Concentración de la enzima Concentración del...
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VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE
UNA REACIÓN ENZIMÁTICA
t
s
p[ ]
Concepto de velocidad inicial
d[ ]
dtv = , t -> 0
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VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE
UNA REACIÓN ENZIMÁTICA
• Concentración de la enzima
• Concentración del sustrato
• pH
• Temperatura
• Efectores (Activadores e Inhibidores)
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Efecto de la concentración de enzima: relación lineal
v
[E]
. . . . . . . . .. .
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S
E
ES
P
EP
Ciclo catalítico
de una enzima
Una cinética lineal implica
un proceso regenerativo,
cíclico
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v
[s]
Efecto de la concentración de substrato
..
.. . . . .
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E + S ES E + Pk+1
k-1
k+2
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:
Hay un número limitado de sitios en la enzima
para fijar substrato; una vez que están ocupados
todos, por mucho que aumente la concentración
de substrato, la velocidad permanecerá constante
tendiendo a un valor asintótico
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CINETICA ENZIMATICA
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CINETICA ENZIMATICA
• La cinética enzimática estudia la velocidad de
las reacciones catalizadas por enzimas.
Estos estudios proporcionan información directa
acerca del mecanismo de la reacción catalítica y
de la específisidad del enzima.
• La velocidad de una reacción catalizada por un
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya
que en muchos casos no es necesario
purificar o aislar el enzima.
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CINETICA ENZIMATICA
• La medida se realiza siempre en las
condiciones óptimas de pH, temperatura,
presencia de cofactores, etc, y se utilizan
concentraciones saturantes de sustrato.
• En estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax). La
velocidad puede determinarse bien midiendo la
aparición de los productos o la desaparición de
los reactivos.
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CINETICA ENZIMATICA
• En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:
• v1 = k1 [E] [S]
• v2 = k2 [ES]
• v3 = k3 [ES]
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CINETICA ENZIMATICA
• Se puede distinguir entre enzima libre (E)
y enzima unido al sustrato (ES), de
forma que la concentración total de
enzima, [ET], (que es constante a lo largo
de la reacción) es:
[ET] = [E] + [ES]
Como [E] = [ET] - [ES], resulta que:
v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
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Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario,
según el cual la concentración del complejo ES es pequeña y
constante a lo largo de la reacción
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CINETICA ENZIMATICA
Por lo tanto, la velocidad de formación del
complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su
disociación (v2+ v3):
v1 = v2 + v3
Además, como [ES] es constante, la velocidad
de formación de los productos es constante:
v = v3 = k3 [ES] = constante.
Como v1=v2+v3, podemos decir que:
k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]
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CINETICA ENZIMATICA
Despejando [ES], queda que:
[ES] = [ET] [S] / Km + [S]
siendo Km = (k2 + k3)/ k1, en donde la expresión (k2 + k3)/ k1 se ha sustituído por Km, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la Km es un parámetro cinético importante.
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Por lo tanto, en el estado estacionario, la
velocidad de formación del producto es:
v = v3 = k3 [ES] = k3[ET] [S]/ Km + [S]
Para cualquier reacción enzimática, [ET],
k3 y Km son constantes. Vamos a
considerar dos casos extremos:
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CINETICA ENZIMATICA
• A concentraciones de sustrato pequeñas
([S] << Km) v = (k3 [ET]/KM) [S].
Como los términos entre paréntesis son
constantes, pueden englobarse en una nueva
constante, kobs, de forma que la expresión
queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la
reacción es un proceso cinético de primer
orden.
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CINETICA ENZIMATICA
• A concentraciones de sustrato elevadas
([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax).
Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato.
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CINETICA ENZIMATICA
• Si introducimos el parámetro Vmax en la
ecuación general de la velocidad.
Obtenemos la expresión más conocida
de la ecuación de Michaelis-Menten:
V = Vmax [S] / Km + [S]
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CINETICA ENZIMATICA
Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide .
En la cinética sigmoide, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la Km) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.
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Razones por la cual la Km es un parámetro
cinético importante
• Km es la concentración de sustrato para la cual
la velocidad de reacción es la mitad de la
velocidad máxima. En efecto, si Km = [S], la
ecuación de Michaelis-Menten se reduce a:
v = Vmax/2.
• El valor de Km da idea de la afinidad del enzima
por el sustrato: A menor Km, mayor afinidad del
enzima por el sustrato, y a mayor Km, menor
afinidad.
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Razones que hacen de la Km un parámetro
cinético importante
• La Km del sustrato natural es menor
que la de los sustratos análogos. Si dos
sustratos del mismo enzima tienen distinta
Km, el que presente mayor Km tiene
menor afinidad por el enzima, y la
reacción transcurre siempre a menor
velocidad que con el sustrato de menor
Km, salvo a concentraciones saturantes
de sustrato, donde la v = Vmax.
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Razones por la cual la Km es un parámetro
cinético importante
• Los valores de Km de muchos enzimas
son próximos a los de la concentración
fisiológica de sus sustratos, de forma
que pequeñas variaciones en la [S]
pueden suponer grandes cambios en la
velocidad de toda una ruta metabólica.
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CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA
ENZIMA
• La representación gráfica de la ecuación
de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es
una hipérbola. La Vmax corresponde al
valor máximo al que tiende la curva
experimental, y la Km corresponde a la
concentración de sustrato a la cual la
velocidad de la reacción es la mitad de la
Vmax.
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CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA
ENZIMA
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CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA
ENZIMA
• Para determinar gráficamente los valores de Km y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cual:
• La pendiente es Km/Vmax
• La abscisa en el origen (1/v = 0) es -1/Km
• La ordenada en el origen (1/[S] = 0) es 1/Vmax
• De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.
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CALCULO DE LA Km Y DE LA Vmax DE UNA
ENZIMA
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ACTIVIDAD ENZIMATICA
• Se define la unidad de actividad enzimática
(U) como la cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto.
La actividad específica es el número de
unidades de enzima por miligramo de proteína
(U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).
• Recientemente, el Sistema Internacional de
unidades (SI) ha definido la unidad de actividad
enzimática como la cantidad de enzima que
transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta
unidad se llama katal (kat).
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ACTIVIDAD ENZIMATICA
• Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x106 U. Esta unidad es muy grande, de formaque se utilizan frecuentemente los submúltiploscomo el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal(nkat, 10-9 kat).
• Cuando se conoce el peso molecular del enzimapuro y el número de centros activos pormolécula de enzima, las medidas de actividadenzimática permiten calcular el número derecambio del enzima, o sea, el número dereacciones elementales que realiza un enzimapor cada centro activo y por unidad de tiempo.
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EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA
Los enzimas poseen grupos químicos ionizables(carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;imidazol, etc.) en las cadenas laterales de susaminoácidos. Según el pH del medio, estosgrupos pueden tener carga eléctrica positiva,negativa o neutra. Como la conformación de lasproteínas depende, en parte, de sus cargaseléctricas, habrá un pH en el cual laconformación será la más adecuada para laactividad catalítica. Este es el llamado pHóptimo.
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EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA
• La mayoría de los enzimas son muy sensibles alos cambios de pH. Desviaciones de pocasdécimas por encima o por debajo del pH óptimopueden afectar drásticamente su actividad. Así,la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, laureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene apH 10. Como ligeros cambios del pH puedenprovocar la desnaturalización de la proteína, losseres vivos han desarrollado sistemas más omenos complejos para mantener estable el pHintracelular: Los amortiguadores fisiológicos.
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EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA
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EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA
En general, los aumentos de temperatura
aceleran las reacciones químicas: por
cada 10ºC de incremento, la velocidad de
reacción se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley
general. Sin embargo, al ser proteínas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan
a desnaturalizar por el calor
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EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA
• La temperatura a la cual la actividad
catalítica es máxima se llama
temperatura óptima. Por encima de esta
temperatura, el aumento de velocidad de
la reacción debido a la temperatura es
contrarrestado por la pérdida de actividad
catalítica debida a la desnaturalización
térmica, y la actividad enzimática decrece
rápidamente hasta anularse.
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EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA