CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA Y COLUMNA

Loboa Norma, código: 0828020Orejuela Richard, código: 0829894

Laboratorio de Química Orgánica I-Q.Universidad del Valle.

Departamento de Química

DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS

Cromatografía de columna:

Peso Alúmina: 2.02g

La mezcla de tientes era de color verde cuando se vertió a la columna de cromatografía, pero al adicionarle disolvente (etanol), la mezcla se separó en dos sustancias de colores diferentes (azul y amarillo). La primera sustancia que bajó fue la azul adicionando etanol mientras que la solución amarilla quedó en la parte superior de la alúmina (fase estacionaria), la solución amarilla bajó por la columna utilizando como disolvente agua.

Tabla 1: Soluciones recolectadas en la cromatografía de columna.

CC

FASEESTACIO

NARIAFASE MÓVIL

2.02g de Alúmina

EtOH EtOH Agua Agua

Tubo 1:

Sln. incolora

Tubo 2:

Sln. azul

Tubo 3:

Sln. amarilla

Tubo 4:

Sln. incolora

Fuente: Los autores

Fuente: Los autores.Figura 1. Fracciones obtenidas mediante CC

OBSERVACIONES.

-TUBO # 1: El disolvente EtOH, se recolecta en este tubo ya que no había nada que arrastrar.

Fuente: Los autores.Figura 2. Tubo # 1 con EtOH.

-TUBO# 2: En este procedimiento se le adicionó 3 gotas de la mezcla de tintes y en este tubo se recolectó una sustancia de color azul correspondiente al azul de metileno proveniente de la descomposición de la mezcla de tintes utilizada.

Fuente: Los autoresFigura 3. Tubo # 2 con azul de metilno.

-TUBO# 3: La solución obtenida es amarilla correspondiente al naranja de metilo proveniente de la mezcla de tintes utilizada.

Fuente: Los autoresFigura 4. Tubo # 3 con naranja de metilo.

-TUBO# 4: Por último Se recolecto el componente incoloro correspondiente al disolvente utilizado, en este caso Agua.

Fuente: Los autoresFigura 4. Tubo # 4 con agua.

Cromatografía de capa delgada:

Tabla 2: Distancias recorridas para la Placa 10-1 (etanol-agua).

Distancia recorrida (cm)

Disolvente 4.5Tinte puro 0.6Mezcla 1 0.5Mezcla 2 4.3Tubo # 2 0.3Tubo # 3 0.0Fuente: Los autores

Fuente: Los autoresFigura 5. Cromatografía de capa delgada.

Tabla 3: Distancias recorridas para la Placa 1-10 (etanol-agua).

Distancia recorrida (cm)

Disolvente 4.0Tinte puro 0.0Mezcla 1 0.0Mezcla 2 3.9Tubo # 2 0.0Tubo # 3 0.0Fuente: Los autores

Fuente: Los autoresFigura 6. Placa de cromatografía.

Para calcular la movilidad relativa se utilizó siguiente ecuación:

Rf = distancia recorrida por el compuestodistanciarecorrida porel disolvente

Tabla 4: Factores de retención de la mezcla de tintes y las sustancias obtenidas en al cromatografía de columna frente a disolventes compuestos por agua y etanol.

SOLVENTE SUSTANCIA Rf

CCD

10:1EtOH:H2O

Tinte puro 0.13Mezcla de tintes

0.11

Mezcla 2 0.96Tubo #2 0.07Tubo #3 0.00

1:10EtOH:H2O

Tinte puro 0.00

Mezcla de tintes

0.00

Mezcla 2 0.97

Tubo #2 0.00Tubo #3 0.00

Fuente: Los autores

Referencia de las placas cromatográficas: Sílica gel 60 F254

Marca: Merck

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Para esta práctica se emplearon dos tipos de técnicas cromatográficas para la separación de mezclas e identificación de sustancias, las cuales son cromatografía de columna y cromatografía de capa delgada. Estos métodos involucran la transferencia reversible de un compuesto que está adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase móvil (disolvente) que fluye a través de la fase estacionaria. [2]

La separación surge de las interacciones mutuas de componentes de una muestra, disolvente y adsorbente. El adsorbente está presente en un gran exceso, con una gran superficie y con sitios polares capaces de unir reversiblemente pequeñas concentraciones de sustancias por un proceso esencialmente electrostático. El disolvente compite con los componentes de la muestra por los sitios de unión. Estos componentes son desplazados reversible y continuamente en la dirección del flujo del disolvente. El proceso descrito puede escribirse como un equilibrio competitivo en donde hay una partición de los componentes entre la fase estacionaria y la fase móvil:

Componentes-adsorbente ↔ disolvente-adsorbente↔componente−disolvente

Entre más polar sea un compuesto, más fuertemente se adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su migración a lo largo de ella es menor, siendo eluído (arrastrado) más lentamente por la fase móvil, que los compuestos menos polares. De este modo, la separación selectiva de los componentes de una muestra, por cromatografía, se debe a las diferencias en la migración de los componentes individuales a lo largo de la fase estacionaria. [3]

La cromatografía de columna es una técnica que consiste en adicionar la mezcla a separar sobre el borde de la fase estacionaria que en éste caso fue alúmina básica, la cual fue empacada uniformemente dentro de la columna (figura.7). La distribución de los componentes entre la fase sólida y líquida es determinada, además de por la polaridad propia de cada compuesto, por el grado de actividad del adsorbente (el cual depende principalmente del grado de

hidratación y de la polaridad del disolvente). [2]

Fuente: Los autores.Figura 7. Montaje de la técnica de cromatografía de columna.

El principal factor para controlar el movimiento de los diferentes compuestos en un cromatograma es la polaridad del disolvente. Una lista de los disolventes más usados en los diferentes tipos de cromatografía, en orden de polaridad creciente, se indica en la Tabla 4. Entre más polar sea un disolvente, más rápido es el movimiento de los compuestos y menos efectiva la separación. [7]

Tabla 4. Disolventes comunes para cromatografía de líquidos.

Fuente:http://www.bib.uia.mx/gsdl/docdig/didactic/IngCienciasQuimicas/lqoa001.pdf

La cromatografía de columna se empleó para separar los componentes de una mezcla de tintes de color verde aguamarina, la cual contenía azul de metileno (cloruro de metilionina) un compuesto heterocíclico de formula C16H18N3SCl (figura. 8) y naranja de metilo (colorante azoderivado) de formula C14H14N3NaO3S(figura. 9). Estos tintes son

polares, aunque el naranja de metilo es más polar que el azul de metileno, debido a que el naranja de metilo tiene menos carbonos (14) que es la parte no polar y tiene grupos polares como el SO3Na y dos aminas, a diferencia del azul de metileno que tiene un grupo S y tres N, además tiene 16 carbonos que lo hacen menos polar. Para separar esta mezcla, los solventes o fases móviles empleados, fueron agua y etanol ya que “lo semejante disuelve lo semejante” pues son muy polares aunque el agua es más polar que el etanol ocasionado por la constante dieléctrica. [3]

Fuente: Los autores.Figura. 8: Estructura del azul de metileno.

Fuente: Los autores.Figura. 9: Estructura del naranja de metilo.

Para la mezcla de tintes se utilizó como fase estacionaria un empaquetamiento de alúmina básica Al2O3 (pH= 10), este óxido de aluminio tiene un empaquetamiento característico (figura. 10) y un tamaño muy fino que permite que el equilibrio adsorción-desorción se establezca de manera rápida y se produzca una mejor resolución en la cromatografía. Además este compuesto permitió que los componentes de la mezcla que puedan formar enlaces de hidrogeno tengan una mayor atracción y puedan ser retenidos para la separación de ellos, así en el momento que se adicionó la mezcla de tintes con posterior incorporación del EtOH como primer solvente, se observó que el compuesto que se arrastraba por la columna era el azul de metileno y esto se debió a que las interacciones entre este tinte y el etanol

son más fuertes que las interacciones entre el etanol y el naranja de metilo gracias a la presencia de un mayor número de hidrógenos disponibles para llevar a cabo el enlace, además la interacción entre el naranja de metilo y la fase estacionaria (alúmina) se hizo más fuerte debido a la alta polaridad marcada sobre el grupo SO3

-, por lo que la fase estacionaria retuvo el compuesto con mayor polaridad y el menos polar fue removido por el eluyente. [5]

Fuente: Los autores.Figura. 10: Sistema cristalino hexagonal del Al2O3

Al finalizar la recolección la solución de color azul (debido al azul de metileno), se cambió el eluyente por agua, esté al poseer un momento dipolar más grande que el EtOH, compitió con el naranja de metilo por adsorberse en los centros polares de la fase estacionaria, esto permitió un desplazamiento del tinte por las moléculas de agua. Al poseer el naranja de metilo en su estructura tres átomos de oxígeno tiene la posibilidad de formar enlaces de hidrógeno con el agua. Cuando se adicionó EtOH en la primera etapa, el naranja de metilo no eluyó porque la fuerza entre naranja de metilo-alúmina fue más fuerte que la interacción naranja de metilo - EtOH. [2]

Por otro lado, la cromatografía de capa delgada se empleó para identificar las sustancias separadas de la mezcla. Ésta es una de las técnicas más comunes empleadas en un laboratorio de química orgánica, pues permite determinar el grado de pureza de un compuesto, comparar muestras, realizar el seguimiento de una reacción y controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna [8]. El montaje de ésta técnica se muestra en la figura 11.

Fuente: JARAMILLO L.M. Fundamentos de la separación y purificación de compuestos orgánicos por métodos de distribución entre fases.

Figura 11. Montaje de cromatografía de capa delgada. Está presente un vaso tapado y dentro de él se encuentra la mezcla de disolventes y la placa cromatográfica.

Para llevar a cabo esta técnica, se utilizó dos placas de cromatografía de capa fina, que tienen una capa uniforme de adsorbente sólido o fase estacionaria la cual es sílica. En cada una de ellas, con ayuda de un capilar, se colocó un punto de la mezcla de tintes y un punto de la solución de tinte puro soluble en etanol. Lo mismo se hizo con los tintes obtenidos (amarillo y azul). Luego cada una de las placas se introdujeron en dos beakers diferentes que tenían una cantidad diferente de la mezcla de disolventes de elusión (etanol-agua), que se difundía por la placa para separar los componentes y así poder calcular el Rf (movilidad relativa) que es característica para cada compuesto, teniendo en cuenta el desplazamiento. [7]

Con esta técnica cromatográfica se observó que el compuesto que subió a lo largo de la placa fue el naranja de metilo y en pequeñas proporciones el azul de metileno, esto se debió a que en la sílica gel con su composición (figura 12) pudo formar enlaces más fuertes con el naranja de metilo.

Fuente: www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm.Figura 12: Organización molecular de la sílica Gel.

Es decir, un compuesto que tenga muchos hidrógenos disponibles para formar puentes de hidrogeno, tendrá una interacción fuerte con la fase fija, en este caso el azul de metileno tiene mayor posibilidad de formar puentes de hidrogeno con la sílica, además a diferencia de la alúmina, la sílica tiene más oxígenos en su estructura por lo cual será más fácil formar el puente de hidrogeno, las propiedades absorbentes de la gel de sílice se deben a los grupos hidroxilo unidos a los átomos de silicio, los cuales actúan como dadores de hidrogeno formando los correspondientes enlaces puente de hidrogeno, en este caso no se necesita que la molécula sea muy polar, por el contrario se necesita que pueda formar los enlaces para mantenerse fija a pesar de que el naranja de metilo tiene la polaridad marcada sobre el grupo SO3

-.; La mezcla que se utilizó para este caso fue de etanol-agua en las proporciones mostradas en la tabla 2, los dos solventes tienen polaridad marcada y gran capacidad de formar puentes de hidrogeno los cuales se forman con el naranja de metilo debido a la presencia de 3 oxígenos con pares de electrones libres. [4]

Como la marca del patrón de naranja de metilo y uno de los componentes de la mezcla corrió a la misma distancia, se dedujo que el tinte naranja de metilo si estaba presente en la mezcla. Se descarta que uno de los componentes de la mezcla fuera azul de metileno ya que el recorrido del patrón fue despreciable.

En la segunda placa se observó que solo corrió el naranja de metilo esto se debió a la gran polaridad que tiene el componente en mayor proporción del eluyente, el cual interacciono solo con las moléculas con alta polaridad.

Observando los valores de Rf, parámetro que caracteriza la migración del solvente se corrobora lo mencionado anteriormente. [5]

PREGUNTAS

1. ¿Explique por qué y cómo se separan los compuestos de la mezcla de tintes?

La especie que migra de última, lo hace porque es más fuertemente retenida que la

otra y por tanto se retrasa durante el proceso de migración.

Los compuestos de la mezcla de tintes se separan, porque tiene diferentes velocidades de migración y se van aislando cada vez más, hasta completar la separación a medida que se les pase cantidades suficientes de fase móvil a través de la columna, hasta lograr que cada uno de los componentes individuales llegue al final para recogerlos por separado. [3]

2. ¿Qué es la cromatografía de columna seca? ¿Y cómo se desarrolla?

Fue una técnica descrita por Loev y Goodman, la cual consiste en rellanar una columna clásica de cromatografía con adsorbente, sin ayuda de ningún solvente, ósea que en vez de usar varios volúmenes de disolvente la cromatografía de columna seca finaliza cuando el solvente alcanza el fondo de la columna al usar un solo volumen de disolvente. Este método ofrece algunas ventajas como el grado y la velocidad de separación. [1]

Para el montaje de la cromatografía de columna seca se inicia rellenando un columna de vidrio o preferiblemente un tubo de nylon con alúmina seca o sílice gel seca, la adición de este se hace sin la presencia de ningún disolvente y tratando de disminuir al máximo los espacios que puedan quedar al adicionarse el adsorbente. El tamaño de la columna se escoge dependiendo de la dificultad para separar la muestra, entre más difícil más grande ha de ser la columna. Posteriormente se adiciona la muestra en el tope del absorbente, se adiciona el solvente eluyente hasta que este alcance el fondo de la columna resultando un cromatograma que es revelado con una lámpara de UV observando zonas del absorbente correspondiente a los compuestos separados. La columna de nylon se marca con una pluma y se corta con un cuchillo cada zona, luego se pueden extraer los compuestos contenidos en el absorbente con metanol, éter o el solvente adecuado. [1]

3. ¿Cuál es el desarrollo múltiple y el desarrollo bidimensional de la CCD?

La cromatografía de capa delgada posee un poder máximo de resolución en una región específica. En separaciones difíciles la resolución puede incrementarse por desarrollo múltiple. En esta técnica después del primer desarrollo la placa se remueve de la cámara, se deja secar y se desarrolla otra vez en el mismo solvente. Estas separaciones son ideales para compuestos con Rf menores de 0,5. [1]

Fuente: www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm.Figura 13. Cromatograma de desarrollo múltiple.

La cromatografía de capa delgada en dos dimensiones puede usarse para la separación de mezclas que contienen muchos componentes con propiedades diferentes. Esta técnica permite trabajar con un amplio rango de condiciones ya que se efectúan dos desarrollos con el mismo sistema de solventes o con dos sistemas diferentes y una gran área disponible. Este método es muy útil para la separación de aminoácidos. [1]

Fuente: www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm.Figura 14. Cromatograma bidimensional con dos diferentes sistemas de solventes.

4. ¿En qué consiste la CCD preparativa?

Este método cromatográfico es ideal para la separación de pequeñas muestras de compuestos ligeramente no volátiles. Además es de gran utilidad para separar

mezclas de reacción con el objeto de obtener muestras para estudio preliminar. También para la preparación de muestras analíticas puras de productos naturales donde las cantidades aisladas son muy pequeñas y de mezclas complejas. [4]

La muestra a separarse se deposita en una línea delgada sobre un lado de una placa grande y se desarrolla en una dirección perpendicular a esta línea de manera que la mezcla se resuelva en bandas o zonas que se visualizan en forma no destructiva si los compuestos no son coloreados. El absorbente que contiene las franjas se remueve del plato y luego se extrae con un solvente polar para recuperar el compuesto orgánico.

El absorbente más utilizado en la CCD preparativa es la sílica gel, también se pueden usar los demás adsorbentes comerciales de la CCD, igualmente se usan los mismos solventes. [1]

5. ¿Qué es una resina de intercambio aniónica? ¿Y una resina catiónica?

Las resinas de intercambio iónico son materiales de estructura porosa e insoluble que contienen grupos reactivos que están asociados a iones lábiles capaces de intercambiarse con los del medio que los rodea. [2]

Las resinas de intercambio iónico se clasificaron en dos grandes grupos, resinas catiónicas y resinas aniónicas, estas pueden ser resinas catiónicas fuertemente o débilmente ácidas y resinas aniónicas fuertemente o débilmente básicas.

Las resinas catiónicas poseen cargas negativas e interaccionan con cargas positivas, estas generalmente son utilizadas en dos formas, en forma libre del ácido o forma de hidrógeno y de forma salina, la forma de hidrógeno fijara aniones y liberará una cantidad equimolecular de iones hidrogeno a la solución, mientras que la forma sódica se absorberán los aniones y se liberará iones sodio, entre los intercambiadores catiónicos se encuentran –SO3H y -CH2SO3H.

Las resinas aniónicas poseen cargas positivas e interaccionan con cargas negativas, además tienen propiedades que dependen de la fuerza básica de la naturaleza del grupo activo y también de su posición, entre las resinas aniónicos se encuentran los grupos amino, -NH2 y amino sustituidos. [3]

6. Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografía de adsorción en columna.

La cromatografía de absorción en la que la fase móvil es un líquido que fluye a través de un sólido por efecto de la gravedad se utiliza para concentración de trazas, separación de iones interferentes en análisis clásico, separaciones de iones de características similares, separación de componentes de una síntesis orgánica, separación de colorantes, separación e identificación de hioscina y de morfina, desmineralización del agua, preparación de disoluciones patrón y disolución de sustancia insolubles. [6]

CONCLUSIONES

La cromatografía de capa delgada es necesaria para conocer el tipo de componentes de la mezcla, sin embargo no proporciona una separación cuantitativa; para esta es necesaria utilizar un procedimiento complementario como es la cromatografía de columna.

Por medio de los valores calculados de Rf para las dos placas analizadas, se puede identificar los componentes de una mezcla, ya que estos se comparan con los valores arrojados de las posibles sustancias que se creen que están dentro de esta.

La separación de un tinte depende de la fuerza con la que interactúa cada componente de la mezcla a separar con la fase estacionaria. En ese caso las interacciones naranja de metilo - alúmina son las mayores debido a la alta polaridad que las interacciones azul de metileno-alúmina, por lo cual el azul de metileno se separa con mayor velocidad, quedando el naranja de metilo retenido.

Las interacciones que ocasionaron la adsorción fueron las fuerzas de atracción

entre las moléculas de fase estacionaria y de la fase móvil (EtOH) como dipolo-dipolo, puentes de hidrógeno y de Van der Waals.

BIBLIOGRAFÍA[1] JARAMILLO L.M. Fundamentos de la

separación y purificación de compuestos orgánicos por métodos de distribución entre fases, Cali. Departamento de Química, Universidad del valle; 1987. 84-86pp.

[2] Gómez. A., M.; Técnicas analíticas de separación, 1ra ed., Ed. Reverté, 1988, España, pp. 337, 343, 485 – 487, 533

[3] Galagovsky L., Química Orgánica: Fundamentos teórico prácticos para el laboratorio. 5. Buenos Aires: editorial EUDEBA; 1996. 203-206pp.

[4] Algunas aplicaciones de la Cromatografía Líquida a la investigación de proteínas [Página Web] http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/ChrAppl.html [Consultada: 02 de diciembre de 2011, 03:45pm]

[5] Desmineralizadores [Página Web] http://webs.ono.com/desmineralizadores/tipos.html. [Consultada el 02 de diciembre de 2011, 04:15pm].

[6] [Página Web] www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm. [Consultada el 02 de diciembre de 2011, 04:37pm].

[7] Cromatografía en capa delgada y en papel detección de los componentes en mezclas [Página Web] http://www.bib.uia.mx/gsdl/docdig/didactic/IngCienciasQuimicas/lqoa001.pdf. [Consultada el 02 de diciembre de 2011, 05:10pm].

[8] Técnica y síntesis en química inorgánica [Página Web] http://books.google.com.co/books?id=QdY3wC2EiE0C&pg=PA185&lpg=PA185&dq=por+que+el+SiO2+es+polar%3F&source=bl&ots=b5hPqLTWV3&sig=lklqx2DJWOXwharJ1nknvlirnnE&hl=es&ei=Fqu3TJ3WKcG78gbmybSTCg&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=6&ved=0CDYQ6AEwBQ#v=onepage&q=por

%20que%20el%20SiO2%20es%20polar%3F&f=false[Consultada el 03 de diciembre de 2011, 11:20am].