CromatografaLa cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales est en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase mvil, F.M.) se mueve en una direccin definida.Otras definiciones (en la web): cromatograma, cromatografiar, cromatgrafo, fase ligada, fase inmovilizada, eluir, efluente, muestra, componentes de la muestra, soluto, disolvente, zona.Otros trminos: columna, lecho cromatogrfico, empaquetamiento... (vase laseccin de nomenclatura).Hay 3 mtodos principales de cromatografa: frontal, de desplazamiento y de elucin. Slo consideraremos este ltimo, que es el ms habitual, al menos en Bioqumica y Biologa Molecular.Clasificacin de las tcnicas cromatogrficas1. De acuerdo con la forma del lecho cromatogrfico:1.1 Cromatografa planaSe realiza sobre papel u otro material slido. Suele llamarse en capa fina o en capa delgada porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rgido.Cromatografa ascendente en capa finaDisposiciones experimentales para realizar una cromatografa en papel descendente (izqda.) y ascendente (dcha.).

Cromatografa ascendente en capa fina: colocacin de una muestra (con 3 componentes), desarrollo de la cromatografa y revelado del cromatograma.Rfes elfactor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada componente con respecto al mximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase mvil.Componente 1: Rf= a / DComponente 2: Rf= b / DComponente 3: Rf= c / D1: aplicacin de la muestra2: se sumerge el extremo inferior en la fase mvil3 a 5: la fase mvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separacin de los componentes6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance

1.2 Cromatografa en columnaF.M. lquida, F.E. slida: columnas de varios mm de dimetro y varios cm de longitud.F.M. gas, F.E. slida: columnas de unos 5 mm de dimetro y 1-20 m de longitud.F.M. gas, F.E. lquida: columnas capilares, con menor dimetro y 30-100 m (incluso ms) de longitud.Puede verse unaanimacindel avance de las molculas por la columna.Funcionamiento de una columna, mostrando la carga de la muestra y diversos momentos a lo largo de la elucin:1. Muestra depositada sobre el lecho cromatogrfico2. La muestra penetra en el lecho3. Se aade fase mvil4. Comienza la separacin de los componentes de la muestra1. Eluye el primer componente1. Eluye el segundo componente

2. De acuerdo con el estado fsico de las fasesfase mvil

lquidagaseosa

cromatografalquidacromatografade gases

faseestacionariaslidaCromatografalquido-slidoCromatografagas-slido

lquidaCromatografalquido-lquidoCromatografagas-lquido

2.1 Cromatografa de gasesCon fase mvil gaseosa. Cromatografa gas-lquido Cromatografa gas-slido2.2 Cromatografa lquidaCon fase mvil lquida. Cromatografa lquido-lquido Cromatografa lquido-slido2.2.1 HPLCCromatografa lquida de alta presin o de alta eficacia (cuando se emplean particulas de fase estacionaria muy pequeas y una presin de entrada relativamente alta).[HPLC, deHigh Pressure Liquid Chromatography/High Performance Liquid Chromatography]3. De acuerdo con el mecanismo de separacinNota: sta es una clasificacin conceptual; en la prctica, el mecanismo que rige la separacin puede ser mixto; p.ej., adsorcin+reparto.3.1 Cromatografa de adsorcin(atencin: es adsorcin, no absorcin)Diferenteafinidad de adsorcinde los componentes de la muestra sobre la superficie de un slido activo. La adsorcin es la capacidad de las superficies para fijar molculas.La F.E. es siempre slida. Ejemplos: almina, gel de slice, carbn activo, fosfato clcico, hidroxiapatito...3.2 Cromatografa de repartoDiferentesolubilidadde los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatografa de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases mvil y estacionaria (caso de la cromatografa lquida).Ejemplos: en cromatografa plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al soporte slido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de slice, celulosa en polvo...3.3 Cromatografa de intercambio inicoDiferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. Qu significa intercambio de iones? La F.E. posee carga elctrica y por ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga opuesta. Intercambio aninico: F.E. con cargapositiva, uneaniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la muestra (de ah la palabra intercambio). Intercambio catinico: F.E. con carganegativa, unecationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la muestra.Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. slida):intercambiadores catinicosintercambiadores aninicos

carboximetilo (CM)sulfopropilo (SP)fosforilosulfonatocarboxilatodietilaminoetilo (DEAE)dietil-(2 hidroxipropil)aminoetilopolietilenimina

La F.E. suele llamarse resina (de intercambio inico).Puede verse unaanimacinde una cromatografa de intercambio aninico.

3.4 Cromatografa de exclusinTambin se llamade exclusin molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamao, forma o carga entre las molculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo ms habitual es aprovechar lasdiferencias de forma y tamao. En este caso, se la llama tambincromatografa de exclusin por tamao, defiltracin en gel, depermeacin en gelo detamiz molecular.Esquema de la separacin de molculas de distinto tamao durante una cromatografa de exclusin.Haciendo clic sobre la imagen de la columna a la derecha se mostrar el aspecto en detalle del relleno ilustrando el diferente acceso a los poros de las molculas dependiendo de su tamao.entrada de fase mvildetectorcolumnacromatogrficaconrelleno porososeal

Pueden verse dos animaciones (AyB) de una cromatografa de exclusin.Ejemplos: para la separacin de protenas y polisacridos se usan como F.E. polmeros lineales entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los ms comunes son dextranos (marca comercial:Sephadex), agarosa (SepharosayBiogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos materiales, en forma de pequeas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones acuosas, generando un retculo o matriz tridimensional, con poros de tamao definido.Aplicaciones: Para la purificacin de una protena (al igual que otras tcnicas cromatogrficas). Se puede establecer una correlacin entre el tamao molecular y la movilidad en la columna de exclusin, por lo que esta tcnica se emplea para determinar masas moleculares. Para eliminar sustancias de pequeo tamao molecular de una muestra proteica (p.ej., las sales inorgnicas en un desalado de la muestra, eliminacin del exceso de reactivos tras tratar una protena en el laboratorio, eliminacin de inhibidores enzimticos,...). El resultado es similar a una dilisis, pero ms rpido. (ms aplicaciones en Freifelder, 1991)3.5 Cromatografa de afinidadVariedad particular de cromatografa en la que la separacin se basa en laespecificidad biolgica singularde interaccin entre un componente de la muestra y otra molcula unida a la F.E.; los ejemplos ms comunes son las interacciones enzima-sustrato, antgeno-anticuerpo y ligando-receptor.F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plstico, gel de agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima, anticuerpo, antgeno, hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacridos, lectinas (protenas con afinidad por oligosacridos)...Pueden verse dos animaciones (AyB) de una cromatografa de afinidad.4. Algunas tcnicas especiales4.1 Cromatografas de fase normal y de fase invertidaFase normal: cuando la F.E. es ms polar que la F.M.Fase invertida: cuando es ms polar la F.M.[Nota: se suele ver el trmino "fase reversa", expresin incorrecta que debe evitarse (la normativa IUPAC indica que en ingls debe decirseReversedPhasey noReverse Phase).]4.2 Anlisis isocrticoLa composicin de la fase mvil permanece constante a lo largo del proceso de elucin.4.3 Elucin con gradienteLa composicin de la fase mvil se cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elucin (respectivamente,gradiente continuoygradiente escalonado o en etapas).4.4 Cromatografa bidimensionalUna vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o todos se someten a etapas adicionales de separacin bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la cromatografa plana, en direccin perpendicular.Ejemplo: Huellas dactilares estudio de protenas (Freifelder-193ss)Etapas en la realizacin de una cromatografaCromatografa en columnaCromatografa plana (papel o capa fina)

1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.

1.1.- Equilibrado de la columna.

2.- Aplicacin de la muestra.2.- Aplicacin de la muestra.Secado.

3.- Elucin:a) Lavado de componentes no retenidos.b) Liberacin, desplazamiento o elucin propiamente dicha de los componentes retenidos.3.- Desarrollo de la cromatografa.

4.- Recoleccin de fracciones o anlisis del efluente en continuo.4.- Secado de la placa.

5.- Anlisis, cuantificacin o revelado.5.- Revelado y cuantificacin en su caso.

6.- Regeneracin de la fase estacionaria.

Recogida del efluenteEl efluente de una columna se suele recoger en forma de pequeas porciones o fracciones, comnmente con la ayuda de un dispositivo mecnico llamado colector defracciones.Esquema de uncolector de fracciones. En cada tubo cae un nmero determinado de gotas o un cierto volumen. A continuacin el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una clula fotoelctrica; cada gota interrumpe el haz de luz y as se cuenta.

DeteccinLos componentes de la muestra separados se detectan en el efluente:a. Mediante su anlisis en continuo. Por ejemplo: midiendo absorbancia a 280 nm para protenas midiendo absorbancia a 260 nm para cidos nucleicos midiendo radiactividadb. O bien mediante el anlisis de las fracciones una vez recogidas. cualquier tipo de anlisis (absorbancia, radiactividad, ensayo enzimtico, ensayo biolgico...)

Cromatografia en papel.cromatografa,tcnicade anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de mezclas complejas. esta tcnica depende del principio de adsorcin selectiva (no confundir con absorcin). la cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, mijal tswett en 1906, pero su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930. tswett separ los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en elinteriorde una probeta. a medida que la disolucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferentevelocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales decolores, denominadas cromatogramas. cada banda corresponde a un pigmento diferente.la cromatografa en columna utiliza un amplio espectro de adsorbentes slidos, incluidas la slice, la almina y la slice gelatinosa. tambin los lquidos pueden ser adsorbidos en estos slidos y a su vez sirven como adsorbentes (un proceso denominado cromatografa de reparto) permitiendo al qumico elaborar columnas de diferentes propiedades para diversasaplicaciones. en la cromatografa con lquidos de alto rendimiento, una variante de esta tcnica de uso frecuente hoy enda, se utilizan lquidos adsorbidos en partculas muy pequeas y uniformes, lo cual proporciona una sensibilidad bastante alta. para llevar la mezcla a travs de la columna se precisa una bomba. la cromatografa de capas finas es otra forma de cromatografa en columna en la cual el material adsorbente reposa en un cristal o en una pelcula de plstico.en la cromatografa en papel, una muestra lquida fluye por una tira vertical de papel adsorbente, sobre la cual se van depositando los componentes en lugares especficos. otra tcnica conocida como cromatografa gas-lquido permite la separacin de mezclas de compuestos gaseosos o de sustancias susceptibles de vaporizarse por calor. la mezcla vaporizada es conducida mediante un gas inerte a travs de un estrecho tubo en espiral que contiene una sustancia, por la que los componentes fluyen en diferentes proporciones, siendo detectados al final del tubo. otro mtodo es la cromatografa por infiltracin gelatinosa, basado en la accin filtrante de un adsorbente poroso de tamao uniforme. con este mtodo se consigue separar y detectar molculas de mayor masa molecular.el uso de la cromatografa est ampliamente extendido en el anlisis de alimentos, medicinas, sangre, productos petrolferos y de fisin radiactiva.materiales:envase de vidrio con tapapipetavaso qumicopapelprobetareactivos:glucosa: la solucin de glucosa al 5% est indicada cuando es necesario administrar agua libre de sodio; es auxiliar en el mantenimiento o correccin del equilibrio hidroelectroltico.cuando se desea incrementar el aporte calrico y en los casos en que se requiere mantener una vena permeable.las soluciones de glucosa al 10%-50% son consideradas soluciones hipertnicas, estn indicadas en el tratamiento del colapso circulatorio y de los edemas cerebrales y pulmonares.est contraindicada en la diabetes mellitus y en el coma de la misma. se debe restringir su empleo en pacientes con edema con o sin hiponatremia; en la insuficiencia cardiaca con edema pulmonar o sin ste y en pacientes oligo-anricos. en el coma hiperosmolar y en la hiperglucemia. las contraindicaciones principales seran el coma addisoniano y la diabetes.sacarosa: el azcar pura en cantidad excesiva puede ser peligrosa porque desajusta los delicados mecanismos de regulacin que permiten almacenar y quemar los azcares simples.este desajuste favorece la gordura (almacenamiento de azcar en forma de grasa por intermedio del hgado). favorece tambin la diabetes (respuesta incorrecta a la produccin de insulina por el pncreas); fatiga las clulas del pncreas.fructuosa: a pesar de la buena imagen de este carbohidrato natural, el consumo de productos edulcorados con fructosa (mermeladas, productos integrales,..) puede resultar muy engordante, no slo por su contenido en caloras sino tambin porque es metabolizada de una forma diferente a otros carbohidratos, favoreciendo en gran medida la acumulacin de grasa.: