Cristalografia RX

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CRISTALOGRAFIA DE RAYOS X. La cristalografía es la ciencia de los cristales. Esto concierne forma externa, forma interna, crecimiento y propiedades físicas de cristales. La palabra “cristal” proviene del griego krustallas y significa “solidificado por enfriamiento”. Los griegos pensaban que el cuarzo era formado a través de la transformación del hielo por enfriamiento. Originalmente, la cristalografía era puramente descriptiva y fue considerada como una rama de la mineralogía. Posteriormente se dieron cuenta que el estado cristalino no es limitado solo a las sales minerales y que es más bien un estado muy común de la materia. Hacia mediados del siglo XIX la cristalografía llegó a ser una ciencia por derechos propios. Por un largo tiempo se ha pensado que la apariencia externa de un cristal refleja algún orden interno regular de materia. Las primeras referencias de esto se encuentran en el trabajo de Johannes Kepler (1619), Robert Hooke (1665) y Christian Huyhens (1690). Estudiando la birrefringencia de la calcita, huyhens sugirió que sus propiedades ópticas podrían ser explicadas por las reglas que gobiernan el arreglo interno dentro del cristal. La primera Ley cuantitativa de cristalografía (Ley de ángulos constantes) fue prevista en 1669 por Nils Steensen de las mediciones realizadas de los ángulos entre las caras de un cristal de cuarzo. La ley fue formalmente expresada en 1772 por Jean Baptiste Romé de I’lse en su “essai de Cristallographie”. La segunda ley (Ley de índices racionales o simple truncación) fue establecida en 1774 por Abbé René-Just Hauy. Él se dio cuenta que cuando un cristal de calcita se rompía, las piezas obtenidas tenían formas idénticas a las del

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CRISTALOGRAFIA DE RAYOS X.

La cristalografía es la ciencia de los cristales. Esto concierne forma externa, forma interna, crecimiento y propiedades físicas de cristales. La palabra “cristal” proviene del griego krustallas y significa “solidificado por enfriamiento”. Los griegos pensaban que el cuarzo era formado a través de la transformación del hielo por enfriamiento.

Originalmente, la cristalografía era puramente descriptiva y fue considerada como una rama de la mineralogía. Posteriormente se dieron cuenta que el estado cristalino no es limitado solo a las sales minerales y que es más bien un estado muy común de la materia. Hacia mediados del siglo XIX la cristalografía llegó a ser una ciencia por derechos propios.

Por un largo tiempo se ha pensado que la apariencia externa de un cristal refleja algún orden interno regular de materia. Las primeras referencias de esto se encuentran en el trabajo de Johannes Kepler (1619), Robert Hooke (1665) y Christian Huyhens (1690). Estudiando la birrefringencia de la calcita, huyhens sugirió que sus propiedades ópticas podrían ser explicadas por las reglas que gobiernan el arreglo interno dentro del cristal.

La primera Ley cuantitativa de cristalografía (Ley de ángulos constantes) fue prevista en 1669 por Nils Steensen de las mediciones realizadas de los ángulos entre las caras de un cristal de cuarzo. La ley fue formalmente expresada en 1772 por Jean Baptiste Romé de I’lse en su “essai de Cristallographie”.

La segunda ley (Ley de índices racionales o simple truncación) fue establecida en 1774 por Abbé René-Just Hauy. Él se dio cuenta que cuando un cristal de calcita se rompía, las piezas obtenidas tenían formas idénticas a las del cristal original. Asumió que los cristales estaban hechos de paralepipedos idénticos que él llamó “moléculas integrantes”. Esta proposición lleva al hecho de que la posición en el espacio de cada cara de un cristal puede ser descrita por tres números enteros. Las ideas de Hauy fueron refinadas por W.H. Miller, quien introdujo los métodos de geometría analítica en la cristalografía y quien además propuso el sistema de notación que actualmente se usa.

La contribución de auguste Bravais a la cristalografía es particularmente importante. En su trabajo de 1849 “The Lattice Structure of Crystals” estableció el postulado que ha sido base de la cristalografía, el postulado de Bravis: “Dado un punto P en un cristal, existen un número infinito de puntos discretos, sin límite en las tres direcciones del espacio, alrededor de los cuales el arreglo de la materia es el mismo que alrededor del punto P”.

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De este postulado se desprende la noción de un cristal tridimensional entrelazado y todas las consideraciones simétricas involucradas. A la par del trabajo teórico los ingenieros desarrollaban los instrumentos de medición cristalográfica. El primer goniómetro fue elaborado en 1782 por Carangeot.

En los inicios del siglo XX, la cristalografía era puramente axiomática. Los primeros experimentos de difracción de rayos X fueron realizados en 1912 por W. Frienerich y P. Knipping, siguiendo las ideas de M. von Laue. El trabajo de L. Bragg confirmó la precisión del postulado de Bravis. Las medidas de difracción daban pruebas experimentales directas del arreglo regular dentro del cristal.

Los CRISTALES se definen como materiales cristalinos aquellos materiales sólidos cuyos elementos constitutivos (átomos, iones o moléculas) se repiten de manera ordenada y paralela y cuya distribución en el espacio muestra ciertas relaciones de simetría. Así, la propiedad característica del medio cristalino es ser periódico, es decir, que a lo largo de cualquier dirección la materia que lo forma se halla a distancias específicas y paralelamente orientadas. Por tanto, el cristal está formado por la repetición monótona de agrupaciones atómicas paralelas entre sí y a distancias repetitivas especificas formando una red cristalina. En esta red existe una porción del espacio cristalino, denominado celda unitaria.

La técnica actual más eficaz para descubrir la estructura molecular de cualquier compuesto es la difracción de rayos x sobre cristales, un método un tanto complicado, desarrollado durante el siglo XX a tal grado que en 1962 se otorgó el premio Nobel de química a Max Perutz y John Kendrew por haber obtenido la primera estructura. Esta técnica consiste en hacer interferir un haz de rayos X con una agrupación ordenada de moléculas idénticas de proteína, es decir, con lo que se denomina un cristal de proteína. Si se consigue cristalizar una proteína, conocer su estructura es cuestión de meses, de ahí la importancia de la cristalización de proteínas.

La cristalografía de rayos X puede considerarse como una microscopía de muy alta resolución, mediante la cual podemos visualizar estructuras a nivel atómico. A menudo se desconocen los fundamentos de la técnica.

La cristalografía de rayos X ha sido una herramienta fundamental en el desarrollo de muchos campos de la ciencia, y la biología no podía ser menos. Gracias a esta técnica se ha podido averiguar la estructura y el mecanismo molecular y de actuación de moléculas biológicas de origen diverso, como proteínas, ácidos nucléicos, etc. También puede utilizarse en el diseño racional de fármacos. A pesar de estas bondades, y de su importancia y utilidad, desde el mundo de la Biología la cristalografía de macromoléculas se observa a menudo con el respeto que provoca una cierta incomprensión. Se puede avanzar en la comprensión de

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esta disciplina atendiendo a las características de su enunciado: Difracción de rayos X de monocristal.

¿Por qué utilizamos Rayos X?

Para poder visualizar objetos que no podemos detectar a simple vista recurrimos a la utilización de fuentes de radiación electromagnética de una longitud de onda comparable al objeto de estudio que se quiere resolver. Así pues, para visualizar células eucariotas, con un tamaño medio de unos 10 µm, podemos utilizar perfectamente fotones en el espectro visible (0,40-0,75 µm) y microscopios ópticos. Sin embargo, si se trata de visualizar algo menor, como determinados orgánulos celulares como mitocondrias, de tamaño medio 0.5-1.0 µm, o partículas virales (10 a 500 nm), precisaremos de una radiación de menor longitud de onda, como la asociada a los electrones. Este es el fundamento del microscopio electrónico de transmisión, que alcanza resoluciones de hasta 0.05 nm (1 nm es una milmillonésima de metro: 10-9 m). Resolver la estructura tridimensional a nivel atómico supone poder individualizar los átomos que la constituyen. Es decir, que en realidad queremos distinguir distancias interatómicas que están en el rango de 10-10 metros o un Armstrong (Å: 0.1 nm).

Las radiaciones electromagnéticas que se encuentran en esa zona del espectro son precisamente los rayos X. Es decir, que la utilización de los rayos X viene condicionada por el objeto de estudio, ya que pretendemos visualizar distancias interatómicas en macromoléculas. Los rayos X se generan mediante ánodos rotatorios, con longitud de onda fija, o mediante fuentes de radiación de sincrotrón, como la que se está construyendo en Barcelona (ALBA). Estos rayos son dispersados por las nubes electrónicas de los átomos que forman parte del cristal dando lugar a un determinado patrón de difracción.

¿Por qué se utiliza la difracción?

En microscopía óptica se utiliza una fuente de luz visible que incide sobre la muestra y, mediante unas lentes, se reconstituye la imagen del objeto de estudio. Dicho objeto es irradiado con luz y provoca difracción de la radiación incidente en todas las direcciones. La lente recoge, enfoca y magnifica los rayos difractados. Una lente funciona por refracción. Es decir, es capaz de modificar la trayectoria de la luz a medida que pasa sobre ella cambiando su dirección. Ello significa que los rayos parecen proceder de un punto más próximo al que realmente se originan, lo cual supone que visualicemos los objetos que se ven a través de una lente de

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mayor tamaño que el original. Sin embargo, a diferencia de la luz visible, y aunque constituye un área actualmente en desarrollo, los rayos X no pueden ser focalizados con facilidad. Por ello es necesario separar en dos operaciones lo que la microscopía óptica es capaz de realizar de manera simultánea. La primera parte de esta operación consiste en realizar un experimento de difracción.

El experimento de difracción conlleva una penalización seria: la denominada pérdida de la fase. Una onda electromagnética es una función sinusoidal que puede quedar definida de forma vectorial con un módulo, o amplitud, y una fase, o ángulo de dicho módulo. Podemos calcular el módulo, puesto que es proporcional a las intensidades de difracción que pueden medirse, pero desconocemos la fase asociada a cada una de esas intensidades. Perdemos por tanto la componente necesaria para reconstruir la imagen. Así pues, el cuello de botella para resolver la estructura cristalográfica de macromoléculas es la recuperación de la mencionada fase. La fase puede calcularse a partir de modelos, si existe alguna estructura similar, mediante la técnica denominada reemplazamiento molecular. Si no, también se pueden hacer experimentos adicionales empleando átomos pesados que sirven de referencia al modificar las intensidades de difracción. Una vez calculada, al combinarla con los módulos obtenidos a partir de las intensidades recogidas en el experimento de difracción, podemos generar un mapa de densidad electrónica que conducirá a la interpretación del modelo.

¿Por qué se necesitan cristales?

La difracción procedente de una sola molécula es demasiado débil para que pueda medirse. Un cristal es un sólido con estructura interna ordenada de los elementos que lo componen. Todas sus moléculas muestran idéntica orientación en las tres dimensiones del espacio de manera que, al sumarse la contribución de todas ellas, actúa como amplificador de la señal. El grado de orden interno en el cristal determina el máximo ángulo de difracción de los rayos X y por tanto la máxima resolución que la difracción alcanza. Si el cristal está bien ordenado, entonces puede medirse la difracción a ángulos elevados, o alta resolución, obteniéndose una estructura más detallada.

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Cabe mencionar que la cristalografía en sus inicios se limitaba a tratar sobre el aspecto externo de los cristales. La naturaleza del estado cristalino u orden interno no es un hecho tan evidente como la visión de las perfectas caras o formas cristalinas. La primera conexión entre forma externa o caras de un cristal y su orden interno no se realizo hasta el siglo XVII. Más adelante se vio que el orden interno podía existir aunque no hubiera evidencia externa de ello. Como se menciono antes, las relaciones angulares entre las caras de un cristal no quedan afectadas por la simetría de traslación ya que originan desplazamientos tan pequeños que no pueden observarse morfológicamente. Solo las técnicas de rayos X y difracción electrónica permiten su detección.

La cristalografía de rayos X nos proporciona la imagen más adecuada que podemos tener de las estructuras cristalinas. Los métodos de difracción de rayos X constituyen la herramienta más poderosa que se dispone para el estudio de la estructura intima de la materia cristalina, dotando de una extensa base de resultados estructurales a la química, mineralogía y biología. La mayor parte de la información que poseemos de las estructuras internas cristalinas es mediante la técnica de difracción de rayos X.

De Broglie y Tompson cada uno por su cuenta demostraron que era posible difractar la luz. Esta puede ser desdoblada en haces mediante una rejilla de difracción que consiste en una seria de líneas muy cercanas y regularmente espaciadas trazadas en una superficie plana. La difracción de la luz se produce si su longitud de onda es prácticamente la misma que la distancia que hay entre las

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líneas trazadas. La difracción de las ondas electromagnéticas se produce porque los elementos de una rejilla, por llamarlo así, absorben la radiación y actúan a su vez como fuentes secundarias reemitiendo la radiación en todas direcciones. Los rayos X fueron descubiertos accidentalmente por Wilhelm Conrad Rontgen en 1895 cuando experimentaba con la producción de rayos catódicos en tubos de descarga cubiertos de papel negro. Descubrió que el haz de electrones producido en el cátodo incidía en el vidrio del tubo y producía una radiación X de pequeña intensidad. No obstante, Rontgen no llegó a determinar la longitud de onda de ese nuevo tipo de radiación electromagnética. En 1912, el físico alemán Max Von Laue y su equipo, sugirieron que los átomos de un cristal están espaciados a una distancia tan pequeña que les permite servir como elementos de una rejilla de difracción tridimensional para los rayos X.

Los rayos X interaccionan con la materia a través de los electrones que la forman y que se están moviendo a velocidades mucho menores que la de la luz. Cuando la radiación electromagnética X alcanza un electrón cargado éste se convierte en fuente de radiación electromagnética secundaria dispersada, por lo que si se incide un haz de rayos x sobre un cristal, éste choca con los átomos haciendo que los electrones que se encuentren en su trayectoria vibren con una frecuencia idéntica a la de la radiación incidente y actúan como fuentes secundarias de nuevos frentes de onda de rayos X con la misma longitud de onda y frecuencia.

Uno de los primeros ensayos de difracción se realizo con un cristal de CuSO4 al que se le sometió a la acción de los rayos X haciendo que el haz incidiera en una placa fotográfica. El resultado fue la impresión de la placa por una serie de manchas distribuidas geométricamente alrededor de una mancha central grande producida por el haz directo de la cristalografía de rayos X. la disposición de los puntos resultantes depende de las disposiciones relativas de los átomos del cristal (modelo de Laue).

Tras el descubrimiento de los rayos X en 1895 por Rontgen, en 1912 von Laue, basándose en tres hipótesis (que el medio cristalino es periódico, que los rayos X son ondas, y que la longitud de onda de los rayos X es del mismo orden de magnitud que la distancia que se repite en los cristales) confirmó la difracción de rayos X (DRX) y dio la pauta para el comienzo de la ciencia de la cristalografía de rayos X. Poco después, Bragg descubrió que la geometría del proceso de DRX es análoga a la reflexión de la luz por un espejo plano. Así, en una estructura tridimensional, debido a su periodicidad, es posible construir conjuntos de muchos planos que son paralelos entre sí, igualmente espaciados y conteniendo idénticas disposiciones atómicas. El proceso consiste en la dispersión de los rayos X por las nubes electrónicas que rodean a los átomos del cristal originando un patrón de difracción regular (al igual que la estructura atómica del cristal), resultado de la

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interferencia constructiva y destructiva de la radiación dispersada por todos los átomos. Las circunstancias en las que el resultado de esta interferencia es constructivo vienen reguladas por la ecuación de Bragg, que no suministra más información que la dada por las ecuaciones de von Laue, pero si facilita enormemente la interpretación del resultado.

ECUACIONES DE LAUE.

Cuando un cristal difracta rayos X, las ondas dispersadas electromagnéticas reemitidas interfieren entre sí constructivamente sólo en algunas direcciones, es decir se refuerzan, anulándose en el resto. En la figura de abajo los rayos 1 y 2 estarán en fase y por tanto se producirá difracción cuando la distancia AB represente un numero entero de longitud de onda, esto es cuando AB=n, siendo n un numero entero (0,1,2,3,..n)

Para cada n el ángulo es constante y el conjunto de los rayos difractados forma un cono cuyo eje central está formado por una fila de átomos. Ese cono tiene otro simétrico al otro lado del haz incidente. En la figura se representa cada cono formado por un conjunto de haces difractados correspondientes a cada n.

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Así, para que se produzca un haz difractado es necesario que tres conjuntos de conos representantes de tres posibles soluciones de las ecuaciones deban intersectarse a lo largo de tal dirección. Esto sucede en rarísimas ocasiones por lo que en la práctica se utiliza la ecuación de Bragg.

ECUACIÓN DE BRAGG.

Bragg se dio cuenta que los rayos X dispersados por todos los puntos de la red en un plano (hkl) debían estar en fase para que las ecuaciones de Laue se vieran satisfechas y aún más, la dispersión a partir de sucesivos planos (hkl) debían estar asimismo en fase. Para una diferencia de fase igual a cero las leyes de la simple reflexión deben mantenerse para un plano sencillo y la diferencia de camino para

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reflexiones de planos sucesivos debe ser un número entero de longitudes de onda.

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GENERADORES DE RAYOS X.

Los rayos X que más interesan en el campo de la cristalografía de rayos X son aquellos que disponen de una longitud de onda próxima a 1 ángstrom (los denominados rayos X “duros”) y corresponden a una frecuencia de aproximadamente 3 millones de THz (tera-herzios) y a una energía de 12.4 keV (kilo-electrón-voltios), que a su vez equivaldría a una temperatura de unos 144 millones de grados. Estos rayos X se producen en los laboratorios de cristalografía o en las llamadas grandes instalaciones de sincrotrón.

GENERADORES DE TUBO.

Los equipos que se utilizan en los laboratorios de cristalografía para producir estos rayos X son relativamente sencillos. Disponen de un generador de alta tensión (unos 50.000 voltios) que se suministra al llamado tubo de rayos X, que es realmente donde se produce la radiación.

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Esos 50 kV se suministran como diferencia de potencial (alto voltaje) entre un filamento incandescente (por el que se hace pasar una corriente i de bajo voltaje, unos 5 A a unos 12 V) y un metal puro (normalmente cobre o molibdeno), estableciéndose entre ambos una corriente de unos 30 mA de electrones libres. Desde el filamento incandescente (cargado negativamente) saltan electrones hacia el ánodo (cargado positivamente) provocando, en los átomos de este último, una reorganización electrónica en sus niveles de energía. Este es un proceso en el que se genera mucho calor, por lo que los tubos de rayos X deben estar muy refrigerados.

GENERADORES DE ÁNODO ROTATORIO.

Una alternativa a los tubos convencionales son los llamados generadores de ánodo rotatorio, en los cuales el ánodo, en forma de cilindro, se mantiene con un giro continuo, consiguiendo con ello que la incidencia de los electrones se reparta por la superficie del cilindro y así se puedan obtener potencias mayores de rayos X.

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El restablecimiento energético del electrón anódico que se excitó, se lleva a cabo con emisión de rayos X con una frecuencia que corresponde exactamente al salto de energía concreto que necesita ese electrón para volver a su estado inicial. Estos rayos X tienen por tanto una longitud de onda concreta y se conocen con el nombre de radiación característica. Las radiaciones características más importantes en cristalografía de rayos X son las llamadas LINEAS K-ALPHA (KA), donde los electrones caen a la capa mas exterior del átomo (mayor energía de ligadura). Sin embargo, además de estas longitudes de onda, muy próximas entre sí, y que se denomina radiación continua, debido al frenado por el material de los electrones incidentes y es característica del material anódico.

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SINCROTÓN.

En las grandes instalaciones de sincrotón, la generación de rayos X es distinta. Una instalación sincrotónica contiene un anillo muy grande (del orden de kilómetros) por el que se hacen circular electrones a altísima velocidad en el interior de canales rectilíneos que de vez en cuando se quiebran para adaptarse a la curvatura del anillo. A estos electrones se les hace cambiar de dirección para pasar de un canal a otro usando campos magnéticos de gran energía. Y es en ese momento, en el cambio de dirección, cuando los electrones emiten una radiación muy energética denominada radiación sincrotónica. Esa radiación está compuesta por un continuo de longitudes de onda que abarcan desde las microondas hasta los llamados rayos X duros. Los rayos X que se obtienen en las instalaciones de sincrotón tienen la gran ventaja de modular la longitud de onda.

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MÉTODOS DE DIFRACCIÓN DE RAYOS X.

A partir de las medidas de las posiciones de las manchas de difracción en una película fotográfica se pueden determinar las dimensiones de una celda unitaria. Para la deducción del sistema cristalino debe determinarse la simetría del patrón de difracción. Ausencias sistemáticas de ciertos tipos de reflexiones evidencian la presencia de celdas unitaria no primitivas, de planos de deslizamiento, de ejes helicoidales que ayudará a deducir los grupos espaciales. Los métodos experimentales de difracción de rayos X más utilizados son los siguientes:

EL MÉTODO DE LAUE.

Históricamente este fue el primer método de difracción. Utiliza un haz de policromático de rayos X que incide sobre un cristal fijo; por ello, el ángulo de Bragg es invariable para cada uno de los planos hkl. De este modo, el cristal genera un conjunto de haces que representan la simetría interna del cristal. En estas condiciones, y teniendo en cuenta la ley de Bragg, las ctes. del experimento son los espaciados d y la posición del cristal respecto al haz incidente, y las variables don la longitud de onda y el entero n, así que cada haz difractado corresponderá al primer orden de difracción (n=1) de una cierta longitud de onda, al segundo orden (n=2). Por lo tanto, el diagrama de Laue es simplemente una proyección estereográfica de los planos del cristal. Cada uno de estos conjuntos de planos de espaciado dhkl satisface la ecuación de Bragg para un determinado valor de longitud de onda. Así, cada haz difractado tiene distinta longitud de onda.

Existen dos variantes del método de Laue:

a) Por TRANSMISIÓN, en la que el haz de rayos X incide sobre el cristal y los haces transmitidos y difractados por él se recogen sobre una película.

b) Por REFLEXIÓN hacia atrás: en este montaje, la película se sitúa entre la fuente de rayos X y el cristal. Por un orificio practicado en la película pasa un colimador que selecciona un pincel de rayos X que incide sobre el cristal; y la película recoge los haces difractados hacia atrás.

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MÉTODO DEL CRISTAL GIRATORIO.

La limitación más grande del método de Laue es el desconocimiento de la longitud de onda de rayos X que se difractan para dar un determinado punto en el diagrama. Según la Ley de Bragg al fijar el valor de la longitud de onda, no hay otra posibilidad para un determinado espaciado de cristal que modificar el ángulo. Esto se consigue haciendo un montaje del cristal que permita su giro, en torno a un eje coaxial, a una película cilíndrica que se sitúa en su alrededor. Así, para un valor discreto de ángulo que satisface la ecuación, se produce un haz de rayos X que marcara un punto en la película.

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MÉTODO DE WEISSENBERG.

Está basado en la cámara del mismo nombre, desarrollada por K. Weissenberg (1924). Consta de un cilindro metálico que contiene en su interior una película fotográfica sensible a los rayos X. el cristal se monta sobre un eje coaxial con dicho cilindro y se hace girar según el modelo de Ewald, de tal modo que los puntos recíprocos que intersectan la superficie de la esfera de Ewald son los responsables de los haces de difracción. Estos haces generan un ennegrecimiento (mancha) sobre la película fotográfica. El tipo de diagramas Weissenberg que se obtienen del modo descrito se denominan de rotación o de oscilación, dependiendo de que el giro de cristal sea de 360° o parcial (aprox. 20°), respectivamente. El montaje del cristal debe ser tal que su eje de giro coincida con un eje directo de la celda elemental. De este modo, por definición de la red reciproca, existirán plano recíprocos perpendiculares a dicho eje.

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MÉTODO DE PROCESIÓN.

El método de procesión fue desarrollado por Martin J. Buerger, a principios de la década de 1940, como alternativa muy ingeniosa para poder impresionar placas fotográficas de planos recíprocos sin distorsionar. Al igual que el método de Weissenberg, se trata de un método en el que el cristal se mueve, pero el movimiento del cristal (y como consecuencia el de los planos recíprocos solidarios) es como el de precesión de los planetas, de ahí su nombre. La película fotográfica se coloca sobre un soporte plano y se mueve solidariamente con el cristal. El cristal debe orientarse de tal modo que el plano reciproco que se desee recoger sea perpendicular al haz directo de los rayos X, es decir, que un eje directo coincida con la dirección de los rayos X incidentes.

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Este tipo de programas son mucho más simples de interpretar que los de Weissenberg, ya que muestran el aspecto de un plano reciproco sin distorsión. La separación de un plano reciproco sin distorsión. La separación de un plano recíproco determinado se consigue mediante el uso de pantallas que seleccionan los haces difractados de dicho plano. Del mismo modo a como ocurre en el caso de Weissenberg, se pueden medir las distancias recíprocas y las intensidades de difracción. Sin embargo, aquí es mucho más fácil observar los elementos de simetría del espacio reciproco.

ESPECTROPOLARIMETRÍA.

La polarización es una característica fundamental de la radiación, además de su intensidad y color. En el contexto astrofísico, la polarización de la luz es importante porque codifica las anisotropías de los objetos que la emiten y del propio campo de radiación y lleva información cuantitativa sobre los campos magnéticos presentes en los mismos. La espectropolarimetría es una técnica muy potente porque abarca todos los análisis y medidas posibles que se pueden hacer a la radiación electromagnética, así como su interacción con la materia. Este libro es una amplia introducción a la espectropolarimetría, y contiene una descripción de la polarización de la luz, así como de las posibles técnicas para poder medirla en los telescopios. Dado que es una técnica muy extendida en la física solar moderna, este libro nos acerca a la espectropolarimetría solar a través del transporte de la radiación polarizada en atmósferas estelares y de la formación de líneas espectrales en el seno de un campo magnético. El formalismo de este libro se centra en el contexto clásico, aunque se dan varias pinceladas en el formalismo cuántico.

La Espectropolarimetría es la ciencia de la medida de la polarización de la luz precedente de los objetos celestes en un ancho de banda lo más estrecho posible con un polarímetro convencional. Los principios son los mismos que los del polarímetro convencional, si bien las longitudes de onda medidas son aisladas con un espectrógrafo en vez con filtros. La Espectropolarimetría es utilizada para medir el campo magnético de las estrellas a partir del efecto Zeeman y para estudiar el origen de las líneas espectrales. El efecto Zeeman es muy importante en aplicaciones como: espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), la espectroscopia de resonancia electrónica de spin y espectroscopia Mössbauer, así

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como en la Espectropolarimetría. También puede ser utilizado para mejorar la precisión en la espectroscopia de absorción atómica.

La polarimetría consiste en medir la actividad óptica a una sola longitud de onda, mientras que la Espectropolarimetría se basa en medir dicha actividad óptica en función de la longitud de onda, dando lugar a un espectro, a partir del cual puede obtenerse información acerca de la propia estructura de la molécula activa.

En general se puede decir que la Espectropolarimetría es la medición de los espectros ópticos acoplados con polarización de la luz. La Espectropolarimetría tiene la ventaja de que se puede averiguar el estado de polarización de las líneas espectrales, a la vez que permite discriminar con mayor precisión entre las causas que producen la dependencia de la polarización con la longitud de onda.

Existen numerosas sustancias que provocan la rotación, de forma característica del plano de una radiación polarizada. Se dice que estas sustancias son ópticamente activas o que poseen poder óptico rotatorio y se caracterizan por su asimetría molecular o cristalina. El ángulo de rotación del plano de la radiación polarizada varía mucho de un compuesto activo a otro. Para un compuesto dado, el ángulo de rotación depende del número de moléculas que atraviesa la radiación o, en el caso de disoluciones, de la concentración y de la longitud del recipiente. La rotación es también función de la longitud de onda de la radiación y de la temperatura. La polarimetría consiste en la medida de la act. óptica a una solo longitud de onda (generalmente a 589 nm, la línea D de la lámpara de sodio), mientras que la espectropolarimetría se basa en medir la actividad óptica en función de la longitud de onda, dando un espectro. La información estructural que proporciona la espectropolarimetría es muy superior a la dada por la polarimetría. La variación de la rotación óptica con la longitud de onda se conoce como dispersión óptica rotatoria (DOR).

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La mayor parte del trabajo observacional en Astrofísica ha venido realizándose primordialmente a partir de la "intensidad" (I) de la radiación recibida del plasma astrofísico en estudio en función de la longitud de onda. Sin embargo, un aspecto muy importante con frecuencia olvidado de la radiación electromagnética es su estado de "polarización", el cual está relacionado con la orientación del campo eléctrico de la onda. El estado de polarización puede caracterizarse convenientemente mediante cuatro cantidades que pueden ser medidas acoplando un polarímetro a nuestros telescopios. Estas cantidades "observables" son los cuatro parámetros de Stokes (I,Q,U,V) en función de la longitud de onda. Una definición rápida e intuitiva del significado de estos cuatro parámetros, que fueron formulados por Sir George Stokes en 1852 e introducidos en el mundo de la Astrofísica por el Premio Nobel Subrahmanyan Chandrasekhar en 1946, puede verse en el cartel anunciador de la duodécima Escuela de Invierno sobre Espectropolarimetría en Astrofísica.

En los laboratorios de Física, las señales de polarización que se observan en experimentos donde el campo magnético es conocido de antemano son utilizadas para obtener información sobre la estructura atómica y molecular. En Astrofísica, el problema es el inverso: el campo magnético es el gran desconocido, pero el punto importante es que podemos obtener información sobre el mismo si

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aprendemos a interpretar correctamente observaciones espectropolarimétricas, haciendo uso de nuestro conocimiento de la Física Atómica y Molecular.

A pesar de que aún sabemos muy poco de ellos, no cabe duda de que los campos magnéticos desempeñan un papel fundamental en el Universo (véase, por ejemplo, el vídeo de la conferencia impartida por Sir Martin Rees en la reunión ``Key Problems in Astronomy’’, la cual tuvo lugar en 1995, en Tenerife). Los campos magnéticos son importantes en diversos y variopintos contextos astrofísicos; por ejemplo, en los núcleos activos de galaxias, en las estrellas de neutrones, en los agujeros negros que pueblan el Universo, en las regiones de formación estelar, en las atmósferas del Sol y de otras estrellas, etc. Tanta es la fascinación que suscitan y el misterio que esconden que Henk van de Hulst escribió: ``Magnetic fields are to astrophysicists what sex is to psychoanalysts’’ (Los campos magnéticos son a los astrofísicos lo que el sexo a los psicoanalistas). Otro famoso físico, R. Leighton, escribió hace tiempo: "If the Sun did not have a magnetic field, it would be as uninteresting a star as most night-time astronomers believe it to be’’. (Si el Sol no tuviera campo magnético, sería una estrella tan poco interesante como la mayoría de los astrónomos nocturnos creen que es).

Aunque la importancia de la información que contiene la polarización de la radiación electromagnética es algo que viene reconociéndose en Física Solar desde hace décadas, donde la resolución espacial y el cociente señal/ruido en observaciones espectroscópicas son mucho más favorables que en observaciones nocturnas, en los últimos años desarrollos en Astrofísica Teórica y en instrumentación astronómica (telescopios con grandes superficies colectoras de fotones y novedosos espectropolarímetros) están llevando a un número cada vez mayor de astrofísicos a saber apreciar el enorme potencial de diagnóstico que nos ofrece la Espectro-polarimetría. De hecho, hoy ya parece existir acuerdo en que la polarización de la luz es la clave para facilitar nuevos descubrimientos y para poder obtener la información que necesitamos con vistas a entender la física de muchos de los sistemas que acontecen en el Universo. Ejemplos particularmente relevantes, más allá del caso del plasma magnetizado solar o el de las estrellas Ap y Bp, lo constituyen los objetos estelares jóvenes y sus discos circundantes, los objetos Herbig-Haro, las estrellas simbióticas, los vientos estelares de estrellas calientes, los núcleos activos de galaxias, las radiogalaxias, los agujeros negros, el medio interestelar, la radiación de fondo de microondas y sus implicaciones cosmológicas, etc.

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Los mecanismos físicos que pueden generar polarización en un punto dado de un plasma astrofísico son numerosos y variopintos: el efecto Zeeman debido a la acción de un campo magnético (el cual da lugar a un desdoblamiento de los niveles atómicos y moleculares), procesos de dispersión Thomson, Rayleigh y/o Raman, el efecto Hanle, polarización en líneas moleculares y su amplificación en máseres astronómicos, polarización debida a la existencia de granos de polvo alineados, radiación ciclotrón producida por electrones que se mueven en trayectorias espirales alrededor de las líneas de fuertes campos magnéticos, radiación sincrotrón debida a electrones relativísticos, etc. Tales señales de polarización que pueden generarse en cada punto del plasma astrofísico en consideración son con frecuencia fuertemente modificadas debido a procesos de transporte radiativo en el mismo. Todos estos mecanismos físicos dejan su huella en la polarización de la radiación que llega a nuestros telescopios. El primer objetivo es lograr medir con precisión el grado de polarización de la radiación que recibimos del objeto astrofísico en estudio, lo cual no es tarea fácil pues, en general, las señales polarimétricas son muy débiles. Una vez que se ha logrado cuantificar correctamente el grado de polarización (idealmente para cada longitud de onda), uno tiene entonces que aplicar técnicas de diagnóstico de plasmas desarrolladas para lograr extraer la información que está codificada en la polarización de la radiación. Tales técnicas de diagnóstico están basadas en la teoría de la generación y transporte de radiación polarizada en plasmas magnetizados.

La Espectropolarimetría puede proporcionar pistas decisivas sobre los procesos físicos que gobiernan el comportamiento de un plasma astrofísico concreto y resulta muy útil a la hora de seleccionar entre varios modelos teóricos competitivos. Además de permitirnos la realización de estudios sobre magnetismo en Astrofísica, puede ayudarnos a averiguar la geometría del sistema astrofísico en estudio incluso sin tener la posibilidad de resolverlo espacialmente.

La Espectropolarimetría en Astrofísica tiene una naturaleza multidisciplinar, ya que requiere conocer y combinar suficientemente bien varias áreas de la Física y la Tecnología. La Física Atómica y Molecular es necesaria para conocer a fondo los mecanismos físicos que pueden generar polarización; el Transporte Radiativo y la Matemática Aplicada son claves para poder realizar simulaciones numéricas del proceso de generación y transporte de radiación polarizada; la Óptica y la Electrónica resultan vitales para lograr construir espectro-polarímetros capaces de detectar señales de polarización de muy baja amplitud; y la Astrofísica Teórica y

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Observacional resultan indispensables para lograr identificar, con visión de futuro, los problemas claves en Astronomía donde es de esperar que la Espectropolarimetría dé lugar a nuevos avances.

La duodécima Escuela de Invierno del IAC sobre Espectropolarimetría en Astrofísica aparece en un momento en el que existe un enorme y creciente interés por el tema. Este creciente interés se debe principalmente a las nuevas oportunidades observacio-nales que comienzan ahora a ser posibles gracias a la nueva generación de telescopios con espejos de 10 metros de diámetro. Algunos de estos grandes telescopios han sido recientemente inaugurados en algunos de los mejores observatorios del mundo, mientras que otros están actualmente en construcción. Un ejemplo lo constituye el Gran Telescopio Canarias (GTC), el primer proyecto de Gran Ciencia liderado completamente por España.

Debido a la gran superficie colectora de este tipo de telescopios, al desarrollo de espectropolarímetros capaces de cuantificar con precisión el estado de polarización de la luz y a recientes avances sin precedentes en el campo de la Astrofísica Teórica y Numérica, la Espectropolarimetría esta poco a poco emergiendo como una nueva y poderosa herramienta de diagnóstico de las condiciones físicas y de los campos magnéticos en el Universo. La relevancia del tema radica en las nuevas posibilidades que la Espectropolarimetría ofrece a los astrofísicos para dar lugar en las próximas décadas a nuevos y revolucionarios avances en Astrofísica mediante la observación e interpretación teórica rigurosa de la polarización de la radiación que recibimos de plasmas astrofísicos.

Si bien la Espectropolarimetría continúa dando lugar a nuevos descubrimientos en Física Solar, su aplicación al mundo de las estrellas, medio interestelar y galaxias está aún en su fase inicial de desarrollo. Esto la hace especialmente atractiva para jóvenes investigadores deseosos de contribuir al avance de la Astrofísica trabajando en el marco de una disciplina relativamente poco explotada y donde existen todavía muchas oportunidades de ser pioneros. En esta disciplina se dan cita la Astrofísica Teórica y Numérica y la Astrofísica Instrumental y Observacional, y en ella la "nueva ventana al Universo’’ la ofrece la posibilidad de lograr nuevos descubrimientos mediante la interpretación rigurosa de observaciones espectro-polarimétricas, lo cual proporciona una información imposible de lograr mediante la espectroscopía convencional.

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En definitiva, hemos organizado esta escuela internacional con el deseo de lograr una introducción sin precedentes al campo de la Espectropolarimetría en Astrofísica, con vistas a facilitar que jóvenes investigadores se animen a investigar en profundidad y con rigor el "Universo Polarizado’’. Nuestra motivación ha estado basada en nuestra convicción de que lo que estamos logrando hacer hoy gracias a la Espectropolarimetría teórica y observa-cional en Física Solar, empezará pronto a ser posible también en otros campos de la Astrofísica. En España tenemos todas las condiciones para lograrlo debido en parte a la llegada de los grandes telescopios, a la participación de nuestro país en proyectos internacionales como el interferómetro ALMA y a nuestra participación en el desarrollo de telescopios espaciales como FIRST y PLANCK.

DICROISMO CIRCULAR.

El dicroísmo circular es una técnica de espectroscopía de absorción electrónica, basada en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada.

La teoría de dicroísmo circular fue desarrollada por Biot Neumann y Fresnel Snatzke (1990).

Fundamentos

Un haz de luz polarizado es aquel que tiene su vibración electromagnética en un solo plano.

Un haz de luz polarizado circularmente, se obtiene girando el plano de polarización de forma continua y en un solo sentido alrededor del eje de propagación de la fase luminosa. Así, el campo eléctrico de una onda polarizada circular derecha (ED), se puede comparar con una hélice que gira alrededor de la dirección de la propagación.

Igualmente, una componente circular izquierda (EI), constituye una hélice que gira alrededor de la dirección de propagación en la dirección opuesta a ED. Si ED gira en el sentido de las manecillas del reloj y EI gira en sentido inverso, ambas con una frecuencia tal que los dos vectores formen un ángulo idéntico, su resultante E corresponde al movimiento de la onda polarizada en un plano, en la cual el campo eléctrico oscila siguiendo la dirección del eje de las x.

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Se puede considerar entonces a una onda polarizada en el plano, como la superposición de una onda polarizada circular derecha y una onda polarizada circular izquierda, ambas de la misma frecuencia.

Cuando un haz de luz polarizado, incide sobre una muestra en la cual el rayo circularmente polarizado a la derecha es absorbido de una manera distinta al rayo circularmente polarizado a la izquierda, se da el fenómeno de dicroísmo circular.

Como consecuencia de la diferencia de absorción entre EI y ED, la longitud del vector

EI es distinto a la longitud del vector ED y la resultante E no describe una circunferencia, sino una elipse; la velocidad del componente EI es diferente de la de ED

(Frensel 1825), de esta manera, la interacción de la radiación con la muestra induce un desfasamiento y un cambio de magnitud diferencial en ambos componentes originalmente polarizados circularmente, y estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo y la distorsión de este plano genera una elipse. La rotación del plano y la diferencia en la absorción de los componentes circularmente polarizados, varían con la longitud de onda. Se puede graficar la rotación o elipticidad contra la longitud de onda.

Biot planteó una relación entre el poder rotatorio específico y la longitud de onda como

Donde A es la absortividad molar.

*Esa “ro” siempre está un poco estilizada para denotar poder rotatorio específico y no confundir con densidad es como una “ro” manuscrita.

Más tarde Drude (Fisico Alemán que hizo una gran labor introduciendo las teorías de Maxwell en Alemania) planteó una mejor aproximación:

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La diferencia entre los coeficientes de absorción 1 y D para la luz polarizada circular derecha e izquierda respectivamente, no constituye más que una fracción ínfima del valor del coeficiente de absorción:

Por tanto, experimentalmente se encuentra que la elipse generada, normalmente es muy alargada.

Unidades comúnmente empleadas en dicroísmo circular como técnica espectroscópica

En espectroscopia de dicroísmo circular (DC) la diferencia de absortividad molar entre las dos componentes circularmente polarizadas de la luz (), se expresa como la elipticidad molar [], siendo el ángulo de elipticidad ( = arcotangente del cociente del eje menor entre el eje mayor de la elipse)

Así, la absorción dicroica diferencial está definida como

Donde I y D son los coeficientes de extinción molar para los rayos izquierdo y derecho respectivamente.

La elipticidad molar [] está relacionada con la absorción dicroica diferencial , por

[]= 3300•

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Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250-350 nm) y lejano (180-250 nm) de la radiación electromagnética.

Las señales en la región del UV cercano son extremadamente sensibles a los cambios en la conformación en una molécula.

Dado que la espectroscopía de dicroísmo circular es una técnica de absorción electrónica, también hablamos de grupos cromóforos.

Interpretación de espectros de DC

Como ya se ha discutido, una molécula quiral (la que carece de eje de rotación impropio), exhibe dicroísmo circular. Es decir, la molécula tiene coeficientes de absorción diferentes para la luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda a una longitud de onda dada.

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Un espectro de dicroísmo circular es una representación de la diferencia de los coeficientes de absorción molar para la luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda frente a una longitud de onda dada.

Los enantiómeros tendrán espectros DC que serán imágenes especulares uno del otro.

Los espectros de DC se pueden comparar con espectros de absorción convencionales para apreciar cosas que no se alcanzan a ver en los últimos.

Con espectroscopía DC se pueden identificar las configuraciones absolutas de los compuestos quirales por comparación, ya que la misma configuración absoluta de dos compuestos con configuraciones electrónicas semejantes, darán espectros DC del mismo signo. También se puede comparar con un espectro teórico obtenido mediante cálculos de densidad electrónica.

Equipos para obtención de espectros de DC

La característica más importante de un Espectropolarímetro de Dicroísmo Circular, es que debe contar con una fuente de luz polarizada.

En general un espectrofotómetro de dicroísmo circular cuenta con un generador de radiación (fuentes de carburo de silicio), que inicialmente se filtra y luego se polariza.

Esta pasa por un modulador fotoelástico que consiste en un material que se comprime y expande para producir radiación circularmente polarizada (generalmente un cristal de selenuro de zinc) la cual incide sobre la muestra bajo estudio, (disuelta generalmente en tetracloruro de carbono o en deuterocloroformo), colocada en una celda con ventanas de materiales estables (como BaF2).

La radiación que emana de la celda pasa a un detector que proporciona los espectros de dicroísmo circular.

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Originalmente el dicroísmo circular se medía con el dicrógrafo de Roussel-Jouan.

La rotación del plano y la diferente absorción de los componentes circularmente polarizados varían de acuerdo con la longitud de onda, pudiéndose obtener espectros de estos fenómenos, esto es, gráficas de la rotación o elipticidad versus la longitud de onda.

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Transiciones electrónicas:

Las bandas observadas en los espectros de absorción y de CD de macromoléculas en solución corresponden principalmente a las transiciones electrónicas entre los niveles vibracionales más bajos y diversos niveles vibracionales en el primer estado excitado.

Una transición electrónica se produce porque el campo eléctrico de la radiación, el magnético o ambos inducen a los electrones a un nuevo estado de energía. El efecto del campo eléctrico es un rearreglo lineal de los electrones llamado “momento dipolar eléctrico de la transición” y se denota por el vector µ. La dirección de µ es la misma que la del dipolo de polarización, esto es la dirección en la cual los electrones son empujados. El campo magnético induce un rearreglo circular de la densidad electrónica llamado “momento dipolar magnético de transición, m”

En una molécula aquiral la redistribución neta de electrones se da siempre en el plano, pudiendo ser lineal (µ≠0; m=0) o circular (µ=0; m≠0), pero también puede darse que ambos momentos sean diferentes de 0 y en este caso el rearreglo es en una espiral. En una molécula quiral, el rearreglo de electrones durante una transición es siempre helicoidal.

Si la hélice formada por el movimiento de electrones es hacia la derecha (dextrógira), es más fácilmente inducida por luz polarizada hacia la izquierda, y se observa una señal positiva de CD; mientras que si es hacia la izquierda, se induce más fácilmente por luz polarizada hacia la derecha, y la señal es negativa. Esto es debido a que el vector del campo eléctrico de la luz interactúa con µ, y simultáneamente el vector del campo magnético de la luz interactúa con m.

Estos dos sistemas aromáticos tienen 6 anillos fusionados, en el primero son coplanares entre si y en el segundo, uno de los anillos esta en otro plano (el anillo 1 no está unido al 6). Si se mira desde arriba, el primero sería como una dona, y el

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segundo como un fracción de hélice. En la molécula aquiral (la primera) hay una distribución plana de los electrones, confinada en dos planos, uno por arriba de la molécula y otro por debajo, mientras que en la quiral (la segunda), la distribución de los electrones es helicoidal. Entonces, tenemos que para el primer caso, el momento dipolar eléctrico es cero (se anulan) y el momento dipolar magnético resultante es un vector hacia arriba (por la regla de la mano derecha). En el segundo caso, tanto el momento dipolar eléctrico como el magnético son diferentes de cero. Ambos vectores están dirigidos hacia arriba. El producto escalar de µ.m es también distinto a cero lo que implica que ambos vectores no son perpendiculares.

Para que una transición sea permitida en CD (para que una sustancia absorba en CD) debe inducirse una circulación helicoidal de corriente, es decir, que el producto escalar entre los momentos dipolares sea distinto de cero. Esto es lo que se conoce como las reglas de selección de CD.

Formas de análisis de los espectros de CD:

Para una colección de moléculas quirales, se espera observar una señal de CD si los fotones de luz que inciden sobre la muestra tienen la energía suficiente para causar la transición.

La ecuación que resume los requerimientos de paralelismo entre µ y m para un movimiento de electrones helicoidal necesario para CD es la ecuación de Rosenfeld:

R= Im {µ . m}

R es la intensidad de CD para la transición en una colección de moléculas quirales orientadas al azar. Se le conoce como la fuerza de CD o fuerza rotacional. Im significa “la parte imaginaria de”.

Los métodos para el análisis de los espectros de CD son:

Métodos empíricos: Se basan en la comparación con otros sistemas. La mayoría de las aplicaciones de CD involucran análisis espectrales cualitativos y/o empíricos. Por cualitativo se entiende que es la observación: cuando se hace determinado cambio (aumento o disminución de la Tº, etc), se observa dicho cambio en el espectro de CD. Si el análisis es cuantificado midiendo el cambio en el espectro de CD en función de la concentración, temperatura, fuerza iónica, etc, y/o comparando con otro sistema relacionado (tanto espectroscópicamente como estructuralmente), entonces se trata de un análisis empírico.

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Ab initio: Se basan en cálculos a partir de la ecuación de Rosenfeld. Estos cálculos requieren mucho trabajo para asegurar que sean confiables, y generalmente solo sirven para un determinado sistema.

Análisis Cromofórico: La característica principal de un cromóforo como grupo funcional, es que puede ser considerado como una subunidad bien definida espectroscópicamente dentro de una molécula que es muy poco perturbada por el resto del sistema. Un cromóforo aquiral aislado no tiene CD intrínseco, por lo que se puede deducir el CD inducido en una la transición particular del medio que rodea al cromóforo.

Dado que los cromóforos son aquirales, m=0, µ=0 o µ y m son perpendiculares entre sí. La transición m=0,

µ ≠ 0 se llama dipolo eléctrico permitido, dipolo magnético prohibido. La transición m≠0, µ=0 es dipolo magnético permitido, dipolo eléctrico prohibido. La intensidad de CD es inducida por los dos tipos de transiciones, la primera (m=0, µ ≠ 0) requiere la inducción de la componente magnética, mientras que la segunda (m≠0, µ=0), la de la componente eléctrica. Dependiendo de cual componente sea inducida se podrán determinar aspectos de la geometría de la molécula.

Cromóforo Amida:

El enlace peptídico posee una rotación limitada respecto al enlace O=C-NH debido a su carácter parcial de doble enlace que resulta de la deslocalización de un par de electrones no enlazante del átomo de nitrógeno. Por lo tanto no es ópticamente activo por sí mismo, pero el entorno quiral en el que se encuentra hace que pueda ser detectado por CD.

Hay dos enlaces con rotación permitida: R-Cα-NH determinado por el ángulo Φ y O=C-Cα-R determinado por el ángulo Ψ. Las diferentes estructuras secundarias que se encuentran en péptidos y proteínas se definen según los valores de estos dos ángulos diedros del esqueleto polipeptídico, por lo que son los responsables de los espectros de CD particulares de los diferentes elementos de estructura secundaria (α-hélice, lamina β, etc).

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La transición π π* es la de mayor energía porque se pasa de un orbital enlazante a uno antienlazante y se observa como un pico positivo a 190nm; la transición n π* es de menor energía ya que se pasa de un orbital no enlazante a uno antienlazante, y se visualiza como un pico negativo centrado a 220nm

El cromóforo Fenilalanina

La cadena lateral de la Phe tiene un alto grado de simetría por lo que absorbe uy débilmente. El espectro tiene 4 bandas vibracionales que pueden ser positivas o negativas y tienen diferentes intensidades.

En el espectro de CD de una proteína, la estructura vibracional de la Phe puede observarse cuando la proteína está plegada.

Debido al alto grado de simetría, la Phe tiene el menor coeficiente de extinción molar, y en consecuencia la menor fuerza rotacional de los 3 aa aromáticos. Phe es también el a.a. menos sensible a los cambios en el entorno debido a que la transición es insensible al cambio en la polaridad del solvente.

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El cromóforo Tirosina

Es más asimétrico que la Phe, por lo que las bandas son más intensas. Las bandas vibracionales tienen todas el mismo signo.

En una proteína plegada, el espectro de absorción de este aa está compuesto por bandas anchas superpuestas, y el pico principal está a 276nm con un hombro a 283nm.

La Tyr es capaz de formar puentes de H, lo que disminuye su energía de transición del estado basal al excitado y lleva a un corrimiento del espectro hacia el rojo. La posición del pico de la Tyr puede dar indicios sobre el entorno de la misma.

El cromóforo Triptófano

El Trp absorbe mucho más intensamente que los otros aa aromáticos, sin embargo en una proteína suele haber más residuos de Tyr, por lo que la contribución de ambos al espectro suele ser similar.

El cromóforo Puente disulfuro

Este cromóforo resulta de la unión covalente de dos Cys de una proteína. Aunque la absorción de este enlace es débil, la intensidad de la banda en el espectro de CD puede ser fuerte. Sin embargo, la contribución al espectro de CD de este cromóforo está siempre bajo los cromóforos aromáticos.

La contribución del cromóforo disulfuro al UV cercano es un pico que puede ser positivo o negativo, entre 250 y 300nm, sin bandas vibracionales distinguibles.

Espectro de dímeros en CD

Si dos cromóforos son idénticos o muy parecidos y están muy cerca pero no en el mismo plano, se va a ver un acoplamiento significativo en las transiciones de ambos que se dan a la misma energía (E): los µ de estas transiciones tienen igual modulo, pero distinta orientación y sentido por lo que se acoplan para dar una de las dos hélices según se encuentren en fase o desfasados, por lo que en el espectro de CD se espera observar dos picos. Las dos hélices que se formen tendrán igual magnitud, pero señal de signo opuesto en el espectro de CD y

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energías muy cercanas a E, por lo que se verá un espectro con dos picos, uno negativo y uno positivo.

El ejemplo más simple es el de los anillos bifenilos: estos no son coplanares y dependiendo de los sustituyentes que tengan van a adoptar una orientación determinada. Los anillos A y C son idénticos, son dos cromóforos aquirales que aislados no tienen señal en CD debido a que sus momentos dipolares son perpendiculares (µ.m=0). Sin embargo, el dimero AC sí va a tener señal en el espectro de CD ya que una de las componentes del momento dipolar magnético de C puede interaccionar con la componente del dipolo eléctrico de transición de A y como A y C son iguales (tienen la misma energía), se produce un acoplamiento en sus momentos dipolares de transición, esto es lo que se denomina acoplamiento excitónico. Así se observa un desdoblamiento excitónico en el estado excitado, y en consecuencia va a haber señal de dicroísmo.

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Instrumentación:

La característica más importante de un Espectropolarímetro de Dicroísmo Circular, es que debe contar con una fuente de luz polarizada. La fuente es inmóvil, y debe ser lo más intensa posible de forma de minimizar los ruidos. Generalmente es luz monocromática. La luz polarizada circularmente puede ser construida a partir de dos haces de luz polarizada linealmente que tengan la misma magnitud pero que estén fuera de fase una respecto a la otra. La luz pasa a través de un polarizador lineal que está orientado a 45º del retardador de onda. Se elige un retardador de espesor tal que los dos haces emergentes estén desfasados en π/2 cuando lo atraviesen, de manera que ambos constituyan luz circularmente polarizada hacia la derecha. Si el polarizador se rota 90º, la luz es circularmente polarizada hacia la izquierda.

La luz polarizada pasa por un modulador fotoelástico que consiste en un material que se comprime y expande para producir radiación circularmente polarizada (generalmente un cristal de seleniuro de zinc) la cual incide sobre la muestra bajo estudio, colocada en una celda con ventanas de materiales estables. La radiación que emana de la celda pasa a un detector que proporciona los espectros de dicroísmo circular.

Aplicaciones y usos de CD:

Determinación de la estructura 2ria de proteínas que no pueden ser cristalizadas.

Estudio de ligando Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T,

solventes, etc. Determinación de estructuras 2rias de proteínas de membranas (difíciles de

cristalizar) y dentro de vesículas lipídicas (in vivo)

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Estudio de interacciones proteína-proteína y ácidos nucleico-proteína Estudios de aspectos estructurales de: ácidos nucleicos, polisacáridos,

péptidos, hormonas y otras moléculas pequeñas.

PURIFICACIÓN POR CRISTALIZACIÓN.

Es un método que sirve para purificar sustancias, consiste en formar una solución sobresaturada, pues se basa en la solubilidad de las sustancias ( a mayor temperatura , mayor solubilidad ) el exceso del soluto sobresaturado es el que se cristaliza .

Se entiende por cristalización, al paso de un cuerpo desde un estado cualquiera al cristalino, aunque en sentido estricto es el paso desde el estado de solución al cristalino.

Es un procedimiento utilísimo de purificación e identificación de sustancias. En líneas generales la operación consiste en disolver en caliente la sustancia, la mezcla caliente se filtra para eliminar todas las impurezas solubles , y entonces la solución se deja enfriar para que se produzca la cristalización. En el caso ideal, toda la sustancia deseada debe separarse en forma cristalina y todas las impurezas solubles deben quedarse disueltas en la aguas madres, finalmente los cristales se separan por filtración y se deja secar, cuando se desconoce una sustancia y se teme pueda descomponerse a alta temperatura se deja al vacío.

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