Continua fermentación de la lactosa por el Clostridiumacetobutylicum - Evaluación de la cinética

de acidogénesis

Fabio Napoli, Giuseppe Olivieri, María Elena Russo, Antonio Marzocchella⇑, Piero Salatino

a, b s t r a t c

Una evaluación de la cinética de crecimiento de las células de

Clostridiumacidogénicaacetobutylicum DSM 792 se informó en el documento. Las pruebas se

llevaron a cabo en un reactor de tanque agitado continuo bajo condiciones controladas que

adoptan un medio complejo suplementado con lactosa como fuente de carbono para imitar suero

de queso. Los efectos de los ácidos (acético y butírico), disolventes (acetona, etanol y butanol) y el

pH de la tasa de crecimiento de las células acidógenos fueron evaluados. El proceso de conversión

se ha caracterizado bajo el estado de con-diciones en términos de concentración de la lactosa, las

células, los ácidos, el carbono orgánico total y pH. La cinética de crecimiento se expresó por medio

de una inhibición de múltiples productos y el modelo de interacción incluyendo una novedosa

formula-ción para tener en cuenta el papel de pH. El modelo tiene el potencial para predecir la

tasa de crecimiento de microorganismos en un intervalo amplio de condiciones de funcionamiento,

incluso los que son típicos de la producción de disolventes.

1. introducción

La acetona-butanol-etanol (ABE), la producción por la bacteria Clostridium ACET-obutylicum solía

ser un proceso biotecnológico importante hasta mediados de siglo 20 cuando la ruta petroquímica

de butanol hizo poco rentable (Jones y Woods, 1986). Los recientes avances en el genotipo de

micrófono y de la ingeniería metabólica asociada al nuevo escenario económico de los últimos

veinte años han contribuido a renovar el interés en el proceso de ABE (Cascone, 2008). Para

aumentar la competitividad de la economía en el proceso biológico, la atención se ha centrado en

tres cuestiones principales: i) la mejora de la capacidad metabólica de la industria

solventogenicclostridios por mutación u otros tipos de manipulación genética (Papoutsakis, 2008),

(ii) proceso de intensificación - ción a través de la adopción de configuraciones de reactores

innovadores (Qureshi et al, 2005;.. Nielsen et al, 2010), (iii) el uso de los recursos renovables de

bajo costo como sustratos para la fermentación (Gutiérrez et al, 1998; Ezeji y Blaschek, 2008. ;

Qureshi et al, 2008)..

Como crítica por Jones y Woods (1986), dos vías se han identificado en el metabolismo de las

cepas de clostridios: acidogene-sis, que se caracteriza por la conversión del sustrato en los ácidos

(ácidos acético y BU-tyric) por las altas células móviles (células acidógenos); solventogenesis , que

se caracteriza por la conversión del sustrato y el ácido en disolventes (ABE) por las células

clostridios-forma que no pueden crecer células (solventogenic).el cambio de las dos vías depende

en gran medida del pH y la concentración de los metabolitos-ción. Los estudios sobre la

producción continua de disolventes por medio de las cepas de clostridios confinados en los

reactores - por inmovilización-ción o el reciclaje de células - los datos de producción simultánea de

ácidos y solventes que sugieren que las células acidogénesis y solventogenic coexisten en las

culturas (Mutschlechner et al, 2000;.Huang et al.,

2004; Qureshi y Blaschek, 2005; Tashiro et al, 2005;.Ezeji et al, 2007;.Napoli et al, 2009).. La

producción simultánea de ácidos y solventes, junto con la presencia simultánea de las células,

tanto acidogénesis y solventogenic que la producción ABE pro-ceso de un sistema muy complejo

para ser investigado.

La producción de la EBA por clostridios se ha caracterizado por la adopción de diversas técnicas y

metodologías. El análisis de flujos metabólicos y el análisis de control metabólico han demostrado

ser prisionero de guerra-puede verse mermada en la promoción de herramientas de aplicaciones

de ingeniería genética para modificar la red de regulación con el fin de mejorar el desempeño de

la celda (Vil-ladsen, 2007). Los análisis se basan en un modelo detallado de la red metabólica

celular y se ven complicados por las fuertes interconexiones entre la captación de sustrato /

metabolito / producción. Pero los beneficios de bio-reactor de diseño, escalado y optimización

también puede derivar de los modelos no estructurados, las relaciones simples de las variables

clave. Por otra parte, la caracterización de los dos patrones de bifurcaciones y el comportamiento

dinámico de biorreactores es posible gracias a los modelos ágiles no estructurados (Russo et al.,

2008).

Por lo general, los modelos propuestos en la literatura son caracterizada mediante pruebas de

fermentación llevado a cabo bajo condiciones de proceso por lotes (Jones y Woods, 1986; Yang y

Tsao, 1994). Sin embargo, el peculiar comportamiento de la fermentación por lotes puede

introducir efectos transitorios sobre el crecimiento de las células y el metabolito de producción /

absorción que no sonrepresentante de estado estacionario cultivos continuos, típicamente

adoptadas para mejorar la productividad biorreactor. Por lo tanto, los parámetros del modelo de

proceso por lotes evaluados por las culturas pueden ser diferentes de los parámetros evaluados

por el estado estacionario culturas (Li y Humphrey, 1989), la diferencia es notable cuando los

procesos metabólicos se caracteriza por la inhibición de sustrato / producto (Schröder et al.,

1996 ).

Hay una gran cantidad de literatura sobre la producción de glucosa por ABE clostridios adoptando

como sustrato. La capacidad de las cepas de clostridios a metabolizar la lactosa también está

reportado en la literatura (Qureshi et al, 2005;.. Napoli et al, 2009, 2010). El interés en la hexosa

último tiene que ver con su presencia masiva en el permeado de suero y su eliminación es un tema

crítico para la industria láctea.

El presente estudio da un paso más hacia el personaje-zación de la producción de butanol por C.

acetobutylicum. En consideración de la complejidad de las vías metabólicas y con vistas a obtener

un modelo cinético desestructurado, en el presente estudio la elección se ha hecho para investigar

el comportamiento de las células acidógenos como un primer paso de todo el proceso, las células

acidógenos siendo todavía activo durante la producción de disolventes. La cinética de crecimiento

celular acidogénica en un CSTR operado bajo pH controlado es el foco del presente documento. El

estudio tiene como objetivo proporcionar los modelos y parámetros cinéticos para la producción

de butanol la adopción de una solución de lactosa para imitar suero de queso. La influencia de los

ácidos (acético y butírico), disolventes (acetona, etanol y butanol) y el pH en la tasa de crecimiento

de las células de C. acetobutylicum bajo condiciones de fase acidogénesis se ha abordado. Las

condiciones del proceso que se caracterizan por altas ABE concen-traciones han sido incluidos en

el análisis con el objetivo de ex-tienden el modelo para describir la tasa de crecimiento de células

también bajo condiciones solventogenesis. Un procedimiento específico se ha pro-puesto para

evaluar los parámetros del modelo minimizando el número de pruebas.

2. Materiales y procedimiento

2,1. Microorganismos y la cultura de los medios

C. acetobutylicum DSM 792 fue suministrado por DSMZ. Archivo las culturas se reactivaron de

acuerdo con el método sugerido por el proveedor. Semi-sintético medio de cultivo (Napoli et al.,

2009) fue suministrado con 5 g / L extracto de levadura (YE) y D-lactosa como fuente de carbono.

El medio se esterilizó en autoclave (121 ° C, 20 min).

2,2. Aparato

El reactor fue agitado magnéticamente un recipiente 1 litro (Pyrex) equipado con la temperatura y

controlador de pH. La temperatura se controla por medio de una camisa de agua conectada a un

baño de agua termostático. Ambas corrientes de líquido de entrada y salida se maneja por medio

de bombas peristálticas (GilsonMinipuls 3). El volumen de la fase líquida en el reactor se fijó en 0,6

L.

El pH se ajustó al valor deseado por un controlador (Appli-konBio controlador IDA 1030) equipado

con 1 M de solución de NaOH

tanque. El nitrógeno se roció (10 Nl / h) en la parte inferior del reactor para preservar la condición

anaeróbica.

2,3. Los métodos de análisis

El análisis de muestras de cultivos retirados del quimiostato proporcionado concentración de

biomasa, lactosa y metabolito concentración y el carbono orgánico total (TOC) en la fase líquida.

La célula den-sidad se midió como la absorbancia óptica a 600 nm (OD 600) utilizando un

espectrofotómetro Cary-50 (Varian). Pruebas de calibración de C. ACET-obutylicum masa seca

indicó que un OD 600 = 0,4 gdm / L. El análisis elemento mental de biomasa seca se realizó por

medio de un C / H / N 2000 analizador LECO.

La concentración de las especies solubles se midió en la fase líquida después de la recolección de

células por centrifugación. Concentración de lactosa se midió por medio de un kit enzimático

(Biopharm). Concentraciones de metabolitos se midieron por medio de un cromatógrafo de gases

(GC Agilent 7890A) equipado con un FID y con una columna capilar poraplot Q (25 m 0,32 mm), la

adopción de estándares externos. El TOC se midió mediante un Shimadzu TOC V-CSH analizador.

2,4. Condiciones de funcionamiento y procedimientos

Pre-cultivos se prepara inoculando 2 ml de las células vuelve a activarse en 50 ml de lactosa

suplementado semi-sintético medio y se incubaron durante dos días.

Los cultivos previos se inocularon en el reactor que contiene

0,6 l de medio semisintético que consta de YE y la lactosa en concentración fija. Típicamente,

después de 6 h de cultivo discontinuo la corriente de la lactosa-cojinete se alimentó al reactor a la

tasa de dilución deseada (D). El cultivo se tomaron muestras periódicamente para medir las

concentraciones de biomasa y el metabolito hasta condiciones de estado estacionario se alcanza.

Dentro de cada conjunto de condiciones de funcionamiento, el estado estacionario se caracteriza

en términos de concentración de lactosa, las células y metabolitos, como promedio durante un

largo tiempo de cultivo de 5-6 veces el líquido del espacio-tiempo.

3. Diseño de los experimentos y análisis de datos

3,1. La evaluación de los balances de materiales

La fiabilidad de los datos medidos durante las pruebas se comprobó mediante la evaluación del

cierre de balance de masa de carbono. la

Las pruebas se llevaron a cabo a 35 ° C bajo condiciones anaerobias. La concentración de lactosa

en la corriente de entrada se fijó entre 4 y

50 g / L. La puesta a punto para el controlador de pH se fijó en sonar-Ing valores entre 4,0 y 7,0. La

tasa de dilución se cambió entre

0,05 y 0,77 h 1.

La vasija del reactor y el medio se esteriliza en autoclave. La corriente de gas se esterilizó por

filtración (corte 0,2 LM, Millipore).siguientes suposiciones se hicieron: (i) operación en estado

estacionario, (ii)sólo la vía acidogénica era activa, (iii) la conversión de carbono en CO2 seguido la

ruta de Embden-Meyerhof (Jones yWoods, 1986), iv) la alimentación estériles. En consecuencia, el

balance de masa

sobre carbono lee:

donde rand MW es la masa de carbono fraccional de C. acetobutylicum, MW son el peso

molecular de carbono y la lactosa, respectivamente, X, L y el COT las concentraciones en la fase

líquida de la biomasa, carbono orgánico lactosa y total, respectivamente. El subíndice'' 0 "se

refiere a la alimentación. La precisión de las mediciones se expresa por d define como:

Cabe señalar que el supuesto (ii) fue apoyada por las pruebas, como se informa en la sección de

resultados. Los resultados de las pruebas continuas fueron elaborados teniendo en cuenta la

balance de masa en las células extiende al reactor continuo. Bajo condiciones de estado estable

del equilibrio biomasa lee: