica - se localizan dos compuestos, lo que ha impedido determinar la concentracidn con la que entran, cada uno de ellos, a formar parte en los aceites de la diferentes especies, aunque en algunos casos se - ha comprobado la presencia de uno de ellos solamente.

Como estos compuestos aparecen en fracciones de distinta - polaridad, se han podido registrar sus espectros de masas. El espectro del compuesto menos polar, pone de manifiesto que se trata de - un hidro carburo sesquiterpénico de peso molecular 204. Los picos dé mayor intensidad aparecen a m/z 81, 80 y 123.

Existen datos de masas (31) de un hidrocarburo sesquiterpénico, cuyos picos de mayor intensidad coinciden con los de este compuesto. Al ser tan poco corrientes estos picos en hidro carburo s ses- quiterpénicos, creemos que se trata de la misma estructura, y que - corresponde a la de 1 '^-bourboneno. Ademâs se ha registrado el espectro de ^-RMN. Este no se ha podido obtener del compuesto totalmente puro, s in embargo, sus bandas mas caracterlsticas parecen indicar que se trata del mismo compuesto.

El otro componente que sale en GC junto al (? -bourboneno, es el alcanfor, identificado por comparacidn de su espectro de masas con su patrén. En los aceites de T . nseudochamaeoityè y T. homotricum - se ha comprobado la presencia de alcanfor como componente mayoritario.

En el resto de las especies no se ha calculado la concentracidn de - cada uno de ellos separadamente, puesto que estân présentes en cantidades minoritarias.

32.- Se ha detect ado su presencia solo en algunos aceites, siempre - en cantidades minoritarias. En el espectro de masas (fig. 8) de este componente no se aprecia la sehal correpondiente a su idn molecular. Sin embargo, de la comparacidn de los picos de mayor intensidad con los que aparecen en (25), parece deducirse que se trata del dxido - de oc -pineno, con gran probabilidad.

33.- Linalol. Se eluye por cromatografîa llquido-sdlido con n-hexano- éter, 85-15. Es un componente caracterlstico de todos los aceites - esenciales de Teucrium, pues estâ presents en todas las especies, — aunque en cantidades mayo rit arias solamente en el 7T1/8 y 7T1/9. Su espectro de masas coincide con el de nuestro linalol patrdn y se - confirma su identidad por GO.

33*.- Isopinocanfona. Présente solo en cantidades traza. Se eluye en columna con n-hexano-eter, 88-12. Su espectro de masas coincide con el que se cita en (30), para este compuesto.

34.- Pinocarvona. Este compuesto estâ presents en todos los aceites estudiados, pero siempre en cantidades minoritarias. Se ha llegado a identificar por comparacidn de su espectro de masas con el citado en (30).

35.- Acetato de isobomilo. Se ha registrado su espectro de masas a partir de alguna fraccidn en la que se hallaba a mayor concentracidn, pues en los aceites esta no supera el 1 El espectro coincide con el de su patrdn, asl como su retencidn cromatogrâfica.

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36.- Tan solo se ha observado la presencia de este componente en - los aceites esenciales 9T1/8 y 9T1/9 a una concentracidn del 0,1 9.Es posible que esté presente en otras especies en cantidades traza.Se ha podido registrar su espectro de masas a partir de una fraccidn cromatogrâfica enriquecida.

A la vista del espectro (fig. 9) se pueden sacar algunas - consecuencias. La fdrmula molecular debe ser 0, que debe -corresponder a cuatro insaturaciones (un ciclo y très dobles enlaces). los picos a n/z 149 134 (M^-CHgO), 133 (M^-OOH.) y 119(M -CH^ -OHgO) , podrfan indicar que se trata de un eter metflico del p-cimeno.

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No obstante la parte baja del espectro sugiere que el producto puede estar impurificado.

37.- Cariofileno. Se eluye por cromatograf fa Ifquido-sdlido con n- hexano-eter, 88-12. En los aceites del género Teucrium, estâ siempre presente, a concentraciones algunas veces mayoritarias. Su identificacidn se llevd a cabo mediante su espectro de masas, confirmada - por la comparacidn de su tiempo de retencidn con el de su patrdn.

38.- T erpinen-4-ol. Se eluye por cromatograf fa en columna con n-hexano-eter, 80-20. Présenta un fndice de retencidn muy similar al del - cariofileno, por este motivo no se ha podido determinar aisladamente la concentracidn de ambos component es. No obstante al ser compuestos de naturaleza muy diferente, se han separado complet ament e por -

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cromatografla llquido-sdlido. Se ha registrado su espectro de masas, que coincide con el del correspondiente patrdn. Asimismo, se ha confirmado su identidad por GC.

38* .- Acetato de 4-terpenilo. La retencidn cromatogrâfica de este - compuesto es muy similar a la del componente anterior. Por este motivo, su presencia en los aceites no es facilmente determinable. No - obstante, se ha comprobado su existencia en algunas especies. Su espectro de masas, obtenido de una fraccidn cromatogrâfica coincide conel que figura en (32).

39.- Este componente estâ presents en el aceite de la especie 5T1/7 a una concentracidn de 3,9 en el resto de ellas, cuando existe, - aparece en cantidades minoritarias.

Su espectro de masas (fig. 10) no se ha podido registrar delproducto totalmente puro. Se aprecian impurezas debidas a un hidro-carburo de masa molecular 204. No es observable el idn molecular, ni ninguna sehal indicative del mismo, ya que el pico visible de mayor masa es el m/z 82. Por estos motivos es dificil llegar a formuler - una estructura. Unie ament e apuntar que puede tratarse de un alcohol monoterpénico del tipo del mentol, quizâs impurificado por el terpinen-4-ol, ya que ambos presentan con pico base el idn m/z 71, y en el espectro del primero no se aprecia la sehal correspondiente a su idn molecular. Tanto el mentol normal como el neomentol presentan - un pico a m/z 82 con una intensidad notable (30,5 y 41,7 respectivamente), segdn como se cita en (26).

40.- Mirtenal. Se ha eluido por cromatograf la en columna llquido-sdlido, con n-hexano-eter^ 88-12. Este compuesto estâ presente en casi todos los aceites estudiados. Su espectro de masas estâ de acuerdo

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con los datos que figuran en (30) para este compuesto.

41.- Aromadendreno. Algunas especies lo contienen, aunque en cantidades minoritarias. Se ha registrado su espectro de masas que coincide con el del compuesto patrdn, asi como su retencidn cromatogrâfica.

42.- t-Pinocarved. Estâ presente en todas las especies, siendo - mayoritario en los T. gnaphalodes. Se ha logrado aislar por fraccionamiento en columna cromatogrâfica llquido-sdlido con n-hexano- eter, 85-15. Su espectro de masas (fig. 11) parece coincidir con el public ado en (33) y (34). Se ha.podido confirmar su estructura por medio de su espectro de ^-BMN. Las bandas mas caracterlsticas se describen a continuacidn:a) Dos singletes a 4,95 y = 4,75 ppm, correspondientes a los dos protones del grupo sCHg, que ademâs presentan estructura fina - por acoplamientos alllicos.b) Doblete a <T = 4,40 ppm (f = 8 Hz), perteneciente al protdn geminal al grupo OH, por acoplamiento con un protdn del carbono vecino. Se aprecia asimismo un segundo desdoblamiento debido al segundo protdn, con una constante de acoplamiento muy pequena.c) AcT= 0,85 y = 1,25 ppm présenta el espectro dos singletes perteneciente s a metilos en carbono cuatemario.

43.- Ha sido comprobado su presencia en pocas especies, donde su - concentracidn nunc a supera el 0,6 Esto junto a que en cromatografla de gases aparece en una zona muy comple ja, donde hay diverses - compuestos con retenciones muy similares, ha impedido su identificacidn, pues ni siquiera se ha podido registrar su espectro de masas.

44.- Estâ presente en algunas especies, a una concentracidn que en -

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el mejor de los casos alcanza el 0,5 No obstante se ha podido - registrar su espectro de masas (fig. 12) el cual pone de manifiesto que se trata de un compuesto monoterpénico de peso molecular - 152. Las primeras fragmentaciones observables son la pérdida de un radical metilo (M 15) y la de agua (M - 18). Esto nos indica - que posiblemente se trate de un alcohol monoterpénico de férmula - empirica 0 que poseera por tanto, très insaturaciones.

El pico base del espectro n/z 59 es caracterlstico del gru- OH , el ién a m/z 91 (tropilio) es propio de estruc-po

Hturas clclicas. Que satisfagan estas condiciones se pueden formulerlas estructuras siguientes:

OH OHOH

VIV

OH

I II III IVLas V y VI, son menos probables, pues no parece estar favorecida - la ruptura para producir el ién intense a n/z 59. Las estructuras I y II no son frecuentes en terpenos, lo cual nos lie va a pensar - en las III y IV.

Por otra parte los picos mas intenses del espectro n/z 59» 94, 79 coinciden con los de un alcohol monoterpénico sintético que se cita en (35) cuya estructura es

OH

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la similitud entre esta estructura y las propuestas III y IV, indican que ciertamente debe tratarse de una de ellas,

Con una retencidn cromatogrâfica algo mayor aparece otro - compuesto, cuyo espectro de masas es muy similar al citado. Por - las mismas razones cabe pensar que se trate de uno de los dos is6- meros III o IV. Dada su escasa concentracidn en los aceites, y la dificultad de localizarlo, no se le ha asignado ningiîn ndmero de - orden,

45.- oC -Humuleno. Estâ présente en todas las especies de Teucrium.Se ha eluido junto a otros hidro carburo s sesquiterpénicos en fracciones poco polares. Se ha identificado por comparacidn de su espectro de masas con el de un patrdn, lo que se ha conf irmado asimismo por GC.

46.- Posee una retencidn cromatogrâfica muy similar a la del ^ -humuleno. Su concentracidn alcanza su valor mâximo en los T . gnaphalodes, donde en algdn caso supera el 4 9. En el resto de la especies, cuando estâ présente, su concentracidn es muy baja.

Se ha aislado en una fraccidn obtenida por cromatograf fa - de columna llquido-sdlido, al eluirse con n-hexano-eter, 75-25. Su espectro de masas (fig. 13) nos indica un idn molecular 152, con los principales picos m/z 109, 91, 41 y 43. Existen, ademâs, los - picos correspondientes a la pérdida de metilo (M^- 15) y agua - (M^- 18), que ponen de manifiesto su naturaleza alcohdlica, lo - que se confirma por la aparicidn de la banda a 3.480 cm ^ en su - espectro infrarrojo.

Los picos mas significativos de su espectro de masas pueden

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explicarse como se indica en el siguiente eso_uema:

M* 152

-C3

-CH.

-HgO

m/z 109

m/z 137

^ m/z 134

-HgO

-HgO-s» m/z 119

I-fc- m/z 91

*-O3

Por otra parte, su espectro de ^-RMN (fig. 14) confirma - su funcidn de alcohol por la desaparicidn de la handa de hidroxilo a cT = 1,6 ppm. al agitar con agua deuterada. Las bandas mas caracterlsticas de dicho espectro son las siguientes:a) Un multiplete centrado a / = 5,33 ppm. y constante de acoplamien- to muy pequeha, debido a un protdn oleflnico.b) Una banda ancha a cT = 4,25 ppm. perteneciente a un protdn enla-

^ OHzado a un carbono terciario, portador del grupo OH: • P&raexplicar que este protdn saiga a campo relativamente bajo, debe - considerarse que estâ en carbono contiguo a doble enlace.c) A / = 0,85 y = 1,32 ppm., el espectro de resonancia présenta dos singletes que intengran por tres protones cada uno. Deben serpor tanto de metilos uni do s a carbono cuatemario,

H Q QJJque deben estar situados en distinto entomo. 3 3d) Un grupo metilo vinflico a = 1,70 ppm., cuya sehal de resonancia se escinde en un triplete (J = 1,5 Hz) lo cual se explica si - existe un solo protdn en (3), en cuyo caso, este desdoblamiento - procédé de un acoplamiento alllico con el H en (2) y otro homoall- lico con el H en (3).

e) Multiplete a cT = 2,2 ppm, de protones -CH 6 -CH^- contiguo s a doble enlace.

Para un alcohol 0 con tres insaturaciones, una delas cuales es un doble enlace debe corre spender una e structura bi* ciclica que ademâs teniendo en cuenta las caracterlsticas antes - mencionadas debe ser del tipo:

6

5OHH

HO

II III

La e structura II no cumple la condicidn (b), ya que, el - protdn del carbono (4) no suele aparecer a campo s tan bajos. Las e structuras I y III son coherent es con la informacidn obtenida de sus espectros de MS, IR y ^-RMN. 8in embargo, creemos mas probable la primera que posee el esqueleto base del pinano, que es mas fre- cuente en terpenos.

Se han encontrado diferentes datos (26, 36) sobre el espectro de masas del compuesto I denominado verbenol, que en ningdn caso coinciden con los de nuestro espectro, en lo que se refiere a - la intensidad de los picos. Podrla pensarse que se trata de un is6- mero diferente a los que se citan en la bibliografia, o bien que - ha influido sobre el espectro algdn factor de carâcter experimental.

En el espectro de ^-RMN aparece un singlet e a cT = 1,25 ppm que no pertenece a nuestro compuesto, as! como un multiplete centrado a cf = 0,85 ppm propio de hidrocarburos de cadena lineal, los -

cuaj.es se na comproDaao que proceaen ae impurezas ae xos aiso±ven- tes apolares que son menos volâtiles que nuestro, pues se han podido separar dichas impurezas,

47.- y -Muuroleno. Se eluye en columna cromatogrâfica liquido-s6li- do con n-hexano.* Estâ présente en todos los aceites esenciales estudiados de Teucrium, gene raiment e a concentraciones inferiors s al 5 Por su espectro de masas se ha identificado como T -muuroleno, por comparacidn con los puhlicados en (28) y (37).

48 y 49.- Por cromatograffa de gases se han localizado estos dos - compuestos en los aceites de algunas especies, que debido a su pequeha concentraciân no se han podido identificar.

50.- o< -Terpineol, Bomeol, Acetato de<X-Terpenilo. En aceites de especies diferentes se han localizado estos tres componentes, con una retenciân cromatogrâfica. muy similar. Su identificaciân se rea- liz6 por medio de sus espectros de masas, por comparaciân de sus - correspondientes patrones. El registre del espectro de cada uno de elles, pudo realizarse en fracciones distintas separadas por cromatograffa Ifquido-sâlido. No siempre estân présentes los très compuesto s en la misma especie. La mayorfa de ellas present an solo el

-terpineol y bomeol.

51.- Isoborneol. Es components mayoritario en la especie 9T1/9. Su espectro de masas coincide con el de su patrân. Esta asignaciân se confirma por GC.

52.- Germacreno D . Es components fundamental en el T. capitatum de Vaciamadrid. Se ha recogido esta especie en diferentes épocas con el objeto de estudiar la variabilidad de la composiciân de su aceite esencial. La concentraciân de este components, parses aumentar

con el grado de madurez de la planta.

✓A partir del aceite total se registre su espectro de masas (fig. 15) el cual ponfa de manifiesto que se t rat aba de un hidrocarburo sesquiterpénico. En la bibliografia se encontraron algunos datos del espectro de masas del Germacreno D (14), coïncidentes con los picos mas intenses de nuestro espectro. No obstante, para confirmar su estructura, al ser el components fundamental, se trat6 - de aislar tanto por medio de fracionamiento en columna cromatogrâ- fica liquido-sdlido, como por GO preparativa. En ambos cases se pro- dug eron isomerizaciones.

En la fraccidn de hidrocarburos sesquiterpénicos, se obser- v6 un cambio en la intensidad del pico cromatogrâfico correspondiente a este compuesto, por transformacidn de este en otro con mayor retencidn. El producto formado se identified por su espectro de - masas como -cadineno, y se confirme con su espectro de ^-RMN, - que muestra las siguientes bandas:a) Un singlets a cT = 5,5 ppm de un protdn oleflnico.b) Dos singletes a. S = 4,5 y ^ = 4,6 ppm de dos protones en un grupo = CHg.c) Banda ancha a <f = 1,6 ppm, que integra por tres protones, propio del grupo ^-CH^.d) Dos dobletes centrados a. S =. 0,68 y ^ = 0,88 ppm (J = 6 Hz) de metilos en grupo isopropilo.

En la bibliografia se cita al Germacreno D como compuesto que sufre fâciles isomerizaciones a o( -muuroleno, 1^-cadineno, etc., tanto por la accidn de la luz y el calor o sobre la gel de silice, lo cual nos sugiere que reaimente se trate de este compuesto.

n J I r - i I P » f i ' i

4 '4 353556 7697 7

64. g3 8 . 016.03 6 . 0 22. 0 2 4 . 82 8 . 0

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10.5 1 0 7 119

4 0 . 0 5 -4 . 05 4 . 0 3 o . 9 f 3. i ' : 6 . 9 4 4.0

120.1 3 31611 6 22 8 4

2 4 . 0 20.0

188.0 14. 8 12.0

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1 5 0

C t P r t f l C R E M O 0

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M/Z

r r n "

(Fig- 15)

M / Z

41435 35 56 36 7

I N T

5 2 . 21 9 . 6 1 5 . 22 7 . 2 1 0 . 92 1 . 7

M / Z

6 97 77 981919 3

INT1 9 . 6 2 5 . 0 3 9 . 1 4 3 . 5 4 7 . 3 4 8 . 9

M / Z

1 0 51 1 91 3 31611 8 92 0 4

I M T

7 0 . 74 5 . 7 2 3 . 3

100 .03 . 7

2 5 . 0

H - H 4-1

ES

I D S

S I 93 113I1 3 3

151

I I I I I I

2041 0 3

1 T--"T50 1 00 150 200

V-CADINENOEE0M / 2 (fig. 16)

52* Dihidroagarofurano. Estâ presente solamente en el aceite de una de las especies estudiadas. Se ha identificado por su espectro de masas que pare ce coincidir con el que se cita para dicho compuesto en (39).

53.- A pe que nas concentraciones estâ presents en algunas especies. Solamente se ha obtenido el espectro de masas de este components - (fig. 17). Su idn molecular M"*"204 y su retencidn cromatogrâf ica, indican que es un hidro c arburo sesquiterpénico. Su pico a m/z 189, intenso, es propio de las e structuras de selinenos aunque, suele - ser aiîn mas intenso en estos. S in embargo, los picos intenso s a - m/ z 93, 91, 105, podrlan procéder de otro hidro carburo que posea - su misma retencién cromatogrâf ica.

54.- -Muuroleno y -Bisaboleno. Con esta misma retencién cromatogrâf ica se han identificado estos dos hidro carburo s. El âltimo de ellos solo aparece en el T. chamaedrys. Su identificacién se ha 11e- vado a cabo por comparacién de los espectros de masas con los represent ado s en (28) y (38), respectivamente.

55.- Carvona. Se eluye en cromatogrâf la de columna llquido-sélido con n-hexano-eter, 88-12. Se ha identificado por comparacién de su espectro de masas con los de un patrén, y por su tiempo de retencién cromatogrâfica.

56.- ^ -Cadineno. Se eluye con n-hexano por cromatogrâf la en columna llquido-sélido. Se ha identificado por su espectro de masas (fig.18) que coincide con el public ado en (40). En este trabajo se asig- na al compuesto la estructura I. En (41) y (42) ap arec en informacio- nes diferentes sobre el espectro del cT -Cadineno, al que atribuyen la estructura II.

M/Z IMl f l 'Z M/2 IMT

4143

777981

100. eS'5. 52 8 . 3 6 1 . 8 35.. 3 44 . 74 7 . 4

93 10.5 107 109 113 121

•91.63 3 . 5 32.3

133147161133204

4 7 . 42 6 . 32 3 . 3 3 3 . 2 32 . 3

4 ;

u2H 1S3

1 3 3

50M. 2

COMPONEMTE H.55 (Pig. 17)

M / 2

4 14 3M5 35 56 56 7

I HT6 5 . 6 2 8 . :

9 , 41 8 . 33 1 . 3 1 4 . 1 1 2 . 5

M/Z6 9777 98 1919 3

1 0 5

IKT1 8 . 32 5 . 0 1 8 . 83 4 . 4 4 3 . S2 5 . 0 5 4 . 7

M/i1 1 31 3 41 6 11 6 21 3 32 0 4

I M T

5 6 . 368.8100.021.91 5 . 64 3 . 8

151L.azH

S3

200M/Z

(f-CfiOrttEHO (Fig. 18)

I

II

Como se puede observar se trata de dos isdmeros de posicidn con la misma nominacidn, Como en I estâ especificada la estereoiso- merfa del compuesto hemos encontrado mas fiable la primera info3>- macidn.

57.~ -Curcumeno. Se eluye con n-hexano-eter, 96-4. Su espectro de masas coincide con los que da la bibliografia (43)» (44), para este compuesto.

58.- La concentracidn de este component e, en los aceites donde existe es muy pequeha. Se ha podido registrar su espectro de masas, del cual solo se puede deducir que se trata de un hidro carburo sesquiterpénico.

59.- Aldehido cumlnico. Su espectro de masas y su tiempo de retencién coinciden con el del patrén.

60.- Mirtenol. Se eluye en cromatograffa de columna llquido-sélido con n-hexano-eter, 80-20. Estâ presente en la mayorfa de los aceites, alcanzando su mayor concentracién en los T. gnaphalodes. Su - espectro de masas coincide con el del patrén, asf como su retencién cromatogrâfica.

61.- trans-Carveol. Se eluye en cromatograffa Ifquido-sélido con -

n-hexano-eter, 80-20. Estâ presente tan solo en algunas especies, y en cantidades minoritarias. Su espectro de masas parece coincidir con el que se cita en (26), para este compuesto.

Con la misma retencién cromatogrâf ica, existe otro componente, también en pequeha concentracién, cuyo espectro de masas (fig. -19) indica que se trata de un hidro carburo de peso molecular 204. - Los picos mas importantes de su espectro coinciden con los del - ^ -elemeno. S in embargo, nos harfan fait a mas datos para asignar- le esa estructura, puesto que ambos espectros no coinciden exactamente.

62.- Calameneno. Se eluye por cromatograffa Ifquido-sélido con n- hexano-eter, 98-12. El espectro de masas de este componente, coincide con el public ado para el calameneno en ( 28) y (41). Estâ presents en gran parte de los aceites, aunque gene raiment e a concentraciones no superiores al 2 9.

62* .- Se trata de un compuesto que se eluye con n-hexano-eter, 80- 20. En su espectro de masas (fig. 20) se observa un ién molecular

152, y sus primeros fragmentes a m/z 137 (M'*" - OH^) y m/z 134 (M^-HgO), lo que indica que debe tratarse de un alcohol mono t erp ë- nico y probablement e monocfclico dada la intensidad de su pico -

-18. Se ha comparado su espectro con el que se cita en (26) para el cis-carveol, y existe un gran parecido en el aspecto cualitativo de los picos mas representatives, con un pico base a n/z 84, ana- logamente.

Estudiadas las e structuras, que nos pueden conducir al ién m/z 84 como pico fundamental solamente son posibles las I y II, En ambas estâ favorecida la fragmentacién retro-Diels Aider para pro-

53556768 69 77

4 2 . 55 1 . 55 6 . 6 2 6 . 5 3 3 . 83 9 . 7

919395

105107108

5 0 . 08 9 . 720.65 2 . 97 3 . 52 6 . 5

12213314716118920 4

3 5 . 3 2 9 . 42 4 . 3 3 3 . 8 1 6 . 22 1 . 3

4 1

5 7 SI

1213 3

107

" I T" r r "T5 0 1 8 0

133161

1 47 1B9T I i"

204

T" I 1 f1 5 0

COMPOMEMTE M.61

200T— I— I— I— I— I— I— r

G50

M'Z(Fig. 19)

M/241435556 69 67

IMT7 6 . 96 1 . 566.22 7 . 75 2 . 33 0 . 3

M/ Z 79 31 83

. 84 91 9 3

I M T3 8 . 53 2 . 35 0 . 3

100.03 3 . 3 3 0 . 3

M / 29 5

109119134137152

IMT2 6 . 25 3 . 52 9 . 23 3 . 810 .8

4 . 6

54u

H

34S-t

ise

d : M P C M E N T e M . 6 2 ' (fig. 20)

ducir dicho l6n.

I IISin embargo, en el espectro del compuesto correspondiente

a la estructura II citado en (26), no aparece dicho idn entre los cinco primeros picos de mayor intensidad. Si ademâs, tenemos en - cuenta que el trans-carveol ya ha sido identificado (componente 61), lo mas probable es que este compuesto sea el cis-carveol (estructura I).

63.- Se eluye en una fraccidn de columna cromatogrâf ica con n-hexano-eter, 75-25. Solo se dispone de su espectro de masas (fig. 21), del que no se ha encontrado ninguna referenda bibliogrâfica. Su - i6n molecular M - 222 y los fragmentes a M - 15 y M - 18, indican que se trata de un alcohol o eter sesquiterpénico de fârmula empirica 0. Su retencién cromatogrâf ica es mas propia de éteres,aunque no se excluye la posiblidad de un alcohol.

64.- Su concentracién en los aceites no alcanza el 1 y no estâ présente en todas las especies. Se ha registrado el espectro de - masas (fig. 22) de este componente a partir de una fraccién cromatogrâf ica de polaridad media. Su ién molecular M 150, y los iones intensos m/z 135 (M"**- CH^) y m/z 132 (M* - H^G) sehalan que es un - compuesto de férmula empirica C^Q 0. El ién m/z 91 (tropilio), y demâs picos de mener intensidad del espectro, ponen de manifiesto el caracter aromâtico del compuesto, con lo que quedan cubiertas

M : I M T I M T M / Z

• 5 4 . 1 "^9 2 9 . * ’ 1 5 1- 7 . e 4 . 9 5 1 n Î 4 C 1 7 95 3 ^ 7 . 5 9 1 4 0 . 5 1 9 95 Î' 4 6 . 5 9 7 2 0 46 5 1 0 . 8 5 5 2 1 . 6 2 0 79 7 1 5 . 9 1 0 5 9 1 . 1 2 2 26 9 2 8 . 4 1 0 7 1 5 . 57 7 2 0 . 3 Î 19 6 7 . 6

I M T

17.6 13.9 2c.e

4 51c.

515559 207

ED

( f i g . 2 1 )COriF'OMEMTE M. £5

M/Z INT41 33.343 100.051 15.355 20.857 13.959 25.063 25.065 19.467 29.2

ri/£ INT77 16.779 19.481 12.5.83 13.991 58.392 23.693 . 15.395 11. 1105 13.2

M%Z107109115117119132133 150

IMT9.716.713.922.215.353.393.113.2

43135uB

*-H

B753 7353

1BQM/Z

COMPOMEMTE M.64 ( f i g . 2 2 )

las cuatro insaturaciones permitidas para esta fdrmula molecular. Con un grupo hidroxilo y estructura aromàtica solo se pueden formu- lar las siguientes estructuras terpénicas:

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OHOH CHpOH

II III IV

Las tres primeras pertenecen a compuestos cuyos espectros de masas son perfectamente conocidas (timol, carvacrol, cuminol), y no coinciden con el nuestro. Sobre la estructura IV, figuran tres espectros muy diferentes en la literatura (45)> (46),(47)> para el mismo compuesto, ninguno de ellos coïncidente con el nuestro, El - aspecto del espectro de (46) es muy parecido al del registrado por nosotros. Sin embargo, al no disponer de patrdn ni de otros datos, no podemos asignar con seguridad dicha estructura a nuestro compuesto, Sobre la V no se dispone de ninguna informacidn.

65 y 67.- Isdmeros del Calameneno deshidrogenado. Se encuentran en una fraccidn e lui da con n-hexano-eter, 98-2, Sus espectros de masas (fig, 23) que son similares sugieren que se trata de dos hidrocarburos sesquiterpénicos de masa molecular 200 y férmula empirica, - por tanto, C^^ ^20* parte baja del espectro es similar a la del calameneno, hi dro c arburo de peso molecular 202, Los picos de mayor masa, que son los de mayor intensidad, son dos unidades menores que los del calameneno, Esto nos lleva a pensar que puede tratarse de productos de deshidrogenacién del mismo, Siendo la estructura de - este hidrocarburo:

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Una insaturacién mas, darla lugar a seis isdmeros de posi- ci6n. Con los datos de que se dispone, es muy dificil de precisar la posicidn del nuevo doble enlace en la parte saturada de la molé- cula de calameneno. Los componentes 65 y 67 deben ser dos estereoisdmeros, de un calameneno deshidrogenado.

66.- Se trata de un componente, cuyo peso molecular es 192. No se ha podido obtener el espectro de masas del compuesto tot aimente - puro. Sin embargo, su aspecto general recuerda al de las iononas.Si tenemos en cuenta ademds, que présenta una retencién muy préxi- ma a la de la (S -ionona, podriamos pensar que se trata de uno de - los isémeros de ésta.

67'.- En la mayorla de las especies, con esta retencién cromatogrâ- fica se ha localizado el isémero del calameneno deshidrogenado ya citado anteriormente (componente 67), junto con el componente 65.En el T. pseudochamaepitys, se ha localizado un compuesto con esta misma retencién, de naturaleza diferente. Su espectro de masas y - tiempo de retencién, coinciden con los del patrén de [i -ionona.

68.- Se eluye en la misma fraccién cromatogrâf ica que el componente 63, y posee un espectro de masas similar al de este compuesto. Esto sugiere que puedan tratarse de dos estereoisémeros de un compuesto, cuya estinctura posea mas de un carbono asimétrico.

68' Alcohol Perllico. Aparece en algunos aceites, con una retencién muy similar a la del componente anterior. Se ha identificado por comparacién de su espectro de masas con el que figura en (48), para este compuesto.

69.- Oxido de Cariofileno. Se eluye con n-hexano-eter,85-15 , por cromatograffa en columna Ifquido-sélido. Estâ presents en la mayorfa de las especies. Sin embargo, es particularmente importante en el T. gnaphalodes. Su espectro de masas y de ^-RMN coinciden con los que figuran (49), para este compuesto.

70.- Gubenol. Se eluye con n-hexano-eter, 92-8. A partir de esta fraccién se registré su espectro de masas que coincide con el citado en la bibliograffa (28).

71.- De su espectro de masas (fig. 24), se deduce un peso molecular de 222. No se dispone de otros datos que ayuden a elucidar sus caracterfsticas estructurales y en la bibliograffa consultada no aparece ningdn compuesto cuyo espectro de masas coincida tôt aiment e - con el de este componente. En (39) aparece citado el espectro de - masas del dihidrofamesal, cuyos picos de mayor intensidad coinciden con los del nuestro, aunque las intensidades relativas son diferentes.

72.- En general, es un componente présente a pequeha concentracién. Se ha registrado su espectro de masas (fig. 25) de una fraccién eluida con n-hexano-eter, 88-12. Este no coincide con ninguno de los - consult ado 8 en la bibliograffa. Los picos mas importantes de dicho espectro, son los mismos que présenta el epéxido de humuleno II - que se cita en (50), como picos de mayor intensidad. El n/z I3 8, - es un pico poco corriente en las e structuras mas frecuentes de -

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de esqueletos sesquiterpénicos, lo que nos induce a pensar que se trata de este compuesto o de otro con estructura muy similar.

73.- Nerolidol. Identificado por comparacién de sus espectro de masas y ^-RMN con el del patrén. Su concentracién es importante en muchos aceites. Alcanza sus valores mâximos en los T . capitatum de Vaciamadrid, y T. gnaphalodes.

74.- Cadinenol. En cromatograffa en columna Ifquido-sélido, se eluye con n-hexano-eter, 88-12. Los picos mas importantes de sus espectro de masas (fig. 26), coinciden con los que se citan en la bibliograffa para este compuesto (51). Para confirmar su estructura se - ha aislado este componente por GC preparativa y se registré su espectro de IR y de ^-RMN. En efecto, el espectro IR présenta a 3460 cm ^ la banda de alcohol. Su espectro de ^-RÎÆN (fig. 27) présenta las siguientes bandas caracterfsticas:a) Una banda a (T = 5» 36 ppm debida a un solo protén olefinico, en- sanchada por acoplamiento a larga distancia con protones de grupo metilo.b) Banda ancha a 1,67 ppm de metilo contiguo a doble enlace.c) A ^ = 0,84 ppm esté centrado un triplets , que en realidad corresponde a dos dobletes (J = 6 Hz) de protones de grupo isopropilo.d) La sehal de resonancia de metilo en carbono terciario aparece a cT = 0,94 ppm como un doblete (J = 6 Hz).f) No aparece sehal de protén en carbono contiguo a OH, lo que confirma que el hidroxilo esté en un carbono cuatemario.

Estas caracterfsticas son perfectamente coherentes con la estructura del cadinenol.

Esté presents en algunos aceites a concentraciones minorita-

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75.- Estâ presents siempre en cantidades minoritarias. De su espectro de masas, registrado de una fracciân polar, solo se deduce que se trata de un alcohol sesquiterpénico de peso molecular 222, lo - que estâ de acuerdo con su retencién cromatogrâf ica. Por otra parte el ién a m/z 189, como pico hase del espectro, apunta hacia una estructura con esqueleto de eudesmano.

76.- Elemol. Su espectro de masas, obtenido de una fraccién croma- togrâfica de aita polaridad, parece indicar que se trata de este - compuesto al compararlo con el que aparece en (52).

77.- Se eluye por cromatograffa en columna Ifquido-sélido, con di- solventes de alta polaridad. Su espectro de masas indica que es - un alcohol sesquiterpénico 0. Dicho espectro, no coincidecon ninguno de los consult ado s en la bibliograffa, ni se ha podido obtener mas datos de él.

78.- Se eluye en columna cromatogrâf ica Ifquido-sélido, en las fracciones de alta polaridad. Del espectro de masas de este compuesto (fig. 28), se deduce un peso molecular de 220. La sehal M - 18, - pone de manifiesto la presencia de funcién oxigenada. Corresponde por tanto para este componente, una férmula empfrica de 0.No hemos encontrado en la bibliograffa compuestos con espectros de masassimilares al de este componente.

El aislamiento del compuesto por 00 preparativa, a partir de fracciones polares, nos ha permitido realizar ademâs, sus espectros de IR y ^-RMN. La banda a 3*380 cm~^ de su espectro IR (fig. 29), indica la presencia de grupo OH, asf como la que aparece a -

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1,635 cm ^ nos senala la existencia de dobles enlaces. Por otra - parte, su espectro de ^-RMN (fig. 30) présenta las siguientes bandas caracterlsticas:a) Una banda ancha centrada a cT = 4,68 ppm, que revela la existencia del grupo ^ C = OH^.b) Singlete a = 1,30 ppm de metilo en carbono contiguo a OH.c) Dos singletes a S = 1,03 ppm, correspondientes a dos metilos en carbono cuatemario.d) A campo mas alto, aparecen una serie de sehal es muy caracterlsticas de protones de un ciclo de tres miembros.

La hidrogenacidn catalltica del producto, nos lleva a la - conclusidn, de que la dnica insaturacidn que posee el compuesto, - en forma de doble enlace, es la del grupo yC = CH^, puesto que se descarta la posibilidad de dobles enlaces tetrasustituidos. De esto se dedude, que la estructura posee necesariamente un sistema - triclclico.

Estos datos estructurales, apuntan hacia una estructura - derivada del esqueleto de aromadendrano :

Lo que no se puede precisar, es la posici&n del grupo hidroxilo y del metileno terminal, ya que caben para ello, las posiciones C^, 0^^ 6 0^^, 0^, respectivamente.

79.- Isoeugenol. Su espectro de masas y retencidn cromatogrâfica, coinciden con les del patrdn.

80.- t-Cadinol. Estâ presente en la mayor!a de las especies y su - concent racidn gene raiment e no sobrepasa el 5 En cromatografla - en columna, se eluye en las fracciones de mayor polaridad junto a los alcoholes sesquiterpénicos. Se ha registrado su espectro de - masas (fig. 31) > que no coinciden exact ament e con ninguno de los consultados en la bibliograffa, ni de los pat rones disponibles. De las fracciones mas enriquecidas se ha conseguido aislar, por cromatografia de gases preparativa.

Su espectro de masas présenta como pico de mayor masa el - m/z 204, sin embargo, es évidente que no se trata de un hidrocarburo, tanto por su retencidn cromatogrâfica como por la fraccidn en que se eluye por cromatograffa Ifquido-sdlido. Debe tratarse por - tanto, de un alcohol o éter sesquiterpénico de i6n molecular 222, que por pérdida de agua produce el fragmente a m/z 204. Su reten- ci6n cromatogrâfica, por otra parte, es mas caracterîstica de alcoholes, lo que se confirma por la desaparicidn de la banda de OH del espectro de ^-RMN al agitar con agua deuterada y por la près en- cia de la correspondiente banda a 3*440 cm"" , en su espectro infrarrojo. Se trata pues, de un alcohol sesquiterpénico de férmula empirica 0, con très insaturaciones por lo tanto.

Las bandas mas caract eristic as de su espectro de ^-RMN - (fig. 32) se indican a continuacién:a) Una banda ancha a ^ = 5,55 ppm. debida a un protén olefinico.b) La presencia de un grupo metilo unido a doble enlace se pone - de manifiesto por la banda ancha que aparece a cT = 1,65 ppm,c) Un singlete a cT = 1,20 ppm que integra por très protones, es -

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Se han aislado otros alcoholes sesquiterpénicos ( componentes 82, 86) de distinta retencién cromatogrâfica, cuyos espectros de masas, practicamente idénticos, parecen coincidir con los cita- dos en (28, 4I) para el -cadinol. Sus espectros de ^-RMN son - ademâs muy similares y a su vez de anâlogas caracterlsticas al del component e 80, que estâmes considerando. La estructura de los cadi- noles, no estâ en contradiccién con ninguno de los dates que posee-

HO

mes de este compuesto. Esta estructura posee cuatro âtomos de carbono asimétrico, por lo que es de esperar la existencia de echo es- tereoisémeros, cuya identificacién requiers otros dates que no hemos podido obtener. Sin embargo, un cierto parecido del espectro - de masas con el que se cita en (50) para el t-cadinol, sugiere que

HO

se trata de este compuesto, aunque no se puede afirmar con toda — certeza,

81,- Estâ presents solamente en los aceites de T. gnaphalode s. Se - eluye por cromatograffa en columna llquido-sâlido con n-hexano-éter (85 -15). A la vista de su espectro de masas, (fig. 33) y consultada la bibliograffa, no podemos deducir la estructura de este component e. El i6n molecular es un 222, y los picos a n/z 204 y 207 indican la presencia de una funciân alcohol, lo que se confirma por la banda ancha a 3*380 cm*" de su espectro infrarrojo. Le debe corresponder, por lo tanto, una férmula empfrica de 0, con -très insaturaciones.

Su espectro de ^-RMN (fig. 34) tampoco conduce a conclusiones definitivas sobre su estructura. En él se observan algunas bandas en la zona de protones oleflnicos, que proceden con seguridad de impurezas, pues, al hidrogenar el compuesto se mantiene su peso molecular. Se trata pues, de un alcohol saturado. Por tanto, debe tener una estructura triclclica. A cT = 3,53 ppm aparece una banda caracterfstica de protén geminal a OH, con forma de seudotriplete. Centradas a ^ = 0,80 ppm aparecen unas bandas agudas, que deben - corresponder a grupos metilos, cuya multiplicidad résulta dificil de estimar. .

El hecho de que el desplazamiento qufmico de éstos metilos sea muy similar y el escaso desdoblamiento de las bandas parece - indicar que la mayorfa de ellas correspond en a metilos cuatemarios. Es muy dificil con estos datos establecer una estructura base de - hidrocarburo triclclico, pues, entre las mas comunes no hay ninguna que presents todos los metilos cuatemarios.

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82.- Cadinol I. Se encuentra a mayor concentracidn en el T. erice- phalum. Su naturaleza es muy similar a la del componente 80, por lo que su separacidn a resultado muy dificultosa. Esta se ha conseguido por sucesivos fraccionamientos en columna, utilizando el colector de fracciones, y finalmente por cromatograffa de gases preparativa. Su espectro de masas (fig. 35) parece coincidir con el citado en (28, 41) para el -cadinol. Sin embargo, el components 86, que se eluye en una fraccidn cromatogrâfica de mayor polaridad, y posee una mayor retencidn en GO, présenta un espectro de masas muy similar. Hemos creido conveniente separar y aislar ambos componentes para su mejor caracterizacidn.

El espectro de ^-RMN (fig. 36) del componente que nos ocupa, présenta el mismo tipo de bandas, con desplazamientos y constantes de acoplamiento muy similares a las del components 80. Tan solo présenta pequehas diferencias, en el acoplamiento de los protones del isopropilo, y el desplazamiento de la banda del metilo contiguo a OH. Este tipo de resonancia es perfect ament e coherente con la estructura citada del << -cadinol, por lo que debe tratarse, como se ha dicho, de uno de sus estereoisdmeros posibles.

82* .- Timol. En GO el pico correspondiente a este components aparece enmascarado en la mayorfa de los aceites estudiados por el del - components 82, salvo en los de T. pseudochamaepitys y T. chamaedrys que estâ presents solo este components. Para su identificacidn se ha us ado su patrdn.

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83.- F ame sol. Su espectro de masas y retencidn cromatogrâfica - coinciden con las del patrdn,

84.- 1,6 - dimetil - 4 - isopropilnaftaleno. Se eluye en una frac- ci6n polar, por cromatograffa en columna llquido-sdlido, a partir de la cual se ha registrado su espectro de masas (fig. 37). I*a gran intensidad de los picos a mayor masa, y la presencia de los picosa m/z 91 y 105, sugieren su caracter aromâtico. Su ion molecular - es 198 y el pico base aparece a n/z I83 = M - 15. El espectro no es el del compuesto totaimente puro, y en la parte baja del mismo, hay picos que no corresponden a este compuesto. Los picos mas importantes son los mismos que se dan en (25) para el 1,6-dime til-4- isopropilnaftaleno. No se dispone de otros datos que confirmen su estructura, la que considérâmes bast ante probable, por su relacidn con los esqueletos terpénicos.

85.- Con la misma retencidn cromatogrâfica, se encuentran dos compuesto s de muy distinta naturaleza, en algunas especies. Uno de - elles, es un compuesto sesquiterpénico de peso molecular 222. El espectro de masas no se ha podido conseguir del componente totalmente puro, puesto que éste siempre sale junte al carvacrol, que - se ha podido identificar por GO, dado que se dispone de patrdn, y por algunos picos significatives de su espectro de masas. En el - anâlisis cuantitativo se engloba para el componente ndmero 85 la suma de ambos compuestos.

86.- Cadinol II. Ya se ha mencionado al hablar de los component es 80 y 82 que la estructura de este compuesto es muy similar a la de aquellos. El espectro de ^-RMN coincide con el de ambos. En lo - que respecta a su espectro de masas es practicamente identico al del componente 82, por lo que debe tratarse de un isdmero del mismo

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87.- Es un componente que aparece a pequena concentraci6n, solo en algunos aceites. Se ha registrado su espectro de masas (fig. 38) a partir de una fraccidn eluida por cromatografia en columna con n- hexano-éter, 85-15. Su ion molecular a m/z 218, indica que dehe - tratarse de un compuesto oxigenado, de fdrmula elemental 0, con cinco insaturaciones. La ausencia del pico - 18 y la presencia de algdn pico par intenso, tal como el 122, sugieren que la - funcidn oxigenada sea de tipo cetdnico, aunque no se puede excluir la posibilidad de alcohol.

88.- El espectro de masas de este componente, es muy seme jante al del vetivenol, aunque no lo suficiente como para afirmar que se - trate de este compuesto. Posiblemente posea una naturaleza similar.

89.- Se eluye por cromatograffa en columna Ifquido-sdlido en una -fraccidn polar. Solo se dispone de su espectro de masas (fig. 39)»en el cual se observa un ion molecular M 218, y los primeros frag-

+ -Vmentes M - 15 y M - 18, lo que indica que es un compuesto de f6r- mula empfrica 0 y posiblemente alcohol, dada su ait a reten-ci6n cromatogrâfica. No se ha encontrado informacidn a cerca de - ningdn compuesto que ppsea un espectro de masas similar. Se ha detect ado su presencia, solo en algdn aceite, a muy pequena concentra- ci6n.

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III.2.- ANALISIS CUANTITATIVO

Los resuitados del estudio analltico cualitativo y cuantitativo de los aceites, se muestran en la tabla III (Apéndice I). - Los component es identificados aparecen a la izquierda de la tabla, ordenados por su retencidn cromatogrâfica, al igual que se hizo en el apartado 111,1. En los casos en que el componente no ha podido ser identificado con seguridad, se le caracteriza para posterior — referencia con su ndmero de orden de elucidn. En la parte superior de la tabla, figura la relacidn de mue stras de plantas cuyos aceites han sido estudiados. La signatura es la misma que la indicada en la tabla I (apartado 11,1), y serâ utilizada en lo sucesivo, en muchas ocasiones para representar al aceite a que corresponde.

La comparacidn visual de los cromatogramas de estos aceites, puede ofrecer una visidn de con junto de la complejidad del problema, al tiempo que resalta las semejanzas y diferencias mas aparentes entre aceites. En el apéndice II, se han representado los aceites en forma de diagrama de barras. En abscisas, se toma para cada componente su niîmero de elucién (apartado III, 1) y en ordenadas - una altura proporcional a la concentracién del componente.

III.3*~CQMPARACI0N DE RESüLTADOS

La composicién de un aceite esencial depende de muy diverses factores. Es Idgico que plantas de diferentes especies botâni- cas produzcan diferentes aceites esenciales (lo que présenta un - elevado interés taxondmico), pero incluso dentro de la misma e specie pueden a veces distinguirse grupo s (quimiotipos) , que se diferencian por la distinta composicidn quimica dé sus aceites.

Clima, localidad, época de recogida, etc., influyen también en la composicidn del aceite,. generalmente solo de forma cuantitativa. Por dltimo, la separacidn y almacenamiento del aceite, as! - como el propio proceso de anâlisis, pro duc en también la alteracién de algunos de sus componentes.

El estudio estadistico de los datos contenidos en la tabla III, no puede llevarse a cabo usando un t rat ami ent o estadistico - clâsico por dos motivos:a) Faita de homogeneidad en los datos expérimentales. Debido a la dispersién geogrâfica, y en ciertos casos al interés botânico de - las diversas especies de Teucrium, el ndmero de aceites estudiados de cada uno es muy variable. Mi ent ras que de T. capitatum, especie muy abondante y de gran interés botânico, se han estudiado veintisiete mue stras diferentes, en la mayorîa de las demâs especies, solo se han podido obtener una o dos muestras.b) El elevado niîmero de component es e interdependencia de los valores de sus concentraciones. Se han cuantificado hast a ciento dos - compuestos diferentes, y es de esperar como veremos mas adelante - (pag, 122), que la presencia de un compuesto, influya en la concentracién de los demâs.

Ante estas dificultades, hemos procedido a realizar el estudio comparative de nuestros datos, utilizando métodos de anâlisis multivariable, con el fin de obtener indicaciones sobre la existencia y caracteristicas de los factores que influyen en la composi- ci6n del aceite.

El t rat ami ent o matemâtico de los datos, se ha realizado - principaimente, utilizando el conjunto de programas ARTHUR (53). - Solo se han utilizado algunas de sus sub rut inas, que se expli carân al ser aplicadas a cada caso particular. El computador utilizado - ha sido un IBM 360, del Centro de Câlculo Electrénico del C.S.I.C. El resto de los programas ha sido escrito por nosotros para su uso en dicho computador o en un Olivetti P6060.

Dado el elevado ndmero de component es, hemos considerado - necesario el reducirlos, eliminandô de los câlculos, los componentes con menor importancia cuantitativa, o aquellos cuya concentracién no présenta variaciones signifie at i vas en los acéiteS: estudiados. AsI, se obtiene una gran sim#lificacién en los câlculos mate- mâticos y en la interpretacién de los result ado s. La informacién - cuantitativa que se pierde no es muy importante, y aunque en algunos casos, entre los componentes eliminados puede haber alguno tipico de alguna de las especies, siempre se tratarâ de un compuesto presents a concentraciones tan bajas que su utilizacién para casos prâcticos presentaria problemas.

Hemos escogido los siguientes componentes:

oi -Pineno (> -Pineno S abineno Componente 8 Mirceno Limoneno p-Cimeno

-Bourboneno

Linalol Pinocarvona Cariofileno 4-Terpineol Mirtenal t-Pino carve ol ot -Humuleno Verbenol

Isoborneol t-CadinolGermacreno D Componente 81 cT -Cadineno Cadinol IMirtenol TimolOx.Cariofileno Carvacrol Nerolidol Cadinol IICadinenol Componente 78

El primer problema que se nos présenta es la definicién - de una o varias medidas de là semejanza o diferencia entre las composiciones de los aceites. Una sencilla medida de la separacién entre dos puntos y x^ en un espacio de n dimensiones es el valor:

denominado distancia euclfdea.

En nuestro caso, podemos considerar que cada aceite i es un punto en un espacio de n dimensiones (n es el ndmero de component es) . El valor de la coordenada de cada punto sobre el e j e k, - ^ik’ Isi concentracién del componente k en dicho aceite.

Hemos calculado, utilizando el programa BIST de ARTHUR, la matriz de distancias entre todos los posibles pares de aceites. A continuacién, hemos procedido a agrupar los aceites, considerando su distancia euclidea como una medida de su disimilaridad. El proceso de agrupacién ha sido el siguiente:12. Se considéra que en la situacién original cada aceite es un - grupo. Si hay m aceites, habrâ pues^ m grupo s.

22, Se escogen los dos aceites que tengan una menor distancia eu- clldea entre si, Estos dos aceites forman un dnico grupo, siendo - pues, el ndmero de éstos m-1 .32, Se recalculan en los casos necesarios, las distancias entre - grupo s. En los casos de grupo s que contienen dos o mas aceites, - la distancia entre elles se toma como el valor minime de las distancias entre los posibles pares de aceites, cuando se escoge un aceite de cada grupo.42. Se escogen los dos grupos que prèsenten menor distancia entre 81. Estos dos grupo s se funden en uno nuevo, reduciendose pues, - en uno, el ndmero total de grupo s.52. Se repiten los pasos 3 y 4, hasta que solo quede un grupo.

El anterior método denominado método jerârquico, agrupa - prefe reniement e aceites con la menor distancia entre si (mayor similitud) . Sus resultados se mue s t ran en la figura 40. En ordenadas se presentan los aceites y en abscisas los valores de las distancias. El valor a que aparece una linea vertical indica la distancia a ? que se unieron los dos grupos senalados por las lineas horizontales que une.

El diagrama muestra la existencia de un complicado sistema de agrupaciones, presentandose al tiempo, grupos con muy variado - ndmero de miembros y, aceites que tienden a quedar aislados. Es - dificil elegir un umbral de distancias que permita la separacién - de grupo s "natural es". Hemos escogido solo el valor 13,5 para dicho umbral.

A este nivel destaca la existencia de un grupo muy numero- so, junto con varios grupo s de muy pocos component es. El grupo grande présenta a su vez dos subgrupos. El primero de ellos incluye -

8T7/17T1/29T1/99T7/19T12/19T13/18T1/108T1/67T4/17T5/19T9/17T2/18T1/38T1/18T1/2IT 1/48T1/47T1/18T10/19T6/18T6/48T8/18T1/78T1/129T10/17T3/18T1/147T1/35T1/18T6/38T6/28T6/68T6/58T6/19T6/39T6/29T1/68T1/98T9/19T1/88T1/89T1/79T1/55T11/I8T1/118T1/138T1/59T1/49TI/39ÏI/2

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(fig. 40)

los aceites que van desde 9T1/6 hasta 9T1/2 en el diagrama, (subgrupo A) y el segundo, desde el 5T1/1 hasta el 9T6/2 (subgrupo B).

El subgrupo A estâ formado por catorce aceites, doce de - los cuales proceden de T. capitatum, cuatro de la regidn levantina y el resto de la provincia de Madrid (salvo el de Yepes y el del - Puerto de Almansa) . Es dificil obtener una caracteristica comdn a un grupo tan numéro so pues, a pesar de estar formado s por el mismo tipo de componentes, su concentracién varia entre ellos. Sin embargo, en general parecen coincidir en no tener ningiîn componente a - concentracién elevada (salvo el 8TI/I3), con el -pinenp, (3 -pineno y mirceno como componentes mayoritarios, en gran parte de ellos. Sus concentraciones por lo general son inferiors s al 15

Una agrupacién homogénea la forman los cinco aceites de la parte inferior de la tabla, très 2. capitatum de Madrid, una de -Albacete y uno de Valencia. Se podria decir que todos ellos estânformado s por los mismos componentes, con anâlogas concentraciones en los cuatro primeros aceites. El aceite de T. capitatum de Corbe- ra, difiere en su alto contenido en cineol (36 ^). Este grupo estâ bastante relacionado a su vez con el formado por très aceites, in- mediatamente superior en la tabla, en el que con dos T. capitatum de Madrid aparece el T. lusitanicum. Estes poseen una concentracién de o(-pineno, f) -pineno y mirceno algo mayor que la del anterior -grupo. Los dos T. capitatum recogidos en El Altet, que poseen un -contenido relativamente alto en -pineno, s abineno y cariof ileno, se agrupan a su vez entre si, antes de unirse al subgrupo, al que mas tarde se une un T. capitatum de Madrid, con la particularidad de tener una concentracién de ï-muuroleno mas alta, un T. capitatum de Murcia y el T. homotricum de Corbera. Estos très dltimos poseen al -pineno y mirceno como componentes mayoritarios.

El subgrupo B es muy homogène o, botânicamente. Estâ formado por la mayorîa de los T. gnaphalodes y algo mas separado el T. capitatum de Hellln. Poseen una composicién quimica muy parecida, en especial en lo que se refiere a la concentracién en -pineno, mirtenal, t-pinocarveol, mirtenol, éxido de cariofileno, apareciendo ademâs dos componentes caracterlsticos de este grupo: el verbenol y el nâmero 81 (salvo en el T. capitatum),

Los restantes grupo s contienen menos miembros, El formado por cuatro T . capitatum recogidos en.Vaciamadrid, en diferentes - épocas, présenta los mayores parecidps entre sus componentes. Estos poseen un contenido en hidrocarburo s monoterpénicos no muy alto , concentracién elevada de germacreno D y, présentes en todos ellos el oC-muuroleno, <T-cadineno, nerolidol, t-cadinol y cadinol II a concentraciones muy similares. Se es cap an dos aceites de esta localidad del grupo, el ÔTl/3 y 8T1/1, que adn siendo de gran parecido con los anteriores tienen menor contenido en germacreno D y - nerolidol.

También es grupo muy homogène o el foimado por los dos ^ - gnaphalodes que no se incluyeron en el subgrupo B, que poseen de - singular la concentracién mas elevada de o(-pineno y nerolidol respect ivamente.

Los aceites de T. capitatum de Mo rat a y Arganda estân muy - relacionados en el diagrama. Sus componentes mayoritarios son los mismos que los de los de otros T. capitatum recogidos en otras localidades de Madrid que pertenecen al subgrupo A, aunque a mayor - concentracién, El germacreno D en estos dos aceites alcanza concentraciones algo mayores.

Otros dos T. capitatum de la regién de Levante, los recogidos en Villena y La Canada, presentan gran similitud. Estos se distinguer por la elevada concentracién de limoneno.

Los grupos restantes parecen ser heterogéneos, sin embargo, la pare j a T. aureum, T . subtriphyllum corresponde a un mismo grupo dentro de la subsect. Polium (ver divisién botânica en la introduc- cién). Estos poseen un alto contenido en -pineno, ^-pineno, mirceno y limoneno. Observâmes en el diagrama que el T . lus it ani cum y T. subtriphyllum estân muy separados. S in embargo, tal como se ha indicado en la introduccién, segén Valdés Bermejo y Sânchez Crespo, estas dos especies en realidad son la misma. Esta diferencia en sus composiciones obedece con seguridad al tiempo de almacenamiento del T. lusitanicum muy superior al de T . subtriphyllum. Si se comparen sus cromatogramas (apéndice II) se observa un gran parecido en las concentraciones relativas de los componentes en ambos aceites, con menor contenido en volâtiles en el T. lusitanicum.

Por otra parte, el trio T. eriocephalum, T. charidemi y T. homotricum, que poseen de oomân su pequena concentracién en compuestos volâtiles y su alto contenido en /-cadineno, estâ incluido en la subsect. Polium, pertenecientes las dos primeras especies ademâs, a un grupo botânico con los mismos caractères morfolégicos.

Entre los aceites mas diferentes al resto, estân los dos - T. pseudochamaepitys, que en efecto, pertenecen a una seccién botâ- nica diferente a la de todas las especies estudiadas. Estos, a su vez, no estân relacionados en el diagrama. Sin embargo, el rendimiento en aceite de esta planta es bajisimo, por lo que la concentracién de componentes volâtiles asignada a estos dos aceites no es fiable. Ambos difieren ademâs en la concentracién de timol. Este -

problema se ha presentado también en otros aceites, p. e j., en el T . chamaedrys, las dos muestras recogidas parecen pertenecer a - grupos muy diferentes, sin embargo, si se comparan sus cromatogramas, el aspecto general es muy similar. La composicién asignada - al aceite de T. carolipaui, asimismo no es fiable por disponer de muy poca cantidad de muestra.

Cabe especial mencién entre los aceites de T. capitatum - mas diferentes,los procedentes de plantas recogidas entre las lo- c alidade s de Tobarra y Hellin (9T1/9) y el de Cartagena (7T1/2). - En el primero de ellos destaca su alto contenido en hi dro c arburo s monoterpénicos, en especial el -pineno (33 9) y limoneno (18 ^) .En el T. capitatum de Cartagena los hidrocarburo s monoterpénicos forman practicamente la tôtalidad del aceite, siendo el p-cimeno (28 o) el componente fundamental.

Es légico suponer que la ausencia o presencia (y en este - caso, la concentracién) de un componente, influya sobre la concentracién de los demâs. En el caso mas sencillo, suponiendo que no - exista interdependencia entre componentes, dado que su concentracién viene dada en porcentaje del total, séria de esperar el encontrar coeficientes de correlacién, para parejas de componentes, con valores pequehos-y négatives.

Hemos calculado los coeficientes de correlacién para todas las pare j as de componentes, mediant e el programa CORREL de ARTHUR.De él se deduce que existen valores muy elevado s y los mas importantes tienen signo positive. Se han agrupado los compuestos que - presentan entre si coeficientes de correlacién elevados y positives, de los que se puede suponer que se originan en el aceite por un - factor o serie de factores comunes, obteniendo los cuatro grupos

siguientes:

Mirtenal Cadinenol Componente 8t-Pinocarveol Componente 78 p-CimenoMirtenol ^ -Cadineno S abinenoPinocarvona Cadinol I 4-TerpineolOx, Cariofileno Cadinol IIComponente 81 t-Cadinol

^ -BourbonenoLinalolTimol

Es de interés que el segundo grupo estâ formado por compuestos de e structuras qufmicas similares. También debemos destacar que el germacreno D, compuesto importante en estos aceites, présenta - elevadas correlaciones negativas con los miembros del primer grupo.

La existencia de aitas correlaciones entre componentes, nos indica que es posible simplificar mat emât i c ameiit e los datos de composicién de los aceites, sin pérdida de la informacién contenida en ellos. Al reducir la dimensionalidad de los datos, la interpretacién de los resultados serâ mas fàcil.

Para conseguir ésto, hemos utilizado el programa KARLOV de ARTHUR. Este programa utiliza el anâlisis de componentes principales, cuyo objeto es encontrar un pequeho ndmero de combinaciones - lineales que pue dan usarse para resumir los datos, perdiendo la - menor cantidad posible de informacién.

La reduccién en dimensiones que se obtiene puede usarse - para representaciones grâficas. AsI, si sélo usando dos componentes se explica con suficiente exactitud nuestros datos, un diagrama en que éstos se represent en, tomando como ejes de coordenadas - esos dos componentes, proporcionarâ una representacién fiel de su

distribucidn. En el caso mas general, tomando como ejes dos de los primeros component es principales, la representacidn serâ mas adecuada que tomando dos de los component es originales.

KARLOV genera para cada aceite un nuevo grupo de coordenadas, que son combinacidn lineal de las antiguas (los porcentajes - de componentes), A1 aplicar el KARLOV se observa que con doce component es se pue de explicar el 95^ de la varianza y, que con vein- ticinco se explica practicamente el 100^.

Para representar en un piano los aceites, hemos utilizado el programa VARVAR de ARTHUR. Los ejes de coordenadas pueden ser - cualquier variable en este programa, aunque para nuestro caso hemos utilizado prefereniemente los componentes principales generados por KARLOV. VARVAR es simplemente un modo de proyectar los datos - sobre un piano, es decir un modo de verlos. Las representaciones - que us an los diferentes componentes principales, son distintas •- "vistas" de los aceites.

En nuestro caso, hemos elegido los pares de componentes -1,3 y 2,3 (figuras 41 y 42). En la 41 se observa la amplia distribucidn de los T. capitatum. Puede distinguirse un nucleo central - alrededor del cual se agrupa la mayor!a, jjf un grupo mas separado - (muestras procédantes de Vaciamadrid). El grupo central parece coincidir con las muestras recogidas en la région central de la peninsula, mi entras que los procédantes de la periferia se encûentran - mas disperses (Albacete, regidn levantine). También se observa - claramente en ambas representaciones, un grupo formado por la mayor parte de los T. gnaphalodes. El T . aureum y T. subtriphyllum, salen juntos en los dos diagramas. Observâmes /en la figura 41, que el - T. lusitanicum aparece no muy distante de los anteriores. El hecho

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de no salir mas unido al T . subt riphyllum (misma especie botânica) puede deberse como hemos senalado anteriormente^a alteraciones su- fridas durante el almacenamiento. Estas especies (5T11/1, 9T12/1 y 9TI3/I) junto al T . capitatum (repartidos alrededor del T. lusitanicum) forman un grupo muy homogèneo botanicamente, pues ademâs de pertenecer a la misma subsect. botânica (Polium), poseen también - anâlogos caractères morfolégicos. Otra agrupacién muy homogènea - botanicamente, la forman el T. charidemi, T. lanigerum y T. eriocephalum que pertenecen asimismo a la subsect. Polium pero, ademâs con caractères morfolégicos anâlogos entre si, Estos, aunque no - estân muy préximos, en el diagrama de la figura 41 se observa que forman un grupo, entre los T. capitatum y los T. gnaphalodes.

El empleo de diagramas jerârquicos, como el de la figura 40, permite visualizar en conjunto las agrupaciones de los aceites, - pero no nos informa sobre su e structura interna. Por este mot ivo, nos ha parecido interesante combinar la informacién numèrica de - las distancias entre aceites con la grâfica obtenida en las representaciones de VARVAR.

El proceso seguido ha sido la unién de las parejas de aceites cuya distancia fuera inferior a un cierto valor. En la figura - 43, con llnea continua se indican las parejas de aceites cuya distancia es inferior a 11, y con Ifnea de puntos aquellas cuya distancia es inferior a 12. Los grupos que se observan son los mismos que aparecieron en el diagrama jerârquico a dichos niveles. Ahora, puede observarse que los cuatro T. capitatum(lly sobre todo, los seis T. gnaphalod.es (6) forman grupos muy compactos, mi entras que los demâs T. capitatum forman grupos mas abiertos. Obsérvese que en los diagramas los nâmeros asignados a los diferentes aceites corresponden a - los de su especie botânica.

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En la figura 41 se observa que la mayor parte de los aceites de T . gnaphalodes, asf como los dos T. capitatum de Albacete, - tienen poco contenido de componentes 1 y 3 de KARLOV, de lo que se deduce que son aceites que poseen a pequena concentracidn el germacreno D, cT-cadineno, -pineno, p-cimeno, sabineno y mirceno.

Los aceites de T. capitatum de Vaciamadrid se distinguen - por su alto contenido en component e 1 de KARLOV, es decir que poseen gran proporcidn de germacreno D y cf-cadineno, siendo los compuestos que menos influyen en su composicidn el c< -pineno y fi -pineno. Se obsei*va asimismo que los aceites de T. capitatum de la région levantina, se caracterizan por su gran contenido de component e 3 y pequena proporcidn de component e 1. De esto se deduce que el - germacreno D y cT-cadineno son poco influyentes en la omposicidn de estos aceites, mientras que el e/-pineno, p-cimeno, sabineno y mirceno son los componentes mas importantes.

Los aceites de T» aureum l2 ,0ubtriphyllum» 13 y lusitanicum 11 poseen en comdn su contenido medio en componente 3 y pequena proporcidn del 1.

No se pueden sacar deducciones tan concluyentes del resto de los aceites, pues la mayorfa de elles poseen un contenido medio de ambos componentes.

Las representaciones grâficas obtenidas mediante el uso - del VARVAR pueden considerarse como la proyeccidn en un piano de - una nube de puntos en un espacio de n dimensiones, siendo los puntos los aceites y las dimensiones los componentes. Si en esta pro- yeecidn se observa que aceites de determinados grupos botânicos o determinadas localidades tienden a agruparse, de forma que en cier-

tos casos se sépara mediante una recta del resto de los aceites - en el piano, es Idgico suponer que esta separacidn sera mâs facil en el espacio de n dimensiones, utilizando para la separacidn un hiperplano.PLANE, (otro programa de ARTHUR) calcula mediante ite- raciones un hiperplano que sépara dos categorxas en que se ha debido dividir previamente los datos, MULTI, mediante un proceso similar, calcula une s hiperplanos que en este caso separan cada cate- gorla de todas las demâs„

PLANE admite solo dos categorxas, y no tiene sentido apli- carlo a los casos en que solo se dispone de una muestra por especie. Por eso hemos agrupado los datos en très categorias: 1) T. capitatum 3) T. gnaphalodes, 2) Resto de las especies, y calculado los hiperplanos de separacidn para las posibles parejas de cat^orxas.

La separacidn entre T. capitatum y T. gnaphalodes es correcta en el 100 ^ de los casos (pag,131). A partir del vector de peso se pueden conocer cuales son los componentes que mas influyen en - esta particular separacidn, y que result an ser por orden de importancia:

Propj.os de T. capitatum Propios de T. gnaphalodes Germacreno D. Componente 81Limoneno VefbenolMirceno Cariofileno-Pineno Pinocarvona

En la pâgina 132 figuran los result ado s del PLANE que sépara T . capitatum del resto de las especies, exclûyendo los T. gnaphalodes. La separacidn es también correcta al 100 En este caso, - los componentes propios de cada categorfa son los siguientes:

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T. capitatum RestoGermacreno D Cariofilenot-pinocarveol ^-Pinenop-cimeno oc-HumulenoLimoneno Cadinenol

Por dltimo, entre los T. gnaphalodes y el resto de especies, excluido el T. capitatum, se ha obtenido también separacién correcta en el 100 9» de los casos (pag. 133). Los aceites mas similares - a los procedentes de T. gnaphalodes son los que se obtienen de T. - lusitanicum, aureum y subt riphyllum. El T , gnaphalo d e s menos tipico es el de Albacete (8T6/4), que también resultaba serlo al comparar con los T, capitatum. En cuanto a los componentes propios de cada - categoria, son los siguientes:

T . gnaphalo de s RestoComponents 81 -CadinenoMirtenol <-Cadinol IIPinocarvona Timol

t-cadinol

Dados los result ado s obtenidos en la clasificacién (100 9* - correcta en los très casos) ,, intentâmes separar al tiempo las très categorias usando MCJLTI, Los resultados figuran en la pâgina 135 . La clasificacién es correcta en el 100 fo de los casos. Asimismo podemos utilizar los vectores de peso para saber cuales son los componentes mas representatives y menos, de cada categorfa. Para el - T. capitatum obtenemos:Mas representatives: Mirceno, Sabineno, p-Cimeno, Limoneno, Germacreno D,Menos representatives: Cariofileno, Timol, p-Bourboneno.

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7 •71 •3 1 1 1 .9576 Cl 2 2.9286 01 3 4.(556 01K • 71 •4 1 1 1 (.8926 01 2 1.4036 01 3 5.C4CO Cl5 « • 71 •5 1 1 1 4.6236 01 2 2.7616 01 3 2.(166 0110 in 571 *5 1 1 1 (.C36£ 01 2 3.2536 Cl 3 2.3»66 Oi11 11■7 1 •7 1 1 1 5.1996 01 2 4.6205 01 3 3.6316 011 7 i; • 71 T 1 5.5046 01 2 2.0966 01 3 2.8(56 Cl1? 1» •7 1 I 1 4.356: Cl 2 3.7626 01 3 4.3476 01|4 14 • 71 •10 1 1 1 (.8086 01 2 3.4106 01 3 1.60|c oi1 « 15 • 7 I •11 1 1 1 4.1536 Cl 2 3.7096 Cl 3 3.1626 OiIf |4 • 7 1 •12 I 1 1 4.6476 01 2 2.9786 01 3 3.3*56 0117 17 •7 1 *13 1 1 1 2.1896 Cl 2 2-0836 01 3 1.7376 Li7" 1* • 71 •14 1 1 1 (.1246 01 2 3.6716 01 3 3,6*46 3174 1*> 371 • 1 1 1 (.5856 01 2 1.7)46 Cl 3 4.671* Cl7C 70 071 I 1 5.724!, 01 2 3.8276 01 ? 7.(327 Oi21 71 •71 I 1 5.C91L 01 ; 3.182C 01 • 3.••7* 0177 77 07 1 1 1 4.7-86 01 ? 3.5996 01 3 5.473' Ol73 73 •7 1 • 5 1 1 1 2.?4f6 01 2 5.1746 01 3 l.?” 6 Ol74 74 071 •5 1 1 t 4.8(86 01 2 3.7666 Cl 3 3.9(26 Cl75 75 971 •7 I 1 1 4.756C Cl 2 4.7206 01 3 4.3366 01

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Y para el T. gnaphalodes;Mas representatives: (3-Pinene, Verbenel, Componente 81.Menos representatives: Limoneno, Mirceno, p-Oimeno.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en VARVAR, - PLANE y MULTI, en cuanto a la composicién de los aceites se podrfa sacar como conclusion que les componentes que mas caracterizan a - los T. capitatum son: mirceno, sabineno, p-cimeno, limoneno, germacreno D y J-cadineno. Estos mismos compuestos son los de mener importancia en los T . gnaphalo de s, mi entras que los que mejor represent an a éstos son: el componente 81, verbenol, cariofileno, pfnocarvona, mirtenol y (3-pineno. Del resto de las especies son caracterxsticos, aparté del (^-cadineno (T. e ri o c ephalum, carolipaui, oharidemi, homo tri cum) que lo es asimismo del T. capitatum, y del cariofileno -x (T. e ri oc ephalum, lanigerum) del T. gnaphalodes, el -pineno ( la - mayorfa de ellos), o(-humuleno (T. chamaedrys), o(-cadinollî (T. eriocephalum, lanigerum) , timol (T. pseudochamaepitys) , t-cadinol (T. - eriocephalum, carolipaui)•

El ndmero de muestras estudiadas procédantes del T. capitatum es superior al del resto. Esto se debe, como se indicé anterior-mente, a la amplia distribucién geogrâfica de esta especie y al -interés que présenta desde el punto de vista botânico. Utilizando las veintisiete muestras de que disponemos, hemos realizado una - serie de câlculos similares a los llevados a cabo con las cincuenta muestras, empleando los mismos programas.

No es necesario calcular de nuevo la matriz de distancias, pues puede obtenerse de la producida por DIST con las cincuenta - muestras. Al igual que en aquel caso se ha obtenido un diagrama -jerârquico, que se représenta en la figura 44.

9Ï1/97T1/1ST 1/49T1/1 ST 1/2ST 1/3 ST 1/12 ST 1/5 9T1/2 9T1/3 9T1/4 ST1/13 9T1/5 ST 1/89T1/8 9T1/6 ST 1/9 9T1/7STl/115T1/17T1/3STl/14STl/1ST 1/7STl/lO ST 1/67T1/2

IB IS— r~ 50

A la distancia de 11 unidades se distinguen cuatro grupos:Uno de ellos lo forman los cuatro aceites que van desde el 7T1/1 - al 8TI/2 , todos ellos de Vaciamadrid. El grupo mas numéro so esté - formado por los aceites comprendidos entre el 8T1/5 y el 9T1/5 -(gru.po A). En éste, se relacionan primero très aceites de Madrid, y luego se unen a este grupo otros tres de Madrid, Valencia y Albacete. Exist en también a ese nivel dos parejas. La primera la forman el 711/3 y el 8TI/I4 , precedent es de localidades préximas de Madrid, y la segunda los dos aceites recogidos en El Alt et (Valencia).

A distancias superiorss aparecen dos nuevos grupos. Uno de ellos, formado por T. capitatum de Albacete, Madrid y Toledo (estos dos dltimos con mayor similaridad) que se une al grupo A, al igual que el grupo del Altet y otros aceites aislados. El otro lo forman aceites de Valencia y Alicante.

A distancias mayorss se van agregando el resto de los aceites y ampliandose los grupos, resultando los aceites de Cartagena y Tobarra-Hellln, los mas diferentes.

Al igual que con todos los aceites, hemos procedido a aplicar el programa KARLOV para poder hacer una representacién grâfica mediant e VARVAR. Al ser la muestra mas homogène a, se necesitan menos componentes. Asf, para explicar el 96 ^ de la varianza bast an nueve componentes, y con veintidos se consigne practicamente el 100/ .

Eligiendo como ejes de coordenadas los componentes 1,2 y -1,3 se han representado los T. capitatum usando VARVAR. Los resultados aparecen en las figuras 45 y 46.

Los diferentes aceites,en la figura 45 quedan agrupados -

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de la siguiente mariera: a la derecha de la tabla aparecen los T, - capitatum de Vaciamadrid. Otro grupo estâ formado por cuatro de la regién levantina (Valencia, Murcia y dos de Alicante). Un grupo mas numéro so se forma con una muestra de Toledo, cuatro de Madrid de - localidades préximas y una de Albacete y Valencia. Alrededor de este grupo se sitdan, muy cerca, tres muestras de Madrid y algo mas - aiejadas otra de Albacete y la de Cuenca.

Parecen por lo tanto observarse tres grupos, formados respect ivamente por los T. capitatum de Vaciamadrid, interior de la - peninsula y regién levantina. Para comprobar esta hipétesis, hemos representado en primer lugar nuestros puntos utilizando un nuevo - sistema de ejes de coordenadas calculado por NIM (otro programa de ARTHUR) . Este programa pretende representar los datos sobre un piano, de forma que la diferencia entre sus distancias en el piano y sus distancias reales (calculadas en DIST) sean lo menor posible.

En este diagrama (fig. 47) se observa un grupo compacto - formado por cuatro T. capitatum de Vaciamadrid. Los otros de aceites de Vaciamadrid, que se encûentran lige rament e separado s de los anteriores, corresponden uno a una muestra recogida en mayo (el resto se recogié en Junio o Julio) , y el otro procédé de una planta extra- ida en verde.

El resto de aceites se agrupa de forma mas abierta, y aunque se pueda hablar de que los aceites recogidos en la provincia de - Madrid u otras provincias interiores se encûentran agrupados entre si, y los de la regién levantina forman un grupo alrededor suyo, - existen uniones entre miembros de una y otra categorfa.

Otro tipo de relacién que parece observarse es la similitud

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existente entre aceites procedentes de localidades prdximas, proba- blemente debido al parecido en la composicidn de los suelos.

En la figura 46 bemos procurado representar las anteriores categorias, de forma que ocupen regiones del piano diferentes. La separaci6n se logra facilmente, debido sobre todo a las diferencias del componente ndmero 1 de KARLOV. A la derecha de la tabla con valores altos de dicho componente, aparecen los seis T. capitatum de Vaciamadrid , son los que poseen mayor proporcidn de nerolidol y sobre todo de germacreno D. A la izquierda de la tabla, coincidien- do todos ellos en valores bajos para el componente 1, estën todos - los aceites de T. capitatum recogidos en la regidn levantina - (Valencia, Alicante y Murcia), aunque como se puede observar entre ellos se diferencian por el valor del componente 3> variando su contenido en oC-pineno y (3-pineno de ser mâximo en el T. capitatum de - Cartagena a mlnimo en las muestras de La Canada y Villena. Todos - ellos poseen concentraci6n escasa o nul a de germacreno D y nerolidol.

Los sehalados por 1, son los aceites de T. capitatum de la regidn interior de la peninsula (Madrid, Toledo, Cuenca y Albacete). Estos se encûentran situados entre el grupo de Vaciamadrid y el de la region levantina, con un contenido pequeho o medio de germacreno D y nerolidol, y muy variado, de -pineno y -pineno.

Dado que el compuesto mas importante en el componente ntSme- ro 1 es el germacreno D, hemos representado en la figura 48 la oon- centracidn de este componente frente a otro escogido, el t-pinocarveol. La separacidn en este caso no es perfecta, pero se pueden ver agrupaciones bien definidas.

Para conseguir esta separacidn, hemos utilizado, al igual -

:;ocococ’oc‘0 0ocoooooc. c c o c- o o o o O O O O O C O O O O O C r - . o C C O O O O O O O O O C ' O O C C O O C

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que en el caso de todos los aceites, los programas PLANE y MULTI.

Las ecuaciones de los hiperplanos que separan cada par de categorias, al aplicar PLANE, se muestran en la pâgina; siguiente.. La clasificaciân asi obtenida es correcta en el 100 ^ de los casos. Se puede observar que se han eliminado dos componentes, el 81 y el cadinenol, por no estar présentes en la mayorla de los aceites de T. capitatum. Los componentes que mas influyen en esta particular separaciân, por orden de importancia son los siguientes:

Propios de T. capitatum del interior T. de VaciamadridP -Pineno Germacreno DLinalol Nerolidolt-P ino c arve o 1

T. capitatum del interior fï-Pineno Cadinol I Germacreno D

T . capitatum Vaciamadrid Germacreno D

T . capitatum levantines Limoneno 4-terpineol Componente 8 p-Cimeno

T. capitatum levantines

t» ft

Las mayores similitudes entre muestras de categorias diferentes son las siguientes:T . capitatum de Vaciamadrid mas parecido al del interior: 8T1/3

al de Vaciamadrid: 871/12 al interior: 871/13, 9T1/6 al de Levante: 9T1/12 al de Levante : ninguno al de Vaciamadrid: ninguno

" interior ** Levante ” interior ** Vaciamadrid " ” Levante

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146r i ' S S F sNUMPFR R 15PT P F R C E N T

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P I AA'F F f P A P A T F O r i i S S 1 F R O M C U S S 2 I N 4 C Y C L E S . T w ; H t l G M T I M S V F C Y 1 R f S-R .OA 'O P-0 1 -1 . PA A " no 4 .R02RF-01 Î .O OO 0S-O I 1 .4 1 A IF - 0 1 - 5 . 4 1 2 7 C - 0 1 - S . 1 7 Î 4 E - 0 1 3 . ? l«SF-Or C" .»>1 o p r - ' / .- 1 . 1 = 7 7 7 - 0 / - A , 4 > 4 3 ' ' - r » - 1 . 1 4 4 A Ç - 0 1 - P . I A * ! j - 0 1 ’ . A S 4 ^ c - 0 1 l . A ? 3 0 ' ’ - 0 l a . P ' O O P - C » 7 . »< 4 l : - r * - j . s o - r « i

I . 2 4 0 2 P - C 1 4 . Ç 7 I A C - 0 1 - < 3 . f ' C 3 * E - 0 2 2 . 3 5 P J r - 0 1 2 . 3 7 S 6 F - 0 1 ) . » A 6 9 C - 0 1 4 . P A 3 3 P - 0 2 3 . > 4 4 2 « - 0 1 3 . l ? R 4 f - q l

T R A I N T N r F F T R F S U I T S U S I N G T ^ f P f S T H E I G P T V E C T O RP A T T F P N M A » F C L A S S 0 1 SCR I RINA NTM I P P F R

1 5 T 1 * 1 1 . - 4 . E 6 A 9 E 0 17 T 1 * 1 I . - 1 . 9 Ü 7 E 0 1R T l * S 1 . - O . e t C R E 0 0

1 ? A T I 1 . - i . s e s c E 0 11 S A T V • 11 I . - 3 . 0 S 2 0 E 0 11 < R T l • 1 2 1 . - 5 . 9 5 6 4 E 0 0I P A T I • 1 4 1 . - I . 2 2 ( I E 0 12 0 P T I • 2 I . - 1 . 7 1 5 6 E 0 1

7 1 P T I • 1 1 . - 1 . 0 6 A 5 E 0 12 2 R T l 1 . - I . A 2 S 5 E 0 17 Î P T I •R 1 . - I . A 5 I 7 E 0 129 9T1 • 7 1 . - 3 . 1 A 2 2 E 0 12 7 P T I I . - 6 . 1 7 5 7 E 0 1

P A T T C R NW J M 3 E R

C L A S S O I S C P I R l ' l / N T

2 7 T 1 • ! 2. I . 8 R 6 R F 0 15 8 T l 4 1 2. 8 . I 0 9 E E 0 06 8 T 1 • ? 2 . 1 . 7 0 7 1 E 0 17 8 T 1 • T 2. 2 . P 7 3 I Ç 0 08 8 7 1 »4 2 . 1 . 3 P 3 3 F 0 1

1 9 P T I • ' 2. 1 . 4 3 8 4 E or

H H I F F I S 1 0 0 . 0 0 P E R C E N T C O R R E C T

A N P NOW F C P T H E T F S T S E T . . .

C L A S S I F I F P A S C L A S S 1 P A T T E R N NANÇ T N P U T E D D 1 S C R I » I N A N TN U N P F P C L A S S

C L A S S I F I E D AS C L A S S 2 P A T T E R N N A M E I N P U T E U 0 1 S C P I N I N A N TN U N 9 E R C L A S S

J 9 T T 4 PJ 4 . T . ? : 3 ? r 9 0

• A . I P F N U H A Ç A N U M P E P P E R C E N TP A S S 3 F N f N O R R I G H T R I G H T

P A S S E S1 2 I P 9 0 . 4 7 6 22 2 2 0 9 5 . 2 3 8 1

2 2 1 1 0 0 . C 0 C 3

P| a n f s f p a r a t f p c l a s s 1 F R O M r i A S S 3 1 1 1 0 C Y C L E S . T H E W E I G H T I N G V F C T O R I S2 . P 2 A . 1 F - 0 I - 1 . 4 3 1 I E C O 9 . 2 2 7 4 = - 0 1 B . 3 7 4 2 i - C l - 3 . 0 3 P 3 F - 0 L 1 . 1 0 2 2 6 0 0 9 . 1 2 9 3 F - 0 1 3 . 5 1 8 3 6 - 0 1 1 . 3 9 9 8 =

- 3 . 3 A 7 « . F - r | 7 . 1 3 7 4 F - 0 I - P . I 4 1 1 F - 0 2 - 4 . P 1 6 3 E - 0 1 1 . P 0 2 2 F - 0 1 - 4 . 3 7 4 3 6 - 0 1 2 . 5 3 9 J f - 0 1 - S . l O B l c - O ' - 2 . « * 9 9 f2 . 4 - » 3 0 F - P 1 3 . C 2 S 4 E - 0 1 - 4 . 9 9 2 0 F - 0 1 1 . 1 7 6 * 4 - 0 2 4 . 4 8 1 4 6 - 0 2 1 . 6 5 7 3 6 - 0 1 - 9 . 3 « P * = - 0 l 2 . ( 5 1 5 E - G 1 3 . Î 9 P 0 L

T p a I K I N G S ' T P E S I I L T S U S I N G T H E P . f S T H E I G H T V E C T O Rp a t t e r n N A M E C L A S S D I S C R I M I N A N T P A T T E R N N A M E C L A S S D I S C R I M I N A I Tn u m b e r N U M B E R

1 S T L • ! 1 . - I . 8 2 4 2 E 0 1 3 7 T 1 4 2 3 . 1 . 9 9 2 9 1 0 17 T 1 * 3 I . - 2 . 2 3 3 4 E C l 1 0 A T I 4 9 3 . 9 . 8 1 6 0 : 0 0A T I » A 1 . - 2 . I 4 C 4 E 0 0 1 1 B T l 4 7 3 . 4 . 3 1 0 6 1 0 0

1 3 A T I P R 1 . - 1 . 4 C T S E 0 1 1 2 S T I A 3 . I . 3 3 9 6 E 0 1I S A T I A l l 1 . - 1 . 0 A Î I E 0 1 1 4 8 T l 4 1 0 3 . 2 . 3 4 B4E 71I B 8 T 1 4 1 2 1 . - 2 . 6 S 1 1 E 0 0 1 7 8 T 1 4 1 3 3 . 5 . 0 1 9 0 E - 0 I1 8 A T I * 1 4 1 . - 1 . 7 P C 5 E 0 1 2 4 P T I 4 9 3 . • B . 8 7 0 1 E - 0 12 0 P T I * 2 1 . - 3 . 7 2 E 4 E - 0 1 2 6 9 T l 4 8 3 . 1 . 8 0 7 3 = 0 17 1 P T I 4 3 1 . - 3 . 1 6 6 S E 0 02 / P T I * 4 I . - 4 . 4 5 7 S E 0 02 3 P T I * A 1 . - 4 . 1 3 6 5 E 0 02 R 9 T L 4 7 1 . - 9 . 6 2 8 8 6 OC2 7 P T I 49 1 # - 2 . 5 8 * 2 6 0 1

W H i r F I S 1 0 0 . 0 0 P E R C E N T c o r r e c t

A N O NOW EC R T H E T E S T S E T

C L A S S I F I E D A S C L A S S 1 C L A S S I F I E D A S C L A S S 3p a t t e r n N A M E I N P U T E D D I S C R I M N A N T P A T T E R N N A M E I N P U T C D D I S C R I M I N A N Tt l l l H B F P C L A S S N U M B E R C L A S S

3 C 7 T 4 4 1 4 . - 2 . S 5 C 5 E 0 0

• A . I C F N U M B E R N U M B E R P E R C E N TP A S S O F m i n o r R I G H T R I G H T

P A S S E S1 1 1 4 l O O . O C O O

PLAAAF S f P A R A T E O C L A S S 2 f r o m c l a s s 3 i n 3 C Y C L E S . T H E H c I C H T l N C V E C T O R I S3 . 4 I 2 A F - C I 1 . 0 1 I 4 E - 0 I 5 . 0 0 C C F - 0 1 5 . O C C 0 E - C 1 5 . 4 Î 3 1 F - 0 3 3 . 3 5 1 5 E - 0 I 9 . 0 0 0 0 E - 0 1 4 . 0 8 4 2 6 - 0 1 4 . 1 4 5 2 !3 . 9 3 4 7 F - P 1 4 . B 3 3 T E - 0 1 4 . P 3 R P E - 0 1 4 . 6 9 4 7 3 - 0 1 4 . 2 B 7 3 F - 0 1 3 . 7 7 8 9 S - 0 1 9 . 0 0 0 0 4 - 0 1 - 1 . 5 8 2 0 6 OC 1 . A 4 2 C I 's . p n r o A - 0 1 3 . 4 7 3 B F - 0 1 2 . 0 0 1 3 E - 0 1 3 . 0 4 6 2 6 - 0 1 4 . E 7 7 9 F - 0 1 4 . 8 7 7 9 E - 0 I 5 . 0 0 C D F - P 1 3 . 4 7 3 6 E - 0 1 4 . 3 8 9 4 T

T R A I N I N G SE T P F 5 I I I T S U S I N G T M B E S T H E I G H T V E C T O RP A T T FRA! n a m e C L A S S D I S C R I P I N A N T P A T T E R N N A M E C L A S S D I S C R I M I N A N TN i i m RFR M J M A E R

2 7 T l 4 1 J . - 4 . 2 1 C 3 E 0 1 3 7 T 1 4 ? 3 . 2 . 5 3 7 3 * - 018 T 1 4 L 2 . 1 . 6 8 5 S E 0 1 1 0 8 7 1 4 6 3 . 2 . 0 8 8 = = 01

t A T I 4 2 2 . - 3 . 6 1 ' P E 0 1 1 1 8 T l 4 7 S . 2 . P 0 2 7 I 0 17 A T I 3 2 . - 2 . 4 S 3 P E 0 1 1 2 S T I 4 8 3 . 2 . 4 4 7 A E 0 1P A T I * 4 2 . - 4 . 9 0 5 2 E 0 1 1 4 8 T 1 4 1 0 3 . 2 . 1 6 5 6 E 0 1

I S P T I # 1 2 . - 3 . B 8 Î 9 C 0 1 1 7 B T l 4 1 3 3 . 1 . 6 4 1 3 E 0 12 4 P T I 4 6 3 . 2 . B 3 4 P r 312 6 P T I 4 8 3 . 2 . 7 7 P P F 0 1

W N T C F I S 1 0 0 . 0 0 P E R C E N T C O R R E C T

I.’ÎORF-OI

4.6R47f-0’ S . T O O w l - O *

Los resultados obtenidos al aplicar MULTI se mue s t ran, en la pâgina I48. La separaciân entre cada categorfa y las otras dos, asimismo résulta correcta en el 100 de los casos. De las ecuaciones de los hiperplanos se deducen los componentes mas representatives de cada categorfa.

Asf en el T . capitatum de Vaciamadrid el coeficiente mayor corresponde al germacreno D. Tambiân son representatives aunque con valores mas pequehos, el nerolidol y componente 78. En los T. capitatum de la regiân levantina los valores mayores corresponden al limoneno, p-cimeno, sabineno, -pineno. Los componentes que menos caracterizan estos aceites son el germacreno D y el t-pinocarveol. De - las restantes especies del interior pare c en ser mas representatives el ^-pineno, t-pinocarveol, carvacrol, linalol, mirtenal, mirtenol, mi entras el limoneno es el que menos les caracteriza.

Como se ha indicado en el apart ado II.1, existe una subsp. botânica del T . capitatum denominada gracillimum, que se extiende por Valencia, Alicante y Murcia. En nuestro caso por falta de testimonio de la planta, no podemos asegurar en la mayorfa de los casos, cuales de los T. capitatum que proceden de esta regiân pertenecen - a la subsp. gracillimum. Hemos preferido por tanto, hacer un e studio global agrupando en una categorfa todos los de dicha regiân, - puesto que por otra parte se ha obtenido como divisiân natural en VARVAR y en NLM, que se ha visto confirmada en PLANE y MULTI. Serf a de gran utilidad comprobar la verdadera identidad de cada una de - las plantas estudiadas, por si justificaran las diferencias o similitudes existentes entre ellas.

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C O N C L U S I O N E S

1. Se ha estudidado la composicidn de los aceites esenciales procédantes de cincuenta mue stras de plantas del género Teu- crium, correspondientes a once especies diferentes, algunas de ellas endémicas de nuestro pals (Tabla I) . Para ciertas especies, se h an recogido muestras en diferentes épocas y lugares, con objeto de estudiar la variacidn en la çomposicidn del aceite.

2. Para el aislamiento del aceite, se ha elegido el mêtodo de arrastre en corriente de vapor con reciclacidn de agua, buscan- do reducir al mâximo las posibles alteraciones de los component es,

3. Corne técnicas de fraccionamiento del aceite, previo a - su posterior estudio, se han empleado fundament aiment e la cromatograffa en columna llquido-sdlido y la cromatograffa de gases préparât iva. En el primer caso se han utilizado tanto columnas largas - como columnas cortas con sobrepresidn, con gel de silice como adsor- bente y mezclas de n-hexano y eter como eluyentes mâs comunes, con el objeto de obtener fracciones enriquecidas en components s de intends. En cromatograffa de gases preparativa se han utilizado columnas de relleno, con gradiente de concentracidn de fase. Esta dltima tdcnica ha resultado muy dtil para el aislamiento de compuestos - puros.

4. La técnica utilizada tanto para el control de fracciones

como para la caracterizacidn de los component es y su anâlisis cuantitativo, ha sido la cromatografia de gases. Con estos fines se han utilizado columnas capilares de vidrio de pared recubierta (WCOT) - de alta eficacia.

5. Para la identificacidn de los componentes de los aceites se ha empleado f undamentalment e el acoplamiento cromat ograf la de - gases-espectrometrla de masas (GC-MS).

6. Ademâs de las columnas capilares WCOT antes citadas se han ensayado diverses tratamientos o recubrimientos de pared con - el fin de obtener columnas de elevada eficacia y capacidad de carga (Tabla II). En los casos mas satisfactorios, estas columnas se han utilizado en GC-MS para permitir el anâlisis de component es trazas in necesidad de pasos previo s de enriquecimiento que pudieran al- terarlos.

7. En los component es présentes en concentracidn media o - alta, se han aplicado la espectroscopla infrarroja y la RMN para - su identificaciân o determinacidn de caracterlsticas e structurale s.

8. Se han caracterizado por su retencidn cromatogrâfica y dates de masas, noventa y seis compuestos diferentes, cuya relacidn se encuentra en el apartado III. 1. De elles se han identificado con seguridad sesenta y ocho, mono y sesquiterpenes la mayor peirte de - ellos, predominantemente hidrocarburos y alcoholes, aunque aparecen también otros tipos de funciones oxigenadas en mener proporcidn.

9. Se han aportado dates estructurales de veintiseis component es que no se han podido identificar t et aiment e. Un hidro carbure, una cetona, un eter y seis alcoholes monoterpénicos; dos hidrocar^

buros, un eter y seis alcoholes sesquiterpénicos. Se han caracterizado asimismo, un compuesto monoterpénico y cuatro sesquiterpénicos oxigenados, probablement e alcoholes o éteres; y un aldehido y dos - alcoholes no terpénicos. Para algunos de estos compuestos se han - propuesto posibles estructuras de acuerdo con los datos espectros- cépicos disponibles.

10. La determinacién cuantitativa de los componentes se ha realizado por GO, fundament aiment e por el método del patrdn intemo, con los result ado s que se mue s t ran en la Tabla III (Apéhdice I).

11. Se ha realizado un estudio comparativo de los 'diferentes aceites (apartado III, 3)» mediante el uso de técnicas de anâlisis multi variant e, con el fin de obtener indicaciones sobre la - existencia y caracterlsticas de los factores que influyen en la composicién del aceite. Las conclusiones obtenidas en este estudio se resumen en los puntos siguientes.

12. La alteracién de la composicién durante el almacenamien- to de las plantas y manipulacién del aceite, es importante cuando - la cantidad de aceite que se dispone es pequeha. Se produce por lo general un evaporacién selectiva de los componentes mas volâtiles,y dado que éstos estân présentes en un elevado tanto por ciento en los demâs aceites, las diferencias cuant i t at ivas son considerables. Sin embargo, las proporciones relativas de compuestos con parecida volatilidad se mantienen constantes, como pue de observarse al comparar los cromatogramas.

13. No pare ce importante, por lo general, la diferencia - entre aceites procédantes de plantas de la misma especie, recogidas en la misma localidad, en anos sucesivos. En cuant o a la época de

recpgida,parece influir cuando se recoge la planta en diferente estado de madurez.

14. Las diferencias entre plantas de la misma especie, de diferentes localidades podrfan adscribirse a dos efectos: suelo y clima. Plantas procédantes de localidades cercanas dan lugar a - aceites parecidos, lo que parece ser debido a tener el mismo clima y no muy diferente suelo. En cuant o al clima es dificil de sacar - conclusiones, pues, si bien se ha podido comprobar una diferencia general entre las plantas de la regidn levantina y del interior, - existe otro factor de tipo botânico (apartado III, 3), que pudiera influir en la composicién de los aceites.

15. Quimiotipos. En el caso del T. capitatum, las mue stras de Vaciamadrid presentan con el resto una diferencia tan pronuncia- da que no pue de adscribirse a climas. El suelo de esta localidad - particularmente rico en yesos puede ser la causa de estas diferencias; pero la constancia en composicién dentro de la localidad y la separacién del resto de los aceites, indican que estas plantas pueden constituir un quimiotipo diferente.

16. Diferencias entre especies. Se observan claras diferencias estre especies, pero aquellas de las que hemos dispuesto de - muestras suficientes también presentan una gran variabilidad, debido a las causas anteriores. En algunos casos se observan correlaciones entre clasificacién botânica y composicién quimica, aunque para confirmer este hecho se requerirla disponer de mas muestras de cada especie.

17. Por dltimo, mi entras unos componentes presentan una dis- tribucién al parecer aleatoria dentro de los aceites estudiados,otros

parecen estar fuertemente relacionados con aJLguno de los cinco - factores anteriores. El caso mas claro es el germacreno D, que - estâ asociado con las muestras recogidas en Vaciamadrid, ya sea debido a tratarse de un quimiotipo o a la especial constitucidn de su suelo. Este y otros componentes especificos son importantes como marcadores de diferencias botdnicas o debidas a otros factores. Asf, en el caso general nos han servido para distinguir la adscripcidn de los aceites a la especie capitatum, gnaphalodes o al resto, y en el del capitatum para distinguir entre très tipos diferentes de localidades.

B I B L I O G R A P I A

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srb/1 GMAPHALODES ( Yepes )

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2 0 3 2 4 3 53 50 7 3 2 3 9 8

8T6/2 GMAPHALODES ( Puerto de Gabrejas )

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i ü 20 5 0 40 5 0 SB 7 0 SB 9 0

8T6/3 GMAPHALODES ( Barranco del Infiemo )

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STb-'4 GMAPHALODES. ( Bonete - Almansa )

J . I i . i t Î I j 1 S i n U i { I I M IT I i i » I i { I ! I i ! I I I i i ! I : i i < I I ! i i I i , I H } I10 20 30 42 50 E0 70 5B 30

*riTS/5 GMAPHALODES ( Q )erue l )

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t i nr* 32 40 52 50 72 50 90

ST6/5 GMAPHALODES ( Cuenca )

10/

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9T6/1 GMAPHALODES! C Campo Real - Carabana )

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9T6/2 GMAPHALODES ( Arganda )

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10 5 3 33 4 0 5 0 53 7 0 5 3 9 3

976/3 GMAPHALODES ( Barranco del Infiernb )

188

9 2

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22 43 52 58 98

PSEUDOGHAMAEPITYS ( Morata - Valdelaguna )

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4 0 5 3 5 3 7 2 S3 53

917/1 PSEUDOCHAIÆAEPITYS ( Arganda - Morata )

13 22 3 3 4 8

I 1 i - i i . 1 1 i i I ! i I i t I I

50«Z

SB I92

STS/-Î PÜMILÜM ( Fuentiduena del Ta jo )

189

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30 50 70 ‘i3 3 9 0

ST9/1 HOMOTRICUM ( Gorbers )

I i I I I I I * I : I t I I

40 20 3 0 4 0 50 50 7 0

1 .BQ 92

9TS/1 HOMOTRICUM ( Sierra de Grevillente )

Lu '! !!i ! ; T T T ; ! i j • i ; I i ! H | i , i î J t , i•1 n» 32

I i

4 0 70

HZil J i . * > I i t t i

5 0 5 2

ST10/1 CHAMAEDRYS. ( Morata de Tajuna )

u ! : i : I j ! I î i I i ( n J i l M i I i 1 î I 1 } I ! i M i ! f i I i"! n ! i i î ' i î î !T| ! î f I i H I i I t I i I12 20 ■ 32 42 50 SB. 70

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I iI50 90

9T10/1 CHAMAEDRYS ( Morata de Tajuna )

“ S'28 I38

Il i t i f t I i i

40 S3 53 73 BQ11 53

5T11/1 LUSITAMICUM ( Antequera )

48 20 33 40I

I 1 : I M i l M i l

50 50 70 B0 SB

3712/1 flUREUri ( Sierra de Cdzulas )

40 20 30 40

I i I

50 f53 70 50 58

9T13/1 SUBTRIPHYLUM ( Zafarralla )

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