RESUMEN

La cromatografía en columna es una técnica de separación, generalmente usada para

compuestos orgánicos, que tiene el mismo principio que la cromatografía en papel y en

capa fina, ya que para la separación de los componentes de la sustancia, se juega con

su polaridad.

El proceso consiste en llenar una columna de vidrio o plástico, como lo fue en este

caso, con un soporte sólido adsorbente que fue la fase estacionaria, alúmina (Al2O3)).

La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El

resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil)

que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna.

Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el

disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los

componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase

estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su

separación

Se logró separar 15ml de la fase verde correspondiente a clorofilas y 10ml de una fase

amarilla clara, correspondiente a carotenos.

Se determinó que las longitudes de onda máximas experimentales para la clorifila fue

de 630nm y entre 415-435nm para los carotenos.

MARCO TEORICO

Cloroplastos

Los cloroplastos son los organelos en donde se realiza la fotosíntesis. Están formados

por un sistema de membranas interno en donde se encuentran ubicados los sitios en

que se realiza cada una de las partes del proceso fotosintético.

Los cloroplastos son plastidios que contienen los pigmentos verdes clorofila a y b, así

como carotenoides de color anaranjado y xantofilas amarillas, son característicos de los

seres fotoautótrofos, que poseen la maquinaria enzimática para transformar la energía

solar en energía química, a través de la fotosíntesis

Figura 1. Espectro de absorción óptica de la clorofila como grafico de porcentaje de

absorción versus la longitud de onda. La clorofila a, se muestra en rojo y la clorofila b

en azul.

Fuente: bibliografía 1.

Clorofilas

La clorofila: Es una porfirina, contiene un átomo de magnesio en el centro del anillo de

porfirina. Contiene radicales específicos unidos al anillo de porfirina, así como una

molécula hidrofóbica de un alcohol de cadena larga. La clorofila se asocia con lípidos y

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proteínas hidrofóbicas de las membranas fotosintéticas mediante esta cadena lateral

del alcohol.  Se localiza en la membrana de los tilacoides dentro de la célula.

Existen dos, clorofila a y clorofila b y se distinguen por sus diferentes espectros de

absorción.

Clorofila a :Es de color verde porque absorbe con preferencia la luz roja y la azul y

transmite la luz verde. Muestra una fuerte absorción de la luz roja (absorción máxima a

una longitud de onda de 680nm) y de la luz azul (máximo a 430nm). Esta clorofila se

encuentra en los procariotas y las bacterias.

Clorofila b: Tiene una absorción máxima de 660nm en vez de 680

Carotenos y Xantofilas

El β-caroteno, es el carotenoide más abundante en la naturaleza y el más importante

para la dieta humana, por lo que da su nombre a todo un grupo de compuestos

bioquímicos.

El espectro de absorción del β-caroteno muestra dos picos de absorción entre los

400 nm y 500 nm, correspondiente al azul y verde, por lo que la luz roja-anaranjada-

amarilla que refleja le proporciona su color característico. En general, el contenido de

carotenos y xantofilas (carotenoides) se cuantifica a 480 nm.

Figura 2. Longitudes de ondas de los pigmentos en los cloroplastos.

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La cromatografía en columna es el método más general, utilizado para la separación,

a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se

encuentren en estado sólido o líquido.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es

decir, el absorbente, se coloca en el interior de una columna de

vidrio o plástica, la cual finaliza con una llave para controlar el paso

de sustancias al exterior de la columna.

La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil.

Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la

depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la

fase móvil podrá ir atravesando el sistema.

Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco

a poco saldrán de la columna cromatográfica, y se recogen en

fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general

las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la

columna.

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RESULTADOS

Tabla 1. Volúmenes de muestra recuperados

Verde 15ml

Amarillo 9ml

Tabla 2. Longitud de onda máxima de absorción de las muestras obtenida por

espectroscopia UV-Vis

Color Absorción máxima

[A]

Longitud de onda

[nm]

Verde 2.767 295

0.355 630

Amarillo 2.792 305

Tabla 3. Datos teóricos de longitud de onda a la máxima absorbancia correspondientes

a cada pigmento.

Compuesto Color Longitud de onda a la Longitud de onda

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máxima absorbancia [nm] experimental

Clorofila a Verde intenso 680 --

Clorofila b Verde 640 630

Carotenos Amarillo claro  400-500 305

Xantofilas Amarillo

anaranjado

480 --

DISCUSION

La cromatografía en columna es una técnica de separación, generalmente usada para

compuestos orgánicos, que tiene el mismo principio que la cromatografía en papel y en

capa fina, ya que para la separación de los componentes de la sustancia, se juega con

su polaridad.

El proceso consiste en llenar una columna de vidrio o plástico, como lo fue en este

caso, con un soporte sólido adsorbente que fue la fase estacionaria, alúmina (Al2O3)).

Se analizó los componentes de los cloroplastos. Los cloroplastos le dan ese color

característico a las plantas verdes. Para ello se pesaron 15g de hojas de durazno, se

macero con 10mñ de metanol y se dejó reposar, luego se agregó 6ml de hexano y se

separó el extracto. Luego se separó el extracto en un ampolla de decantación y se lavó

con una solución de NaCl para eliminar los residuos de disolvente. Se descartó la fase

polar y a la fase no polar se le agrego se depositó en un beacker.

Se preparó la columna cromatográfica colocando un algodón en la parte inferior de la

columna sobre la llave de paso y luego se rellenó la columna con alúmina, se agregó

una solución de tolueno-acetona 9:1. Se esperó hasta que se mojara toda la fase

estacionaria, se colocó el extracto. Se utilizó una fase móvil de hexano debido a que

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este es de baja polaridad al igual que el extracto, con esto se consiguió separar una

fase amarilla, correspondiente a los carotenos.

Luego de un tiempo, había quedado una fase verde en la parte superior de la columna.

Para extraerla se agregó metanol que es un disolvente más polar que el hexano y se

logró separa 15ml de pigmentos verdes, los cuales corresponden a la clorofila.

Para saber que compuesto representaba cada color, se realizó un barrido para

determinar la longitud de onda a la máxima absorción, para cada color. Se obtuvieron

las gráficas 1 y 2 (ver anexo). Para el barrido de color amarillo, se obtuvo un pico muy

claro y definido, el cual se tomó como representativo de carotenosy ocurre a 305nm.

Por otra parte el barrido para el compuesto verde, el barrido marco varios picos. Al

comparar la figura 2 con la figura 4, se encuentra una similitud. La figura 3, es el barrido

obtenido en el laboratorio y el pico 11 da una longitud de onda de 630, es similar a la

longitud de onda máxima teorica, según la figura 1, entre 600 y 700nm

aproximadamente, por lo que se tomó como válida la separación de clorofila b

En el caso de los volúmenes obtenidos, no se tomaron como representativos ya que no

se utilizó la misma fase móvil. Ya que el hexano no logro hacer descender el verde en

la columna, por lo que se le agrego un disolvente más polar, metanol, hasta que este

descendiera. Por esta razón el volumen de verde o clorofila a, fue de 15ml y 9ml para

los carotenos.

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CONCLUSIONES

1. La cromatografía en columna es un método sencillo de identificación y

separación de los compuestos de los cloroplastos.

2. De la maceración de hojas verdes de durazno, se logró separar clorofila b,

verde, y carotenos que fue la solución amarilla clara.

3. la longitud de onda máxima experimental para la clorofila b fue de 630nm y

305 para los carotenos.

4. Al realizar una separación en columna se debe verificar las polaridades de la

fase móvil como el de la muestra en estudio.

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BIBLIOGRAFÍA

1. Atkins, William. Loretta Ones “Principios de Química: Los Caminos Del

Descubrimiento” Editorial Medica Panamericana. Pág. 124.

2. Descripcion de compuestos de los cloroplastos. Consultado el 22/4/2013.

Disponible en http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?

qid=20080103100126AAFeyKm

3. Isoprenos/Terpeno. Consultado el 22/4/2013. Disponible en:

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e20/20b.htm

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ANEXOS

Fotografías de práctica

1. Decantación del extracto

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2.

Columna al inicio, agregando la fase móvil

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3. Columna a media separación

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4. Separaciones obtenidas

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Fotografía de resultado del análisis espectrofotométrico

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Figura 1. Verde

Figura 2. Amarillo

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