Compuestos con potencial actividad farmacológica obtenidos ... · Una de las principales...

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Recibido: Julio 31 de 2015Aceptado: Agosto 28 de 2015

1. Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia. Químico, Magíster en Ciencias-Química. Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia. [email protected]. Universidad Pedagógica Nacional, Bogotá, Colombia. Biólogo, Estudiante de Ingeniería Eléctrica. Bogotá, Colombia. [email protected]. Química.UniversidadSantiagodeCali.SubgerenteLaboratoriosAmaquimS.A.S.SantiagodeCali,[email protected]

Compuestos con potencial actividad farmacológicaobtenidos a partir de conotoxinas de animales marinos(moluscos gasterópodos Conus magus)

Compounds with potential pharmacological activity derived from conotoxins of marine animals (gastropod mollusks Conus magus)

Nelson Giovanny Rincón Silva1, Juan David Rincón Silva2, Cindy Vanessa Castellanos Bernal3

RESUMENEldoloresunaexperienciasensorialyemocionaldesagradable,quepuedenexperimentartodosaquellosseresvivosquedisponendeunsistemanerviosocentral-SNC,esunaexperienciaasociadaaunalesióntisularoexpre-sadacomosiestaexistiera.Enestarevisión,sepresentannuevasfuentesnaturalesparalaobtencióndediversosfármacosparatratareldolorcrónicodediversaspatologíasaisladosdesdeanimalesmarinos(caracolesdelgéneroConus),setratadeconotoxinasaisladasdevenenosdeestosanimales.Suefectoterapéuticoconsisteenunblo-queoselectivodeloscanalesdecalcio(Ca)tipoN,pormediodelcualreducelaliberacióndeneurotransmisorespronociceptivosenelastaposteriordelamédulaespinal,inhibiendo,deestamanera,latransmisióndelimpulsodoloroso. Asimismo se plantean diversas metodologías para la obtención de estos novedosos compuestos, así como una caracterización completa de los animales de donde se extraen y otras aplicaciones médicas de estos compuestos.

Palabras clave: Analgésicos,Dolor,Venenos,Conotoxinas,Conopéptidos,Moluscosgasterópodos,Caracoles.

ABSTRACTPainisasensoryandemotionalunpleasantexperience,whichcouldexperienceallthoselivingbeingswhohaveacentralnervoussystem-CNS,isanexperienceassociatetotissueinjuryorexpressedasifitexisted.Inthisreview,newsourcesforobtainingvariousdrugstotreatchronicpainofvariouspathologiesisolatedfrommarineanimals(snailsConusgenus)arepresented.Itisconotoxinsisolatedvenomsoftheseanimals,theirtherapeuticeffectisaselectiveblockadecalciumchannel(Ca)typeN,bywhichreducesthereleaseofneurotransmitterspronocicep-torinthedorsalhornofthespinalcord,inhibiting,thuspainimpulsetransmission.Differentmethodologiesforobtainingthesenewdrugsaswellasacompletecharacterizationofanimalsandothermedicalapplicationsofisolatedcompoundswerealsoindicated.

Keywords:Painkillers,Pain,Venoms,Conotoxins,Conopeptides,GastropodMollusks,Snails.

Biociencias•Volumen10•Número2•51-63•Julio-Diciembre2015•UniversidadLibreSeccionalBarranquilla

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NelsonGiovannyRincónSilva,JuanDavidRincónSilva,CindyVanessaCastellanosBernal

INTRODUCCIÓN

El dolor es una de las principales causas de consul-ta en atención primaria y urgencias médicas en el mundo, este es un padecimiento universal, por lo queresultaprioritarioadquirirunaformaciónade-cuadaensudiagnósticoytratamiento.Porfortunainvestigacionesenbioquímica,químicafarmacéuti-ca,farmacología,entreotrasramas,sehanenfoca-doenobtenerdiversoscompuestosquebloqueanalgunos canales relacionados directamente con el dolor desde fuentes naturales, por ejemplo: co-notoxinasdeanimalesmarinosquehanresultadoadecuadamenteefectivos(1).

La cienciaqueestudiael dolor se llamaalgología(esuntérminonoregistradoporelDiccionariodela LenguaEspañolaperoencuentra su etimologíaenelgriegoάλγος,algos,dolor)(2).Eldolorpuedeser agudo o sordo. Puede ser intermitente o cons-tante.Enloshumanossepuedesentirenalgúnlu-gar del cuerpo, como la espalda, el abdomen o el pechoosentirdolorgeneralizado,comolosdoloresmusculares(mialgia)(3).Lasensacióndedolorar-ticularomuscularsepuedeproducirpordiversasenfermedadescomo:artritis,fibromialgia,algunostiposdecánceruotrasenfermedadescrónicas(4).Además, cuando se produce una lesión o trauma-tismodirectosobreuntejidoporestímulosmecá-nicos,térmicosoquímicosseproducedañocelular,desencadenándoseunaseriedesucesosquepro-ducenliberacióndepotasio,síntesisdebradiquini-na del plasma, y síntesis de prostaglandinas en la regióndeltejidodañado,quealavezaumentanlasensibilidaddel terminala labradiquininayotrassustancias productoras del dolor o algógenas (4).Además de estos casos, algunos pacientes presen-tanseverosdoloresdecabezaocefaleasquealgu-nas veces pueden resultar incapacitantes cuando

eldolorestanfuertequelapersonanopuedede-sarrollar ninguna actividad, padecimiento conoci-docomoMigrañaquepuedeocurrirconsíntomascomo náuseas, vómitos o sensibilidad a la luz y al sonido, el cual algunas veces presenta causas des-conocidasactualmente(1-3).

El dolor en los pacientes se trata con medicamen-tos denominados Analgésicos, los cuales pueden serdediversostipos; entre losprincipales se en-cuentran:Antiinflamatoriosnoesteroideos(AINES)como laaspirina, ibuprofenoonaproxeno (Figura1. a), o el paracetamol más conocido como aceta-minofén –AINE carente de efectos antinflamato-rios (Figura1.b), loscualesactúan inhibiendo laspostraglandinas (5-7). Otros tipos de analgésicosson los opiáceos menores como el tramadol y los opiáceosmayores,estossonungrupodefármacosnaturales(opiáceos)comolamorfinayartificiales(opioide)comoelfentanilo.Entreestoselmáspo-pulareslamorfinaqueseutilizaparatratardolorescrónicos en pacientes oncológicos, dolores en los huesos o en pacientes post-quirúrgicos (Figura 1.c)(7).Elproblemadelamayoríadeestosanalgé-sicosesquepresentanefectos secundarios comodañohepático, gástricoo renal y en los opiáceospuede provocar adicción en los pacientes debido a lacombinacióndefactorespsicológicosyfisiológi-cos(7-8).

a)

b)

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Compuestosconpotencialactividadfarmacológicaobtenidosapartirdeconotoxinasdeanimalesmarinos(moluscosgasterópodosConus magus)

c)

Figura 1. Estructura química de los analgésicos comúnmente utilizados para tratar el dolor en enfermedades agudas y crónicas: a) Ácido (S)-2-(6-metoxi-2-naftil) propanoico conocido comúnmente como naproxeno. b) N-(4-hidroxifenil)acetamida conocido como paracetamol o acetaminofén. c) (5α,6α)-7,8-didehidro-4,5-epoxi-17-metilmorfinan-3,6-diol alcaloide fenantreno del opio, conocida como morfina nombrada así por el farmacéutico alemán Friedrich Wilhelm Adam Sertürner en honor a Morfeo, el dios griego de los sueños (5,7,8-11). Imágenes editadas por autores

Recientementesehademostradolaimportanciadealgunoscompuestosquímicosconactividadbioló-gica presentes en algunos venenos de organismos marinosenel tratamientocontradiferentestiposdedolorescrónicos(12).Losreportesdeinvestiga-ciones de metabolitos provenientes de organismos marinos datan desde 1997 con estudios que sellevaronacaboconlospecesgloboydinoflagela-dosparaobtenertetrodotoxinaysaxitoxina,hasta1987sereportaroncercade2500metabolitospro-venientes de estos organismos. En 1998 se tenían cerca de 850 nuevas estructuras de compuestos químicosconactividadmedicinalprovenientesdeorganismosdelmaryparaelaño2012sepresenta-ron más de 2000 nuevos compuestos en solo este año provenientes de lamisma fuente (13). Estospotenciales analgésicos pueden llegar a tener un efectomilvecesmásefectivoquepoderososanal-gésicos como lamorfinapero sin dependencia nidepresiónrespiratoria,deahíqueactualmentesonestudiadosporcientosdegruposdeinvestigaciónanivelmundial(12-13).

Aproximadamentecercadel70%de lasuperficie

de la Tierra está cubierta por agua y los océanos contienen alrededor del 96,5 % de toda el aguadelplanetadondehacemillonesdeañossurgióyevolucionó lavida (13-15).Dentrode losorganis-mosmarinosseencuentranelfitoplancton,lasal-gasverdes,pardas, rojasygrandesfilosdel reinoanimal: esponjas o poríferos, cordados (específi-camente el subfilo urocordados), equinodermos,moluscos,entreotros (15-16).Estosúltimosyes-pecíficamente los caracoles resultan ser muy in-teresantesyaquesuvenenocontienetoxinascongranpoderanalgésico(14-17).Porlotanto,enestetrabajo se pretende realizar una extensa revisión acerca de compuestos con actividad farmacológi-ca obtenidos desde organismos marinos, con una extensa caracterización biológica y fisiológica delosanimales (caracoles),de igualmanera, sepre-sentan metodologías actuales para la obtención y estudios de estos compuestos, así como diversas aplicaciones médicas de estas nuevas sustancias.

LOS MOLUSCOS

Pertenecen al gran filo animal de los Mollusca.Trabajos recientes muestran que se han descritoalrededor de 100.000 especies de moluscos vivien-tesymásde35.000especiesextintas(18-19).Losmoluscoshancolonizadolamayoríadeambientesterrestres, desde grandes alturas a más de 3000 m sobreelniveldelmarhastaprofundidadesdemásde 5000 m, se distribuyen tanto en aguas polares comotropicales,aunquesuelensermáscomunesenloslitoralesdetodoelmundo(18-19).

Losmoluscos son considerados como el segundogrupo más abundante de invertebrados después de losartrópodos.Presentanunamorfologíamuyhe-

terogénea, desdetípicasformasdealmejas,ostras,

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caracoles,babosas,quitonesylapashastaorganis-

moscontamañosyformasconsiderablescomolos

pulpos y calamares (20). Esta gran diversidad ha

resultadoenunaenormeclasificacióntaxonómica,

que incluye siete clases: Aplacophora, 320 espe-

cies;Monoplacophora,20especies;Poliplacopho-

ra,600especies;Escaphopoda,350especies;Bival-

via,13000especies;Cephalopoda,800especiesy

Gastropodacon50.000especies(Figura2)(18-19).

Figura 2. Diferentes representantes del filo de moluscos (Mollusca del latín molluscum, “blando”) (20). Editada por autores

GENERALIDADES DE LOS GASTERÓPODOS

(CARACOLES Y BABOSAS)

Losgasterópodos(claseGasterópoda)sonelgrupo

másabundantedemoluscosqueincluyeaproxima-

damentemásde40.000especiesdescritas,aunque

sehanhechoalgunasestimacionesconrespectoa

lacantidaddeorganismosquesehandescritoyal-

gunosconsideranysugierenquesunúmeropodría

aumentaren lospróximosañosaunas80.000fá-

cilmente, debido básicamente al desconocimiento,

biodiversidad y fácil adaptabilidad de estos orga-

nismosalosdiferentesecosistemas(18-19).Sehan

descritoaproximadamenteunos15.000fósilesde

gasterópodos.

CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DEL GRUPO

Una de las principales características de los gas-terópodosessuconcha,puestoquevariosde lossistemas de clasificación se basan en algunos desusrasgosycaracterísticas.Existenconchasdedi-ferentesformas,enespiral,convexa,cónica,globo-sa,planayturriculada.Losindividuospresentandemodomásclarolatípicadivisióndelblandocuerpoencabeza,pie,masavisceral ymanto (18-19). Laconchadelosgasterópodossecomponedevariascapas como en la mayoría de los moluscos, pero su superficie,amenudopolícroma,solosuelerevelarsubellezadespuésdequitarleelperiostraco.Enelcasomássimplelaconchaestádispuestacomountubo arrollado en espiral que se ensancha conti-nuamente. Cuando las espirales, llamadas también vueltas,sejuntanenelejeformandounhusosó-lido, columnilla o columela, que se conecta en labocaalbordecolumelar:silasvueltasnosetocan,seoriginaunhuecocónico,llamadoombligo,visi-bleenlabasedelaconcha.Lasvueltascontactanarriba y abajo en una sutura. El comienzo de las vueltas, con la espiral embrionaria, constituye elápice.Enelextremoopuestodelaconchaestálabase,bordeinferiordelaconchaoperistomo,queenmuchasespeciesseprolongaenformadecanalosifón,surcopordondesalenlostubosrespirato-rios. El agujero terminalde la concha,pordondeasoma el blando cuerpo del molusco, se denomi-naestoma,ypuedeserredondo,ovalohendido.Ellabioexternodelestomapuedeserafiladoodeforma labial, liso o dentadopor dentro y revesti-doporfueracontubérculosoespinas(18).Lasu-perficiedelaconchaeslisaybrillante,obienestáprovistadecostillas,tubérculos,espinasocerdas;las costillaspuedenserparalelasaleje (esculturaaxial) o seguir los giros (escultura espiral). Cuan-do las esculturas se entrecruzan con un relieve del



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mismotipo,seproduceunreticulado,queavecespresenta nódulos en los puntos de intersección. Al-gunosgrupostienenenlapartesuperiordelpieundiscocórneoocalcificado,elopérculo,queencajaexactamente en el estoma, cerrándolo al ocultarse elanimal(19).

Un rasgomuy característico de un grupo antiguode gasterópodosmarinos y que los diferencia delosdemásgasterópodoseselfenómenodetorsiónde la masa visceral. Este consiste en una torsión de 180gradosquesufreelanimaldurantesudesarro-llo, este giro se da en torno a su eje longitudinal, ensentidoopuestoalasagujasdelreloj,almismotiempoque lo hace en espiral. Como consecuen-cia de ello, la masa visceral con los órganos pares (branquias,riñonesylasaurículasdelcorazón),asícomoelorificiogenitalyelano,se trasladana laparteanteriordelcuerpo.Lasbranquiassesitúandelante del corazón, por esta razón a este grupo se le denomina prosobranquios (subclase Proso-branchia).Ademásenesteproceso,losgasterópo-dospierdenunodelosórganosparesysequedansoloconunaaurícula,unabranquiayunriñón.Elhepato-páncreasizquierdoaumentamuchodeta-mañoacostadelderechoylasgónadasmuestrantambién desarrollo unilateral. En los opistobran-quios (subclase Opisthobranchia), “de branquiasposteriores”, todos marinos, la masa visceral gira solo parcialmente, la cavidad paleal se coloca en elladoderechodelorganismo,volviendoasituar-se labranquiadetrásdel corazón. Lopropioocu-rretambiénenloscaracolesdetierrapulmonados(subclase Pulmonata), que se diferencian de losopistobranquios precisamente por la ausencia debranquias.Ensucaso,elrevestimientodelacavi-dadpaleal seha convertidoenun tejido surcadoporcapilares,quefuncionademodosimilaraldeunpulmón(19).

En muchosopistobranquiosypulmonados,lamasavisceralsedesplazamuypocohaciadelante;enesecaso, la mayoría de los órganos se alojan en el pie, y suele producirse también una involución de la concha,quepasaaserunsimplevestigiocalizocu-biertoporelmantoeinvisible;ocurreestoconloslimacoideos(babosas).Laconchadesaparecetotal-menteen losnudibranquios,quedesechanense-guidalaconchaembrionaria;lacavidadpalealylabranquiaserefundenporcompleto,encargándosede su actividad unos lóbulos dérmicos tubulares,queactúancomobranquiassecundarias(18-19).Lacabezatieneojosyunoodosparesdetentáculos.Enmuchosprosobranquios seprolongaen formadehocico,convirtiéndoseenunalargaprobóscideprotráctil.Elestomaesventral,ylafaringepresen-taunarádulamultidenticulada,precedidaamenu-dodeunasplacasafiladasquetrabajancomoman-díbulas.Unasglándulasesofágicasparessegreganunmucusqueenvuelvelaspartículasalimenticias;algunos géneros producen también una secreción tóxicaqueparalizaa lapresay ladigieredespués(18-19).

ÓRGANOS SENSORIALES DE MOLUSCOS

En la mayoría de los casos existen, junto a la base de los tentáculos, unos ojos primarios, ocelos, o incluso ojos con lente, que les proporcionan unavisiónprimitiva.Lospulmonadosterrestrestienenesos ojos con lente en el extremo de un par de ten-táculoscontráctiles.Juntoalabranquiaydentrodelacavidadpaleal,haycélulassensorialesquehacendeórganoolfativo.Controlanlassustanciasaromá-ticascontenidasenelaguaqueentraenesacavi-dad, para saber si proceden de presas, enemigos o individuos sexualmente interesantes. Eso permite almoluscodesplazarsehaciaadelante,reaccionar



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ante un enemigo que se acerca o aproximarse a un compañerosexual(18-19).Losgasterópodossedesplazan normalmente reptando, por medio de ondasque recorren la sueladelpieyempujanalanimalhaciadelante.Parapoderavanzartambiénsobresuperficiesásperas,sinfricción,unaglándulapedalsegregamucus,demaneraqueelmoluscosedeslizasobrela“alfombra”viscosaresultante(19).

Los prosobranquios son, por lo regular, unisexua-dos.Suelehacerlasvecesdepeneunapéndicedeformavariadasituadoenlapareddelacabezadelosmachos,queenlasespeciesmarinasseatrofiaoesdesechadodespuésde laépocade la repro-ducción.Losopistobranquiosylospulmonadossonhermafroditasygeneralmentepracticanunacópu-lacruzada;muyraravezseautofecundan(18).Losgasterópodos se reproducenporhuevos,quepo-nenporlocomúnenformadecápsulasocordonesgelatinosos,otambiéndecapullosapergaminadosque contienen muchos huevos. Los caracoles te-rrestres envuelven los suyos en cubiertas duras, a menudocalizas,ylosponenenhoyosenelsuelo.El desarrollo de las especies marinas pasa por un estadio larvario, eldevelígera (larvavelíger), conunafasedevidaplanctónicamásomenosprolon-gada, pero a veces, las larvas permanecen dentro de la envoltura ovígera y se alimentan de los demás huevosde lamismapuesta. Los gasterópodosdetierrayaguadulcesedesarrollandirectamente,sinestadiolarvario(18-19).

Finalmente como se dijo con antelación, los gas-terópodos sedividen sistemáticamenteenproso-branquios (principalmente marinos), opistobran-quios(exclusivamentemarinos),ypulmonados(ensumayoríaterrestres).Losmoluscosgasterópodos(piecarnoso)pertenecientesalordenStylommato-

phora, familiaHelicidae (caracol)y Limacidae (ba-bosa), se caracterizan por sumovimiento en for-maondulatoria (18-19). Lamayoría son polífagosypuedenprovocar importantesdañosenplantasornamentales.Sealimentandehojasyfrutosyseobserva su mayor actividad cuando hay buenascondiciones de humedad, esto generalmente sepresentacuandosehacenriegossobrelasplantaso se presentan lloviznas esporádicas, generalmente sealimentandenoche,aunqueocasionalmentelohaceneneldía(18-19).

Deestoselque recibemayoratenciónaniveldecompuestos con actividad bioquímica, específica-mente farmacológica es el género Conus, el cual cuentaconcercade700especies.PertenecenalafamiliaConidae, mejor conocidos como conos (Fi-gura 3), son caracoles marinos de aguas tropicales encontradosenlosarrecifesdecoral.Soncarnívo-rosyposeenunórganovenenoso,queconsisteenunaglándulaunidaaundienteradularenformadearpón.Conbaseeneltipodepresasconsumidas,loscaracolesconoseclasificanenvermivorous(ca-zadores de gusanos),moluscívoros (cazadores demoluscos) y piscívoras (cazadores de peces) aun-que hay algunas especies de caracoles cono quetienenelpotencialdeconsumirmásdeuntipodepresa. El veneno de ciertas especies como Conus geographus, Conus aulicus, Conus textile, Conus marmoreus, Conus leopardus,puedeserfatalparaelhombre,produceparálisisypuedellegarapro-ducir la muerte. El veneno de los conos compren-denumerosospéptidosricosencisteínallamadosconotoxinas o conopéptidos junto con análogosdepéptidosde señalizaciónendógenaypéptidoslineales.Estospéptidossedirigenaloscanalesióni-cos y receptores en el sistema nervioso de la presa conexquisitapotenciayespecificidad(12,14).



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Figura 3. Caracoles marinos del género Conus, denominado de esta manera por la forma de su concha. Las especies que habitan el océano Indo-Pacífico producen un veneno que le puede causar la muerte a los humanos, de ahí surgió el interés por estudiar las toxinas presentes en estos animales, actualmente denominadas Conotoxinas (21-23).a)

b)

Fuente: Imagen original de Janette y Scott Johnson. Editadapor autores

Compuestos químicos con actividad farmacológi-ca extraídos de caracoles

Lamayoríadeconopéptidososcilanentre10y30aminoácidos de longitud y cada especie de caraco-lesconoproduceunvenenoquecomprendemásde1000péptidosúnicos. Supequeño tamaño, larelativafacilidaddesíntesisquímicayladiversidaddecanaliónicoylosreceptoresobjetivohacenquelos conopéptidos sean valiosos fármacos (24-26).Muchosde losconopéptidos farmacológicamente

caracterizados se dirigen a los receptores de canal iónico (proteínastransmembranaconporosacuo-sosquecuandoseabrenpermitenelpasoselecti-vodeionesespecíficosatravésdelasmembranascelulares) en losmamíferos, los cuales participanen las vías del dolor, incluyendo los receptores ni-cotínicosdeacetilcolina(α-conotoxinas),loscana-lesdesodio(μ-conotoxinasyμO-conotoxinas),loscanales de calcio (ω-conotoxins), transportadoresde noradrenalina (χ-conopéptidos), receptor deNMDA(conantoquinas)yelreceptordeneuroten-sina(contulakins)conaltaselectividadhaciéndolosfármacos muy útiles (12, 27-29). Por ejemplo, elconopéptidoZiconotidatipoω-MVIIAseencuentradisponible en el mercado bajo el nombre comer-cial de Prialt(Figura4ayb)aprobadoen2004porlaFDA(Food and Drug Administration: Agencia de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos responsable de la regulación de alimentos, me-dicamentos cosméticos, aparatos médicos, pro-ductos biológicos y derivados sanguíneos), como analgésico intratecal (lugardondefluyeel líquidoqueseencuentraalrededordelamédulaespinal).Esteesunanalgésicoquebloquea los canalesdecalcio tipoN (BCCN:Analgésicos con importanciabiomédica en el tratamientode la hipertensión yarritmiascardiacas),noesnarcóticoyesaisladodelvenenoqueemplea laespecieConus magus para aturdir las presas que captura. Los canales CCNregulan la liberación de neurotransmisores en po-blacionesneuronalesespecíficas,responsablesdelprocesamiento medular del dolor. Al unirse a estos CCN neuronales, la ziconotida inhibe la corrientede calcio sensible al voltaje en las vías aferentesnociceptivasprincipalesqueterminanenlascapassuperficialesdelastadorsalde lamédulaespinal.A su vez, esto inhibe la liberacióndeneurotrans-misores(incluidalasustanciaP:unundecapéptidode estructura Arg-Pro-Lis-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gli-Leu-Met-NH2 (RPKPQQFFGLM)conunaaminación



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en el carboxilo terminal especialmente involucrada enlapercepcióndeldolor,esunneuropéptidoqueactúa como neuromodulador y neurotransmisor) y,portanto,laseñalizaciónmedulardeldolor(12,24-30).

Figura 4. a) Conopéptido Ziconotida tipo ω-MVIIA.b) Comercialmente denominado Prialt. Este fue el primer derivado marino que recibió la aprobación como medicamento (31). Imágenes editadas por autoresa)

b)

Actualmenteseestimaquehaymásde50000cono-péptidosdiferentesdeloscualesmenosdel0,1% se ha caracterizado hasta la fecha. Esta cantidadestá aumentando con la llegada de nuevas técnicas másrápidasyqueademásrequierenmenoscanti-daddemuestradeveneno.Específicamentelatéc-

nica instrumental de espectrometría de masas MS, lacualcadavezesmássensible.Lacombinacióndelosdatosdeespectrometríaconinformacióndese-cuenciasdeADNobtenidasapartirdebibliotecasde ADNc y EST’s marcador de secuencia expresada (acrónimodel inglésExpressed Sequence Tag) re-sultasermuypráctico(12,15,24-28).

NUEVAS HERRAMIENTAS EN EL DESCUBRIMIENTO Y

OBTENCIÓN DE CONOPÉPTIDOS

Laobtencióndeconopéptidostradicionalmenteserealizamediantemétodosclásicosdebioactividadguiadospor fraccionamiento,dondeelvenenoesdetectadopor subioactividad, luegosepurificaycaracterizan las fracciones que exhiben actividadbiológica.Noobstante,estemétodorequierebas-tante tiempo para llevarse a cabo y necesita degrandescantidadesdevenenocrudo, loquecon-vierteinviableeltrabajoconestemétodo(31).

Conelfindeacelerarelprocesodeobtenciónydelimitarlacantidaddevenenonecesariaparaestosestudios, han sido implementados nuevos méto-dos con ayuda del avance tecnológico en la instru-mentación y el desarrollo de nuevas técnicas, así como su combinación (Figura 5), por ejemplo: laproteómica (estudio del proteoma o conjunto deproteínaspresentesenunaunidadbiológica,frac-ción celular, célula, tejido, órgano u organismo bajo condicionesdeinterésespecíficas),juntoaestaserequiereunespectrómetrodemasasMSconaltasensibilidaddebidoalaextremadamentepequeñacantidaddemuestradelveneno(32-33).Desarro-llos paralelos en el campo de la proteómica y las mejorasenlainstrumentacióndeMShanhechodelos estudios proteómicos uno de los pilares en el campodelosestudiosdeveneno(34-35).Estasse



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componenprincipalmentedepéptidosyportantosonsusceptiblesdeestudiodeanálisisdemasas.Elacoplamientocon técnicascomo lacromatografíalíquida conespectrometría demasas (LC-MS), asícomo el aumento de la sensibilidad en la instru-mentaciónhaayudadoadesentrañarlaverdaderacomplejidaddelosvenenos.Enparticulartécnicascomo:Desorción/ionización láserasistidaporma-triz(MALDI,eninglésMatrix-Assisted Laser Desorp-tion-ionización) con detector de iones de tiempodevueloTOF,permiteelanálisisdebiomoléculas(biopolímeroscomolasproteínas,lospéptidos,losazúcares y los lípidos) y moléculas orgánicas gran-des (como lospolímeros, losdendrímerosyotrasmacromoléculas)quetiendenahacerse frágilesyfragmentarse cuando son ionizadas por métodosmás convencionales, además la proteómica em-plea la espectrometría de masas ionización por electroespray (en inglés,Electrospray ionization o ESI).Así,laespectrometríademasashaelucidadola complejidad del veneno. Adicionalmente, estas técnicashanpermitidounaumentodediezvecesenestimacionesdelnúmerodeconopéptidospre-sentes en cada especie Conus yhanayudadoaes-pecificar ladiversidaddevenenoentrediferentesespecies,asícomodentrodelamisma(12,33).

En cuanto a la transcriptómica (ómica encarga-dade identificar laporcióndelgenomadeunor-ganismo transcrito amRNA, rRNA, tRNAs, niRNA,miRNA presentes en una célula, tejido u órgano,o la cuantificaciónde los nivelesde transcripcióndelosgenes),variosgruposhanutilizadométodosgenómicos y transcriptómicos tradicionales para estudiar los genes que codifican para los compo-nentesdelvenenoqueseencuentraenloscaraco-les cono. Estos estudios se basan en la construcción de bibliotecas de ADNc seguidos por el método de

secuenciación Sanger(determinacióndelordendelosnucleótidosenunoligonucleótidodeADN)(32,36).

Lasecuenciacióndeunmarcadordesecuenciaex-presada EST(unasecuencianucleotídicatranscritacodificantedeunaproteína)hapermitidolaidenti-ficacióndeunnúmerodegenesquecodificanparatoxinas particulares. Adicionalmente, también hallevadoaldescubrimientodenuevasα-conotoxinas.Elusodeperfilesdeexpresióngénicatambiénsehautilizadoparaayudaraexplicarlosmecanismosdelavariaciónylaevolucióndelosconopéptidos.Sinembargo,lacantidaddeinformaciónobtenidaa travésde lasecuenciacióndepartesespecíficasdel transcriptoma es evidentemente restringida y talesmétodossonpropensosalosefectosqueim-pidenlaidentificacióndeloscomplejostranscritosde muestreo.

La reciente disponibilidad de plataformas de se-cuenciación de última generación como Illumina(Illumina Inc.)y454pirosecuenciación(Roche)hahechoposiblequetodoeltranscriptomaogenomaseestudiedeunamanera relativamente rápida yconfiable.Elestudiodelatotalidaddeltranscripto-mapermitealosinvestigadoresobtenerunacom-prensiónmásprofundadelosprocesosquedeter-minan la composición del veneno. Sin embargo, los métodos de secuenciación de última generaciónnoestánexentosdedefectosyerrores.Estosgru-pos de investigación también descubrieron variasenzimasnuevasenlamodificaciónpostraduccional(cambioquímicoocurridodespuésdelasíntesisdeunaproteína)yasíhanpresentado lacaracteriza-cióncompletadelaglánduladeveneno(32-36).

Estos estudios paraleloshandemostradolaidonei-



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daddeutilizarmetodostranscriptómicosparage-nerar informaciónvaliosaparaelrápidodescubri-mientodenuevos componentesdel veneno (37).De esta manera, los nuevos avances en MS están siendo integrados con la transcriptómica, genó-mica,proteómicaybioinformáticaenunenfoquemultidisciplinario que algunos investigadores handenominado venómica(32).

Otra aplicaciónmédica de las conotoxinas prove-nientes de caracoles ha sido estudiada por dife-rentesgruposdeinvestigaciónenlosúltimosaños,dondeestastoxinassehanempleadoentratamien-tos contra desórdenes neurodegenerativos, espe-cíficamenteenpatologías comoAlzheimer, enfer-medaddeParkinsonyesclerosismúltiple(38-39).Enfermedadesqueconducenconeltiempoauna

Figura 5. Diagrama de flujo de trabajo secuencial para el procedimiento tradicional (rosado) y los procedimientos integrados (azul). El proceso integrado supera la necesidad de varios de los pasos iniciales que se encuentran en el proceso tradicional (fraccionamiento guiado por bioensayos, purificación, degradación de Edman y/o secuenciación MS/MS) y por lo tanto, reduce la cantidad de tiempo requerido. También aumenta enormemente el alcance del descubrimiento debido al número de secuencias y los datos proteómicos producidos. Además, el enfoque integrado requiere una cantidad mucho más pequeña de material y por lo tanto presenta varias ventajas sobre el enfoque tradicional (12). Editada por autor



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incapacidad progresivayqueafectanamillonesdeseres humanos. Se ha observado que diferentescanales iónicos en las neuronas como algunos de sodioypotasiotienenefectosdirectosen lospa-decimientos neurodegenerativos dependiendo delasexpresionesyanormalidadesensusfunciones(40-41). Por otro lado, las toxinas aisladas de loscaracolespresentanafinidadpordiferentescanalesiónicos de los cuales algunos se relacionan direc-tamenteconeldesarrollodeestasenfermedades.Las conotoxinas que pueden presentar dicha in-teracciónprincipalmenteson: srXIA, srIA,αD-cap,αD-mus,CalTx,SIIIa,SIIIB,entreotros.Deahíquelainvestigaciónconestainteracciónpuedecondu-cir al impedimento en la destrucción de los canales iónicos y como tal con la disminución del proceso neurodegenerativo(40-42).

Finalmente,apesardelospotencialesefectosanal-gésicosde losconopéptidosaisladosdemoluscosgasterópodos que ya han sido comprobados enpruebasfarmacológicas,solounpequeñonúmerode conopéptidos ha sido caracterizado detallada-mente en la actualidad. No obstante las mejoras enloscamposdeestudio:proteómicaytranscrip-tómica y el desarrollo en técnicas instrumentales deMS/MS,hanaceleradolosestudiosdedescubri-mientoy caracterizaciónde conopéptidos, loquefavorecelaesperanzaenpacientesconfuertesdo-loresquelesimpidellevarunavidatranquila.Portanto,es importante favorecer las investigacionesen esta área así como asegurar la protección de las diferentesespeciesmarinasquesoninvestigadas.

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