Cuando - CORE · 2020. 5. 9. · a día; al sonreírme cuando volvía a casa con cara de que no...

"Cuando se abandona el pago y se empieza a repechar, tira el caballo adelante y el alma tira para atrás"

— Atahualpa Yupanqui —

iii

“Efectos de las Infusiones Sistémicas de Angiotensina II

sobre la Rama Ascendente Gruesa del Asa de Henle”

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires

iv

Special thanks It is not easy to get on a plane and settle abroad away from family and friends. Therefore, this

thesis would have never been possible without the enthusiasm and the motivation for fishing, shooting

and the exaggeration of stories I share with my mentor Dr. Jeff Garvin. During my first day in Detroit I

made a comment which ended up being my most important cover letter; I said that according to Wikipedia

“a person in the state (of Michigan) is never more than six miles from a natural water source”. That was

the beginning of a friendship built around lures, gunpowder, burgers and beer; that in spite of our

eagerness to avoid it, was projected into our working environment. Dr. Jeff Garvin is an enthusiastic

person, loving science in special ways. On a formal level, Dr. Garvin develops viable research projects in

terms of financing, to keep his lab running and pay doctoral students’ salaries. Dr. Garvin can be found in

scientific meetings or writing grant applications in his office. Jeff on the other hand, is the curious child in

the class who entertains himself in the lab; where among other things, he maintains a fish tank to make

experiments with gills, or a fluorometer he made using cardboard box, a polygraph and a photomultiplier.

Both, Jeff and Dr. Garvin encourage and participate in my development and growth as a scientist. Thus, I

want to thank “them” first.

Secondly, I would like to thank Dr. Fernando Dominici who in his role of Adviser endured having

to read various drafts of this thesis, some written in indecipherable language, that no doubt gave him

many headaches. Fernando overextended his role by handling several administrative matters, which due

to distance, would have been impossible to complete without his valuable help. This is why I give my most

sincere gratitude to him.

I want to also thank Drs. Analia Tomat, Rosana Elesgaray, Oscar Carretero, Mariela Gironacchi,

Jorge Giani, Pablo Ortiz, Pablo Cabral, Katherine Massey, Jagannath Saikumar, Nancy Hong, Fara Saez,

Vanesa Ramseyer, Marcela Herrera, Rodolfo Soca and Pablo Nakagawa for selflessly helping me at many

different stages of this work.

To my family and friends who sacrificed a part of their vacations to visit me either in Detroit or

Cleveland; ALE, Santiago, Juancito, Santi, Itziar, Nacho, Laura, Miguel, Octavio, Marcelito, Flavia, Manuel,

Nachito, Vale and Jorge (I hope not to forget any), thanks for being present and sharing a little of your

precious time with me and my family.

Special gratitude to my parents Miguel and Maria Elena, and to my siblings Maria Eugenia y Hugo,

who came to visit me in the US but had to engage in tasks such as woodworking, gardening, cooking and

babysitting among many others. I couldn't be more grateful for their effort, presence and dedication when

I needed their help.

Finally, I want to thank my spouse Andrea as she was the one who had to deal with me every day;

and smile when I came home with a failed‐experiment face, or come to have lunch at the lab on the

weekends so we can spend some time together. As a product of that presence and that love, our son

Antonio was born. Antonio has done all at his disposal to hinder the completion of my doctorate including

nights of insomnia, constant interruptions while writing, destruction of drafts, and worst of all... making

me miss him while I was in the laboratory, this thesis is dedicated to him.

v

Agradecimientos No es fácil armar una valija e instalarse en el extranjero alejado de la familia y los amigos. Por ello,

esta tesis nunca hubiera sido posible sin el entusiasmo y la motivación por la pesca, el tiro y la exageración

de historias que compartimos con mi director el Dr. Jeff Garvin. Durante mi primer día en Detroit jugué la

que terminó siendo mi carta de presentación más importante; comenté que había leído en Wikipedia que

en el Estado de Michigan una persona nuca está a “more than six miles (9.7 km) from a natural water

source”. Ese fue el comienzo de una amistad construida alrededor de señuelos, pólvora, hamburguesas y

cerveza; la cual, y a pesar de nuestro afán por evitarlo, se proyectó dentro de nuestro ambiente de trabajo.

El Dr Jeff Garvin es una persona entusiasta, amante la ciencia de un modo particular. En el plano formal,

el Dr. Garvin desarrolla proyectos de investigación viables en términos de financiamiento para mantener

en funcionamiento su laboratorio y pagarles el salario a sus doctorandos. Al Dr. Garvin puede

encontrárselo en congresos científicos o escribiendo subsidios en su oficina. Jeff en cambio, es el chico

curioso de la clase que se entretiene jugando en el laboratorio donde entre otras cosas mantiene una

pecera para hacer experimentos con branquias, o un flourómetro como trofeo que fabricó con una caja

de cartón, un polígrafo y un tubo fotomultiplicador. Ambos, Jeff y el Dr. Garvin, fueron participes e

impulsores de mi crecimiento como científico, y es a ellos a los que quiero agradecer en primer lugar.

En segundo lugar, quiero agradecer al Dr. Fernando Dominici quien en su desempeño como

consejero de estudios soportó tener que leer varios borradores de esta tesis, algunos escritos en un

lenguaje indescifrable que no dudo le produjeron dolores de cabeza. Fernando se extralimitó en su

función al articular varios trámites y cuestiones administrativas, que por mi lejanía hubieran sido

imposible de completar sin tan valiosa ayuda. Por eso mi más sincero agradecimiento hacia él.

Quiero agradecer también a los Drs. Analia Tomat, Rosana Elesgaray, Oscar Carretero, Mariela

Gironacchi, Jorge Giani, Pablo Ortiz, Pablo Cabral, Katherine Massey, Jagannath Saikumar, Nancy Hong,

Fara Saez, Vanesa Ramseyer, Marcela Herrera, Rodolfo Soca y Pablo Nakagawa por haberme ayudado

desinteresadamente en diferentes instancias del desarrollo del presente trabajo.

A mi familia y amigos que resignaron tiempo de sus vacaciones para visitarme ya sea en Detroit o

Cleveland; Ale, Santiago, Juancito, Santi, Itziar, Nacho, Laura, Miguel, Octavio, Marcelito, Flavia, Manuel,

Nachito, Vale y Jorge (espero no olvidarme de ninguno), gracias por haberse hecho presentes y compartir

un poco de su valioso tiempo conmigo y con mi familia.

Menciones especiales merecen mis papas Miguel y María Elena y mis hermanos María Eugenia y

Hugo, quienes vinieron a Estados Unidos de visitas y tuvieron que desarrollar tareas de carpintería,

jardinería, cocina y cuidado de bebes entre muchas otras. No puedo estar más agradecido por su esfuerzo,

presencia y dedicación en los momentos que necesité de ellos.

Finalmente quiero agradecer a mi esposa Andrea, ella fue la que tuvo que lidiar conmigo en el día

a día; al sonreírme cuando volvía a casa con cara de que no funcionaron los experimentos, o viniendo a

almorzar al laboratorio los fines de semana para poder estar un rato juntos. Producto de esa presencia y

ese amor nació nuestro hijo Antonio. Antonio hizo todo lo que estuvo a su alcance para dificultar la

finalización de mi doctorado; incluyendo noches de insomnio, constantes interrupciones en la escritura,

destrucción de borradores, y lo peor de todo… hacerme extrañarlo mientras estaba en el laboratorio, a él

va dedicada esta tesis.

vi

Publicaciones: Parte de los resultados y las técnicas desarrolladas en la presente Tesis Doctoral han dado origen a

las siguientes publicaciones originales:

Gonzalez‐Vicente, A. and Garvin, J.L. Angiotensin II‐induced hypertension increases plasma

membrane Na pump activity by enhancing Na entry in the rat thick ascending limb. Am J Physiol

Renal Physiol. 2013 Nov 1; 305(9):F1306‐14.

Ramseyer, V. D.; Gonzalez‐Vicente, A.; Carretero, O. A.; and Garvin, J. L. Angiotensin II‐induced

hypertension reduces NO production by thick ascending limbs by diminishing NO synthase 3

expression and enhancing phosphorylation at threonine 495. Am J Physiol Renal Physiol. 2015 Jan

15; 308(2):F149‐56.

Gonzalez‐Vicente, A.; Saikumar, J. H.; Massey, J. K.; Hong, N. J.; Dominici, F. P.; Carretero, O. A.;

and Garvin, J. L. Angiotensin II stimulates superoxide production by nitric oxide synthase in thick

ascending limbs. Physiol Rep. 2016 Feb; 4(4). pii: e12697.

Las publicaciones generadas en la presente Tesis Doctoral han sido discutidas y contextualizadas en

los siguientes artículos de revisión:

Gonzalez‐Vicente, A. and Garvin, J. L. Effects of Reactive Oxygen Species on Tubular Transport.

Antioxidants 2017, 6(2), 23.

Gonzalez‐Vicente, A.; Saez, F.; Monzón, C. M.; Asirwatham, J.; and Galvin, J. L. Thick Ascending

Limb Sodium Transport in the Pathogenesis of Hypertension. Physiological Reviews, 2018 En

Revisión

Durante el periodo de realización de esta Tesis Doctoral se publicaron además los siguientes artículos

originales:

Gonzalez‐Vicente, A.; Cabral, P. D.; and Garvin, J. L. Resveratrol increases nitric oxide production

in the rat thick ascending limb via Ca2+/calmodulin. PLoS One. 2014 Oct 14; 9(10):e110487.

Gonzalez‐Vicente, A.; Cabral, P. D.; Hong, N. J.; Asirwatham, J.; Yang, N; Berthiaume, J. N;

Dominici, F. P.; and Garvin, J. L. Dietary Fructose Enhances the Ability of Low Concentrations of

Angiotensin II to Stimulate Proximal Tubule Na+ Reabsorption. Nutrients 2017, 9(8), 885.

Gonzalez‐Vicente, A.; Hopfer, U.; and Garvin, J. L. Developing tools for analysis of renal genomic

data, an invitation to participate. JASN 2017, 28(9).

vii

Abreviaturas y símbolos

HTA Hipertensión arterial

SRA Sistema renina‐angiotensina

Ang Angiotensina

Receptor AT1 Receptor de angiotensina de tipo I

Receptor AT2 Receptor de angiotensina de tipo II

ECA Enzima convertidora de angiotensina de tipo I

ECA2 Enzima convertidora de angiotensina de tipo II

NEP Nefrilisina

AP Aminopeptidasas inespecíficas

ADH Hormona antidiurética, vasopresina

Receptor V2 Receptor de vasopresina de tipo II

ANP Péptido natriurético atrial

ET‐1 Endotelina‐1

Receptor ETA Receptor de endotelina de tipo A

Receptor ETB Receptor de endotelina de tipo A

ROS Especies reactivas del oxígeno

NOSs Óxido nítrico sintasas inespecíficas

NOS1 Óxido nítrico sintasa 1, neuronal

NOS2 Óxido nítrico sintasa 2, inducible

NOS3 Óxido nítrico sintasa 3, endotelial

QO2 Consumo de oxígeno

[Na+] Concentración del catión sodio

HPR Peroxidasa de rábano picante

DMSO Dimetilsulfóxido

SDS Dodecilsulfato de sodio

Vía i.p. Vía intraperitoneal

Sustrato ECL Sustrato para quimioluminiscencia aumentada, (enhanced chemiluminescence)

DPI Puntos por pulgada lineal, (dots per inch)

RAG Rama gruesa ascendente del asa de Henle

viii

NKCC2 Cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2

ROMK Canal de K+ rectificador, “rat outer medullary K+ cannel”

NHEs Intercambiadores de Na+/H+ inespecíficos

NHE3 Intercambiador de Na+/H+ de tipo 3

NHE2 Intercambiador de Na+/H+ de tipo 2

KCC Cotransportador de Cl‐‐K+

ATP Adenosín trifosfato

AMP Adenosín monofosfato

AMPc Adenosín monofosfato cíclico

AC Adenilil ciclasa

GMP Guanosín monofosfato

GMPc Guanosín monofosfato cíclico

GCs Guanilil ciclasa soluble

PDE2 Fosfodiesterasa 2

PDE5 Fosfodiesterasa 5

PKA Proteína quinasa A

Akt Proteína quinasa B

PKC Proteína quinasa C

PKG Proteína quinasa G

PI3K Fosfatidilinositol 3’ quinasa

PDK1 Quinasa‐1 dependiente de fosfoinositidos

PIP2 Fosfatidilinositol 4,5‐difosfato

PIP3 Fosfatidilinositol (3,4,5)‐trisfosfato

PLC Fosfolipasa C

PLA Fosfolipasa A

F Furosemida

Hs Horas

Min Minuto

s Segundo

°C Grado Celsius

g Fuerza g, gravedad estándar

UAF Unidades arbitrarias de fluorescencia

ix

Índice de contenidos

Página

Abreviaturas y símbolos vii

Capítulo 1: INTRODUCCION 2

1.1. Hipertensión Arterial 2

1.2. El Sistema Renina Angiotensina 3

1.2.1. Contexto Histórico 3

1.2.2. Visión Moderna 4

1.2.2.1. Angiotensinógeno 6

1.2.2.2. Renina 6

1.2.2.3. Enzima Convertidora de Angiotensina y Nefrilisina 7

1.2.2.4. Angiotensina II 8

1.2.2.5. Aldosterona 8

1.2.2.6. Sistema renina‐angiotensina intrarenal 9

1.3. Fisiología de Asa de Henle 9

1.3.1. Generalidades 9

1.3.2. Transporte apical en la Rama Ascendente Gruesa 12

1.3.2.1. NKCC2 12

1.3.2.2. ROMK 14

1.3.2.3. NHEs 15

1.3.3. Transporte basolateral en la Rama Ascendente Gruesa 15

1.3.3.1. Na+/K+‐ATPasa 15

1.3.3.2. ClC‐Ks 16

1.3.3.3. KCC 17

1.3.3.4. Canales de K+ 17

1.3.4. Transporte paracelular en la Rama Ascendente Gruesa 17

1.4. Control hormonal del transporte en la Rama Ascendente Gruesa 18

1.4.1. Vasopresina 18

1.4.2. Oxido nítrico y peroxinitrito 20

1.4.3. Anión superóxido y peróxido de hidrógeno 24

1.4.4. Angiotensina II 26

x

1.4.5. Endotelina 29

1.4.6. Aldosterona 31

1.5. Hipótesis 32

1.6. Objetivos Generales 33

Capítulo 2: MATERIALES Y METODOS 35

2.1. Reactivos 36

2.2. Buffers utilizados 36

2.3. Animales 37

2.4. Anestesia y eutanasia 38

2.5. Infusión de Ang II y furosemida 38

2.6. Medición directa de la presión arterial 39

2.7. Preparación de suspensiones de Rama Ascendente Gruesa 39

2.8. Medición de la concentración de sodio intracelular 40

2.9. Medición de la actividad Na+/K+‐ATPasa 40

2.10. Medición del consumo de oxígeno 42

2.10.1. Medición de la actividad máxima (Vmax) de la Na+/K+‐ATPasa 42

2.10.2. Medición de la actividad media (V0.5) de la Na+/K+‐ATPasa 44

2.11. Medición de la afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por iones 44

2.11.1. Determinación de la k0.5 para el Na+ 45

2.11.2. Determinación de la k0.5 para el K+ 46

2.12. Western Blotting 46

2.13. Ensayos de unión a ouabaína marcada con tritio 47

2.14. Medición de la producción de NO 48

2.14.1. Aislamiento y sujeción de Ramas Ascendentes Gruesas Medulares 49

2.14.2. Cargado de los túbulos con fluoróforo 49

2.14.3. Medición de la producción de NO 50

2.14.4. Tratamiento con ET‐1 51

2.14.5. Tratamiento con PIP3 51

2.14.6. Tratamiento con Ang II 51

2.15. Fosforilación de NOS3 en el residuo de Ser 1177 en respuesta a PIP3 52

2.16. Medición de la producción de anión superóxido en respuesta a la Ang II 52

xi

2.16.1. Medición de la producción de anión superóxido derivado de las NOSs

en respuesta a la estimulación con Ang II 54

2.16.2. Investigación de la vía por la cual la Ang II induce el desacople de las NOSs 55

2.17. Análisis estadístico de datos 55

Capítulo 3: RESULTADOS 56

Primera Parte: Estudio de la velocidad de transporte y de los parámetros cinéticos

de la Na+/K+‐ATPasa en la RAG durante las infusiones de Ang II 57

3.1. Efectos de la administración de Ang II por 7 días sobre la Na+/K+‐ATPasa de la RAG 58

3.1.1. Impacto de la infusión crónica de Ang II sobre la presión arterial 58

3.1.2. Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la actividad de la Na+/K+‐ATPasa

en la membrana plasmática de la RAG 59

3.1.2.1. Velocidad de aumento del Na+ intracelular sensible a ouabaína

en túbulos permeabilizados con bajas dosis de nistatina 59

3.1.2.2. Velocidad de Consumo de Oxígeno sensible a ouabaína

en túbulos permeabilizados con nistatina 60

3.1.3. Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la afinidad de

la Na+/K+‐ATPasa por iones 61

3.1.3.1. Constante de afinidad por el Na+ en túbulos permeabilizados

por shock hipotónico y congelamiento 61

3.1.3.2. Constante de afinidad por el K+ en túbulos permeabilizados

por shock hipotónico y congelamiento 61

3.1.3.3. Consumo de Oxígeno sensible a ouabaína con Na+ intracelular

estabilizado en 7,5 mM mediante el uso de nistatina 63

3.1.4. Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la expresión proteica

de la subunidad α1 de Na+/K+‐ATPasa 64

3.1.4.1. Expresión de la subunidad α1 en la médula renal externa 65

3.1.4.2. Expresión de la subunidad α1 en suspensiones de RAGs 65

3.1.5. Unión de ouabaína en túbulos intactos.

Expresión de la Na+/K+‐ATPasa en la membrana plasmática de la RAG 65

3.2. Efectos de la administración simultánea de Ang II y dosis no natriuréticas de furosemida 66

3.2.1. Efectos de la coadministración de furosemida sobre la presión arterial 67

xii

3.2.2. Efectos de la coadministración de furosemida sobre la actividad

de la Na+/K+‐ATPasa 67

3.2.3. Efectos de la coadministración de furosemida sobre la expresión proteica

de la subunidad α1 de Na+/K+‐ATPasa 68

Segunda parte: Estudio del sistema del óxido nítrico dependiente de la enzima

NOS3 en la RAG durante las infusiones de Ang II 69

3.3. Efectos de la infusión de Ang II durante 1 y 5 días sobre la presión arterial,

la expresión de la enzima NOS3 y la fosforilación del residuo de Thr 495 70

3.3.1. Efectos de la infusión de Ang II sobre la presión arterial 70

3.3.2. Efectos de la infusión de Ang II sobre la expresión proteica de NOS3 71

3.3.3. Efectos de la Ang II sobre la fosforilación basal del residuo T495 de la NOS 72

3.4. Efectos de la administración crónica de Ang II sobre la capacidad de producción de NO

en respuesta a estímulos fisiológicos, sistema ET‐1 73

3.4.1. Capacidad de respuesta a ET‐1 73

3.4.2. Expresión proteica del receptor ETB 74

3.4.3. Producción de NO en respuesta a PIP3 75

3.4.4. Fosforilación del residuo S1177 de la NOS3 en respuesta a PIP3 76

Tercera parte: Estudio de la producción de anión superóxido dependiente de enzimas

NOSs en la RAG en respuesta a la estimulación aguda con Ang II 77

3.5. Efectos de la estimulación aguda con Ang II sobre la producción de NO y O2‐ 78

3.5.1. Producción de O2‐ derivado de NOSs en respuesta a la estimulación con Ang II 79

3.5.2. Mecanismo molecular mediante el cual la Ang II estimula la producción

de O2‐ por parte de las enzimas NOSs en suspensiones de RAGs 80

Capítulo 4: DISCUSION 83

4.1. Generalidades del modelo de hipertensión inducido por Ang II 83

4.1.1. Utilización de ratones knockout en el estudio de la participación del riñón

En los modelos de hipertensión inducidos por Ang II 87

4.1.2. El SRA intrarenal durante las infusiones sistémicas de Ang II 88

4.1.3. Efectos de las infusiones de Ang II sobre la actividad y la expresión

de los transportadores de iones en la RAG 88

xiii

4.1.4. Efectos de las infusiones de Ang II sobre el sistema del NO en la RAG 93

4.2. Producción de O2‐ por parte de enzimas NOSs en respuesta a Ang II 97

4.2.1. Interacción Ang II / NO / O2‐ 100

4.3. Perspectivas 103

Capítulo 5: RESUMEN 104

Capítulo 6: ANEXO 108

ANEXO I: Tabla indicando los componentes de la dieta TestDiet5876 109

Capítulo 7: BIBLIOGRAFIA 110

xiv

Índice de figuras y tablas

Página Capítulo 1: INTRODUCCION

Figura 1: Vías proteolíticas de formación de péptidos derivados del angiotensinógeno 5

Figura 2: Rol del Asa de Henle en el mecanismo de formación y concentración de orina 11

Figura 3: Principales transportadores presentes en la Rama Ascendente Gruesa 13

Figura 4: Vías de señalización de la ADH en la Rama Ascendente Gruesa 19

Figura 5: Vías de señalización del NO en la Rama Ascendente Gruesa 23

Figura 6: Vías de señalización del anión O2‐ en la Rama Ascendente Gruesa 25

Figura 7: Vías de señalización de la Ang II en la Rama Ascendente Gruesa 27

Figura 8: Vías de señalización de la ET‐1 en la Rama Ascendente Gruesa 30

Capítulo 2: MATERIALES Y METODOS

Tabla 1: Buffers utilizados 37

Figura 9: Fluorescencia del Na‐Green en respuesta a cambios en la [Na+] intracelular 41

Figura 10: Experimento representativo de medición de la actividad de la Na+/K+‐ATPasa 42

Figura 11: Consumo de oxígeno en condiciones basales por suspensiones de RAGs 43

Figura 12: Experimento representativo de medición de la velocidad de la Na+/K+‐ATPasa 44

Tabla 2: Anticuerpos y buffers utilizados en Western blots 47

Figura 13: Reacción de formación del derivado fluorescente del DAF 48

Figura 14.A: Fotografía de una RAG aislada sujeta entre dos micropipetas 50

Figura 14.B: Fotografía de un experimento representativo de medición de NO 50

Figura 15: Experimento representativo de medición de O2‐ 54

Capítulo 3: RESULTADOS

Primera Parte:

Tabla 3: Efecto de la infusión de Ang II sola o en combinación con furosemida

sobre la presión arterial media. 58

Figura 16: Efecto de la ouabaína sobre la velocidad de aumento de la [Na+] intracelular

en RAGs de animales infundidos con Ang II o Vehículo 59

Figura 17: Efecto de la ouabaína sobre la velocidad máxima de Consumo de Oxígeno 60

xv

Figura 18.A: Curva de activación de la Na+/K+‐ATPasa por Na+ 62

Figura 18.B: Efecto de la infusión de Ang II sobre la afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por el Na+ 62

Figura 19.A: Curva de activación de la Na+/K+‐ATPasa por K+ 62

Figura 19.B: Efecto de la infusión de Ang II sobre la afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por el K+ 62

Figura 20: Consumo de Oxígeno sensible a ouabaína en la isoterma de Na+ 7.5 Mm 63

Figura 21: Efecto de la infusión de Ang II sobre la expresión de la Na+/K+‐ATPasa. 64

Figura 22: Sitios de unión a ouabaína en RAGs aisladas intactas 66

Figura 23: Efecto de la ouabaína sobre la velocidad de aumento de la [Na+] intracelular,

en RAGs de animales infundidos con Furosemida o Furosemida y Ang II 67

Figura 24: Efecto de la coinfusión de Furosemida sobre la expresión de la Na+/K+‐ATPasa 68

Segunda parte:

Tabla 4: Efecto de la infusión de Ang II durante 1 y 5 días sobre la presión arterial media 70

Figura 25.A: Efecto de la infusión de Ang II durante 1 día sobre la expresión de NOS3 71

Figura 25.B: Efecto de la infusión de Ang II durante 5 días sobre la expresión de NOS3 71

Figura 26.A: Efecto de la infusión de Ang II por 1 día sobre la fosforilación de NOS3‐T495 72

Figura 26.B: Efecto de la infusión de Ang II por 5 días sobre la fosforilación de NOS3‐T495 72

Figura 27: Efecto de la infusión de Ang II sobre la producción de NO en respuesta a ET‐1 73

Figura 28: Efecto de la infusión de Ang II sobre la expresión del receptor ETB 74

Figura 29: Efecto de la infusión de Ang II sobre la producción de NO en respuesta a PIP3 75

Figura 30.A: Fosforilación de la NOS3‐S1177 en respuesta a PIP3 Controles 76

Figura 30.B: Fosforilación de la NOS3‐S1177 en respuesta a PIP3 en Ang II 76

Tercera parte:

Figura 31.A: Efecto de la estimulación aguda con Ang II sobre la producción de NO 79

Figura 31.B: Efecto de la estimulación aguda con Ang II sobre la producción de O2‐ 79

Figura 32: Efectos de L‐NAME y L‐arginina sobre la producción de O2‐ en respuesta a Ang II 80

Figura 33: Efectos de Gö6976 y apocianina sobre la producción de O2‐ dependiente de NOS 81

Capítulo 4: DISCUSION

Figura 34: Impacto de la combinación de sal, Ang II y tiempo sobre la presión arterial 86

Figura 35: Impacto de la infusión de diferentes dosis de Ang II sobre el balance de Na+ 86

Figura 36: Estado del sistema del óxido nítrico en la RAG durante las infusiones de Ang II 96

Figura 37: Mecanismo propuesto por el cual la Ang II desacoplaría a la NOS3 99

xvi

Figura 38: Resumen de la interacción Ang II / NO / O2‐ en la RAG 102

Capítulo 1

INTRODUCCIÓN

Introducción

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Hipertensión Arterial

La hipertensión arterial (HTA) es el primer factor de riesgo de enfermedades y daño a la salud

a nivel global9. Aproximadamente el 25 % de la población mundial padece HTA, y su prevalencia

proyectada para el 2025 es de 1,5 billones de pacientes10. Además, Un reciente relevamiento

mundial indica que la HTA y el consumo elevado de NaCl se encuentran entre los 10 factores de

riesgo que más contribuyen a la reducción de la vida productiva de las personas y a retiros

anticipados por invalidez11. Así, la HTA y las dietas ricas en sodio constituyen problema global

tanto a nivel de salud humana como económico.

En la República Argentina, la prevalencia de la HTA se encuentra por encima de la media

mundial y asciende al 33,5% de acuerdo al estudio RENATA12 (Registro Nacional de Hipertensión

Arterial). En dicho estudio, se encuestaron 4006 individuos con una edad promedio de 43.7 años,

y residentes en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires, y las provincias de Buenos Aires, Córdoba,

Tucumán, Corrientes, Chaco, Mendoza y Neuquén12. Además, la prevalencia de la HTA en la

Ciudad de Buenos Aires presenta valores mayores que otras grandes urbes de Latinoamérica13.

El estudio CARMELA (Assessment Of Cardiovascular Risk In Seven Latin American Cities) indicó

que la prevalencia de HTA entre individuos de con edades entre 25 y 64 años en la Ciudad de

Buenos Aires asciende a un 37,7 % en hombres y un 21,7 % en mujeres13. A pesar de esto, los

niveles de conocimiento de la HTA, así como de efectividad en el tratamiento de la misma

permanecen bajos en la Argentina14.

En alrededor del 50% de los pacientes hipertensos, la presión arterial muestra sensibilidad a

la sal, condición en la que el consumo de sodio eleva la presión arterial a niveles mayores15. Dado

que el riñón es el principal órgano encargado de regular el volumen del fluido extracelular todas

las formas de hipertensión sensible a la sal deberían incluir una alteración renal, de no ser así, la

natriuresis por presión restablecería la presión arterial a valores sus normales16, 17.

2

Introducción

1.2. El sistema renina‐angiotensina

El sistema renina‐angiotensina (SRA), es uno de los mecanismos más importantes en la

regulación de la presión arterial. La angiotensina (Ang) II regula la reabsorción renal de Na+

y fluidos de manera directa a nivel del túbulo proximal, asa de Henle y túbulo colector. Ejerce

además acciones indirectas regulando la secreción de aldosterona y péptido natriurético

atrial (ANP) y la hemodinámica renal. De esta manera, hay una estrecha relación entre las

acciones renales de la Ang II, el balance hidrosalino. Aumentos anormales en la actividad del

SRA promueven la retención de Na+ y agua, con el consecuente desarrollo de la HTA. La

importancia del SRA en el desarrollo de la HTA en los seres humanos, se refleja en el número

de fármacos utilizados para reducir la presión arterial, que tienden a bloquear sus efectos18,

entre los que se incluyen inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA),

bloqueantes de receptores de angiotensina de tipo 1 (AT1).

1.2.1. Contexto Histórico

La historia del SRA puede remontarse hasta a la segunda mitad del siglo XIX donde el Dr.

Charles‐Edouard Brown‐Sequard de la universidad “Le Sorbonne” en Francia postuló la

existencia de hormonas. Los experimentos de Brown‐Sequard consistían en evaluar los

efectos de la remoción de órganos endocrinos y/o de la inyección de concentrados de tejidos

animales en otros animales vivos19, 20. Siguiendo esa línea de investigación, Robert

Tiegerstedt, profesor de fisiología del “Karolinska Institute” en Suecia, reportó en el año 1898

que la inyección de extractos de la corteza renal elevaba la presión arterial en conejos.

Tiegerstedt denomino “renina” a la substancia responsable de este efecto21‐23. Los

resultados de Tiegerstedt no fueron debidamente apreciados por decadas hasta que en el

año 1933 Harry Goldblatt y sus colegas de la “Western Reserve University” en Cleveland

EEUU, reportaron que la constricción de la arteria renal en perros producía aumentos

sostenidos de la presión arterial24. Los autores sugirieron que esto podría deberse a la

formación de‐novo de un compuesto similar a una hormona con efectos hipertensivos. Los

resultados de Goldblatt abrieron la puerta a una intensa investigación que incluyó el estudio

3

Introducción

de los efectos biológicos de la administración de diferentes tipos de extractos renales en animales

vivos y órganos aislados, así como también el trasplante de riñones isquemiados.

En el año 1938 el grupo del Dr. Irvine H. Page del “Indianapolis City Hospital” en Indiana

EEUU, reportó que la renina purificada presentaba escaso o nulo efecto vasoconstrictor al ser

inyectada en órganos aislados perfundidos con solución salina. Asimismo, demostró que el

agregado de una fracción proteica en la sangre restauraba el efecto vasoconstrictor de la renina;

se llamó al compuesto presente en dicha fracción “activador de la renina” 25, 26. Esta importante

observación, llevo a que un año más tarde el grupo del Dr. Page27 simultáneamente con el grupo

del Dr. Eduardo Braun‐Menendez28‐30 de la Universidad de Buenos Aires, aislaran una substancia

con efectos hipertensivos de muestras de plasma incubadas con renina. La substancia fue

nombrada “angiotonina” por un grupo e “hipertensina” por otro; las diferentes nomenclaturas

tardaron dos décadas en unificarse, y dicha substancia comenzó a llamarse “angiotensina”31.

En el año 1943, se supo que la interacción de la renina con su “activador” era de carácter

enzimático, en donde la renina era la enzima, y el “activador” un sustrato proteico que corría en

la banda α2‐globulina sérica32, 33 hoy llamado angiotensinógeno. Años más tarde, el grupo del Dr.

Norman, P. Shumway del “Veteran Administration Hospital” en Cleveland EEUU postuló la

existencia de diferentes formas de angiotensina34.

La intensa investigación continua al presente35, y hoy sabemos que tras sucesivos procesos

hidrolíticos el angiotensinógeno produce una familia de péptidos con diferentes actividades

biológicas. Un esquema de la familia de angiotensinas y enzimas formadoras puede observarse

en la Figura 1 y se describirá brevemente a continuación.

1.2.2. Visión Moderna

El SRA es uno de los principales sistemas hormonales envueltos en la sensibilidad de la

presión arterial a la ingesta de sal.

Modelos animales de infusiones de Ang II, han sido largamente utilizados para el estudio del SRA

y de la hipertensión asociada a su aumento de actividad. Cuando Ang II es infundida

crónicamente en animales de experimentación, dos respuestas hipertensivas pueden observarse

dependiendo de la dosis. Altas dosis producen respuestas hipertensivas rápidas, donde los

4

Introducción

principales efectores son la vasoconstricción arterial y la descarga simpática. Por el contrario,

bajas dosis de Ang II elevan la presión a lo largo de días o semanas y la magnitud de este aumento

presenta sensibilidad a la sal36‐38. En estos modelos se cree que el incremento de la presión

arterial es principalmente debido a los efectos de la Ang II a nivel renal, ya que: 1) La expresión

renal únicamente del receptor AT1 es suficiente para desarrollar hipertensión sensible a la sal39;

2) La eliminación del receptor AT1 solamente en el riñón disminuye drásticamente el incremento

en la presión arterial40; 3) la acumulación de Ang II en el riñón se correlaciona con el grado de

hipertensión alcanzado durante las infusiones de Ang II37, 38; y 4) la ausencia de la ECA en el riñón

mitiga el incremento en la presión arterial en los modelos de hipertensión inducida por Ang II41.

Figura 1: Vías proteolíticas que conducen a la formación de los péptidos derivados del angiotensinógeno.

Los principales efectores del sistema renina angiotensina (SRA) son la angiotensina (Ang) II y la Ang‐(1‐7). Los

demás son péptidos de cadenas más cortas con menor actividad y cuyas acciones no se conocen en detalle. Las

secuencias de aminoácidos de cada péptido se presentan entre paréntesis. ECA/ECA2: enzima convertidora de

angiotensina 1 y 2 respectivamente, NEP: nefrilisina, AP: aminopeptidasas.

Figura adaptada de Izzo y col. Hypertension Primer, 200818

5

Introducción

1.2.2.1. Angiotensinógeno

El angiotensinógeno es codificado por el gen Agt, el cual da lugar a una proteína de 62 kDa,

la cual es el único precursor de toda la familia de angiotensinas. En base al lugar de síntesis del

angiotensinógeno, el SRA puede dividirse en: 1) sistémico o tradicional, en el que el

angiotensinógeno se produce en el hígado y alcanza la circulación, y 2) tisular en donde el

angiotensinógeno de produce en diferentes tejidos y se libera localmente, el cual se detallará

más adelante.

La producción hepática de angiotensinógeno está regulada a nivel transcripcional, y la

proteína se secreta al torrente sanguíneo de manera constitutiva. La vida media del

angiotensinógeno circulante es de 16 horas, y sus niveles plasmáticos están determinados

mayormente por el balance entre la producción y secreción hepática y el egreso al espacio

extravascular. La hidrólisis del angiotensinógeno por la renina solo representa entre el 5 y el 10

% del aclaramiento de angiotensinógeno circulante18.

1.2.2.2. Renina

La renina es una aspartil proteasa que al ser liberada al torrente sanguíneo desencadena una

cascada que culmina en la generación de Ang II y otros péptidos de la familia. Su único sustrato

es el angiotensinógeno (Figura 1), formado principalmente en el hígado y liberado a la circulación

sistémica. El producto de la hidrólisis del angiotensinógeno es el decapéptido Ang I, el cual

mediante subsecuentes procesos hidrolíticos da lugar a la familia de angiotensinas. La hidrólisis

de la Ang I catalizada por la renina en un paso limite en la formación de Ang II, de modo que la

actividad de renina plasmática se utiliza como un indicador de la formación endógena de Ang II

y del grado de activación del SRA.

La renina es sintetizada, almacenada y liberada principalmente por las células

yuxtaglomerulares (JC), un reducido grupo de células ubicado entre el extremo glomerular de la

arteriola aferente y el túbulo distal. Este patrón de expresión es característico en el mamífero

adulto; sin embargo, la expresión fetal de la renina posee un patrón diferente, y antes de ser

expresada en el riñón se expresa en glándulas adrenales, testículos, ganglios simpáticos,

cartílago, estómago y timo18.

6

Introducción

En condiciones normales, la secreción de renina por parte de las células JC es suficiente

para mantener el balance hidrodinámico y salino. Sin embargo, cuando un mamífero adulto

es expuesto a ciertos estreses como deshidratación, hemorragia, depleción de Na+, o incluso

la inhibición farmacológica del SRA, nuevas células a lo largo de las arteriolas aferentes son

reclutadas para aumentar la producción de renina. De esta manera, el incremento de renina

circulante, se alcanza por medio de un aumento en el número de células secretoras, no por

una mayor secreción individual18.

La regulación de la liberación renina, es crucial para el correcto funcionamiento del SRA

y el mantenimiento de la homeostasis. Las vías clásicas de regulación incluyen: 1) el

baroreceptor renal que estimula la secreción de renina en respuesta a una caída en la presión

de perfusión renal, 2) la mácula densa que censa cambios en la cantidad de Na+ que alcanza

el túbulo distal, y 3) la activación simpática renal, la cual provee una vía rápida de activación

del SRA. Todos estos estímulos actúan vía AMPc, el cual controla la transcripción del gen Ren

de la renina aumentando los niveles de RNA mensajero18.Entre los factores endocrinos y

parácrinos que median la secreción de renina se encuentran, prostaglandinas, endotelinas,

ANP, óxido nítrico (NO) y Ang II4, 18.

1.2.2.3. Enzima Convertidora de Angiotensina y Nefrilisina

La ECA, codificada por el gen Ace, es un histidina‐leucina peptidasa C‐terminal que

convierte el decapéptido inactivo Ang I en el octapéptido Ang II (Figura 1). A diferencia de la

renina, no tiene un sustrato específico. La ECA hidroliza varios otros péptidos, entre los que

se incluye bradiquinina, por la cual tiene una muy baja k0.5. De esta manera, la ECA cumple

una doble función. Por un lado, genera Ang II, y por el otro inactiva al péptido vasodilatador

bradiquinina. Se conocen dos isoformas de ECA, 1 y 2 las cuales presentan diferente

especificidad de sustrato42.

La nefrilisina (NEP) es una endopeptidasa neutra localizada en el túbulo proximal y otros

tejidos42. Tanto la ECA2 como la nefrilisina producen Ang‐(1‐7), a partir de Ang II y Ang I

respectivamente (Figura 1). En líneas generales, los efectos de la Ang‐(1‐7) son opuestos a

los de la Ang II42.

7

Introducción

1.2.2.4. Angiotensina II

El octapéptido Ang II es el principal efector del SRA, y actúa a través de dos tipos de

receptores, los AT1 y los receptores de angiotensina de tipo 2 (AT2). Entre los efectos del

receptor AT1 se incluyen en diferentes órganos y sistemas se destacan: 1) Sistema cardiovascular:

vasoconstricción, aumento de la presión arterial, aumento del inotropismo cardíaco, y efectos

hipertróficos vasculares y miocárdicos; 2) Riñón: aumento de la reabsorción tubular de Na+ y

fluidos (ver más adelante), vasoconstricción e inhibición de la secreción de renina; 3) Sistema

nervioso simpático: aumento de la secreción de Noradrenalina; y 4) Corteza suprarrenal:

incremento de la síntesis y secreción de aldosterona18. Por el contrario, entre los efectos de la

activación del receptor AT2 se destacan los vasodilatadores, antiproliferativos y la reducción en

la absorción renal de Na+ 18. El receptor AT2 se expresa ampliamente durante la vida fetal

principalmente en el riñón y el cerebro, y sus niveles disminuyen luego del nacimiento18. Los

efectos las vías de señalización de la Ang II en la rama ascendente gruesa (RAG) del asa de Henle

se discutirán en el capítulo de regulación hormonal.

1.2.2.5. Aldosterona

La aldosterona es el mineralocorticoide más importante, cuya función principal es aumentar

la reabsorción de Na+ y la secreción de K+ en el túbulo colector. Si bien la aldosterona no se

relaciona directamente con el presente Trabajo de Tesis, es un efector importante del SRA al

punto que se lo llama comúnmente como el SRA‐aldosterona. Por ello se incluye una breve

descripción de sus principales acciones en este capítulo.

La aldosterona es sintetizada en capa externa de la corteza adrenal, la zona glomerulosa. Su

secreción está regulada principalmente por la Ang II y la concentración sérica de K+, aunque la

adrenocorticotrofina (ACTH) hipofisaria tiene efectos tónicos sobre la corteza adrenal. La

aldosterona se metaboliza mayormente en hígado y riñón18.

La aldosterona produce la reabsorción de Na+ (y consecuente secreción de K+) en el túbulo

colector mediante dos mecanismos. Ambos mecanismos comparten la vía inicial que comprende

la unión de la aldosterona al receptor de mineralocorticoides en las células tipo A del túbulo

colector, la translocación del complejo al núcleo y la expresión de la quinasa Sgk1. La expresión

de la Sgk1 conduce a dos efectos, en el corto plazo, Sgk1 fosforila e inactiva Nedd4‐2. Nedd4‐2

8

Introducción

es un ligando de ubiquitina que contribuye a la internalización del canal epitelial de Na+

(ENaC), por lo tanto, su inactivación lleva a una mayor expresión apical de ENaC. En el

mediano y largo plazo, SGk1 releva la represión del gen de ENaC incrementando su

transcripción18. Los bloqueantes del receptor de aldosterona forman parte del arsenal

farmacológico para controlar la HTA18.

1.2.3. Sistema SRA intrarenal

El riñón posee todos los componentes necesarios para producir Ang II de manera local.

La producción renal de angiotensinógeno43, 44 favorece el control local e independiente del

SRA intrarenal45, a pesar de ser el hígado es el principal órgano productor de

angiotensinógeno renal y sistémico46. De hecho, una elevada concentración de Ang II en la

circulación sistémica, se asocia con la acumulación de péptidos de angiotensina en el riñón,

el aumento en la expresión del angiotensinógeno en el epitelio del túbulo proximal y la

excreción de angiotensinógeno por vía de la orina, la cual se ve reducida por la eliminación

del gen de angiotensinógeno renal46.

Otros estudios han mostrado que la eliminación del receptor AT1 en el epitelio del

túbulo proximal, confiere un efecto protector para el desarrollo de la HTA dependiente de

Ang II, ya que se reduce la activación de los transportadores de Na+ 47. Finalmente el aumento

de expresión de renina en el túbulo colector favorece la actividad del canal epitelial de Na+

(ENaC), promoviendo de esta manera la retención de Na+ y agua48.

1.3. Fisiología del Asa de Henle

1.3.1. Generalidades

La función primordial del asa de Henle es proporcionar el gradiente osmótico adecuado

para favorecer la reabsorción de agua por segmentos más distales de la nefrona. Esto se

logra mediante un mecanismo multiplicador en contracorriente, que utiliza de la

permeabilidad selectiva al agua y el transporte activo de solutos. El filtrado primario

procedente del glomérulo llega, a través del túbulo contorneado proximal, a la rama

descendente del asa de Henle la cual se distingue por tener con una zona ancha cortical y

9

Introducción

una estrecha medular. La rama descendente presenta muy baja permeabilidad a iones y urea,

pero es muy permeable al agua gracias a la expresión constitutiva de canales acuaporina de tipo

1 (AQP1) tanto en la membrana apical como en la basolateral. En esta zona se reabsorbe el 20 %

del agua filtrada, en un proceso favorecido por la acumulación de NaCl y urea en el intersticio

medular. A medida que el agua se extrae de la luz del asa descendente, el fluido luminal se

concentra en NaCl hasta alcanzar una concentración similar a la del medio intersticial49, mientras

que el agua es extraída del intersticio mediante la vasa recta ascendente49.

A continuación, se encuentra la rama ascendente del asa de Henle, con una zona estrecha

en la médula interna, y una rama gruesa que se proyecta desde la franja interna de la médula

externa hasta la corteza renal, donde conecta con el glomérulo para formar la macula densa49

(Figura 2).

La rama ascendente gruesa (RAG) es impermeable al agua y permeable a los iones. En la RAG

se encuentran los cotransportadores Na+‐K+‐2Cl‐ (NKCC2), específicos de esta zona, localizados

en la zona apical del epitelio, que reabsorben Na+, K+ y Cl‐ de la orina en formación mediante

transporte activo, asociado a la actividad de la bomba Na+/K+‐ATPasa presente en el lado

basolateral. El detalle de los procesos de transporte en la RAG se explica en las secciones de

Transporte Apical en la RAG y Transporte Basolateral en la RAG.

En la RAG se produce la reabsorción del 25% del Na+ filtrado en el glomérulo. El K+

reabsorbido recircula la luz del túbulo, lo que es importante para mantener el funcionamiento

del transportador NKCC2, además de generar un potencial electroquímico positivo en la luz, que

favorece la reabsorción paracelular de cationes importantes, (Na+, K+, Mg2+, y Ca2+)49‐51.

La impermeabilidad al agua de la rama ascendente del asa de Henle está asociada con la

permeabilidad del asa descendente. De manera que a medida que el agua se extrae de la luz del

asa descendente, el fluido luminal se concentra en NaCl, que luego es reabsorbido en la RAG, lo

que aumenta la osmolaridad del intersticio: se produce por tanto un efecto multiplicador en

contracorriente. Puesto que el flujo del asa descendente y del asa ascendente son en direcciones

opuestas, se produce una estratificación osmótica. Para una nefrona yuxtamedular, cuando el

sistema funciona a su máximo rendimiento, los valores de concentración del medio intersticial

aproximados son 300 miliosmoles por litro de solución (mOsm/L) al inicio del asa descendente,

10

Introducción

en la zona de unión entre la corteza y la médula, y 1200 mOsm/L en la zona de la papila

(Figura 2)49.

Figura 2: Mecanismo de concentración de orina en el asa de Henle funcionando en condiciones de

antidiuresis. El ultrafiltrado proveniente del túbulo proximal llega a la rama descendente con una osmolaridad

de ~300 mOsm/L. Gracias a la presencia de AQP1 y al gradiente osmótico debido a la hiperosmolaridad

medular, el agua fluye de la luz luminal al espacio intersticial, para ser recolectada y extraída por la vasa recta

(representada en rojo a la izquierda). en la transición desde la rama estrecha descendente a la rama estrecha

ascendente, la osmolaridad del fluido luminal mayor a 1000 mOsm/L, similar a la del intersticio. La rama

estrecha ascendente, presenta alta permeabilidad al NaCl e impermeabilidad al agua, por lo que el NaCl

comienza a difundir pasivamente hacia el intersticio. Al llegar a la rama ascendente gruesa (RAG), el fluido

luminal presenta una osmolaridad de ~600 mOsm/L. En la RAG continua la extracción de NaCl de manera activa

mediante el NKCC2 el cual actúa gracias al gradiente de Na+ generado por la Na+/K+‐ATPasa. Al salir de la RAG

el fluido luminal presenta una osmolaridad de menor a 150 mOsm/L. La presencia de AQP2 y AQP3 en el túbulo

colector permite la extracción de agua de la orina en formación que puede llegar a una osmolaridad de mayor

a 1000 mOsm/L. Finalmente, gracias a los canales transportadores de urea presentes en el túbulo colector, la

urea recircula favoreciendo la preservación entorno hiperosmolar de la médula.

Figura adaptada de Boron & Boulpaep. Medical Physiology, 201249

11

Introducción

1.3.2. Transporte Apical en la RAG

1.3.2.1. NKCC2

Aproximadamente el 50% de la reabsorción de Na+ catiónico que tiene lugar en la RAG es

realizada por el NKCC2; este proceso además representa casi la totalidad del transporte

transcelular de dicho ion (Figura 3). El transportador NKCC2 esta codificado por el gen Slc12a152,

que da lugar a una proteína compuesta por aproximadamente 1100 aminoácidos y con una masa

molecular de entre 120 y 121 kDa. Mediante modelado de secuencia de ADNc se determinó que

el NKCC2 contiene 12 dominios que atraviesan la membrana con dominios amino‐ y carboxi‐

terminales de localización citoplasmática53‐55. Mediante splicing alternativo del exón 4, que

codifica para el segundo segmento transmembrana, se producen tres isoformas diferentes: A, B

y F. Estas isoformas varían inversamente en la capacidad de transporte de solutos y en la afinidad

por los mismos56. Así, se distribuyen en orden afinidad creciente y capacidad de trasporte

decreciente, desde la zona medular a la cortical, generando una alta capacidad de transporte en

la zona medular donde el contenido de NaCl del ultrafiltrado es elevado, y una alta capacidad de

extracción iones en la zona cortical donde el fluido luminal es más diluido55, 57, 58. La isoforma F

del NKCC2 (K0.5 por Cl‐: = 111,3 mM) se expresa en la RAG medular. La isoforma A del NKCC2 (K0.5

por Cl‐ = 44,7 mM) está presente tanto en la médula como la corteza, y la isoforma B del NKCC2

que tiene la mayor afinidad por el Cl‐ (K0.5 = 8,9 mM), se encuentra primariamente en la RAG

cortical y en la mácula densa50, 53. Esta distribución es dinámica, de modo que una dieta

restringida en Na+ provoca una mayor expresión de la isoforma NKCC2‐B (de mayor afinidad por

el Cl‐) en detrimento de la isoforma NKCC2‐A tanto en la corteza como en las zonas exteriores de

la médula59. Este mecanismo tiende a adaptar la capacidad de transporte de iones a los nuevos

requerimientos60. Dado que el NKCC2 es responsable de la totalidad del transporte de Na+ en la

forma de NaCl, usualmente se mide el transporte neto de Cl‐ como marcador de actividad de este

transportador. Finalmente, todas las isoformas del NKCC2 pueden ser inhibidas por los fármacos

de acción diurética furosemida y bumetanida50, 53, 61.

12

Introducción

Figura 3: Principales transportadores presentes en la rama gruesa ascendente. Las flechas representan el

sentido de movimiento de iones, aunque todos los transportadores, a excepción de la Na+/K+‐ATPasa, pueden

trabajar en reverso. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2. ROMK: canal rectificador de K+; las

isoformas 2 y 3 se encuentran en la RAG. NHE3, NHE2: intercambiador de Na+/H+ de tipo 2 y de tipo 3; estas

dos isoformas se encuentran presentes en la membrana apical, y la isoforma 1 (NHE1, no representada en la

figura) se presenta en la membrana basolateral. CA4, CA2: anhidrasa carbónica 4, presente en el lumen, y

anhidrasa carbónica 2 citosólica. KCC4: cotransportador de K+‐Cl‐ de tipo 4. CLC‐K1, CLC‐K2: canales de Cl‐

basolaterales CLC‐K de tipo 1 y 2 respectivamente. Los canales CLC‐K requieren de Barttina para su

funcionamiento. ATP1A1, ATP1B1, Fxyd2: subunidades α1, β1 y γ2A‐B de la Na+/K+‐ATPasa respectivamente. K+

channels: canales basolaterales de K+. Para detalles, ver texto principal.

Figura adaptada de Gonzalez‐Vicente y col (wp3882), J Am Soc Nephrol, 20178

13

Introducción

La regulación de la actividad del NKCC2 es compleja e involucra diferentes mecanismos,

entre ellos que se destacan el tráfico de membrana y el grado de fosforilación, los cuales están

relacionados y funcionan en conjunto53, 61‐64.

El tráfico de membrana regula la actividad del NKCC2 modulando el número de

transportadores en la membrana apical por medio de la regulación del balance entre endocitosis

y exocitosis. Estudios de marcación con biotina realizados en RAG de ratas indican que, en

condiciones basales, solo el 5% del total de NKCC2 se encuentra en la membrana apical65.

Además, cerca del 40% del total de NKCC2 se encuentra a una distancia hacia el interior de la

membrana apical de 0,1 µm; mientras que el resto se encuentra alejado de la membrana apical

por una distancia de entre 0,1 y 1,5 µm66. La abundancia del NKCC2 en la membrana apical, se

mantiene relativamente constante a expensas de una continua inserción y recuperación de

transportadores. La velocidad de recambio del NKCC2 en la RAG es de aproximadamente

1%/min67, 68.

La actividad del NKCC2 es también regulada por fosforilación. Estudios de proteómica

demostraron que el NKCC2 se fosforila en varios aminoácidos, incluyendo los residuos de Ser 87,

126 y 874, y los de Thr 96 y 10169, 70. Los residuos de Thr 96, Thr 101 y Ser 126 en las secuencias

de rata parecen ser clave en términos de regulación por fosforilación71‐73.

1.3.2.2. ROMK

Debido a que la concentración luminal de Na+ es mayor que la de K+ y a que el NKCC2

transporta ambos iones en una proporción equimolar, la reabsorción continua de Na+ requiere

de la recirculación de K+ hacia el lumen. Para ello, cerca de la mitad del K+ reabsorbido por el

NKCC2 retorna hacia el lumen por medio de los canales de K+ ROMK74 (Figura 3).

Los canales ROMK están codificados por el gen Kcnj1. El splicing alternativo del gen produce

3 productos diferentes: ROMK1, ROMK2 y ROMK375. Sólo el ROMK2 y el ROMK3 se presentan en

la RAG76 y se localizan en la superficie apical77. El ROMK2 y el ROMK3 están compuestos por 372

y 378 aminoácidos y presentan pesos moleculares aparentes de 45 kDa. Los ROMK son canales

rectificadores78‐80. Presentan dos alfa‐hélices que atraviesan la membrana y dominios amino‐ y

carboxilo‐ terminales citoplasmáticos81. Al menos dos canales están formados por subunidades

14

Introducción

ROMK con conductancias aproximadamente 30 y 70 pS82, 83, de los cuales el primero se

expresa de manera constitutiva y el segundo en respuesta a dietas elevadas en K+ 83.

El reciclado de K+ mediante los ROMK es esencial para mantener el potencial positivo

del lumen de entre 5 y 10 mV característico de la RAG84‐86, que es utilizado para la

reabsorción paracelular de cationes como se detalla más adelante. Así, y en líneas generales,

los compuestos que bloquean los ROMK, tales como la glibenclamida o el U37883A reducen

la absorción de Na+, mientras que aquellos que favorecen su apertura, como el minoxidil,

tienen el efecto contrario87.

1.3.2.3. NHEs

La RAG reabsorbe alrededor del 15% del bicarbonato filtrado en contra del gradiente de

concentración, gracias a la presencia de anhidrasa carbónica intracelular y luminal y de

NHEs88 (Figura 3). Los NHEs intercambian Na+ y H+ en una estequiometria de 1:1, por lo que

son electroneutros. Poseen 10 o 12 hélices que transmembrana y un extenso dominio

citoplasmático carboxilo terminal. Las isoformas NHE2 y ‐3, codificadas por los genes Slc9a2

y Slc9A3, se expresan en la membrana apical de la RAG en ratas y ratones89‐91 y están

involucradas en la reabsorción de NaHCO3 en estas especies. En otras especies como el

conejo, la membrana apical de la RAG no evidencia ninguna tinción de NHE392, lo cual es

consistente con la ausencia de reabsorción de HCO3‐ en la RAG de dichos animales. Estudios

en túbulos proximales indican que NHE3 es regulado por fosforilación de los residuos de Ser

552 y 605, fenómenos de tráfico apical e interacciones de proteína a proteína93‐96; sin

embargo, ningunos de estos mecanismos ha sido estudiado aún en la RAG.

1.3.3. Transporte basolateral en la RAG

1.3.3.1. Na+/K+‐ATPasa

La Na+/K+‐ATPasa basolateral usa energía proveniente de la hidrólisis de ATP para

intercambiar 3 Na+ intracelulares por 2 K+ del intersticio (Figura 3). Este proceso establece

un gradiente electroquímico de Na+, el cual es utilizado tanto por NKCC2 como por NHE3.

Debido a su carácter electrogénico, la inhibición de Na+/K+‐ATPasa, altera el potencial

positivo del lumen en la RAG97, afectando así el transporte paracelular de otros cationes.

15

Introducción

La Na+/K+‐ATPasa está compuesta de tres subunidades: α, β y γ. En preparaciones purificadas

de Na+/K+‐ATPasa, las subunidades α y β se encuentran en proporción equimolar98, 99. La RAG

presenta principalmente las subunidades α1 y β1 (codificadas por los genes Atp1a1 y Atp1b1

respectivamente) en cantidades equivalentes99, 100. La subunidad α tiene 8 dominios de

transmembrana101 y regiones amino‐ y carboxilo‐ terminales citoplasmáticas101 y una masa

molecular de 112 kDa98. Esta subunidad posee los sitios de unión a sustratos y de actividad

catalítica102, 103.

La subunidad β tiene una masa molecular de 55 kDa, de los cuales solo 35 kDa son de

componente proteico. Esta subunidad tiene un dominio de membrana104, 105 y es necesaria para

la maduración de la enzima y su localización en la membrana plasmática106, 107.

La subunidad γ forma parte de la familia de proteínas FXYD108. El gen Fxyd2 codifica para dos

variantes de esta proteína (FXYD2a y FXYD2b) que se corresponden con las isoformas de la

subunidad γ presentes en la RAG, γa y γb respectivamente109, 110. Se conoce poco acerca del rol

de la subunidad γ en la regulación de la actividad de la Na+/K+‐ATPasa en la RAG, pero se supone

que regula la afinidad por los iones.

La actividad de la Na+/K+‐ATPasa está regulada en parte por fosforilación de la subunidad α,

en múltiples residuos entre los que se destacan los residuos de Ser 11, 18, 23 y 938. En la RAG, la

fosforilación de la Na+/K+‐ATPasa (dependiente de AMPc) aumenta la actividad de la enzima,

aunque no se conoce el residuo afectado111. En el túbulo proximal, la Na+ /K+‐ATPasa también es

regulada por tráfico intracelular, pero esto aún no ha sido estudiado en detalle en lo que

concierne a la RAG.

1.3.3.2. Canales de Cl‐

Los canales basolaterales de Cl‐ presentes en la RAG pertenecen a la familia CIC‐K (Figura 3).

Mediante estos canales, se transporta cerca del 50% del Cl‐ necesario para mantener la

reabsorción de NaCl, impulsado por el voltaje intracelular negativo de ‐40 a ‐70 mV. Dos

isoformas, CLC‐K1 y CLC‐K2, se expresan RAG112. Dichos canales están compuestos de 697

residuos de aminoácidos con una masa molecular de 75 kDa113, 114. Poseen 12 dominios

hidrofóbicos que atraviesan la membrana y regiones amino‐ y carboxilo‐ terminales

citoplasmáticas114, 115. La expresión funcional de los CIC‐Ks requiere de la presencia de Barttina,

16

Introducción

una subunidad accesoria que modifica su distribución subcelular e inserción en la

membrana, así como la apertura dependiente del voltaje112, 116.

1.3.3.3. KCC

Los KCC, son responsables de aproximadamente un 50% del transporte basolateral de

Cl‐, el cual es co‐transportado junto con K+ en una estequiometria 1:1117, 118. Existen cuatro

isoformas de KCC (KCC1, KCC2, KCC3, KCC4), de las cuales solo KCC4 se encuentra en la

RAG119 (Figura 3). La secuencia proteica de los KCC contiene 12 dominios transmembrana120.

Las isoformas KCC comparten una amplia región hidrofóbica flanqueada por dominios

amino‐ y carboxi‐ terminales citoplasmáticos de naturaleza hidrofílica121, 122. El cDNA del

KCC4, codificado por el gen Scl12A4, predice un polipéptido de 1150 residuos de

aminoácidos122. La regulación de KCC no se conoce en detalle. A su vez, tampoco es claro su

rol en la reabsorción de sal y en la regulación de la presión arterial.

1.3.3.4. Canales de K+

Los canales basolaterales de potasio transportan parte del K+ que ingresa a la célula por

medio del NKCC2 y la Na+/K+‐ATPasa hacia el espacio intersticial. En la RAG existen cuatro

tipos de canales basolaterales de K+: KCNK, KCNJ, KCNQ, y SLO123 (Figura 3).

1.3.4. Transporte paracelular en la RAG

Como consecuencia del transporte intercelular de NaCl y la recirculación de K+, se

genera un potencial positivo en el lumen en la RAG que impulsa a la reabsorción de Na+, Ca2+

y Mg2+ a través del espacio que existe entre células adyacentes50, 97. Hasta un 50% del total

del Na+ reabsorbido por la RAG atraviesa esta vía50, 124, la cual presenta selectividad por el

Na+ con una relación de permeabilidad PNa+/PCl‐ de aproximadamente 251, 97, 125. Este tipo

de transporte depende, en última instancia de las proteínas presentes en la uniones

estrechas que conectan las células epiteliales adyacentes, entre las que se destaca la

Claudina 19 (CLD19)126, 127.

17

Introducción

1.4. Control hormonal del transporte en la RAG

1.4.1. Vasopresina

El nanopéptido vasopresina, también conocido como hormona antidiurética (ADH), estimula

la retención de agua a nivel renal y es un potente vasoconstrictor. Su función primaria es

mantener la homeostasis del agua, en parte, mediante el aumento de la reabsorción de NaCl en

la RAG, contribuyendo así a crear el gradiente osmótico necesario para la reabsorción de fluido

en segmentos distales63, 128. En RAGs aisladas y perfundidas in vitro, la ADH estimula la absorción

de Cl‐ y aumenta el voltaje transepitelial129, 130. Estos efectos están limitados a la RAG medular97,

131, y se deben principalmente a cambios en la actividad del cotransportador NKCC2132, 133.

La ADH estimula la translocación del NKCC2 desde el citosol hacia la membrana apical.

Estudios in vivo en ratones indican que el análogo de vasopresina, (deamino‐Cys‐d‐Arg

vasopresina), estimula la fosforilación del NKCC2 en residuos de tirosina amino‐terminales, lo

cual se correlaciona con un aumento en el número de cotransportadores NKCC2 en la membrana

apical con respecto a los niveles basales66.

La ADH incrementa los niveles de AMPc en la RAG134, 135, el cual induce un aumento del

número de transportadores en la membrana apical vía inserción exocitótica136. Estos efectos son

mediados por la proteína quinasa A dependiente de AMP (PKA)136. Analizados conjuntamente,

estos resultados indican que la ADH aumenta la reabsorción del NaCl en la RAG a través de un

mecanismo que involucra su unión al receptor de vasopresina de tipo 2 (V2), activación de la

cascada AMPc‐PKA (Figura 4) y aumento de la fosforilación del NKCC2 y posterior inserción de

cotransportadores adicionales en la membrana apical. Comprender la vía se señalización

AMPc/PKA/NKCC2 es relevante para interpretar los resultados del presente Trabajo de Tesis ya

que los efectos natriuréticos del NO están mediados por la inhibición de la misma como de detalla

a continuación.

18

Introducción

Figura 4: Vías de señalización de la hormona antidiurética (ADH) en la rama gruesa ascendente. Las líneas

terminadas en flechas indican estimulación y las líneas terminadas en “T” inhibición. Las líneas punteadas

representan mecanismos que no se conocen en detalle. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2.

ROMK: canal rectificador de K+. NHE3: intercambiador de Na+/H+ de tipo 3. AC: Adenilil ciclasa. PKA: proteína

quinasa A. AMP: adenosín monofosfato. AMPc: adenosín monofosfato cíclico. V2R: receptor de ADH de tipo 2.

Figura adaptada de Gonzalez‐Vicente y col, Physiol Rev, 20185

19

Introducción

1.4.2. NO y peroxinitrito

El NO es un radical libre altamente difusible producto de la acción de enzimas óxido‐

reductasas sobre la L‐arginina y el oxígeno137. Estas enzimas se conocen como óxido nítrico

sintasas (NOSs) y pertenecen a una familia que contiene tres isoformas, la neuronal (NOS1 o

nNOS), la inducible (NOS2 o iNOS) y la endotelial (NOS3 o nNOS)138‐140. Las distintas isoformas de

NOSs presentan una homología mayor al 55 % y son codificadas por los genes homónimos Nos1,

Nos2 y Nos3138‐140. Las formas catalíticamente activas de NOSs se constituyen como

homodímeros ligados por calmodulina, donde cada subunidad, presenta un dominio C‐terminal

con actividad reductasa y un dominio N‐terminal con actividad oxigenasa138‐140. La síntesis de NO

implica varios pasos en los que electrones son transferidos, desde intermediarios reductores al

oxígeno, que luego se incorpora a la L‐arginina causando la liberación de L‐citrulina y NO138‐140.

Así, el dominio reductasa presenta los sitios de unión para la NADPH, el flavina mononucleótido

(FMN) y la flavina adenina dinucleótido (FAD), mientras que el dominio oxigenasa presenta los

sitos de unión para el grupo hemo, la (6R‐)5,6,7,8‐tetrahidrobiopterina (BH4), el oxígeno y la L‐

arginina138‐140.

La habilidad del NO para inhibir el transporte en la RAG fue demostrada por primera vez in

vitro utilizando RAGs de ratas perfundidas y aisladas, donde la incorporación de un donante de

NO redujo la reabsorción neta de Cl‐ 141. Subsecuentemente, se comprobó que la estimulación de

la producción de NO usando el sustrato común a todas las NOSs, L‐Arginina142, 143 disminuye la

absorción neta de Cl‐ 141, 142 y la reabsorción de HCO3‐ 143. El inhibidor de NOS L‐NAME, bloquea

los efectos de la L‐arginina143, 144. Tomados en conjunto, estos datos indican que el NO producido

endógenamente inhibe el transporte de iones en la RAG.

En la RAG, se expresan las tres isoformas de NOS (NOS1, 2 y 3)145, y el sustrato común L‐

arginina estimula la producción de NO y reduce el transporte en RAGs de ratón aisladas146. Este

efecto no se ve afectado en ratones knockout para NOS1 o NOS2 pero se encuentra

drásticamente disminuido en ratones knockout para NOS3, indicando que el NO proveniente de

esta isoforma es responsable de la reducción en las tasas de transporte en la RAG en respuesta

a la generación de NO inducida por L‐arginina. Más importante, la reintroducción de NOS3 en la

médula renal de ratones knockout para NOS3 mediante el uso de adenovirus, reestablece los

20

Introducción

efectos inhibidores del transporte de la L‐arginina146, 147. Por lo tanto, el NO producto de la

isoforma NOS3 regula el transporte en la RAG4.

El mecanismo por el que el NO inhibe la reabsorción de NaCl se conoce en profundidad,

y esta mediado por la reducción del tráfico del NKCC2 hacia la membrana luminal y por el

aumento de su endocitosis53, 68, 148.

Experimentos de electrofisiología demuestran efectos específicos del NO sobre el NHE3

y ROMK4. Sin embargo, tanto el bloqueante de NHE3 amilorida como el aumento de la

permeabilidad al K+ utilizando ionóforos, tienen un impacto mínimo sobre la magnitud de la

inhibición del transporte neto en la RAG en respuesta al NO149, lo cual sugiere que la

participación de NHE3 y ROMK es mínima en este proceso. La acción del NO sobre estos

transportadores se discutirá más adelante.

Los efectos del NO sobre la Na+/K+‐ATPasa fueron estudiados midiendo cambios en el

consumo de oxígeno (QO2), un indicador de transporte activo, a diferentes [Na+]

intracelulares. Estos experimentos, demostraron que el NO no produce cambios en la

velocidad máxima de la Na+/K+‐ATPasa o en su afinidad por el por el Na+ 149; parámetros que

tampoco fueron afectados por la inhibición de proteínas quinasas dependientes de GMPc150.

Tomados en conjunto estos resultados indican que el NO carece de un efecto directo sobre

la Na+/K+‐ATPasa. Sin embargo, en presencia de O2‐, el cual reacciona con el NO formando

peroxinitrito, se evidencia un efecto inhibitorio sobre la Na+/K+‐ATPasa151, 152.

La cascada de señalización por la que el NO inhibe el transporte en la RAG involucra

GMPc y AMPc (Figura 5). La evidencia de que el NO activa a la guanilil ciclasa soluble (GCs) y

la subsiguiente producción de GMPc en la RAG, proviene de que el inhibidor de GCs LY83583

bloquea la disminución de la reabsorción neta de Cl‐ causada por la L‐arginina142, mientras

que el cyclofosfato de GMPc (un mimético del GMPc no hidrolizable) imita el efecto de la L‐

arginina148.

Una vez producido, el GMPc activa a la fosfodiesterasa 2 (PDE2) la cual reduce los niveles

de AMPc. Así, se demostró que los inhibidores de PDE2 como el KT5823, disminuyen la

capacidad de la L‐arginina 142 y cyclofosfato de GMPc de reducir la reabsorción de Cl‐148.

Además, en RAGs tratados con cyclofosfato de AMPc (un análogo de AMPc permeable a

21

Introducción

membrana y resistente a PDE2) la L‐arginina no ejerce un efecto inhibitorio en la reabsorción

neta de Cl‐.

El mecanismo principal por el cual el GMPc regula la actividad del NKCC2 es a través de

cambios en el tráfico de membrana del mismo. Así, los análogos de GMPc disminuyen los niveles

del NKCC2 en la membrana superficial de las RAGs, pero no su expresión total148, y el inhibidor

de PDE2 BAY60‐7550 bloquea este efecto148.

El NO también reduce la reabsorción NaHCO3 por sus acciones en los NHEs. Los donantes de

NO, reducen la velocidad de recuperación del pH intracelular luego de un pulso ácido en RAGs

aisladas153 , indicando que el NO interfiere con la actividad de los NHEs. En consonancia con estos

resultados, la producción endógena de NO en RAGs aisladas, disminuye reabsorción de HCO3‐143.

Estos efectos fueron bloqueados por el inhibidor de la quinasa dependiente de GMPc (PKG) KT‐

5823143 (Figura 5), demostrando que la vía de señalización difiere de la que inhibe al NKCC2. El

detalle de cómo PKG regula la actividad de NHE3 en la RAG sigue sin ser investigado aún.

Finalmente, el NO puede también inhibir la conductancia del ClC‐K, en un mecanismo que

involucra GMPc y PKG154, y el movimiento transcelular de iones155, 156 (Figura 5).

Los niveles de expresión de la enzima NOS3 en la medula renal externa se encuentran en

parte modulados por el contenido de NaCl de la dieta157, 158, dado que esto es de vital relevancia

para el desarrollo de hipertensión sensible a la sal18 se discutirá con cierto detalle.

El tratamiento con una dieta rica en NaCl, tiene un efecto bifásico en la expresión de NOS3

en la RAG de ratas Sprague‐Dawley. Entre los días 1 a 7, la expresión de NOS3 aumenta159. Sin

embargo, la liberación de NO aumenta al día 1 del tratamiento dietario y retorna a niveles basales

a partir del día 3. Esta disociación temporal entre la expresión de la enzima y la producción de

NO se encuentra acompañada por una disminución del 40% en la fosforilación del residuo

inhibidor Thr 495 al día 1 y de un aumento de más del 200% en la fosforilación de dicho residuo

luego del día 3159, lo cual indica que la producción de NO se regula extensamente mediante la

fosforilación de NOS3 y por sobre su expresión proteica. Se demostró además que, no obstante

la producción de NO en respuesta a estímulos fisiológicos no se ve modificada luego de 7 días de

tratamiento dietario, el efecto inhibitorio que el NO ejerce sobre las tasas de transporte en la

RAG se encuentra preservado o incluso aumentado160. Finalmente la expresión de NOS3 retorna

22

Introducción

a niveles basales al día 14 y se mantiene en dichos niveles el día 28 (al menos) del tratamiento

con una dieta rica en sal159.

Figura 5: Vías de señalización del óxido nítrico (NO) en la rama gruesa ascendente. Las líneas terminadas

en flechas indican estimulación y las líneas terminadas en “T” inhibición. Las líneas punteadas representan

mecanismos que no se conocen en detalle. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2. ROMK: canal

rectificador de K+. NHE3: intercambiador de Na+/H+ de tipo 3. CLD19: Claudina 19. CLC‐K: canal de Cl‐ CLC‐K.

NOS3: óxido nítrico sintasa 3. CGs: guanilil ciclasa soluble. GMPc: guanosín monofosfato cíclico. PKG: proteína

quinasa G. PDE2: fosfodiesterasa 2. PKA: proteína quinasa A. AMP: adenosín monofosfato. AMPc: adenosín

monofosfato cíclico. V2R: receptor de ADH de tipo 2.


23

Introducción

En conjunto estos estudios demuestran la presencia de 2 mecanismos antagónicos. Por un

lado, la dieta rica en NaCl produce un aumento en la fosforilación del residuo de Thr 495 de las

NOS3 lo cual disminuye o inhibe la producción de NO; por el otro, una respuesta compensatoria

aumenta la expresión de la enzima y la sensibilidad al NO. Si bien los mecanismos que llevan a

estos cambios no han sido estudiados todavía, es probable que la producción del anión O2‐ y la

activación de la PKC participen de ellos como se detalla a continuación.

1.4.3. Anión superóxido y peróxido de hidrógeno

La médula renal es la fuente primaria de O2‐ en el riñón161. Si bien está aceptado que la Ang

II estimula la producción de O2‐ en la RAG principalmente a través de enzimas NADPH oxidasa162,

163, estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que otras fuentes de O2‐ son

responsables de entre un 10 164, 165 y un 40% 162 del total de O2‐ producido en respuesta a la

estimulación con Ang II. Sin embargo, en dichos estudios la identidad de tales fuentes no fue

identificada.

Estímulos fisiológicos, tales como el flujo luminal166 y la Ang II167 aumentan el transporte en

la RAG por mecanismos dependientes de PKC, NADPH oxidasa y la producción de O2‐ 165, 168.

Además de este mecanismo, el O2‐ reduce la biodisponibilidad de NO, dañando así una vía

inhibitoria144 (Figura 6).

Parte del efecto estimulante del O2‐ sobre el transporte neto en la RAG, se debe a un

aumento de la actividad del NKCC2169. Por otra parte, el O2‐ también estimula la actividad de NHE

en la membrana apical, mientras que inhibe la actividad de NHE basolateral170. La explicación de

esta diferencia podría deberse a que el NHE en la membrana apical es de tipo 3, mientras que el

que se encuentra en la membrana basolateral es de tipo 1, sin embargo, eso aún debe ser

investigado. Finalmente, el O2‐ generado mediante hipoxantina/xantina oxidasa no afecta la

actividad de la Na+/K+‐ATPasa, pero induce una leve inhibición de la conductancia de la

membrana apical169.

Aunque hay un consenso general en torno al efecto estimulante del O2‐ derivado del

complejo NADPH sobre el transporte de NaCl en la RAG, no existe un consenso sobre las

isoformas de las subunidades catalíticas (NOXs) involucradas en dicho proceso.

24

Introducción

Figura 6: Vías de señalización del anión superóxido (O2‐) en la rama gruesa ascendente. Las líneas


representan mecanismos que no se conocen en detalle. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2. NHE3:

intercambiador de Na+/H+ de tipo 3. NHE: intercambiador de Na+/H+ inespecífico de localización basolateral.

NOX: NADPH oxidasa inespecífica. PKCα: proteína quinasa C alpha.


Originalmente, la isoforma NOX2 y la subunidad p47phox fueron identificadas como la

fuente principal de O2‐ en este segmento163. Se demostró además que la disrupción del gen

que codifica para la subunidad p67phox de la NOX2, disminuye la producción de O2‐

dependiente de NADPH oxidasa en la médula renal de ratas Dahl sensibles a la sal, y que

además disminuye la elevación de presión en dichos animales171. Por el contrario, se

demostró que la producción de O2‐ inducida por el flujo luminal y Ang II en la RAG es

25

Introducción

dependiente de NOX4 e independiente de NOX2162, 165, 172. Parte de la discrepancia en los

hallazgos, pueden deberse a limitaciones en las técnicas de medición empleadas, que solo

miden a nivel general la disponibilidad de O2‐. De todos modos, la redundancia de la cascada O2

‐

/PKC/NADPH/ O2‐ 165 sugiere que los mecanismos que regulan la actividad de las isoformas NOXs

son interdependientes; por eso, la inhibición de una isoforma especifica puede afectar la

activación de otras isoformas e inducir un error en el cálculo de la contribución de cada una a la

producción global de O2‐.

El H202 es un metabolito del O2‐, formado endógenamente producto de la dismutación del

O2‐ por las enzimas superóxido dismutasas (SODs)173. El H202 posee efectos vasoconstrictores y

antinatriuréticos en la médula renal174, 175 que contribuirían a elevar la presión arterial. Sin

embargo los efectos del H202 sobre la RAG son poco claros176, y la estimulación de RAGs aisladas

con H202 en concentración 200 nM no altera la reabsorción neta de NaCl177.

1.4.4. Ang II

La Ang II es un importante regulador de la velocidad de transporte de iones a lo largo de toda

la nefrona, sin embargo, y a pesar de que la Ang II y la RAG tienen un papel muy relevante en la

regulación de la presión arterial, existen relativamente pocos estudios que hayan explorado el

efecto de la Ang II sobre la reabsorción de NaCl o NaHCO3 en este segmento.

La Ang II tiene un efecto bifásico sobre el NKCC2, estimulando la absorción de NaCl a bajas

concentraciones e inhibiéndolo a concentraciones altas178. De esta forma, los efectos fisiológicos

de la Ang II sobre la RAG estarán determinados por la concentración de Ang II en la médula renal,

aunque también dependerán de la presencia de otras hormonas que puedan modificar los niveles

basales de AMPc como se detalla a continuación.

El hecho de que la Ang II pueda inhibir la reabsorción de Cl‐ en la RAG179‐181 se encuentra en

aparente discordancia con la visión general de que la Ang II estimula la retención de sal y fluidos

en el riñón182. Sin embargo, in vivo, la Ang II puede inhibir o estimular la reabsorción de Cl‐,

dependiendo de los niveles de AMPc intracelulares. Así, cuando los túbulos son tratados con

AMPc180 o con noradrenalina179, 180 la Ang II estimula el transporte de Cl‐. De manera similar, la

26

Introducción

Ang II puede elevar el QO2, luego de una inhibición temporal del transporte en RAGs pre‐

tratadas con ADH183.

Figura 7: Vías de señalización de la angiotensina (Ang) II en la rama gruesa ascendente. Las líneas


representan mecanismos que no se conocen en detalle. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2. NHE3:

intercambiador de Na+/H+ de tipo 3. CLC‐K: canal de Cl‐ CLC‐K. AT1R: receptor de angiotensina de tipo 1. AT2R:

receptor de angiotensina de tipo 2. PLA: fosfolipasa A2. PLC: fosfolipasa C. PI3K: fosfatidilinositol 3’ quinasa.

NOS3: óxido nítrico sintasa 3. PKC: proteína quinasa C. NOX4: NADPH oxidasa 4. O2‐: anión superóxido.


Las cascadas de señalización, que median las acciones de la Ang II sobre la actividad del

NKCC2 no están definidas claramente. Se sabe que la activación del receptor AT1 es

necesaria tanto para la inhibición178, 181, 183 como para la estimulación del transporte neto178,

27

Introducción

183. Respecto a los efectos del receptor AT2 sobre la velocidad de transporte en en la RAG se

detallan en la literatura tanto efectos nulos181 como inhibitorios184.

Entre los intermediarios que pueden mediar los efectos inhibitorios de la Ang II se

encuentran: 1) NO184; 2) 20‐HETE178 y 3) reducciones en AMPc183 (Figura 7). Por el contrario, entre

los intermediarios con efectos estimulatorios se encuentran: 1) PKC178; 2) O2‐ 183; y 3) modulación

de la vía AMPc/PKA180 (Figura 7).

La Ang II aumenta la producción de NO en RAGs de rata, a través de un mecanismo que

involucra al receptor AT2184, 185. Este efecto es dependiente de la enzima Akt, ya que la

preincubación de los túbulos con un inhibidor de Akt previene la síntesis del NO inducida por Ang

II, así como la fosforilación de NOS3 inducida por Ang II en los residuos de Ser 663 y 1177185.

Particularmente, la enzima Akt1 intervendría en estas acciones ya que la Ang II incrementa la

fosforilación en el residuo de Ser 473 de dicha isoforma de Akt, y el silenciamiento transiente de

la expresión de Akt1 reduce la generación de NO estimulada por la Ang II185.

La Ang II, actuando en el receptor AT1 activa a la fosfolipasa A2 en la RAG186 dando lugar a

la formación de derivados del ácido araquidónico. El 20‐HETE, sintetizado por las enzimas

citocromo P450‐omega hidroxilasas187, inhibe el transporte de NaCl a través de diversos

mecanismos. Inicialmente se demostró que el 20‐HETE disminuye la absorción de 86Rb+ (una

medida de actividad de NKCC2) en suspensiones de RAGs de conejo188, efecto que fue inhibido

por furosemida189. Estos resultados indican que el 20‐HETE inhibe al NKCC2. Además, el 20‐HETE

es también un intermediario por el cual la Ang II reduce la reabsorción de HCO3‐ mediada por

NHEs190 (Figura 7). Los detalles de los mecanismos inhibitorios del 20‐HETE se desconocen, sin

embargo, la importancia relativa de las cascadas de señalización inhibitorias iniciadas por Ang II

y mediadas por 20‐HETE o por NO, puede depender de la presencia de L‐arginina en el medio.

Los reportes que demuestran que el 20‐HETE inhibe el transporte en la RAG se obtuvieron en

condiciones limitantes de L‐Arginina178, lo que abre el interrogante sobre la relevancia de esta

vía cuando la producción de NO se encuentra inalterada.

Por otra parte, la Ang II, actuando sobre el receptor AT1, ejerce un efecto estimulatorio sobre

el NKCC2 el cual es mayormente mediado por aumentos en la producción de O2‐ dependientes

de PKCα4, 165, 177 (Figura 7). La mayor parte del O2‐ generado en la RAG en respuesta a la

28

Introducción

estimulación con Ang II proviene de las NADPH oxidasas, ya que el efecto generador de O2‐

está drásticamente reducido en ratones knockout para la subunidad p47phox del complejo

NADPH oxidasa165, o en presencia de inhibidores de dicha enzima165. Interesantemente, la

Ang II no es capaz de inducir la producción de O2‐ en túbulos de ratones knockout para la

subunidad catalítica de la NADPH oxidasa 4 (NOX4), mientras que el efecto se encuentra

conservado en ratones que no expresan la isoforma NOX2162. Estos datos indican a la NOX4

sería el mediador de la generación de O2‐ en respuesta a Ang II. Sin embargo, el hecho de

que se detecte producción de O2‐ en los animales que no expresan la subunidad p47phox es

en cierta medida contradictorio, ya que en teoría, la subunidad catalítica NOX4 no requiere

del ensamble dentro de un complejo NADPH oxidasa para su actividad191, 192. Este punto

requiere una investigación más detallada para ser aclarado.

Además, la acción de la Ang II sobre el receptor AT1 estimula los canales ClC‐K mediante

una cascada similar a la que promueve la actividad del NKCC2167 (Figura 7).

Finalmente, los niveles de AMPc celulares pueden modular tanto acciones inhibitorias

como estimulatorias180, 183. Tomados en conjunto estos datos parecen indicar que los

principales efectos de la Ang II son estimulatorios sobre el NKCC2 y los canales basolaterales

de Cl‐, e inhibitorios sobre la actividad de NHEs (Figura 7).

1.4.5. Endotelina

Las endotelinas (ET) son una familia de proteínas compuesta por tres integrantes, todos

ellos constituidos por 21 aminoácidos codificados por tres genes diferentes: Et‐1, Et‐2 y Et‐

3193. La ET‐1 fue inicialmente identificada como un potente vasoconstrictor producido por

las células vasculares endoteliales194, 195. Sin embargo, sus efectos dependen del tipo de

receptor al que se une. Existen dos receptores de endotelina en humanos: ETA

(predominantemente en músculo liso vascular y en miocitos) y ETB (más abundante en

células endoteliales y túbulo renal)196. Los receptores ETA y ETB, suelen tener efectos

antagónicos. El papel de la ET‐1 y el receptor ETB en el transporte y la reabsorción de Na+ se

evidenció claramente mediante la generación de hipertensión sensible a la sal luego de

deleción o bloqueo crónico de la función del receptor ETB197, 198.

29

Introducción

Figura 8: Vías de señalización de la endotelina‐1 (ET‐1) en la rama gruesa ascendente (RAG). Las líneas


representan mecanismos que no se conocen en detalle. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2. ETB:

receptor de endotelina B. PI3K: fosfatidilinositol 3’ quinasa. PIP2: fosfatidilinositol difosfato. PIP3: fosfatidilinositol

(3,4,5)‐trisfosfato. Akt: proteína quinasa B. NOS3: óxido nítrico sintasa 3. NO: óxido nítrico. PDK1: quinasa de tipo 1

dependiente de fosfoinosítidos, se presenta en color naranja porque su presencia aún no ha sido demostrada en la

RAG.


En el riñón, la RAG es la segunda mayor fuente de ET‐1199 luego del túbulo colector. La ET‐1

desempeña un importante papel regulador del transporte en la RAG200. En RAG aisladas y

perfundidas de ratas y ratones, la incubación con ET‐1 inhibe la reabsorción de Cl‐ 201, 202. La

remoción de L‐arginina de las soluciones experimentales o el agregado de L‐NAME bloquean este

efecto202 indicando que NO participa del efecto inhibitorio de la ET‐1, el cual es mediado por una

reducción en la actividad del NKCC2203. Las acciones inhibidoras de ET‐1 sobre el transporte en la

30

Introducción

RAG se deben a la activación de los receptores ETB201, 202. La cascada de señalización de ET‐1

en ratas es relevante para el presente Trabajo de Tesis y se muestra en la Figura 8.

1.4.6. Aldosterona

La regulación del transporte en la RAG por la aldosterona no se comprende con claridad

aún. En particular, si bien la RAG expresa tanto receptores de glucocorticoides como de

mineralocorticoides, los bajos niveles de la enzima 11ß hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo

2, la cual inactiva a los glucocorticoides y brinda selectividad a los receptores

mineralocorticoides, sugiere que, en este segmento la actividad glucocorticoide estaría

favorecida por sobre la aldosterona204, 205.

La escasa información disponible hasta el momento, indica que la aldosterona

disminuye la reabsorción de HCO3‐ mediante la inhibición de la actividad de NHE3 a través

un mecanismo no‐genómico dependiente de ERK1/2206‐208. Sin embargo, la relevancia

fisiológica de estos hallazgos debe aún ser determinada. Finalmente, se desconoce si la

aldosterona regula la actividad del NKCC2.

31

Introducción

1.5. Hipótesis

La Ang II regula la reabsorción renal de Na+ y fluidos de manera directa a nivel del túbulo

proximal, asa de Henle y túbulo colector. Existe una estrecha relación entre las acciones renales

de la Ang II, el balance hidrosalino y la presión arterial. Los modelos de infusión de Ang II,

utilizados para estudiar la patología hipertensiva, cursan con una fase inicial de retención de Na+

y fluidos. Sin embargo, poco se sabe sobre las velocidades de transporte de iones a lo largo de la

nefrona que puedan conducir a la antidiuresis y antinatriuresis. La RAG tiene particular relevancia

en la regulación del balance hidrosalino, no solo porque reabsorbe el 30% del Na+ filtrado en el

glomérulo, sino porque el transporte de Na+ en este segmento es esencial para la generación del

medio hiperosmolar en la médula renal necesario para reabsorber agua en el túbulo colector.

Los modelos de infusión de Ang II, cursan con una reducción en la producción sistémica de

NO acompañada de una elevada formación de O2‐. Desbalances entre la señalización del O2

‐ y el

NO en favor del primero dentro de la médula renal, causan hipertensión sensible a la sal. Por ello,

es posible que el aumento de reabsorción de iones en la RAG sea una consecuencia directa de

alteraciones en la biodisponibilidad local de NO en sus vías de señal.

La hipótesis en la que se basó la presente Tesis Doctoral postula que durante el desarrollo

de la patología hipertensiva en los modelos de infusión de Ang II, el transporte neto en la RAG se

encuentra aumentado debido a una deficiencia en el sistema del NO local. Dado que la Na+/K+‐

ATPasa provee la energía para todos los procesos de transporte en este segmento, la deficiencia

local de NO directa o indirectamente aumenta su actividad.

32

Introducción

1.6. Objetivos Generales

Entre los objetivos generales de este Trabajo de Tesis se encuentran:

1. Estudiar la participación de la RAG, en el desarrollo de la patología

hipertensiva inducida por Ang II.

2. Estudiar los parámetros cinéticos de la Na+/K+‐ATPasa que podrían

contribuir a elevar el transporte neto de Na+.

3. Analizar la vía de señalización del NO en la RAG en etapas tempranas del

desarrollo del modelo de hipertensión inducido por Ang II.

4. Estudiar los mecanismos por los cuales la estimulación aguda con Ang II

induce la producción de O2‐ por parte de las enzimas NOSs en la RAG.

1.6.1. Objetivos específicos

Primera Parte

Objetivo 1: Investigar la actividad de la Na+/K+‐ATPasa en preparados de RAGs,

obtenidos de animales infundidos de manera subcutánea con Ang II o vehículo

por un período de 7 días.

Objetivo 2: Investigar si la infusión subcutánea de Ang II durante 7 días, altera

la actividad de la Na+/K+‐ATPasa de manera directa, modulando parámetros

cinéticos, o de manera indirecta dando lugar a una mayor disponibilidad de

Na+ intracelular.

33

Introducción

Segunda Parte

Objetivo 1: Investigar los efectos de la infusión subcutánea de Ang II

durante períodos de 24 hs y 5 días sobre la expresión proteica de la NOS3 en

la RAG, y el nivel de fosforilación de la misma en el residuo de Thr 495.

Objetivo 2: Investigar la capacidad de producción de NO en RAGs aisladas

provenientes de animales que fueron infundidos de manera subcutánea con

Ang II o vehículo por un período de 5 días, en respuesta a estímulos

natriuréticos, utilizando la señalización de ET‐1 como modelo.

Tercera Parte

Objetivo 1: Investigar los mecanismos por los cuales la estimulación aguda

con Ang II puede aumentar la producción de O2‐ en detrimento de la síntesis

de NO por parte de las enzimas NOSs en la RAG, y de esto modo contribuir a

reducir la biodisponibilidad de NO durante la exposición a una infusión crónica

de Ang II.

34

Capítulo 2

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Reactivos

Los siguientes productos fueron obtenidos de Sigma Aldrich (Saint Louis, Missouri, EE.UU):

HEPES, Tris‐HCl, imidazol, glucosa, sacarosa, manitol, cloruro de sodio, cloruro de potasio, fosfato

de sodio monobásico, sulfato de magnesio, citrato de sodio, lactato de calcio, cloruro de

magnesio, vanadato de sodio, EGTA, EDTA, dimetilsulfóxido (DMSO), DL‐alanina, L‐arginina,

dodecil sulfato de sodio (SDS), igepal, ouabaína, antipaína, aprotinina, leupeptina, quimostatina,

pepstatina, benzimidina, nitrato de bis‐N‐metilacridinio (Lucigenina), ácido 4,5‐dihidroxi‐1,3‐

bencenodisulfónico (Tiron), 1‐(4‐Hidroxi‐3‐metoxifenil)‐etanona (apocianina), Gö6976 así como

también la colagenasa de Tipo I, el inhibidor de proteasas de composición no declarada “pf‐block”

y buffer de lisado “CelLytic™ M”.

Los fluoróforos que atraviesan la membrana plasmática, tetraacetato de sodio‐verde (Na‐

green; número de catálogo: S6901) y diacetato de diaminofluoresceína‐FM (DAF‐FM; número de

catálogo: D23844), fueron obtenidos de Invitrogen (Nueva York, EE.UU).

La ouabaína marcada con tritio ([3H]ouabanina, #NET211001MC) y el líquido de centelleo

(Ultima Gold, #6013326) se obtuvieron de Perkin Elmer (Waltham, Massachusetts, EE.UU).

El reactivo para medir proteínas Coomassie Blue, fue obtenido de Thermo‐Scientific

(Rockford, Illinois, EE.UU).

Los péptidos Ang II y ET‐1 fueron obtenidos de BACHEM (Torrance, California, EE.UU).

El PIP3 (P‐3916, 0,1mg) y el sulfato de neomicina utilizado como “vehículo” (P‐9C1, 50 nmol)

se obtuvieron de Echelon Biosciences (Salt Lake City, Utah, EE.UU).

2.2 Buffers utilizados

Los buffers se prepararon de acuerdo a la Tabla 1.

36


Tabla 1: Buffers utilizados

2.3 Animales

Las ratas Sprague‐Dawley macho utilizadas para la realización de este Trabajo de Tesis,

provinieron del Laboratorio Charles River (Kalamazoo, Michigan, EE.UU). Una vez arribados

al bioterio, los animales fueron mantenidos en jaulas con viruta de madera estéril, a una

temperatura de 21 ± 2 ºC, bajo un fotoperíodo controlado con ciclos de 12 hs de luz y 12 hs

de oscuridad. Los animales recibieron una dieta control artificial (TestDiet 5876) compuesta

por 18,6 % de proteína, 59,3 % de hidratos de carbono y 10 % de grasa. La dieta posee un

contenido calórico de 4,02 kcal/kg y 100 mEq/kg de Na+ (ANEXO 1). Los animales tuvieron

provisión ad libitum de agua potable.

Se tuvo especial cuidado en minimizar el estrés y el sufrimiento de los animales en todas

las etapas de investigación. Todos los experimentos fueron aprobados por los Comités

Institucionales para el Cuidado y Uso de Animales, del Hospital Henry Ford y la Universidad

Case Western Reserve. Además todos los experimentos fueron conducidos de acuerdo a las

37


recomendaciones del National Institute of Health (Bethesda, MD, EE.UU) publicadas en la Guía

para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación Nº 85‐23, revisada en el año 1996,

Oficina de Ciencia y Reportes de Salud, División Recursos de Investigación, NIH, Bethesda, MD,

EE.UU).

2.4 Anestesia y eutanasia

Para la implantación de las mini‐bombas osmóticas, los animales fueron anestesiados con

Isofluorano. Para la cirugía terminal, los animales fueron anestesiados con un cóctel de ketamina

(100 mg/kg de peso corporal) y xylazina (20 mg/kg de peso corporal) administrado por vía i.p. En

todos los casos el plano anestésico se determinó mediante la ausencia de los reflejos corneal y

pedal. A los animales cuyos riñones fueron perfundidos in vivo, se les administró además 1 unidad

de heparina cada 100 g de peso. Luego de obtenidas las muestras correspondientes, los animales

fueron sacrificados mediante la creación de un neumotórax y perforación cardíaca. Para la

eutanasia de animales que por algún motivo no llegaron a la cirugía terminal, se utilizó una

cámara de CO2.

2.5 Infusión de Ang II y furosemida

Transcurrido un período de aclimatación de entre 5 y 7 días, ratas con un peso corporal de

170‐190 g (6‐7 semanas de edad) fueron divididas aleatoriamente en dos grupos: 1) Control, que

recibió vehículo (0,01 % ácido acético); 2) Ang II, que recibió Ang II (200 ng/kg/min). Ambos

tratamientos fueron administrados de manera subcutánea mediante el empleo de mini‐bombas

osmóticas ALZET (Cupertino, CA, EE.UU.), modelo 1007D durante 7 días. Al 7mo día de infusión los

animales fueron sacrificados y procesados de a pares. En algunos experimentos fue necesario

coinfundir furosemida, para lo que se implantó una segunda mini‐bomba osmótica ALZET modelo

2001. Así quedaron conformados otros dos grupos 1) Control + furosemida (Control + F), que

recibió vehículo más furosemida (1,1 mg/kg/día); y 2) Ang II + furosemida (Ang II + F), el cual

recibió Ang II (200 ng/kg/min) junto con furosemida (1,1 mg/kg/día). Como en el caso anterior,

al 7mo día de infusión los animales fueron sacrificados y procesados de a pares.

38


Para la infusión de Ang II durante 5 días se siguieron los mismos lineamientos que para

la infusión durante 7 días de los grupos Control y Ang II, con la única excepción de que los

animales tenían un peso de 90‐120 g (5 semanas de edad) al momento de implantarles la

mini‐bomba osmótica. El motivo por el cual se utilizaron ratas más jóvenes es que al término

de la infusión los animales deben estar por debajo de los 170 g para que la disección manual

de los túbulos renales sea posible.

2.6 Medición directa de la presión arterial

La presión arterial se midió en animales anestesiados, inmediatamente antes de la

cirugía terminal. Para ello se accedió a la arteria femoral mediante el uso de una cánula de

polietileno (PE‐10) estirada con calor, conectada a un transductor de puente. La señal se

registró con un polígrafo digital Power‐Lab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, EEUU).

2.7 Preparación de suspensiones de RAG

Todas las suspensiones de túbulos renales se procesaron como se detalla a

continuación, a menos que se especifique lo contrario. Para acceder a la cavidad abdominal

se realizó una incisión en forma de U que se extendió aproximadamente de una a otra 8vas

costillas y a lo largo del músculo recto mayor. Se accedió luego a la arteria aorta abdominal

inferior mediante el uso de una cánula de polietileno (PE‐180), colocada inmediatamente

proximal a la bifurcación de las arterias ilíacas. Luego se ligó la arteria mesentérica superior

y la aorta abdominal de manera proximal a las arterias renales. Se realizaron incisiones en la

vena cava y la vejiga y luego se infundieron 40 ml de solución salina conteniendo 2,5

unidades/ml heparina y 0,1% de colagenasa I, a razón de 10 ml/min. Una vez perfundidos,

los riñones fueron extraídos y cortados en cortes coronales. La franja interna de la médula

externa fue disecada y cortada en fragmentos menores a 1 mm3. Los fragmentos fueron

luego digeridos en 1,5 ml de Solución Salina conteniendo 0,1 % de colagenasa (30 ºC, 30

min). Durante la digestión la preparación fue agitada suavemente y oxigenada cada 5 min.

Luego de la digestión, la muestra fue centrifugada (100 x g ‐ 4 ºC ‐ 2 min). El pellet obtenido

fue resuspendido en 1 ml de solución salina y el preparado fue agitado por medio de un

39


agitador magnético pequeño (250 rpm ‐ 4 ºC ‐ 30 min). Luego el preparado fue filtrado a través

de una malla de nylon de poro 250 µm. Los túbulos fueron finalmente enjuagados 2 veces por

medio de centrifugado (100 x g ‐ 4 ºC ‐ 2 min) y resuspensión. Este tipo de preparación se

encuentra enriquecida en más de un 90 % en RAGs158, 209.

2.8 Medición de la concentración de sodio intracelular

Con el propósito de medir de la velocidad de incremento de la [Na+] intracelular sensible a

ouabaína en túbulos permeabilizados con nistatina, se utilizaron suspensiones de RAG cargadas

con el fluoróforo Na‐green, un indicador de ion Na+ permeable a las membranas. Para el cargado

de los túbulos con el fluoróforo, se preparó diariamente una solución stock 5 mM de Na‐green

en DMSO. Durante la agitación en frío previa al filtrado en la preparación de soluciones de RAG,

se agregó una concentración final del fluoróforo de 5 µM, mediante la dilución 1:1000 del stock

en el medio de agitación. Luego del ello, los túbulos fueron filtrados normalmente, centrifugados

(100 x g, 2 min, 4°C) y enjuagados. Acto seguido, se incubaron durante 15 min a 37°C para permitir

la hidrólisis de los grupos acetato del fluoróforo para atraparlo intracelularmente por la

generación de 4 cargas negativas. Durante este período, los túbulos fueron agitados, enjuagados

y oxigenados cada 5 min. Luego del enjuague final la suspensión de RAG fue transferida a una

cubeta en un espectrofluorómetro Hitachi F‐2700, y los túbulos se dejaron estabilizar bajo

agitación suave, a 37°C, durante 3 min en la oscuridad.

2.9 Medición de la actividad Na+/K+‐ATPasa

Concluida la estabilización los túbulos comenzaron a ser iluminados a 485 +/‐ 2,5 nm y la luz

emitida recolectada a 544 +/‐ 2,5 nm, con el fotomultiplicador regulado en 700 mV. La

fluorescencia basal fue medida entre los 10 y 60 segundos posteriores al inicio de la iluminación.

En el segundo 60, se agregó nistatina a través del puerto del aparato hasta una concentración de

25 µM, y se midió la pendiente de elevación de [Na+] intracelular entre los segundos 70 y 120.

Esta baja concentración de nistatina produce un aumento linear en la fluorescencia durante al

menos 7 min (Figura 9).

40


Figura 9: Fluorescencia de Na‐Green en respuesta a cambios en la [Na+] intracelular inducidas por nistatina en

ramas gruesas ascendentes (RAGs) es suspensión. Se muestra un trazado de un experimento control para

medir la linealidad del aumento de fluorescencia en función del tiempo. Las flechas rojas indican el agregado

de nistatina 25 µM. La línea punteada celeste (A) demuestra linealidad. La mayor pendiente de fluorescencia

representada por la punteada azul (B) demuestra que luego de 450 s el sistema puede responder a mayores

concentraciones del ionóforo y por tanto no está saturado.

Luego se agregaron 1,5 mM de ouabaína, y se midió la pendiente de elevación de la

[Na+] intracelular entre los segundos 170 y 220. Finalmente, los túbulos fueron recuperados

para determinar proteínas. La diferencia en la pendiente en el incremento en la [Na+]

intracelular antes y después de la adición de ouabaína, representa la actividad de la Na+/K+‐

ATPasa. Los resultados fueron expresados como unidades arbitrarias de fluorescencia

(UAF)/mg/min. El trazado de un experimento representativo puede verse en la Figura 10. En

ningún caso se observaron diferencias en las concentraciones basales de Na+ intracelular.

41


Figura 10: Trazado de dos experimentos representativos, mostrando el efecto de la ouabaína sobre la

velocidad de aumento en la [Na+] intracelular en ramas gruesas ascendentes (RAGs) permeabilizadas con bajas

dosis de nistatina. UAF: unidades arbitrarias de fluorescencia.

2.10 Medición del consumo de oxígeno

Con el propósito de medir la velocidad de QO2 sensible a ouabaína bajo diferentes [Na+]

intracelular se utilizaron suspensiones de RAG permeabilizadas con altas concentraciones de

nistatina en buffers con concentraciones variables de Na+.

2.10.1 Medición de la actividad máxima de la Na+/K+‐ATPasa (Vmax)

Un volumen de 1 ml de suspensión de RAGs se equilibró y saturó de oxígeno mediante el

burbujeo del gas a través de una cánula flexible dentro de una jeringa de vidrio de 2 ml que fue

mantenida a 37 °C mediante un baño termostático. Rápidamente se inyectaron 0,6 ml de

suspensión en la cámara del monitor de tensión de oxígeno YSI 5300, a 37 °C con agitación

magnética suave. Los datos fueron adquiridos en un polígrafo Kipp & Zonen (Delf, Holanda)

modelo BD41. En estas condiciones, los túbulos consumen oxígeno de manera lineal durante al

menos 30 min (Figura 11). La preparación se dejó estabilizar hasta obtener una pendiente lineal

42


de QO2 (al menos 2 min). Luego se equilibró la [Na+] intracelular en valores saturantes para

la Na+/K+‐ATPasa mediante el agregado de 50 µM de nistatina. Bajo estas condiciones se

midió la pendiente de QO2. Seguidamente se agregó ouabaína y la pendiente de QO2 se

medió nuevamente. Finalmente, los túbulos fueron recuperados para determinar proteínas.

La diferencia en la pendiente entre los períodos anterior y posterior al agregado de ouabaína,

representa la actividad máxima de la Na+/K+‐ATPasa. El trazado de un experimento

representativo puede verse en la Figura 12.

Figura 11: trazado de la saturación de oxígeno en función de tiempo. La pendiente de consumo de oxígeno

(QO2) fue de 1.5 divisiones (div)/min durante los períodos 0 a 15 y 15 a 30 minutos. Por debajo del 20% de

saturación máxima de O2 (período 30 – 45) el consumo disminuye a 1 div / min. Todos los experimentos de QO2

realizados para esta Trabajo de Tesis fueron finalizados a una saturación de oxígeno mayor al 25 %.

Tiempo (min)

43


Figura 12: Experimento representativo mostrando el efecto de la ouabaína sobre el consumo de oxígeno (QO2)

en RAGs cuya [Na+] intracelular fue mantenida en valores saturantes para la Na+/K+‐ATPasa mediante el agregado

de nistatina. QO2 basal: 9 div / 4 min; QO2 con nistatina: 16 div / 3.5 min; QO2 nistatina + ouabaína: 5 div / 4 min.

2.10.2 Medición de la actividad media (V0,5) de la Na+/K+‐ATPasa

Se procedió de la misma manera que en el Protocolo 2.10.1 pero el medio utilizado para

realizar la medición contenía Na+ en concentración 7.5 mM. El uso de esta concentración de Na+

se encuentra justificado por los experimentos de afinidad, como se detalla más adelante.

2.11 Medición de la afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por iones

Para determinar las constantes de afinidad medias por iones de la Na+/K+‐ATPasa, se

obtuvieron isotermas de actividad hidrolítica con concentraciones variables de Na+ o K+ según

correspondiese.

Tiempo (min)

44


Se utilizaron suspensiones de RAGs permeabilizadas por la técnica de shock hipotónico

y congelamiento. Para ello las RAGs fueron resuspensidas en agua destilada y sometidas a 3

ciclos de congelamiento en una mezcla de hielo seco/acetona. Se determinó el contenido

proteico y luego la muestra fue dividida en dos y llevada a una concentración de 20µg/50µl

o 30µg/50µl, a ser utilizadas en las curvas de activación o blancos de ouabaína

respectivamente.

2.11.1 Determinación de la k0.5 para el Na+ de la Na+/K+‐ATPasa:

La actividad hidrolítica de la Na+/K+‐ATPasa se midió en 20 µg de muestra, a diferentes

concentraciones de Na+ (80, 20, 16, 12, 8 o 4 mM) mediante la técnica de producción de

fosfato a partir de ATP. La reacción se inició mediante la adición de bis‐TRIS‐ATP

(concentración final 6 mM), y se detuvo a los 10 min utilizando ácido tricloroacético al 20 %.

La cantidad de fosfato liberado se determinó mediante el método de Fiske‐Subarrow.

Paralelamente se procesaron dos tubos conteniendo 30 µg de proteínas, Na+ en

concentración final 15 mM y ouabaína en concentración final 2 mM que fueron utilizados

como blanco. El detalle de la composición de los buffers utilizados se muestra en la Tabla 1.

El promedio de producción de fosfato en los tubos conteniendo ouabaína se substrajo

al valor de cada uno de los tubos experimentales, y luego se llevó a cabo una regresión no

lineal de velocidad (v) en función de sustrato (S) utilizando la ecuación de Hill de la manera

implementada en el programa GraphPad Prism 5.0:

,

Donde [S] es la concentración de S, en nuestro experimento la [Na+]; Vmax es la velocidad

máxima de la enzima obtenida mediante la extrapolación de la velocidad a una [S] infinita.

La k0,5 es la [S] que produce una activación de la enzima correspondiente a un 50% Vmax. El

valor h representa la pendiente o coeficiente de Hill, que indica el grado de cooperatividad

de la unión a sustrato. El coeficiente de Hill puede tomar valores comprendidos en el rango

[1, n] donde n representa el número de sitios de unión a S, en este caso, 3 sitios de unión a

Na+.

45


2.11.2 Determinación de la k0,5 para el K+ de la Na+/K+‐ATPasa:

Se utilizó un procedimiento similar al del Protocolo 2.11.1 pero variando las concentraciones

de K+ (8,0; 4,0; 3,2; 2,4; 1,6 y 0,8 mM) en la isoterma de 80 mM de Na+. Para un detalle de la

composición de los búferes utilizados referirse a la Tabla 1.

2.12 Western Blotting

Se utilizaron suspensiones de túbulos o fragmentos de franja interna de la médula externa

disecados de tejido fresco. En todos los casos, las muestras del grupo experimental y el control

fueron procesadas de a pares. Las muestras fueron obtenidas antes de realizar el experimento y

utilizadas inmediatamente, en ningún caso se recurrió al congelamiento y uso posterior. Las

muestras se solubilizaron mediante el uso de una solución conteniendo detergentes en presencia

de inhibidores de proteasas (y fosfatasas para análisis de fosforilación, cuando correspondiese).

Se estimó el contenido proteico, y las muestras fueron diluidas nuevamente con buffer de

solubilización a una concentración aproximada de 1µg/µl, y se dejaron reposar sobre hielo

durante 10 min. Luego, los extractos fueron centrifugados (12000 x g ‐ 4 ºC ‐ 5 min)

recuperándose el sobrenadante. Se midió la concentración proteica en los sobrenadantes y las

muestras fueron diluidas según correspondiese. Alícuotas del grupo control y experimental,

conteniendo cantidades iguales de proteínas, fueron separadas por la técnica de SDS‐PAGE,

utilizando geles de poliacrilamida al 7,5 %(P/V) (Bio‐Rad Mini‐Protean TGX Stain‐FreeTM gels).

Finalizada la corrida electroforética, las proteínas fueron transferidas a una membrana de

difluoruro de polivinilo (Bio‐Rad, Immun‐Blot(R) LF PVDF). La transferencia se realizó durante 15

horas, a un voltaje constante de 33 V y una corriente que varió entre ~50 y ~30 mAmp a lo largo

de la transferencia. Las membranas fueron incubadas con un buffer de bloqueo y luego con los

anticuerpos primarios y secundarios correspondientes como se detalla en la Tabla 2.

46


Tabla 2: Anticuerpos y Buffers

Referencias: (*) 5% Leche: 50 g/L leche en polvo descremada, disuelta en: 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM

NaCl, and 0.1% Tween‐20. (**) Blok TM‐PO (Millipore, Cat: WBAVDP001). (***) 5% SAB: 50 g/L seroalúmina

bovina, disuelta en: 20 mM Tris (pH 7.6), 137 mM NaCl, and 0.1% Tween‐20.

La interacción entre el anticuerpo primario específico para la proteína en estudio y el

secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se detectó mediante

quimioluminiscencia utilizando el sustrato ECL y un film radiográfico. La digitalización de los

films se llevó a cabo utilizando un escáner EPSON Expression 1680 con el software provisto

con los siguientes parámetros: “positive film, 16‐bit greyscale, 600 dpi (dots per inch)”. La

densitometría de bandas utilizando el software ImageJ 1.47p; en los casos que fue necesario

se corrigió el background con el algoritmo “Rolling‐Ball” con una bola de 300 dpi.

2.13 Ensayos de unión de ouabaína marcada con tritio

En los ensayos de unión a [H3]ouabaína, se utilizaron suspensiones de RAGs y columnas

con micro‐filtros de 10 µm (Pierce, Illinois EEUU, Cat: 69705). Las muestras fueron mediadas

en un contador de centelleo líquido Beckman LS 6500 (Fullerton, California, EEUU).

Las columnas y filtros se bloquearon overnight a 4°C con solución salina conteniendo

5% de albumina bovina. Antes de comenzar el experimento la solución de bloqueo fue

succionada con una línea de vacío. Luego se agregaron 60 µg de suspensión de RAGs en 6

columnas diferentes. Las columnas fueron centrifugadas (100 x g, 2 min, 4°C) para adherir

los túbulos a la membrana filtrante. Seguidamente se tapó la base de la columna con el tapón

47


provisto por el fabricante y se agregaron 50 µl de buffer de unión total a ouabaína a 3 columnas

y buffer de unión inespecífica a ouabaína a las otras 3. Los tubos se dejaron incubar durante 2

horas a 4°C. Transcurrido este tiempo el buffer de incubación fue succionado con una línea de

vacío por la parte inferior de la columna y los filtros enjuagados 5 veces con un volumen de 100

µl de buffer de incubación sin K+ ni ouabaína. Finalmente, los filtros fueron secados mediante

centrifugación (500 x g, 2 min, 4°C), extraídos y depositados en viales conteniendo 10 ml de

líquido de centelleo. Los viales se dejaron reposar durante 12 horas y luego la radiactividad se

midió mediante un contador de centelleo líquido por triplicado. Para cada animal, el promedio

de tubos de unión inespecífica se substrajo a cada uno de los triplicados de unión total, que luego

fueron promediados. Los resultados se expresaron como 109 sitios de unión / µg de proteína. La

medida absoluta de unión inespecífica representó entre 15 y un 20 % del valor hallado para la

unión específica.

2.14 Medición de la producción de NO

La producción de NO por parte de RAGs aisladas en respuesta a estímulos fisiológicos, se

midió mediante microscopia de fluorescencia mediante el uso del fluoróforo DAF‐FM sensible a

NO. El DAF‐FM es un compuesto esencialmente no fluorescente que al reaccionar con NO forma

un derivado de benzotriazol fluorescente (Figura 13).

Figura 13: Reacción de des‐esterificación intracelular, y formación del derivado benzotriazólico fluorescente

del DAF‐FM mediante la reacción con NO.

48


El diacetato de DAF‐FM es permeable a las células y difunde pasivamente a través de

las membranas celulares. Una vez dentro de las células, se desacetila por esterasas

intracelulares para convertirse en DAF‐FM. El rendimiento cuántico de fluorescencia de DAF‐

FM es ~ 0,005, pero aumenta aproximadamente 160 veces, a ~ 0,81, después de reaccionar

con NO. La alta eficiencia cuántica y los máximos de excitación/emisión de 495/515 nm,

hacen posible detectar DAF‐FM por medio de variados instrumentos, incluyendo citómetros

de flujo, microscopios de fluorescencia o lectores de microplaca fluorescente. En este caso

se utilizó un microscopio invertido Diaphot ATM (Nikon, Japón) con una lente de aceite de

40x, y equipado con el Software Metafluor 7.0r3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EEUU).

2.14.1 Aislamiento y sujeción de RAGs

Para el aislamiento de segmentos de RAG individuales, se removió el riñón izquierdo e

inmediatamente se sumergió en solución fisiológica a 4 °C. Luego se cortaron secciones

coronales de menos de 1 mm de ancho sobre una placa de acrílico enfriada sobre hielo, se

descartó la corteza, y se procedió al desgarramiento de rayos medulares con el auxilio de

pinzas, sujetando desde la papila y arrancando suavemente hasta la médula externa. Los

fragmentos de rayos medulares fueron traspasados a una placa de Petri conteniendo

solución fisiológica y con temperatura controlada a 4 °C bajo un esteromicroscopio, y se

procedió a disecar manualmente túbulos de largo mayor a 0,5 mm. Finalmente, un túbulo

fue transferido a la cámara de inmersión a 37 °C de un microscopio invertido y sujetado

mediante pipetas de vidrio (Figura 14.A). La solución salina rodeando al túbulo aislado fue

adicionada con 100µM L‐arginina y sujeta a recambio continuo a un flujo de 1 ml/min. Los

túbulos no fueron perfundidos interiormente por lo que el flujo luminal fue nulo. Bajo estas

condiciones, la producción basal de NO es mínima.

2.14.2 Cargado de los túbulos con fluoróforo

La solución stock de diacetato de DAF‐FM se preparó diariamente en DMSO a una

concentración de 4 mM. Luego de la sujeción del túbulo, el recambio del baño se llevó a cabo

con solución salina conteniendo L‐arginina (10 µM) y DAF‐FM (4 µM) durante 20 min a 37°C.

49


Esta combinación de tiempo y temperatura permite la entrada del diacetato de DAF‐FM a las

células y el atrapamiento por medio de la hidrólisis de los grupos acetato y la generación de dos

cargas negativas (Figura 13). Transcurrido este período, los túbulos fueron enjuagados y

estabilizados con solución salina, conteniendo L‐arginina durante los 5 min previos al comienzo

del experimento.

Figura 14: A) En el panel de la izquierda se observa un segmento de rama ascendente gruesa (RAG) aislado y

sujeto entre dos pipetas a una magnificación de 10X. B) El panel de la derecha muestra un experimento

representativo (40X), de medición de producción de NO mediante la fluorescencia del DAF‐FM; nótese que en

ausencia de flujo luminal no se puede observar el lumen.

2.14.3 Medición de la producción de NO:

Finalizada la carga y el atrapamiento del fluoróforo, los túbulos fueron iluminados con una

lámpara de arco de xenón a través de dos filtros, uno infrarojo y otro de una longitud de onda de

488 +/‐ 5 nm. La fluorescencia emitida fue colectada a longitudes de onda mayores a 500 nm

(Figura 14.B). Para evitar el fotoblanqueo y la muerte celular, los túbulos fueron iluminados

durante 1 segundo a intervalos de 30 segundos. Bajo estas condiciones, se midió la fluorescencia

basal durante 10 min y luego se aplicaron los tratamientos como se detallará a continuación y se

procedió a medir durante otros 10 min. Para cada túbulo, se definió un área de interés

comprendiendo un perímetro que incluyó una sección transversal entera del túbulo y una

longitud de aproximadamente 3/5 del largo total. Dado que la unión del fluoróforo a NO es

50


irreversible, la pendiente de intensidad de pixel media representa la velocidad media de

producción de NO.

2.14.4 Tratamiento con ET‐1:

La ET‐1 fue disuelta diariamente en ácido acético y luego llevada a una concentración

de trabajo de 1 nM en solución salina conteniendo L‐arginina (10 µM). La concentración final

de ácido acético en la solución de ET‐1, o el control sin ET‐1 utilizado como vehículo fue de

0,005%. Se midió la pendiente de producción de NO basal en presencia de vehículo y luego

se reemplazó el vehículo por la solución conteniendo ET‐1 y se monitoreó la fluorescencia

durante otros 10 min. La diferencia entre los 5 últimos min del período control y los 5 min

de mayor pendiente del período experimental se utilizó como la respuesta de NO a ET‐1. Los

resultados fueron expresados como UAF/min.

2.14.5 Tratamiento con PIP3

Se procedió de manera similar al Protocolo 2.14.4 en lo que se refiere a períodos

experimentales y colección y procesamiento de datos, pero se utilizaron 2,5 µM de vehículo

durante el período basal, y 2,5 µM PIP3 + 2,5 µM de vehículo como estímulo. La solución del

PIP3 fue preparada diariamente en solución salina a partir de un vial conteniendo 0,1 mg de

PIP3. El contenido del vial fue suspendido en 35 µl de DMSO, y llevado a 35 ml con solución

salina con L‐arginina. La concentración final de PIP3 en esta solución fue de

aproximadamente 2,5 µM. Luego el contenido de dos viales de carrier, de 50 nmoles cada

uno, fueron disueltos en la solución de PIP3 o en solución salina conteniendo L‐arginina a

utilizar como vehículo. La concentración aproximada del carrier fue de 2,5 µM.

2.14.6 Tratamiento con Ang II

Se procedió de manera similar al Protocolo 2.14.4 en lo que se refiere a períodos

experimentales y colección y procesamiento de datos, pero se utilizaron 3 concentraciones

de Ang II diferentes (10‐13, 10‐11 y 10‐9 M). Por cada túbulo se obtuvieron 2 mediciones de

51


producción de NO: basal, y es respuesta a 1 de las 3 concentraciones de Ang II. Los datos fueron

expresados como la producción de NO inducida por Ang II en UAF/min.

2.15 Determinación de los niveles de fosforilación de la NOS3 en el residuo de Ser

1177 en respuesta a PIP3.

El último paso en la activación de NOS3 por ET‐1 y PIP3 es la fosforilación del residuo de Ser

1177 por la enzima Akt. Por ello se decidió estudiar la fosforilación de este residuo luego de un

tratamiento con PIP3 en RAGs de animales infundidos con Ang II o vehículo durante 5 días. Las

soluciones madre de PIP3 fueron preparadas de igual manera que para medir la respuesta a NO,

pero fueron divididas en alícuotas y congeladas para uso posterior. El contenido un vial de carrier

(50 nmoles) fue disuelto diariamente en 700 µl de solución salina. Luego de obtenidas las

suspensiones de RAGs, dos alícuotas de 300 µl conteniendo aproximadamente 400 µg de

proteína cada una fueron oxigenadas e incubadas a 37°C durante 10 min en tubos de vidrio de

10 ml. Luego a un tubo se le agregaron 0,3 µl de PIP3 más 10 µl de carrier y al otro DMSO y carrier

solamente. Ambos tubos fueron incubados por 8 min. La reacción se detuvo mediante el

agregado de 700 µl de solución salina helada a cada tubo y la sumersión en una mezcla de agua,

hielo y sal. Luego las suspensiones fueron transferidas a tubos Eppendorff de 2 ml, y los túbulos

recuperados por centrifugación y disueltos en 200µl de buffer de lisado conteniendo inhibidores

de proteasas y fosfatasas. El grado de fosforilación en respuesta a PIP3 se midió como se detalla

en la sección de Western blotting.

2.16 Medición de la producción de anión superóxido en respuesta a la Ang II:

La medición de la producción del anión O2‐ por suspensiones de RAGs en respuesta a la

incubación con Ang II se llevó a cabo utilizando el reactivo lucigenina. Al reaccionar con el O2‐, la

lucigenina se oxida emitiendo luz. Dicha cualidad ha permitido validar su empleo en la

determinación de la producción de O2‐ mediante luminiscencia210.

La luz emitida fue medida en un luminómetro Berthold, modelo FB12 (Zylux Oak Ridge, TN,

EEUU), utilizando tubos plásticos Sarstedt número 55.476 (Numbrecht, Alemania) diseñados para

tal fin. La cámara del luminómetro fue estabilizada a 37°C mediante un sistema de recirculación

52


de agua caliente. Los valores de luminiscencia fueron registrados a intervalos de 4,8 seg

usando el software FB12/Sirius V1.5 (Berthold, Zylux Oak Ridge, TN, EEUU).

La solución stock de lucigenina, fue preparada diariamente en agua en concentración

final de 1 mM. Debido a la gran sensibilidad a la luz que presenta la lucigenina, todos los

experimentos fueron llevados a cabo en condiciones de oscuridad, y las soluciones stock

manipuladas en tubos opacos. Previo a la realización del ensayo, las suspensiones de RAGs

fueron diluidas en un rango de concentración de proteína de 0.5 a 1 µg/µl, y luego se dejaron

reposar en la oscuridad por un período de al menos 5 min a 4°C. De cada suspensión de RAGs

se midieron dos alícuotas, una en presencia de solución salina, y otra en presencia de

solución salina conteniendo Ang II en concentración final en la mezcla de reacción de 1 nM.

Los componentes de la mezcla de reacción fueron añadidos al tubo de ensayo en el siguiente

orden: 5 µl de solución stock de lucigenina, 200 µl de suspensión de RAG y 800 µl de solución

salina previamente estabilizada a 37°C. La mezcla se dejó reposar por 5 minutos en un baño

seco a 37°C, y luego el tubo fue colocado en la cámara del luminómetro para realizar la

medición.

La producción inicial de O2‐ (tanto en el tubo basal como en el tubo conteniendo Ang II)

fue registrada durante aproximadamente 10 minutos, tras los cuales se añadió el reactivo

Tiron para secuestrar el O2‐ formado y obtener así un valor de luminiscencia no específico.

El valor de luminiscencia promedio obtenido luego de 2 minutos de la adición del Tiron fue

sustraído del valor promedio de luminiscencia registrado durante los últimos 5 minutos

antes del agregado del mismo, para así obtener los valores de luminiscencia en presencia o

ausencia de Ang II. La superposición en el inicio de la incubación a 37°C del segundo tubo

mientras ocurre la medición del primero, permite una diferencia de entre 13 y 15 minutos

en el inicio de la medición entre ambos. Durante ese período de tiempo, el segundo tubo se

mantuvo a 4°C. Para asegurarse de que las diferencias obtenidas en la producción O2‐ de no

eran producto de esta diferencia en el tiempo de reposo previa al inicio de la medición, el

orden de los tubos tratados con y sin Ang II fue invertido en cada experimento. En la Figura

15 se muestran valores de luminiscencia obtenidos en un ensayo representativo.

Finalmente, las RAGs en suspensión fueron recuperadas por centrifugación y se determinó

53


el contenido de proteínas en cada tubo. Los resultados fueron expresados como unidades

relativas de luminiscencia (URL)/s/µg.

2.16.1 Medición de la producción de anión superóxido derivado de las NOSs en respuesta

a la Ang II

Para medir la producción del anión O2‐ proveniente de NOSs desacopladas en suspensiones

de RAGs en respuesta a la incubación con Ang II, se procedió de manera similar al Protocolo 2.16,

pero añadiendo de 1 mM L‐NAME en una de las alícuotas de la suspensión de RAGs durante el

período inicial de incubación en la oscuridad de 5 minutos de duración.

Figura 15: Trazado de un experimento representativo de medición de producción de O2‐ en suspensiones de

rama ascendente gruesa (RAG). El trazado azul representa los niveles basales de O2‐, y el trazado rojo los niveles de

O2‐ en respuesta a la estimulación con Ang II. La flecha verde indica el agregado de Tiron. El O2

‐ producido tanto en

condiciones basales, como durante la estimulación con Ang II, es calculado mediante la sustracción de la

luminiscencia de background medida luego de los 2 minutos siguientes al agregado de Tiron del promedio de

luminiscencia de los últimos 5 minutos previos al agregado de Tiron.

54


Además, en ambos tubos se añadió Ang II, por lo que de cada suspensión de RAGs se

determinó la producción de O2‐ en presencia de Ang II o de Ang II + L‐NAME.

A fin de evaluar si la producción de O2‐ por parte de las NOSs en respuesta a Ang II era

debido a un efecto directo de la Ang II o consecuencia de un efecto indirecto en respuesta al

consumo del sustrato de las enzimas NOSs, se realizaron mediciones de la producción de O2‐

en presencia de Ang II (1 nM) sola o de Ang II (1 nM) y L‐arginina (100 µM).

2.16.2 Investigación de la vía por la cual la Ang II induce el desacople de la NOSs

Con el objetivo de investigar la vía por la cual la Ang II induce la producción de O2‐ por

las NOSs se procedió de manera similar al Protocolo 2.16.1 en lo que se refiere a medir el

efecto de la Ang II per sé, o en combinación con L‐NAME. Pero en este caso se obtuvieron 3

sets de datos en presencia de:

1) vehículo (DMSO).

2) el inhibidor de PCKα/δ Gö6976 en concentración 100 nM.

3) el inhibidor de NOX apocianina en concentración 10 µM.

El valor resultante de sustraer al valor de luminiscencia obtenida en el tubo que contenía

Ang II, el valor de luminiscencia presente en el tubo que contenía la mezcla de Ang II y L‐

NAME fue considerado como la producción de O2‐ dependiente de NOSs en respuesta a la

estimulación con Ang II en cada caso.

2.17 Análisis estadístico de los datos

Para el análisis estadístico se utilizó el programa GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, California,

EEUU). Las diferencias entre grupos se analizaron mediante el test de Student. Los

resultados fueron expresados como la media aritmética ± el error estándar de la media

(SEM). Para el análisis de las regresiones no lineales se utilizó el modelo Hill “ROUT

regression”. En todos los casos valores de P < 0,05 fueron considerados significativos.

En los casos en los que se requirió hacer comparaciones múltiples, se utilizó el método

de análisis de la varianza (ANOVA) de un factor fijo. Seguidamente se utilizó el método de

Dunnett, el cual está diseñado para comparar la media de cada tratamiento con un grupo

control. Los valores ajustados por comparaciones múltiples (P(Ajustado)) < 0,05 fueron

considerados significativos.

55

Capítulo 3

RESULTADOS

Resultados

3. RESULTADOS

Primera Parte: Estudio de la velocidad de transporte y de los parámetros cinéticos

de la Na+/K+‐ATPasa en la RAG durante las infusiones de Ang II.

Nuestra primera hipótesis de trabajo es que “la actividad de la Na+/K+‐ATPasa se

encuentra aumentada durante el desarrollo de la patología hipertensiva en los modelos de

infusión de Ang II debido a un aumento crónico en la entrada apical de Na+”. Para confrontar

esta hipótesis se utilizaron ratas Sprague‐Dawley macho de 6 a 7 semanas de edad. Los

animales fueron infundidos con Ang II o vehículo, mediante el uso de mini‐bombas osmóticas

subcutáneas por un período de 7 días. Finalizado este período se midió la presión arterial y

se obtuvieron los preparados de RAG correspondientes, como se describe en el capítulo de

Materiales y Métodos. Para evaluar la contribución de la entrada apical de Na+ crónica sobre

la actividad de la Na+/K+‐ATPasa, algunos animales fueron infundidos con Ang II o vehículo,

simultáneamente con bajas dosis del diurético inhibidor del NKCC2 furosemida.

Los resultados presentados en esta sección fueron publicados en:

Angiotensin II‐induced hypertension increases plasma membrane Na pump activity by enhancing Na entry

in rat thick ascending libs. Gonzalez‐Vicente, A.; Galvin, J. L. Am J Physiol Renal Physiol 305: F1306‐1314, 2013

57

Resultados

3.1 Efectos de la administración de Ang II por 7 días sobre la Na+/K+‐ATPasa de la

RAG

El transporte neto de Na+ en la RAG se encuentra elevado en modelos hipertensivos

dependientes de Ang II. Al igual que en otros segmentos de la nefrona, el transporte activo en la

RAG depende de la generación de gradientes electroquímicos por parte de la Na+/K+‐ATPasa. Este

transportador se encuentra localizado en la membrana basolateral, así como en vesículas

intracelulares. Sin embargo, solo los transportadores expresados en la membrana plasmática

participan del transporte transepitelial; por ello, desarrollamos métodos capaces de medir la

actividad de las unidades de Na+/K+‐ATPasa localizadas en la membrana plasmática.

3.1.1 Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la presión arterial:

Para caracterizar el modelo de hipertensión inducida por Ang II, se midió la presión arterial

directa mediante un catéter colocado bajo anestesia en la arteria femoral de los animales.

Llevada a cabo correctamente, esta técnica produce un sangrado nulo o mínimo. Como puede

verse en la Tabla 3, la administración subcutánea de Ang II produjo un aumento significativo en

la presión arterial en comparación con los valores medidos en el grupo control.

Tabla 3: Efecto de la infusión continua de (200 ng/kg/min) de Ang II durante 7 días, sola o en combinación con

1,1 mg/kg/día de furosemida sobre la presión arterial media. El registro de presión arterial directa fue obtenido en

animales anestesiados mediante acceso femoral. Los datos fueron grabados y procesados con el programa

PowerLab.

58

Resultados

3.1.2 Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la actividad de la Na+/K+‐ATPasa

en la membrana plasmática de la RAG

Con el objeto de evaluar si la infusión de Ang II aumentaba la capacidad de transporte

de la Na+/K+/ATPasa expresada en la membrana plasmática se utilizaron dos métodos

diferentes:

3.1.2.1 Velocidad de aumento del Na+ intracelular sensible a ouabaína en túbulos

permeabilizados con bajas dosis de nistatina

Se midió el efecto de la ouabaína, en la velocidad del incremento en la [Na+] intracelular

en suspensiones de RAGs permeabilizadas con bajas dosis de nistatina. La concentración de

nistatina utilizada en este protocolo permite un aumento lineal en la [Na+] intracelular

durante el lapso del experimento (Figura 9). Bajo estas condiciones, se midió el efecto de la

ouabaína sobre la pendiente de aumento de Na+, correspondiente a la actividad de la Na+/K+‐

ATPasa. Como puede observarse en la Figura 16 la actividad Na+/K+‐ATPasa en los túbulos

de animales infundidos con Ang II fue 29 % mayor que en aquellos infundidos con vehículo.

Figura 16: Efecto de la ouabaína sobre la velocidad de aumento de la [Na+] intracelular en túbulos

permeabilizados con bajas dosis de nistatina. La velocidad de aumento de la [Na+] intracelular sensible a

ouabaína en túbulos permeabilizados con nistatina 25 µM fue de 12,8 +/‐ 0,4 en el grupo tratado con Ang II,

comparado con 9,9 +/‐ 1,1 UAF/mg/min en el grupo control (P < 0.05; n = 8). Se muestra un experimento

representativo Figura 10.

59

Resultados

3.1.2.2 Velocidad de consumo de oxígeno sensible a ouabaína en túbulos permeabilizados

con nistatina

Se midió el efecto de la ouabaína, en la velocidad de QO2 en suspensiones de RAGs

permeabilizadas con altas dosis de nistatina en un buffer conteniendo Na+ 140 mM. La

combinación de nistatina y contenido de Na+ en el medio utilizada en este protocolo, permite

equilibrar la [Na+] en niveles saturantes para la Na+/K+‐ATPasa. Bajo estas condiciones, se midió

el efecto de la ouabaína sobre la pendiente de QO2 (Figura 12). Esta medida representa el QO2

dependiente de la Na+/K+‐ATPasa trabajando en su máxima velocidad (Vmax). Como puede

observarse en la Figura 17, la Vmax de la Na+/K+‐ATPasa en túbulos de animales infundidos con

Ang II fue 18% mayor que en aquellos infundidos con vehículo.

Figura 17: Efecto de la ouabaína sobre el consumo de oxígeno (QO2) en túbulos con una [Na+] intracelular

ecualizada en condiciones de saturación para la Na+/K+‐ATPasa. El QO2 sensible a ouabaína fue de 138 +/‐ 6 en RAGs

de animales que fueron infundidos con Ang II, comparado con 117 +/‐ 7 mmol/µg/min en el grupo control (P < 0,05;

n = 12).

60

Resultados

3.1.3 Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la afinidad de la Na+/K+‐ATPasa

por iones

Con el objetivo de estudiar los cambios conducentes al aumento de la actividad

hidrolítica y de transporte de la Na+/K+‐ATPasa en RAGs de animales infundidos con Ang II,

se decidió estudiar los parámetros cinéticos del transportador.

3.1.3.1 Constante de afinidad por el Na+ en túbulos permeabilizados por shock

hipotónico y congelamiento

Se midieron las velocidades de hidrólisis de ATP bajo diferentes concentraciones de Na+

en RAGs permeabilizadas por shock hipotónico y congelamiento. Luego se realizó una

regresión no lineal, utilizando la ecuación de Hill para determinar la k0,5 para el Na+. La

infusión de Ang II no produjo cambios significativos en la afinidad por el Na+ (Figuras 18.A y

.B).

3.1.3.2 Constante de afinidad por el K+ en túbulos permeabilizados por shock

hipotónico y congelamiento

Se midieron las velocidades de hidrólisis de ATP bajo diferentes concentraciones de K+

en túbulos permeabilizados por shock hipotónico y congelamiento. Luego se realizó una

regresión no lineal, utilizando la ecuación de Hill para determinar la k0,5 para el K+. La infusión

de Ang II no produjo cambios significativos en la afinidad por el K+ (Figuras 18.A y .B).

61

Resultados

Figura 18: Afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por el Na+. Los túbulos fueron permeabilizados mediante shock

hipotónico y congelamiento y se midió la capacidad hidrolítica a diferentes [Na+] mediante la medición de producción

de fosfato inorgánico usando el método de Fiske‐Subarrow. A) El panel de la izquierda muestra las curvas de

activación por Na+, generadas para determinar la k0,5 mediante la ecuación de Hill. B) El panel derecho muestra que

los valores promedio obtenidos. La k0,5 para el Na+ fue de 7,5 +/‐ 0,3 en el grupo tratado con Ang II vs. 7,2 +/‐ 0,3

mM en el grupo control (ns; n = 5).

Figura 19: Afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por el K+. Los túbulos fueron permeabilizados mediante shock

hipotónico y congelamiento y se midió la capacidad hidrolítica a diferentes [K+] mediante la medición de producción

de fosfato inorgánico usando el método de Fiske‐Subarrow. A) El panel de la izquierda muestra las curvas de

activación por K+, generadas para determinar la k0,5 mediante la ecuación de Hill. B) El panel derecho muestra que

los valores promedio obtenidos. La k0,5 para el K+ fue de 1,81 +/‐ 0,06 en el grupo tratado con Ang II vs. 1,82 +/‐ 0,07

mM en el grupo control (ns; n = 7).

0 5 10 15 200.0

0.5

1.0

1.5

80

[Na+] (mM)

Control

Ang II

62

Resultados

3.1.3.3 QO2 sensible a ouabaína con la [Na+] intracelular equilibrada en 7,5 mM

mediante el uso de nistatina

Una vez determinada la k0,5 para el Na+, se procedió a medir el QO2 sensible a ouabaína

en túbulos permeabilizados con nistatina, para equilibrar el Na+ intracelular en la

concentración de la k0,5. Tanto en los túbulos de animales infundidos con Ang II como en los

de animales pertenecientes al grupo control, el QO2 sensible a ouabaína en presencia de una

[Na+] intracelular de 7,5 mM fue cercano al 50 % del valor obtenido en presencia de una

[Na+] intracelular considerada saturante para la Na+/K+‐ATPasa, no encontrándose

diferencias significativas entre ambos grupos (Figura 20).

Figura 20: Consumo de oxígeno (QO2) sensible a ouabaína, en túbulos con una concentración de Na+

intracelular mantenida a 7,5 mM. Los resultados están expresados como porcentaje del QO2 en Vmax, obtenido

a una [Na+] intracelular saturante para la Na+/K+‐ATPasa. El QO2 sensible a ouabaína respecto al Vmax fue de 54

+/‐ 6 % (n = 7) en el grupo tratado con Ang II, y de 56 +/‐ 6 % (n = 7) en el grupo control. No se hallaron

diferencias estadísticamente significativas.

63

Resultados

3.1.4 Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la expresión proteica de la subunidad

α1 de la Na+/K+/ATPasa

Una vez evaluada la k0.5 para el Na+, y habiéndose hallado que la misma no estaba afectada

por la infusión de Ang II, se procedió a estudiar la expresión del transportador. Para ello se utilizó

la técnica de Western blotting empleando un anticuerpo anti‐subunidad α1.

Figura 21: Expresión de la subunidad α1 de la Na+/K+‐ATPasa en lisados del segmento interno de la médula

renal externa y en suspensiones de RAGs. Los valores están expresados como la relación entre la cantidad de

subunidad α1 y la de GAPDH para la médula renal externa (1,1 +/‐ 0,1 en el grupo tratado con Ang II vs. 1,0 +/‐ 0,1

en el grupo control; ns; n = 8) y como la relación entre la subunidad α1 y la β‐tubulina en la suspensión de RAGs (1,0

+/‐ 0,1 en el grupo tratado con Ang II vs. 1,2 +/‐ 0,1 en el grupo control; ns; n = 5).

64

Resultados

3.1.4.1 Expresión de subunidad α1 en la franja interna de la médula renal externa

Primeramente, se realizaron estudios de expresión en trozos de franja interna de la

médula externa, los cuales están compuestos primeramente por RAG. En estos

experimentos no se pudo comprobar que la subunidad α1 de la Na+/K+‐ATPasa fuera afectada

por la infusión de Ang II (Figura 21).

3.1.4.2 Expresión de subunidad α1 en suspensiones de RAGs

Dado que la médula renal externa también posee vasos sanguíneos, sangre y túbulos

colectores además de RAGs, se decidió repetir los experimentos de expresión de la

subunidad α1 de la Na+/K+‐ATPasa en suspensiones de túbulos enriquecidas en más del 90 %

en RAGs medulares. Estos experimentos también arrojaron resultados negativos por lo que

se concluyó que la infusión de Ang II no afecta la expresión de subunidad α1 de la Na+/K+‐

ATPasa en la RAG (Figura 21).

3.1.5 Unión de ouabaína en túbulos intactos. Expresión de la Na+/K+‐ATPasa en la

membrana plasmática

Mediante la técnica de Western blot, se determinó la expresión total de la Na+/K+‐

ATPasa, que incluye tanto las bombas localizadas en la membrana plasmática, como las

localizadas en vesículas intracelulares que no contribuyen al transporte transepitelial de Na+.

Para determinar el número de transportadores expresados en la superficie celular, se

procedió a realizar estudios de unión de ligandos radiactivos. Los resultados presentados en

la Figura 22 muestran que la infusión de Ang II no afecta la unión de 3H‐ouabaína, que es un

estimador de la cantidad de unidades de Na+/K+‐ATPasa expresadas en la membrana

plasmática.

65

Resultados

Figura 22: Expresión de la Na+/K+‐ATPasa en la membrana plasmática de RAGs medida mediante la unión de

ouabaína radioactiva (medida a 4 °C para prevenir fenómenos de tráfico a través de la membrana). Los valores están

expresados como sitios de unión por µg de proteína. (6,1 +/‐ 0,8 x109 en el grupo infundido con Ang II vs. 6,4 +/‐ 0,7

x109 en el grupo control; no se hallaron diferencias significativas entre los grupos; n = 6).

3.2 Efectos de la administración simultánea de Ang II y dosis no natriuréticas de

furosemida

Estudios previos al presente trabajo demostraron que los marcadores de activación del

NKCC2 como fosforilación y localización en la membrana apical, así como la diuresis y natriuresis

inducidas por furosemida, se encuentran elevados desde al menos el 4to y hasta al menos el 14to

día desde el comienzo de infusión de Ang II. Estos datos sugieren que la activación de la Na+/K+‐

ATPasa puede ser consecuencia indirecta de una mayor entrada apical de Na+.

Para investigar esta posibilidad, se decidió coinfundir los animales con Ang II en presencia de

una dosis baja de furosemida (1 mg/kg/día) que no altera la presión arterial ni incrementa el

volumen urinario de manera aguda (dosis no natriurética). El objetivo de este método fue reducir

la reabsorción de Na+ en la RAG, pero a un nivel en que otros segmentos puedan equilibrar este

efecto y que no se produzcan cambios en la presión arterial como consecuencia de una mayor

diuresis.

66

Resultados

3.2.1 Efectos de la coadministración de furosemida sobre la presión arterial

Para investigar si la infusión de una dosis no natriurética de furosemida afecta el

desarrollo de hipertensión en animales infundidos con Ang II, se midió la presión arterial

directa, mediante un catéter colocado en la arteria femoral de animales anestesiados. Como

puede observarse en la Tabla 3, la administración subcutánea de furosemida junto con la

Ang II no produjo cambios significativos sobre la presión arterial.

3.2.2 Efectos de la coadministración de furosemida sobre la actividad de la Na+/K+‐

ATPasa de la RAG

Para investigar si la infusión de dosis no‐natriuréticas de furosemida era capaz de

bloquear el aumento de la actividad Na+/K+‐ATPasa en la RAG en animales infundidos con

Ang II, se procedió a repetir los experimentos de la Sección 3.1.2.1, midiendo la velocidad

de aumento del Na+ intracelular sensible a ouabaína en túbulos permeabilizados con bajas

dosis de nistatina. Como se observa en la Figura 23, la coinfusión de furosemida bloquea el

aumento de la actividad Na+/K+‐ATPasa en la RAG en respuesta a la infusión de Ang II.

Figura 23: Efecto de la ouabaína sobre la velocidad de aumento de la [Na+] intracelular en RAGs

permeabilizadas con bajas dosis de nistatina. La velocidad de aumento de la [Na+] intracelular sensible a

ouabaína en túbulos permeabilizados fue de 11,9 +/‐ 0,3 luego de tratamiento con Ang II + Furosemida (F + Ang

II), comparado con 12,9 +/‐ 1,0 UAF/µg/min en animales control infundidos con F únicamente (ns; n = 6).

67

Resultados

3.2.3 Efectos de la coadministración de furosemida sobre la expresión proteica de la

subunidad α1 de la Na+/K+/ATPasa

Dado que la coinfusión de furosemida podría compensar el incremento en Vmax por medio

de la reducción en la expresión de la Na+/K+‐ATPasa, se procedió a realizar estudios de expresión

de la subunidad α1 en suspensiones de RAG. En estos experimentos no se observaron diferencias

significativas entre los animales infundidos con Ang II y Ang II + furosemida (Figura 24).

Figura 24: Expresión de la subunidad α1 de la Na+/K+‐ATPasa en suspensiones de RAGs de animales

infundidos con Ang II + furosemida (Ang II + F) o Ang II + vehículo (Ang II). Los valores representan la relación entre

la subunidad α1 y GAPDH; que fueron de 1,0 +/‐ 0,1 para el tratamiento con Ang II + F vs. 1,1 +/‐ 0,1 para el

tratamiento con Ang II únicamente (no se hallaron diferencias significativas; n = 8).

68

Resultados

Segunda Parte: Estudio del sistema del óxido nítrico dependiente de la enzima NOS3

en la RAG durante las infusiones de Ang II

Nuestra segunda hipótesis de trabajo establece que “la inhabilidad de regular la entrada

apical de Na+ en la RAG durante el desarrollo de la patología hipertensiva en los modelos de

infusión de Ang II se debe a un defecto en la producción local de NO”.

Durante la realización de la primera parte de este Trabajo de Tesis, McDonugh y col.211

reportaron que el aumento de presión arterial generado por la infusión de Ang II durante 14

días, disminuye la expresión de transportadores de Na+ en la RAG medular como parte del

mecanismo de natriuresis por presión. Estos experimentos difieren de los nuestros en la

dosis de Ang II infundida y en el tiempo de tratamiento; no obstante, a los 7 días desde el

comienzo de la infusión de Ang II, y a pesar de que el balance de Na+ es aún positivo, la

pendiente de curva de aumento de presión comienza a disminuir sugiriendo la acción de

mecanismos compensatorios natriuréticos.

Teniendo en cuenta estos resultados, para la realización de la Segunda Parte de este

Trabajo de Tesis, se decidió acortar el tiempo de infusión de Ang II a 1 y 5 días, donde el

aumento de presión tiene una pendiente mayor y relativamente lineal. Por ello, para

confrontar nuestra hipótesis se utilizaron ratas Sprague‐Dawley macho de 5 semanas de

edad. Los animales fueron infundidos de con Ang II o vehículo, mediante el uso de mini‐

bombas osmóticas subcutáneas por los períodos de 1 y 5 días. Finalizado este período se

midió la presión arterial y se obtuvieron los preparados de RAG correspondientes, como se

describe en el capítulo de Materiales y Métodos. En estos preparados se estudiaron la

expresión y fosforilación de la NOS3 y la capacidad de producción de NO en respuesta a

diferentes estímulos fisiológicos.


Angiotensin II‐induced hypertension blunts thick ascending limb NO by reducing NO synthase 3 expression

and enhancing threonine 495 phosphorylation. Ramseyer, V.D.*; Gonzalez‐Vicente, A.*; Carretero, O. A.;

Galvin, J. L. Am J Physiol Renal Physiol 308: F149‐156, 2015.

* Gonzalez‐Vicente, A y Ramseyer, V.D. contribuyeron de manera equivalente al presente artículo.

69

Resultados

3.3 Efectos de la Ang II durante 1 y 5 días sobre la presión arterial, la expresión

proteica de la enzima NOS3, y la fosforilación del residuo de Thr 495

En la Primera Parte de este trabajo se determinó que luego de 7 días de infusión de Ang II el

transporte dependiente de la Na+/K+‐ATPasa se encuentra aumentado en la RAG, posiblemente

debido a un aumento crónico en la entrada apical de Na+. El NO producido por la NOS3 en la RAG

contribuye en la regulación del equilibrio hidrosalino y en la regulación de la presión arterial. En

líneas generales, el NO reduce la velocidad de transporte en la RAG y antagoniza los efectos de

la Ang II al reducir la reabsorción de Na+. La cantidad de NO producido por la NOS3 está dada

primeramente por el grado de expresión de la enzima, la cual tiene además sitios de fosforilación

que controlan su actividad. Los principales sitios de fosforilación de la NOS3 son el residuo de Thr

495 el cual es inhibitorio, y el residuo de Ser 1177 el cual es estimulatorio. El equilibrio entre

expresión y patrones de fosforilación determina la velocidad de producción de NO. Por lo tanto,

en esta Segunda Parte, se estudiaron la actividad y regulación de la NOS3 a 1 y 5 días posteriores

al inicio de la infusión de Ang II, período en el que se desarrolla el aumento de presión.

3.3.1 Efectos de la infusión de Ang II sobre la presión arterial

Para ver el desarrollo del modelo de hipertensión inducida por Ang II, se midió la presión

arterial directa, mediante un catéter colocado en la arteria femoral de animales anestesiados.

Esta técnica produce un sangrado mínimo o nulo. Como puede verse en la Tabla 4, luego de

iniciada la infusión de Ang II la presión arterial evoluciono desde valores no diferentes al control

en el día 1 a valores significativamente elevados luego de 5 días.

Tabla 4: Efecto de la infusión continua de Ang II (200 ng/kg/min) por un lapso de 24 Hs. o 5 días sobre la presión

arterial media. El registro de la presión arterial directa fue obtenido en ratas anestesiadas mediante acceso femoral.

Los datos fueron grabados y procesados usando el programa PowerLab.

70

Resultados

3.3.2 Efectos de la infusión de Ang II sobre la expresión proteica de la NOS3

Para determinar si la infusión de Ang II afecta la expresión proteica de la enzima NOS3

se determinó la abundancia de NOS3 en suspensiones de RAGs mediante Western blot

utilizando un anticuerpo específico para la NOS3. No se hallaron cambios en la expresión de

NOS3 luego de 24 hs de infusión con Ang II (Figura 25.A), pero se halló una disminución

significativa en la expresión de la misma luego de 5 días de infusión con Ang II (Figura 25.B).

Figura 25: Expresión de la NOS3 en lisados de RAG medulares de animales infundidos con Ang II (200

ng/kg/min) durante 1 o 5 días. A) En el panel izquierdo se observa que la infusión de Ang II durante 1 día no

produjo cambios significativos en la expresión de NOS3. B) En el panel derecho se observa que la infusión de

Ang II durante 5 días resultó en una disminución del 40 +/‐ 12 %. (P < 0,007; n = 6) de la abundancia relativa de

la NOS3 (medida como relación NOS3/β‐tubulina).

71

Resultados

3.3.3 Efectos de la infusión de Ang II sobre la fosforilación basal del residuo de Thr 495

de la NOS3

De manera aguda, la Ang II activa vías de señalización celular dependientes de PKC; esta

quinasa tiene la capacidad de fosforilar el residuo Thr 495 de la NOS3 que resulta en una

reducción en la producción de NO. Para estudiar si la infusión de Ang II producía cambios en la

fosforilación de la NOS3 en el residuo Thr 495, se utilizó un anticuerpo monoclonal específico que

detecta a este residuo únicamente si el mismo se encuentra fosforilado. La fosforilación del

residuo de Thr 495 no presentó cambios luego de 1 día de infusión de Ang II (Figura 26.A), pero

aumentó significativamente luego de 5 días de infusión (Figura 26.B).

Figura 26: Nivel de fosforilación de la NOS3 (P‐NOS3) en el residuo de Thr 495 (T495), en lisados de RAG

medulares de animales infundidos con Ang II (200 ng/kg/min) durante 1 y 5 días. A) En el panel izquierdo se observa

que la infusión de Ang II por 1 día no produjo cambios significativos en la fosforilación del residuo T495 de NOS3. B)

En el panel derecho se observa que la infusión de Ang II por 5 días aumentó la relación P‐NOS3(T495)/NOS3 en un

174 +/‐ 26 %. (P < 0,006; n = 6).

72

Resultados

3.4 Efectos de la infusión crónica de Ang II sobre la capacidad de producción de

NO en respuesta a estímulos fisiológicos, sistema ET‐1

En la Sección 3.3 se demostró que los cambios en la expresión proteica y grado de

fosforilación de las NOS3 se evidencian a los 5 días de infusión de Ang II pero no al día 1. De

la misma manera, la presión arterial media evolucionó desde valores similares a los controles

luego de un día de infusión con Ang II, hasta valores significativamente aumentados al día 5.

En base a estos resultados, se decidió medir la capacidad de producción de NO y estudiar las

cascadas de activación de la NOS3 solamente a los 5 días de comenzada la infusión de Ang

II. Para ello se eligió estudiar la vía de señalización de ET‐1 (Figura 8), que es compartida río

abajo del receptor por otras señales que activan la producción de NO como aquellas

dependientes del receptor MAS, el receptor AT2 y el receptor de insulina entre otros.

3.4.1 Capacidad de respuesta a ET‐1

Para estudiar el sistema ET‐1, primero se midió la producción de NO en respuesta a ET‐

1 en concentración 1 nM en RAG medulares aisladas. Se determinó que en animales

infundidos con Ang II por 5 días la capacidad de respuesta a ET‐1 en RAGs se encontraba

disminuida con respecto al grupo control (Figura 27).

Figura 27: Producción de NO inducida por endotelina‐1 (ET‐1) en RAGs aisladas obtenidas de animales

infundidos con 200 ng/kg/min de Ang II durante 5 días. El aumento de fluorescencia del DAF‐FM en respuesta

a ET‐1 se redujo de 0,17 +/‐ 0,06 UAF/m en animales control a ‐0,01 +/‐ 0,06 UAF/m en animales infundidos

con Ang II (P < 0.01; n = 8).

73

Resultados

3.4.2 Expresión proteica del receptor ETB

Para continuar el estudio se midió la expresión del ETB mediante Western Blots. La expresión

del ETB en lisados de RAG medulares no mostró cambios significativos en animales infundidos

con 200 ng/kg/min de Ang II en comparación con animales infundidos con solución salina durante

5 días (Figura 28).

Figura 28: Expresión del receptor ETB en lisados de RAG medulares obtenidas de animales infundidos con Ang

II (200 ng/kg/min) durante 5 días. La infusión de Ang II no produjo cambios significativos en la relación del receptor

ETB/β‐tubulina. (Δ = 10 +/‐ 10 %; ns; n = 6).

74

Resultados

3.4.3 Producción de NO en respuesta a PIP3

La estimulación del receptor ETB da lugar a la activación de la fosfatidilinositol 3’ quinasa

(PI3K) y a la subsecuente generación de PIP3. Para determinar si la infusión de Ang II altera

la actividad de la PI3K, se procedió a medir la producción de NO en RAGs aisladas que fueron

incubadas con PIP3 en concentración 2,5 µM. Los datos obtenidos demuestran que la

capacidad de producción de NO en RAGs de animales infundidos con Ang II se encontró

disminuida respecto al control, sugiriendo que el defecto en la vía se encuentra río abajo de

la PI3K (Figura 29).

Figura 29: Producción de NO inducida por el fosfatidilinositol (3,4,5)‐trisfosfato (PIP3) en RAGs aisladas

obtenidas de animales infundidos con Ang II (200 ng/kg/min) durante 5 días. El aumento de fluorescencia del

DAF‐FM en respuesta a una [PIP3] de 2,5 µM se redujo de 0,13 +/‐ 0,04 UAF/min en animales control a ‐0,07

+/‐ 0,06 UAF/min en animales infundidos con Ang II vs. (P < 0.03; n = 4).

75

Resultados

3.4.4 Fosforilación del residuo de Ser 1177 de la NOS3 en respuesta a PIP3

Una vez generado, el PIP3 facilita la fosforilación y activación de la Akt (Figura 8). La Akt

activada fosforila a la NOS3 en el residuo estimulatorio de Ser 1177 aumentando la producción

de NO. Para explorar si la infusión de Ang II altera este mecanismo, se incubaron suspensiones

de RAGs con 2,5 µM de PIP3 o vehículo y luego se midió la fosforilación del residuo de Ser 1177

mediane Western Blots. Estos experimentos demostraron que las RAGs del grupo control

presentan un aumento en la fosforilación de la Ser 1177 en respuesta a PIP3 (Figura 30.A),

mientras que en RAGs del grupo infundido con Ang II no se observó aumento en la fosforilación

de NOS3 en este residuo (Figura 30. B).

Figura 30: Efecto del tratamiento in vitro con 2.5 µM de fosfatidilinositol (3,4,5)‐trisfosfato (PIP3) sobre la

fosforilación de la NOS3 en el residuo de Ser 1177 en la RAG. A) En el panel de la izquierda se observa que PIP3

aumenta la fosforilación del residuo Ser 1177 en el grupo Control. B) En el panel de la derecha se observa que la

infusión de Ang II por 5 días, interfiere con la fosforilación del residuo Ser 1177 en respuesta a PIP3.

76

Resultados

Tercera Parte: Estudio de la producción de anión superóxido dependiente de

enzimas NOSs en la RAG en respuesta a la estimulación aguda con Ang II

La síntesis de NO implica varios pasos en los que electrones son transferidos a través del

dominio oxidasa de la enzima desde intermediarios reductores a la L‐arginina, causando su

reducción a L‐citrulina y la subsecuente liberación de NO. Bajo determinadas circunstancias,

como la limitación de cofactores o del sustrato L‐arginina, los electrones pueden ser

transferidos al oxígeno molecular lo cual origina la generación de O2‐ 212. El equilibrio entre

la producción de NO y la generación de O2‐ puede además ser regulado por fosforilación

mediante diferentes proteínas quinasas entre las que se incluye a la PKC140, 185, 213, 214. En

particular, la fosforilación de la NOS3 en el residuo de Thr 495 produce un aumento en la

producción de O2‐ en detrimento de la producción de NO215. El inhibidor de NOSs L‐NAME

bloquea tanto la generación de NO como la de O2‐ por parte de las NOSs216‐218.

El tratamiento de RAGs con Ang II estimula la producción de O2‐ mediante un mecanismo

dependiente de la enzima PKC. Además, los resultados presentados en la Segunda Parte de

la presente Tesis Doctoral, indican que las infusiones de Ang II afectan negativamente la

producción de NO, en parte mediante un aumento en la fosforilación del residuo de Thr 495

de la NOS3. Considerando estas evidencias, se planteó la hipótesis que establece que “la

estimulación de RAGs con Ang II produce un incremento en la producción de O2‐ del cual

participan las enzimas NOSs”. Para contrastar esta hipótesis se evaluó la contribución de las

enzimas NOSs al incremento en la producción de O2‐ que ocurre en la RAG, luego de la

estimulación aguda con Ang II. Además, se estudiaron los mecanismos que conllevan al

desacople.


Angiotensin II stimulates superoxide production by nitric oxide synthase in thick ascending limbs.

Gonzalez‐Vicente, A.*; Saikumar, J. H.*; Massey, J. K.; Hong, N. J.; Dominici, F. P.; Carretero, O. A. and Garvin,

J. L. Physiol Rep. 2016 Feb; 4(4). pii: e12697.

* Saikumar, J. H. y Gonzalez‐Vicente, A. contribuyeron de manera equivalente al presente artículo.

77

Resultados

3.5 Efectos de la estimulación aguda con Ang II sobre la producción de óxido nítrico

y anión superóxido en la RAG

Para confirmar que la estimulación aguda con Ang II aumenta la producción de NO en la RAG

y determinar la concentración de Ang II más conveniente para el desarrollo de los experimentos

subsiguientes, se midió el efecto de diferentes concentraciones de Ang II (10‐13, 10‐11, 10‐9 M)

sobre la producción de NO en RAGs aisladas. Los resultados presentados en la Figura 31.A

muestran que la Ang II en concentración 10‐9 M generó un aumento significativo en la producción

de NO dentro de los 5 minutos de tratamiento (P < 0.001; n = 9), mientras que concentraciones

menores no produjeron un aumento significativo en la respuesta de NO. Seguidamente, se

estudió si la estimulación con Ang II en concentración 10‐9 M durante un período de 5 minutos,

elevaba la producción de O2‐ en suspensiones de RAG en ausencia L‐arginina, sustrato general

de las NOSs, para evitar cualquier posible interferencia a causa de la producción de NO. Los datos

presentados en la Figura 31.B demuestran que concentraciones de Ang II en el rango de 10‐9 M

elevan la producción de O2‐ dentro de los 5 minutos de tratamiento, lo que indica que la RAG

tiene la capacidad de producir tanto NO como O2‐ de manera simultánea. Dado que la incubación

con Ang II en concentración 10‐9 M durante 5 minutos estimuló la producción de NO y O2‐, se

decidió utilizar esa combinación de dosis y tiempo pare estudiar la interacción entre la Ang y la

producción de O2‐ por las enzimas NOSs en los experimentos posteriores.

78

Resultados

Figura 31: A) En el panel de la derecha se observa el efecto del tratamiento de agudo con diferentes dosis

de angiotensina (Ang) II sobre la producción de NO en RAGs aisladas. Los túbulos fueron disecados

manualmente y sostenidos entre dos pipetas en un microscopio invertido de fluorescencia. La producción de

NO fue medida mediante la fluorescencia del DAF‐FM. Los valores fueron expresados como unidades de

fluorescencia arbitraria (UAF/min). El tratamiento con Ang II en concentración 1x10‐9 M produjo un aumento

en la producción de NO respecto a valores basales (P < 0.001; n = 9) mientras que concentraciones menores no

desencadenaron aumentos significativos. B) En el panel de la derecha se observa el efecto de la estimulación

con Ang II en concentración pM sobre la producción de O2‐ en suspensiones de rama gruesa ascendente (RAG).

Dentro de los 5 minutos de iniciada la estimulación, la Ang II aumento la producción de O2‐ en valores cercanos

al 50%, yendo de una producción basal de 1,77 ± 0,26 unidades relativas de luz (URL)/s/μg proteína a 2,62 ±

0.36 URL/s/µg en presencia de Ang II (P < 0,04; n = 5).

3.5.1 Producción de anión superóxido derivado de las NOSs en respuesta a la

estimulación con Ang II en la RAG

Los experimentos presentados en esta sección fueros diseñados para estudiar por un

lado la contribución de las enzimas NOSs al incremento en la producción de O2‐ en respuesta

a la Ang II, y por el otro para evaluar la hipótesis de que dicho aumento es una consecuencia

del agotamiento de sustrato debido a un aumento en la producción de NO. Con este fin, se

evaluaron los efectos de la Ang II sobre la producción de O2‐ en presencia o ausencia del

inhibidor general de NOSs L‐NAME o y en exceso del sustrato general de NOSs L‐arginina.

Los resultados presentados en la Figura 32 demuestran que las NOSs contribuyen

significativamente al aumento de la producción de O2‐ desencadenado por la estimulación

con Ang II, y que el exceso del sustrato L‐Arginina no modifica los valores finales de

producción de O2‐.

79

Resultados

Figura 32: Producción total de O2

‐ en suspensiones de rama gruesa ascendente (RAG) tratadas con Ang II en

concentración pM, en presencia de L‐NAME o L‐arginina. Los valores de producción de O2‐ fueron los siguientes: Ang

II, 2.12 ± 0.20 URL/s/µg (n = 13); Ang II + L‐NAME, 1.10 ± 0.11 URL/s/µg (n = 8); y Ang II + L‐arginina, 2.34 ± 0.22

URL/s/µg (n = 5). El análisis de la varianza de un factor fijo indica que las medias de los tratamientos son diferentes

(P < 0.001). El test a posteriori por el método de Dunnett, el cual permite comparar las medias individuales de los

tratamientos con la media de un grupo control indica que la media de Ang II es diferente de Ang II + L‐NAME (P(ajustado)

< 0.002), mientras que las medias de Ang II Vs Ang II + L‐arginina no presentan diferencias significativas (P(ajustado) <

0.7).

3.5.2 Mecanismo molecular mediante el cual la Ang II estimula la producción de anión

superóxido por parte de las enzimas NOSs en suspensiones de RAGs

Estudios previos demostraron que la activación de la enzima PKC induce el desacople de las

NOSs y la generación de O2‐ en detrimento de la producción de NO. Además, la Ang II es capaz de

estimular la actividad de la enzima PKCα en la RAG, tanto de manera directa165, como indirecta a

través del O2‐ derivado del complejo NADPH oxidasa165, 219. Por lo tanto, se planteó la hipótesis

que establece que se requiere la participación conjunta de las enzimas PKCα y NADPH oxidasa

para inducir el desacople en las NOSs. Para contrastar esta hipótesis se estudió la generación de

80

Resultados

O2‐ derivado de las enzimas NOSs en la RAG luego de la estimulación con Ang II, en presencia

de los inhibidores de las enzimas PKCα/δ y del complejo NADPH oxidasa, Gö6976 y apocianina

respectivamente. Los resultados presentados en la Figura 33 indican que tanto la activación

de PKC como la del complejo NADPH oxidasa son eventos necesarios en el proceso de

desacople de NOSs en respuesta al tratamiento con Ang II. Sin embargo, no se pudo

determinar con certeza si el desacople de las enzimas NOSs es producto de una acción

directa de PKC o de una acción indirecta de la elevación de la producción de O2‐ por parte de

la NADPH oxidasa.

Figura 33: Producción de O2‐ dependiente de NOSs en suspensiones de rama gruesa ascendente (RAG)

tratadas con Ang II en concentración pM, en presencia de Gö6976 o Apocianina. Los valores de producción de

O2‐ fueron los siguientes: Ang II, 0.91 ± 0.27 URL/s/µg (n = 8); Ang II + Gö6976, 0.16 ± 0.13 URL/s/µg (n = 7); y

Ang II + Apocianina, ‐0.03 ± 0.09 URL/s/µg (n = 5). El análisis de la varianza de un factor fijo indica que las medias

de los tratamientos son diferentes (P < 0.01). El test a posteriori por el método de Dunnett, el cual permite

comparar las medias individuales de los tratamientos con la media de un grupo control indica que la media de

Ang II es diferente de la de Ang II + Gö6976 (P(ajustado) < 0.03) y de la de Ang II + Apocianina (P(ajustado) < 0.02).

81

Capítulo 4

DISCUSIÓN

Discusión

4. DISCUSIÓN

La interpretación de resultados presentada en esta sección fue parcialmente publicada en los siguientes

artículos de revisión:

Thick Ascending Limb Sodium Transport in the Pathogenesis of Hypertension. Gonzalez‐Vicente, A.; Saez,

F.; Monzón, C. M.; Asirwatham, J. and Galvin, J. L. Physiological Reviews, 2018 En Revisión

Effects of Reactive Oxygen Species on Tubular Transport along the Nephron. Gonzalez‐Vicente, A. and

Garvin, J. L. Antioxidants 2017, 6(2), 23

4.1 Generalidades del modelo de hipertensión inducido por Ang II

El SRA desempeña un papel central en la regulación de la presión arterial a través de sus

acciones sobre los sistemas nervioso central, cardiovascular y renal. La Ang II es el principal

efector de SRA y sus niveles intra‐renales y sistémicos están estrictamente regulados para

alcanzar el equilibrio hidrosalino. Los aumentos anormales en los niveles de Ang II conducen

a la retención de Na+ y al aumento concomitante de la presión arterial, mientras que

reducciones en los niveles de Ang II contribuyen a la eliminación de Na+ y a la disminución

de la presión arterial. En base a esto se han desarrollado varias estrategias de investigación

tendientes al estudio de los efectos de la Ang II sobre el balance hidrosalino y la presión

arterial.

Actualmente se dispone de varios modelos animales donde se manipulan los niveles de

Ang II o se interfiere con sus acciones. Entre las estrategias para disminuir las acciones del

SRA se encuentran el bloqueo de los receptores AT1, el uso de ratones knockout, así como

la reducción de formación endógena de Ang II por medio de inhibidores de la ECA o de la

renina. Estas últimas herramientas farmacológicas son también eficaces en el tratamiento

de pacientes hipertensos220‐222. Por otro lado, están los modelos de hipertensión inducida

por Ang II, que fueron históricamente clasificados en base a los niveles de renina. En los

modelos de “alta actividad de renina”, se obstruye parcialmente el flujo de sangre en una

arteria renal, lo cual, por medio de la disminución de la presión de perfusión renal estimula

la secreción de renina y la subsiguiente formación de Ang II. Estos modelos son generalmente

83

Discusión

acompañados por una nefrectomía parcial para limitar aún más la capacidad de excreción de Na+.

En el grupo clasificado como de “baja actividad de renina”, se utilizan inyecciones o bombas de

infusión para aumentar los niveles circulantes de Ang II de manera precisa. Ambos modelos de

hipertensión inducida por Ang II han sido ampliamente utilizados para estudiar las causas223‐228 y

consecuencias229‐232 de la hipertensión arterial.

En los modelos de hipertensión inducida por el incremento en los niveles de Ang II; la

magnitud y el perfil del aumento de la presión arterial, así como las adaptaciones fisiológicas que

se producen como consecuencia de dicho aumento, dependen de la cantidad de Ang II producida

o infundida. De esta manera, la administración crónica de dosis de efecto hipertensivo lento

(menores a 400 ng/kg/min para la mayoría de las especies) induce un aumento gradual de la

presión arterial. Estas dosis no tienen ningún efecto detectable sobre la presión arterial, el

volumen urinario o la excreción urinaria de Na+ de manera aguda, pero afectan estos parámetros

profundamente si la infusión de Ang II se prolonga por días o semanas225, 229, 233, 234. La progresión

de este modelo se asemeja a la hipertensión esencial en humanos. En el otro extremo, la infusión

de dosis de efectos hipertensivos rápidos (400‐3000 ng/min/kg dependiendo de la especie)

provoca un aumento súbito y sostenido en la presión arterial, que se asemeja a la hipertensión

maligna235‐239.

Por simplicidad, se clasificó la bibliografía existente en estudios de fase inicial y estudios de

fase de adaptación, incluyendo en la primera categoría todos aquellos estudios donde el tiempo

de infusión de Ang II fue de hasta 1 semana y en la segunda al resto.

En sus fases tempranas (de menos de 1 semana), los modelos hipertensivos lentos

dependientes de Ang II son útiles para examinar los cambios que conllevan a la elevación de la

presión arterial. Por el contrario, los modelos hipertensivos rápidos dependientes de Ang II, los

cuales elevan la presión arterial de manera inmediata, son útiles para estudiar los mecanismos

compensatorios al mencionado aumento de presión. Extendidos en el tiempo, ambos modelos,

hipertensivo lento e hipertensivo rápido conducen a altos niveles de estrés oxidativo,

insuficiencia renal, daño vascular y el agravamiento del estado de salud del sujeto en estudio40,

240‐243.

84

Discusión

En líneas generales, el aumento de la presión arterial (ΔPA) en los modelos de

hipertensión inducida por Ang II depende de los siguientes factores:

∆ ~

Donde [Ang II] representa los niveles de Ang II (ya sean de formación endógena o

administrados), [Sal] es la ingesta de NaCl y "Tiempo" es la duración del período

experimental. Dado que la presión arterial en diferentes modelos crónicos de hipertensión

arterial se estabiliza por debajo de los 220 mmHg244‐247, se infiere que en los modelos de

infusión de Ang II la contribución de la ingesta de sal sobre ΔPA se ve reducida en la medida

de que aumenta la dosis de Ang II, y que a lo largo del tiempo, la sensibilidad de la presión

arterial tanto a la ingesta de sal como a la Ang II disminuye (Figura 34).

Por ello, aún en el modelo hipertensivo lento de infusión de Ang II, y luego de un corto

período de retención de Na+, la sensibilidad a la sal disminuye con el tiempo38, 41. Por el

contrario, el aumento inmediato de presión arterial que ocurre cuando se infunden dosis de

Ang II de efecto hipertensivo rápido, hace que los animales entren inmediatamente en una

fase de natriuresis inducida por presión la cual resulta en un balance negativo de Na+ (Figura

35). El corolario de esto es que dosis bajas de Ang II, como las utilizadas en el presente

Trabajo de Tesis, son las más adecuadas para el estudio la hipertensión de origen renal.

La investigación llevada a cabo para esta Tesis Doctoral, estudia la participación de la

RAG en hipertensión inducida por Ang II. Sin embargo, los presentes resultados obtenidos

en RAGs medulares deben ser interpretados en el contexto general del riñón ya que la Ang

II no solo estimula el transporte de Na+ en este segmento1, 168, 248, sino también en el túbulo

proximal249 y en el túbulo colector 250, 251. Así, es importante tener en cuenta las acciones

concomitantes de la Ang II a lo largo de diferentes segmentos de la nefrona182.

A continuación, se discutirán los resultados obtenidos en el presente Trabajo de Tesis,

así como las limitaciones de los métodos experimentales utilizados, en el contexto de la

bibliografía existente.

85

Discusión

Figura 34: Efectos combinados de la ingesta de sal [Sal] y la dosis de angiotensina II [Ang II] sobre el aumento

de presión arterial (ΔPA) a lo largo de la primera semana de infusión. Las contribuciones parciales de [Sal] y [Ang II]

to ΔPA se muestran a la derecha.

Figura 35: Efecto de la infusión de dosis de angiotensina II de efecto hipertensivo lento (área rosa) y rápido

(área celeste), sobre el balance acumulativo de Na+ durante la primera semana de infusión. La pendiente del balance

acumulativo de Na+ indica el balance diario neto para este ion. En ambos casos, la estabilización de la pendiente en

valores cercanos a cero indica que los animales alcanzaron (o están próximos a alcanzar) un nuevo equilibrio de Na+.

86

Discusión

4.1.1 Utilización de ratones knockout para el estudio de la participación del riñón

en los modelos de hipertensión inducidos por Ang II

La confirmación inequívoca de la importancia del riñón en los modelos de hipertensión

inducida por Ang II, proviene de estudios conducidos en ratones knockout específicos para

diferentes componentes del SRA tanto sistémico como intrarenal. La posibilidad de poder

generar ratones knockout, una tecnología que en otros roedores está en sus comienzos252,

tiene como contrapartida que el ratón es resistente a los efectos de la Ang II y requiere altas

dosis del péptido para volverse hipertenso. Esto dificulta la comparación y extrapolación de

resultados con otros modelos de experimentación y con humanos. A modo de ejemplo, en

ratones infundidos con 400 ng/kg/min de Ang II, se presenta un aumento lento en la presión

arterial41 que es similar al originado por la infusión de 200 ng/kg/min de Ang II en ratas38.

Además, y a pesar de que están emergiendo nuevas tecnologías253, los métodos

comúnmente utilizados para generar ratones knockout requieren de la inyección de células

madre modificadas de la cepa SV229 (la cual contiene 1 solo gen de renina), dentro de un

blastocito de un ratón de la cepa C57 (la cual contiene 2 genes de renina)254. Esto representa

una seria limitación para estudiar el SRA, ya que se debe invertir una cantidad de tiempo y

recursos considerables para entrecruzar los ratones mutantes dentro del entorno de C57. En

su defecto se pueden utilizar los ratones quimera que poseen células de linajes genéticos

diferentes y compararlos con el fenotipo de ratones C57 homocigotas los cuales, en este

caso, no representan un control genético adecuado. Finalmente, los ratones C57 presentan

sensibilidad de la presión arterial a la ingesta de sal255. En definitiva, los ratones knockout

ofrecen una importante herramienta de experimentación en tanto y en cuanto se tengan en

cuenta las limitaciones de este modelo.

En estudios que involucraron el transplante de riñones knockout para el receptor AT1 a

ratones normales, se demostró que la señalización mediada por AT1R en el riñón contribuye

en un 35 % a los valores basales de presión arterial256. Una contribución comparable a la

suma de los efectos mediados por la señalización a través del receptor AT1 en todos los

tejidos extrarenales256. Además, estudios de infusión de Ang II en ratones knockout para el

87

Discusión

receptor AT1 o la ECA demuestran la importancia del SRA intrarenal en el desarrollo del modelo

de hipertensión inducida por Ang II como de describe a continuación.

4.1.2 EL SRA intrarenal durante las infusiones sistémicas de Ang II

Los riñones poseen la maquinaria enzimática completa para la síntesis de angiotensinógeno

y de Ang II. Esto se denominó SRA intrarenal43.

Estudios en con ratones carentes de la ECA en el riñón, demostraron que estos animales

presentan aumentos marginales en la presión arterial en respuesta a la infusión de Ang II41, lo

cual indica que la producción renal de Ang II es esencial para desarrollar plenamente el modelo

de hipertensión inducida por Ang II. Si bien angiotensinógeno hepático es la principal fuente de

Ang II de formación renal renal46, las infusiones crónicas de Ang II producen un aumento en la

producción de angiotensinógeno en la corteza renal y de su excreción en orina37, 257, 258, cambios

que no son evidentes en infusiones tiempos de infusión de 3 días o menos182. Además, durante

la infusión de dosis de Ang II de efecto hipertensivo lento, se verifica un aumento en los niveles

circulantes de Ang II desde el 3er día de iniciada la infusión acompañado de una acumulación de

Ang II en el riñón evidente al 10mo día37. Más importante aún, la evolución de la presión arterial

muestra concordancia con los cambios consistentes con la activación del RAS intrarenal37, 38. Así,

la activación del SRA intrarenal resulta en un aumento en el contenido del intrarenal de

angiotensinógeno, ECA y Ang II43, lo cual es esencial para el desarrollo de la patología hipertensiva

inducida por Ang II259.

4.1.3 Efectos de las infusiones de Ang II sobre la actividad y expresión de los

transportadores de iones en la RAG

En el presente Trabajo de Tesis se demostró que la infusión subcutánea de Ang II en dosis de

200 ng/kg/min durante 1 semana, aumenta el transporte neto en la RAG de rata. Estas dosis

también causan que marcadores de activación del NKCC2 como diuresis y natriuresis inducidas

por furosemida, la fracción de NKCC2 fosforilada o localizada en la membrana apical, aumenten

a partir de los 3 días de iniciada la infusión de Ang II y hasta el día 14182, 260. Sin embargo,

previamente a la realización de los experimentos presentados en la presente Tesis Doctoral, no

88

Discusión

existía estudios sobre la velocidad de transporte neto en la RAG, a la dosis de Ang II y tiempo

de infusión mencionados. Tampoco se disponía de información acerca de los cambios que se

producen en la actividad de la Na+/K+‐ATPasa en la RAG medular durante las infusiones de

Ang II.

Nuestra investigación, demostró que la actividad de la Na+/K+‐ATPasa se encuentra

aumentada en las RAGs después de la infusión de dosis hipertensivas lentas de Ang II durante

1 semana1 sin modificaciones ni en la abundancia proteica de la enzima, ni en la afinidad por

el Na+ 1, 260.

Para la realización de nuestros experimentos desarrollamos métodos capaces de medir

la actividad de la Na+/K+‐ATPasa en la membrana plasmática. Dado que dichos métodos

requirieron la utilización de nistatina, no se puede descartar que la presencia de un ionóforo

de Na+ provoque una redistribución de Na+/K+‐ATPasa desde un compartimento intracelular

a la superficie. Si bien esto es posible, es poco probable que suceda durante el rango de

tiempo experimental empleado, ya que el tratamiento agudo con ionóforos de Na+ por

períodos de 30 min no modifica la expresión de la Na+/K+‐ATPasa en la membrana

plasmática261, 262, y los experimentos realizados fueron concluidos en 20 min. Además, se ha

demostrado que el tratamiento con nistatina no aumenta la fosforilación del residuo de Ser

23 de la subunidad α1 de la Na+/K+‐ATPasa de rata263, lo cual es un evento necesario para la

translocación a membrana264, 265.

Se demostró además que la Ang II no causa un efecto sobre afinidad por el Na+ lo cual

contradice estudios previos en túbulos proximales, donde el tratamiento agudo con

concentraciones pM de Ang II aumenta la afinidad de la Na+/K+‐ATPasa por este ion266. Esto

se traduce como un aumento en la actividad de la enzima en los túbulos tratados con Ang II

a concentraciones limitantes de Na+. Sin embargo, el tratamiento de túbulos proximales con

concentraciones mayores de Ang II resulta en una pérdida de dicho efecto estimulatorio a

bajas [Na+] lo cual indica que concentraciones de Ang II mayores no causan un aumento de

afinidad por este ion266. Teniendo en cuenta estos resultados, y dado que los niveles

intrarenales de Ang II están en el rango de 1 a 10 nM267, 268, no sería esperable detectar

89

Discusión

efectos sobre la afinidad por el Na+ en modelos de infusión de Ang II, donde las concentraciones

intrarenales del péptido están elevadas37, 269.

Si bien en el presente Trabajo de Tesis reportamos que la infusión de Ang II eleva la actividad

Na+/K+‐ATPasa en la RAG medular, estudios previos de nuestro laboratorio demostraron que la

infusión de Ang II aumenta el O2‐ renal168 y otros investigadores demostraron que la actividad de

la Na+/K+‐ATPasa es inhibida por ROS270‐274. La explicación de esta aparente discrepancia, es que

la generación de ROS en los modelos de infusión de Ang II depende de la dosis de Ang II, tiempo

de tratamiento y la cantidad de NaCl en la dieta. Así, mientras que en el presente trabajo

infundimos dosis de Ang II de efecto hipertensivo lento, en el mencionado trabajo previo se

utilizaron dosis que causan un aumento inmediato en la presión arterial168. Además, muchos de

los estudios que reportan que los ROS ejercen un efecto inhibidor sobre Na+/K+‐ATPasa utilizan

sistemas de generación de ROS (como la xantina oxidasa o inhibidores de superóxido dismutasa),

los cuales generan altísimos niveles de O2‐, que difieren de la generación de O2

‐ en respuesta a

estímulos fisiológicos como la Ang II. Por último, puede ser importante la presencia o ausencia

de otras sustancias. En estudios previos se demostró que el O2‐ produce daño oxidativo sobre la

actividad de la Na+/K+‐ATPasa274, pero que este daño es dependiente de la presencia de NO151,

169. Así, los efectos deletéreos del O2‐ posiblemente sean mediados por el radical peroxinitrito4,

275. Puesto que como se discute más adelante la Ang II reduce la actividad de la enzima NOS3 y la

biodisponibilidad de NO en la RAG, un aumento en la formación local de peroxinitrito parece

poco probable.

Finalmente, cabe preguntarse por qué la infusión de furosemida, un fármaco utilizado para

aumentar la diuresis, no previene el aumento de la presión arterial. Creemos que la respuesta se

encuentra en que la dosis furosemida utilizada es baja (1mg/kg/día) y la misma no modifica ni la

presión arterial ni el volumen urinario si es administrada de manera aguda276, 277. Tampoco se

ven efectos a este nivel usando dosis 10 veces mayores infundidas de manera continua durante

2 semanas mediante el uso de mini‐bombas osmóticas278. Por ello, la dosis utilizada aquí es una

dosis no‐natriurética, que pretende disminuir, y no bloquear completamente la entrada de Na+ a

la RAG.

90

Discusión

El presente Trabajo de Tesis se muestra por primera vez que la infusión de dosis

hipertensivas lentas de Ang II durante una semana, aumentan la actividad de la Na+/K+‐

ATPasa en la RAG medular. Estos resultados son consistentes con estudios en el túbulo

proximal que demuestran que el tratamiento agudo con Ang II estimula la actividad de este

transportador279, 280, y con otros que muestran que elevaciones crónicas de la Ang II

aumentan la actividad de la Na+/K+‐ATPasa en otros tejidos281, 282.

Hasta aquí, los resultados presentados representan una clara manifestación de los

efectos ahorradores de Na+ de la Ang II. Sin embargo, después de la primera semana de la

infusión de Ang II, el modelo progresivamente evoluciona a la 2da fase donde la natriuresis

inducida por presión contribuye a que se alcance el balance de Na+. La reducción en la

retención de Na+, produce una disminución en la pendiente de aumento de la presión

arterial, la cual finalmente se estabiliza38. Así, cuando los efectos ahorradores de Na+ y

vasoconstrictores de la Ang II convergen en elevar la presión arterial en más de 40 mmHg,

se produce una respuesta natriurética compensatoria que comienza en segmentos

proximales de la nefrona y llega hasta extremidades gruesas medulares283. Como parte de

esta respuesta natriurética, luego de 2 semanas de infusión de Ang II, la expresión de la

Na+/K+‐ATPasa en la franja interna de la médula externa258 disminuye. Esta disminución se

acompaña de una reducción en la abundancia proteica del NKCC2 así como de su

fosforilación258. Sin embargo, en la RAG cortical y en los túbulos colectores, persisten los

efectos positivos de la Ang II sobre transportadores de Na+ 258. Esto es evidencia de la acción

concomitante de dos mecanismos antagónicos, donde la Ang II induce cambios consistentes

con un aumento de actividad del transportador, y la natriuresis inducida por presión reduce

su expresión proteica. La disminución de la abundancia del NKCC2 como mecanismo de

natriuresis por presión se ha demostrado en otros modelos hipertensivos. Por ejemplo, la

elevación de la presión arterial en ratas alcanzando niveles de hasta 220 mmHg, mediante la

infusión de altas dosis de noradrenalina (1000µg/kg/h; durante 1 semana), produce un

aumento en la diuresis y natriuresis, el cual está acompañado por una reducción dramática

del NKCC2 en la médula renal284. Finalmente, pasados los 14 días de iniciada la infusión de

Ang II, se generan cambios irreversibles debidos al aumento de la presión arterial y los

91

Discusión

efectos extrarenales de la Ang II que contribuirían a mantener la presión arterial elevada, entre

los que se destacan el aumento sistémico del estrés oxidativo, la rigidez vascular, la hipertrofia

cardíaca y el daño renal40, 240‐243. En este contexto, los efectos de la Ang II sobre la reabsorción de

Na+ en la RAG ceden protagonismo en el mantenimiento de la hipertensión.

En resumen, los estudios conducidos en ratas indican que durante la fase inicial de la infusión

de Ang II, la abundancia de los transportadores se encuentra aumentada en la RAG182, 260 así como

en otros segmentos de la nefrona182. Además, el modesto aumento en la presión arterial (cercano

a los 20 mmHg) no es suficiente para revertir los efectos de Ang II mediante natriuresis inducida

por presión1 y los animales presentan dificultades eliminando Na+ administrado en un bolo182. En

conjunto, estos cambios conducen a una hipertensión denominada sensible a la sal38. Con el

tiempo, los efectos ahorradores de Na+ de la Ang II en la RAG, son contrarrestados por

elevaciones en la presión arterial258, 285.

Los resultados obtenidos en ratas han sido confirmados en ratones. Así, la infusión de Ang II

en dosis de 400 ng/kg/min durante 2 semanas a ratones C57 origina un aumento continuo de la

presión arterial (de aproximadamente 30 mmHg)41 comparable al que presentan ratas infundidas

con dosis de efecto hipertensivo lento. Los ratones infundidos con Ang II usando el mencionado

protocolo experimental, presentan un aumento en los niveles de fosforilación del transportador

NKCC2, a pesar de observarse una disminución marginal en su expresión total. El incremento en

la fracción de fosforilación del NKCC2, se ve acompañado por un aumento en la localización apical

del transportador y por un aumento en la respuesta al diurético furosemida41. Dichos cambios

son consistentes con una activación del transportador en respuesta a la infusión de Ang II. Por el

contrario, la infusión de Ang II en ratones en dosis de 1000 ng/kg/min, produce una pronunciada

elevación en la presión arterial durante los primeros días de tratamiento286 asemejándose a una

dosis de efecto hipertensivo rápido en ratas. Los ratones infundidos con la dosis antedicha

durante 2 semanas presentan una reducción del 25% en la abundancia del NKCC2 en

homogenatos de riñón286. Finalmente, la infusión de Ang II en dosis de 2000 ng/kg/min produce

una disminución en los niveles de fosforilación del NKCC2287.

Los cambios hallados infundiendo dosis en el orden de los µg/kg/min en ratones, podrían

deberse tanto a un efecto negativo directo de la Ang II sobre la expresión del NKCC2, y por ende

92

Discusión

sobre el transporte iónico en la RAG, o ser evidencia de un mecanismo contraregulador. La

respuesta a esta incógnita se halla a partir de estudios llevados a cabo en ratones de ambos sexos,

los cuales fueron infundidos con 800 ng/kg/min de Ang II durante una semana. En este

estudio, la infusión de Ang II en hembras jóvenes produjo una modesta elevación en la

presión arterial de alrededor de 20 mmHg, la cual estuvo acompañada por aumento cercano

al 25% en la expresión NKCC2288. Por el contrario, la infusión de Ang II en machos jóvenes

elevó la presión arterial en valores cercanos a 40 mmHg, y redujo la expresión del NKCC2 en

un 40 % 288. Finalmente, las hembras adultas presentaron una mayor pendiente de elevación

de la presión arterial en los primeros días de tratamiento comparadas con las hembras

jóvenes, y un valor de presión arterial intermedio ente las hembras y machos jóvenes al final

del estudio; en estos animales no se observaron cambios en la expresión del

transportador288.

De esta manera, los estudios en ratones apoyan las conclusiones obtenidas en los

experimentos realizados en ratas, confirmando que mientras la Ang II estimula la expresión

del NKCC2, la presión arterial la disminuye, de modo que la cantidad final del transportador

resulta del balance de ambos efectos.

4.1.4. Efectos de las infusiones de Ang II sobre el sistema del NO en la RAG

La deficiencia en la producción de NO por la NOS3 en la RAG, es un factor determinante

en la generación de hipertensión arterial. Teniendo en cuenta que el efecto natriurético del

NO antagoniza los efectos ahorradores de Na+ inducidos por la Ang II, en la Segunda Parte

de este trabajo, contrastamos la hipótesis que postula que la infusión crónica de Ang II

induce un deterioro en la producción de NO en la RAG.

Primeramente, evaluamos la expresión de la NOS3 en la RAG medular mediante

Western Blotting, hallando que a los 5 días de iniciada la infusión de Ang II la abundancia de

NOS3 disminuye marcadamente. En simultáneo, la presión arterial se encuentra aumentada,

por lo que se plantea el interrogante de si la reducción en NOS3 es consecuencia de la

acumulación de la Ang II o del aumento concomitante en la presión arterial. La respuesta

más plausible a esta incógnita se puede hallar en las alteraciones encontradas en el modelo

de hipertensión de Goldblat, en su modo 2 riñones‐1 clip; donde ambos riñones están

93

Discusión

expuestos a niveles similares de Ang II269, pero a presiones de perfusión diferentes. En dicho

modelo, la expresión de NOS3 disminuye en igual medida en la médula del riñón en el que

se produjo la constricción de la arteria renal como en el contralateral289, indicando que el origen

de la reducción en la expresión de NOS3 es el aumento en los niveles de Ang II y no la

hipertensión. La reducción de NOS3 en respuesta a Ang II, fue corroborada en nuestro

laboratorio utilizando cultivos primarios de RAGs, en ausencia de presión arterial, hipoxia y

tensión de corte debida al flujo luminal290.

En el presente estudio hemos demostrado que la infusión de Ang II disminuye la expresión

de la NOS3 en la RAG medular. Estos hallazgos contrastan con estudios que reportaron que la

infusión de Ang II no produce cambios a este nivel289, 291, 292 o incluso da lugar a un aumento en

los niveles de NOS3293 en la médula renal. También contrastan con datos que muestran que las

infusiones crónicas de Ang II aumentan la expresión NOS3 en la corteza renal291‐293. Explicaciones

posibles para comprender la disparidad de resultados surgen de considerar los efectos de la Ang

II en otros tejidos.

A modo de ejemplo, se demostró que la exposición de células endoteliales de arteria

pulmonar bovina en cultivo a concentraciones de Ang II en el orden µM por 6 horas, produce un

aumento en los niveles de ARNm para la NOS3294. Sin embargo, otro estudio conducido en células

endoteliales de aorta de rata sometidas a un protocolo de anoxia y reoxigenación, demostró que

el tratamiento con concentraciones µM de Ang II repercute negativamente en los niveles de

ARNm para NOS3295. De manera similar, mientras que la infusión crónica de Ang II en dosis de

700 ng/kg/min por una semana aumenta la expresión de NOS3 en la aorta de ratas Wistar, el

bloqueo de los receptores AT1 mediante la administración crónica de telmisartan en ratas

espontáneamente hipertensas (SHR) produce efectos similares296. En estudios realizados en

corazón también se han hallado resultados dispares293, 297, 298. Tomados en conjunto, estos datos

demuestran que los efectos de la Ang II no solo son específicos para cada tejido, sino que también

dependen de las dosis y de las condiciones experimentales. Más importante aún, no siempre se

pueden discernir claramente los efectos primarios de la Ang II, de los efectos secundarios a otros

cambios, como lo son el aumento de la presión arterial o del estrés oxidativo.

94

Discusión

En la RAG, se demostró la estimulación de la producción de NO por la NOS3 en respuesta

a diversos estímulos, incluyendo el ATP299, 300, los agonistas adrenérgicos α2301, la ET‐1200, 203

y el flujo luminal300, 302, 303 entre otros. De esta estimulación participa la vía de señalización

dependiente de la enzima PI3K y el PIP3. Debido a ello, el estudio de la producción de NO en

respuesta a PIP3 aborda directamente la actividad de la NOS3 evitando la interacción con

otros factores. Más importante aún, los resultados de estudios que abordan el mecanismo

único de esta vía pueden extrapolarse a todos los mediadores río arriba. Por ello, nuestro

hallazgo que muestra que la producción de NO mediada por NOS3 disminuye luego de la

infusión de Ang II, sugiere que la respuesta a NO de todos los activadores de esta vía se

encuentra afectada. Así, nuestros datos indican que la infusión de Ang II dañaría la capacidad

de la NOS3 para responder a cualquier estímulo fisiológico que actúe a través de PIP3.

El paso final en la activación de la NOS3 por la vía de la PI3K, es la fosforilación de la

enzima en el residuo Ser 1177. Se ha acumulado evidencia que indica que la fosforilación en

los residuos Thr 495 y Ser 1177 en respuesta a varios estímulos304‐307, incluyendo el bloqueo

de los receptores AT1308, 309 es antagónica ya que la fosforilación en la Thr 495 reduce la

producción de NO.

Por lo tanto, se planteó la hipótesis que postulaba que, si la Ang II daba lugar a un

aumento en la fosforilación basal de la enzima en el residuo de Thr 495, la fosforilación en el

residuo de Ser 1177 en respuesta a PIP3 se encontraría disminuida, tal cual lo demuestran

nuestros datos experimentales. Además, estudios realizados por integrantes de nuestro

grupo de trabajo en forma posterior a la finalización de la etapa experimental del presente

Trabajo de Tesis, demostraron que la reducción en vía de señalización del NO en la RAG, en

los modelos hipertensivos lentos inducidos por Ang II, se encuentra también asociada a una

disminución en los niveles de GMPc, no solo como consecuencia de una menor producción,

sino también de un aumento de la degradación de este intermediario por parte de la PDE5310.

De esta manera se demostró que, durante las infusiones de Ang II, diferentes mecanismos

convergen en reducir las acciones del NO en la RAG, tanto mediante una menor producción

de NO como por la interferencia en sus vías de señalización. La Figura 36 resume estado de

la vía de señalización del NO en la RAG durante las infusiones de Ang II.

95

Discusión

Figura 36: Estado de la vía de señalización del NO en la rama ascendente gruesa, durante la hipertensión

inducida por angiotensina (Ang) II. La gráfica muestra la cascada simplificada de señalización del NO. Los cambios

que ocurren durante la infusión de Ang II (representados con flechas rojas) dañan la capacidad de inhibición de

NKCC2 mediada por NO en respuesta a estímulos natriuréticos. Akt: Proteína quinasa B. NOS3(P‐S1177): NOS3

fosforilada en el residuo estimulatorio de Ser 1177. NOS3(T‐495): NOS3 fosforilada en el residuo inhibitorio de Thr

495. GMPc: guanosín monofosfato cíclico. PDE5: fosfodiesterasa 5. NKCC2: cotransportador de Na+‐K+‐2Cl‐ de tipo 2.

Finalmente, es importante remarcar que los datos presentados aquí sobre los efectos de la

Ang II sobre la RAG muestran una dependencia temporal. Publicaciones previas, incluyendo

algunas de nuestro grupo de trabajo, indicaron que el tratamiento agudo con Ang II in vitro,

estimula la producción de NO en la RAG185, 311. Además, la infusión por vía intravenosa de 200

ng/kg/min de Ang II produce un aumento en los niveles de NO en la médula renal durante las

primeras 3 horas, para retornar luego a valores basales al 3er día de infusión293. Los resultados

presentados en esta Tesis Doctoral, extienden los hallazgos de estudios previos demostrando que

96

Discusión

luego de 5 días de infusión de Ang II, la producción de NO en la RAG se encuentra afectada

por la disminución en la expresión de NOS3 y por el aumento en la fosforilación en el residuo

de Thr 495.

4.2 Producción de O2‐ por parte de las enzimas NOSs en respuesta a Ang II

La síntesis de NO por parte de la enzima NOS3 y otras isoformas, implica el traspaso de

electrones desde intermediarios reductores a la L‐arginina. Sin embargo, bajo determinadas

circunstancias, los electrones pueden ser transferidos al oxígeno molecular, lo cual causa la

generación de O2‐ 212. El equilibrio entre la producción de NO y la generación de O2

‐ por parte

de la NOS3 está regulado por la fosforilación del residuo de Thr 495, lo cual produce un

aumento en la producción de O2‐ en detrimento de la producción de NO215. En la Segunda

Parte de este Trabajo de Tesis se demostró que la infusión de Ang II causa una reducción en

la producción de NO en la RAG asociada a un aumento en la fosforilación del residuo de Thr

495 de la enzima NOS3, lo cual sugiere que la Ang II podría estar desacoplando dicha

isoforma. Por ello, en la Tercera Parte se decidió estudiar los efectos agudos de las Ang II

sobre la producción de O2‐ por parte de las NOSs.

Los resultados obtenidos demuestran que el tratamiento de suspensiones de RAGs con

Ang II induce la producción de O2‐ por parte de las enzimas NOSs, y que el agregado del

sustrato general de las NOSs L‐arginina no modifica los valores totales de producción de O2‐

. Tomados en conjunto estos datos indican que la producción de O2‐ derivado de las NOSs en

respuesta a la Ang II no es una consecuencia del agotamiento del sustrato en el medio de

medición.

Aparte de la deficiencia de L‐arginina, niveles insuficientes del cofactor BH4 pueden

ocasionar el desacople de las enzimas NOSs y la subsiguiente producción de O2‐ 212, 312, 313.

Esta posibilidad parece poco probable en nuestros experimentos ya que está demostrado

que el precursor de la BH4 sepiapterina no tiene efecto alguno sobre la producción de NO

en suspensiones de RAGs159. Así, y a pesar de que niveles insuficientes de BH4 pueden ser

relevantes en los modelos de hipertensión crónica314 incluidos los dependientes de Ang II315,

97

Discusión

no hay evidencias de que puedan ser una limitante para la producción de NO durante la

exposición aguda a Ang II en suspensiones de RAGs.

Un interrogante a ser respondido es cuál isoforma de NOS es responsable de la producción

de O2‐ en respuesta a la estimulación con Ang II. Si bien un diseño experimental adecuado para

responder a este interrogante involucraría la utilización de ratones knockout para las diferentes

isoformas de NOS o el silenciamiento transiente de las diferentes isoformas de la enzima, algunas

especulaciones pueden hacerse en base a la bibliografía existente. En primer lugar, la isoforma

NOS1 no posee sitios de fosforilación para enzima PKC316, la cual se demostró participa en el

proceso de desacople de las NOSs. De hecho, la PKC reduce la sensibilidad de la NOS1 por el Ca2+

317, lo cual repercute negativamente sobre la actividad enzimática318. Estos datos sugieren que la

NOS1 no participaría significativamente en la generación de O2‐ mediada por la enzima PKC. En

segundo lugar, la isoforma NOS2 es regulada a nivel transcripcional319, 320, principalmente por

factores que estimulan el sistema inmunológico319, 320, por lo que se espera que su abundancia

en condiciones basales sea baja. De hecho, la expresión basal de NOS2 en el riñón de rata está

cercana al límite de detección tanto en experimentos de inmunohistoquímica como en Western

Blots 320, 321, lo cual sugiere que su capacidad de catálisis en esta condiciones es despreciable

comparado con otras isoformas expresadas de manera constitutiva. Finalmente, la isoforma

NOS3 puede ser fosforilada por la PKC215, 322, lo cual está comprobado estimula la producción de

O2‐ 215, 323. Así, la isoforma NOS3 es el mejor candidato a mediar la producción de O2

‐ en respuesta

a la estimulación aguda con Ang II.

Estudios previos indican que la Ang II estimula la producción de O2‐ a través de un mecanismo

mediado por el receptor AT1, y que involucra a la enzima PKCα165 y al complejo NADPH oxidasa162,

165, 166. El O2‐ así generado tiene la capacidad de retroalimentar de manera positiva la activación

de PKC219. Los datos obtenidos en el presente Trabajo de Tesis demuestran además que la

estimulación de RAGs con Ang II induce la producción de O2‐ por las NOS en un mecanismo del

que participa PKC y el complejo NADPH oxidasa. Dado que la acción de PKC sobre el residuo de

Thr495 de la NOS3 induce la producción de O2‐ por esta enzima, se crea el interrogante de por

qué es necesaria la participación del complejo NADPH oxidasa. La respuesta más sencilla es que

el grado de activación directo inducido por la Ang II sobre la enzima PKCα no es suficiente para

98

Discusión

causar la fosforilación de NOS3, por lo que es necesaria la retroalimentación positiva del O2‐

. Alternativamente, puede darse el caso de que el pool de PKCα activado por la Ang II no esté

en condiciones de fosforilar a la NOS3, por lo que un pool secundario de PKC deba ser

reclutado para llevar a cabo esta función.

Figura 37: Modelo de la vía de señalización por medio de la cual la Ang II estimularía la producción de O2‐

por las enzimas NOSs. La vía requiere la participación conjunta de las enzimas PKCα y NADPH oxidasa. La Ang II

estimula a la enzima PKCα, que luego estimula a la NADPH oxidasa produciendo un aumento inicial en la

producción de O2‐. El O2

‐ así producido retroalimenta de manera positiva a la PKCα, lo cual potencia la señal Ang

II/PKCα/NADPH oxidasa/O2‐/PKCα. A partir de entonces se presentan 3 posibles mecanismos de desacople de la

NOS3: 1) el pool de PKCα reclutado inicialmente fosforila a las NOSs (línea celeste); 2) el aumento en la

producción de O2‐ estimula un pool diferente de PKC, el cual fosforila a la NOSs (línea verde); y 3) O2

‐ producido

afecta de manera directa a las NOSs (línea naranja). Las flechas representan efectos estimulatorios.

99

Discusión

En base a estas especulaciones, la producción primaria de O2‐ puede conducir a la formación

de O2‐ por parte de enzimas NOSs por uno de 3 caminos diferentes presentados en la Figura 37.

En el primer caso, producción primaria de O2‐ retroalimentaría de manera positiva al pool inicial

de PKCα, el cual luego fosforaría la NOS3 en el residuo de Thr 495 y aumentaría la producción de

O2‐ en detrimento de la de NO. La segunda alternativa, es que el O2

‐ producido inicialmente

estimule a un pool diferente de PKC219, que luego fosforaría a la NOS3 en la Thr 495. Finalmente,

el O2‐ podría tener un efecto directo sobre las NOSs que lleva al desacople. Tal efecto no ha sido

descrito aún en la bibliografía324.

En resumen, los resultados obtenidos en la Tercera Parte de este Trabajo de Tesis

investigación extienden los hallazgos de estudios anteriores. Se demostró que la Ang II puede

aumentar la producción de O2‐ en la RAG mediante el desacople de enzimas NOSs, posiblemente

NOS3, a través de un mecanismo dependiente de PKC similar al empleado para estimular la

producción de O2‐ vía NADPH oxidasas165. Así, luego de la fuente principal NOX4, la producción

de O2‐ por parte de las NOSs en la RAG contribuye a aumentar los niveles de ROS.

4.2.1 Interacción Ang II / NO / O2‐.

La interacción entre la Ang II, el NO y las especies reactivas del oxígeno (ROS) desempeña un

papel central en la regulación del transporte en la RAG311.

Las vías de producción de NO y O2‐ en respuesta a la Ang II se encuentran altamente

interconectadas. Concentraciones similares de Ang II, actuando en receptores AT1165 y AT2184, 185,

estimulan la producción de O2‐ por la NOX4 o de NO por la NOS3 respectivamente (Figura 38).

Además, la estimulación de las enzimas NOSs por la Ang II puede llevar a la producción de NO185

o a la formación de O2‐ 165 (Figura 38). El entrecruzamiento y la redundancia de estas vías cobra

especial relevancia en modelos de infusión de Ang II crónica donde se genera un desbalance que

favorece la señalización O2‐ por sobre la del NO. Por ejemplo, la expresión de NOS3, tanto a nivel

de ARNm como proteico se encuentra elevada en miocardio297 y tejido vascular325, 326 de ratas

tratadas con Ang II. Sin embargo, y a pesar del aumento en la abundancia de la enzima NOS3,

estos animales presentan una disminución marcada en la biodisponibilidad de NO, y disfunción

endotelial. Ambos parámetros están asociados a elevados niveles de ROS y O2‐. De esta manera,

100

Discusión

el aumento en la expresión de NOS3 en miocardio y tejido vascular de animales infundidos

con Ang II, no se traduce en un mecanismo protector para elevar los niveles de NO, sino que

representa un mecanismo sinérgico de aumento del estrés oxidativo327.

Otro ejemplo de la relevancia de la generación de O2‐ en el modelo de hipertensión

inducida por Ang II, es que la infusión del antioxidante Tempol (el cual secuestra O2‐),

previene el aumento en la velocidad de transporte de iones en la RAG durante las infusiones

de Ang II, la cual está asociada a una mayor activación de PKC168 y a un incremento en la

fosforilación del residuo de Thr495 de las NOS32.

101

Discusión

Figura 38: Interacción entre la señalización de la angiotensina (Ang) II y los senderos de producción de óxido

nítrico (NO) y anión superóxido (O2‐) en la rama ascendente gruesa (RAG). Las líneas terminadas en flechas indican

estimulación y las líneas terminadas en “T” inhibición. Las líneas punteadas representan mecanismos que no se

conocen en detalle. La activación del AT1R estimula a la fosfolipasa C (PLC), la cual hidroliza al fosfatidilinositol 4,5‐

difosfato (PIP2) generando diacilglicerol (DAG) e inositol trisfosfato (IP3). El IP3 difunde hacia el retículo

endoplásmico liberando Ca2+, mientras que el DAG recluta a la proteína quinasa C (PKC) a la membrana plasmática

y junto con el Ca2+ la activan. Paralelamente, la Ang II, actuando en a través del AT2R activa a la enzima

fosfatidilinositol 3’ quinasa (PI3K), lo que genera fosfatidilinositol (3,4,5)‐trisfosfato (PIP3) y posterior activación de

la proteína kinasa B (Akt) en un mecanismo mediado posiblemente por la quinasa de tipo 1 dependiente de

fosfoinosítidos (PDK1). La activación de AT1R y AT2R y la elevación de la [Ca2+] activan por mecanismos no

esclarecidos a la fosfolipasa A2 citosólica (PLA2cit). La PLA2cit. genera 20‐HETE a partir del ácido araquidónico (AA).

El 20‐HETE reduce el transporte neto en la RAG, por un mecanismo en el que participaría la enzima Akt. NOS3 es

activada por Akt y por Ca2+ lo que da lugar a un incremento en la producción de NO que media sus acciones a través

de GMPc. El GMPc reduce el transporte neto de iones en la RAG mediante la reducción de los niveles de AMPc. Una

vez activada, la PKC estimula la producción de O2‐ por la NADPH oxidasa 4 (NOX4). El O2

‐ así producido tiene la

capacidad de secuestrar NO y de estimular sinérgicamente la activación de PCK. El sinergismo de O2‐ sobre PKC

permite que PKC desacople a la NOS3, lo cual eleva aún más la producción de O2‐ en detrimento de la producción de

NO. Si se sostiene en el tiempo, esta situación crea un desbalance en favor de un aumento en los niveles de O2‐ y en

la velocidad neta de transporte. PDE2: fosfodiesterasa 2. PTEN: fosfatidilinositol‐3,4,5‐trisfosfato 3‐fosfatasa.

Figura adaptada de Gonzalez‐Vicente y col (wp3887), J Am Soc Nephrol, 20178

102

Discusión

4.3 Perspectivas

La actividad de la Na+/K+‐ATPasa genera la energía libre necesaria para impulsar todos

los procesos de transporte en la RAG y otros segmentos de la nefrona. Por ello, cambios en

las velocidades de transporte neto deben ser acompañadas por cambios en la actividad de

este transportador. Los hallazgos de esta investigación indican que durante las infusiones de

Ang II, el transporte neto y la velocidad de la Na+/K+‐ATPasa aumentan en la RAG. Sin

embargo, este aumento no es consecuencia de una activación directa por parte de la Ang II

sobre la Na+/K+‐ATPasa, sino que esta modulada por una mayor disponibilidad de Na+

mediada por un aumento en la actividad del NKCC2 apical. Además, se demostró que las

infusiones de Ang II afectan las vías de señal dependientes de NO que normalmente inhiben

al NKCC2 en respuesta a estímulos natriuréticos. Estos resultados explican por qué la entrada

apical de Na+ se encuentra elevada durante las etapas tempranas del modelo de HTA

inducida por Ang II, donde la elevación de la presión arterial presenta sensibilidad a la sal.

La elevada reabsorción de Na+ en la RAG descrita en este Trabajo de Tesis, no se limita

a la HTA inducida por Ang II sino que está presente en modelos genéticos de HTA como la

rata sensible a la sal Dahl, y en poblaciones de ascendencia africana y que también presentan

sensibilidad a la sal. Así, los mecanismos fisiopatológicos de la HTA inducida por Ang II,

pueden utilizarse para entender la HTA sensible a la sal en seres humanos y para trazar

estrategias tendientes a prevenir y controlar los valores de presión arterial.

Los resultados de este Trabajo de Tesis refuerzan la idea de reducir el contenido de Na+

en la dieta, en particular en grupos etarios antes mencionados. Además, los efectos positivos

de una dieta adecuada no se limitarían a una menor ingesta de Na+, ya que está demostrado

que desbalances en el contenido de macronutrientes pueden también elevar las velocidades

de transporte, la producción de O2‐ o incluso la sensibilidad a la Ang II en varios segmentos

de la nefrona incluida la RAG. Finalmente, se ha demostrado que una dieta equilibrada,

acompañada de ejercicio en mucho más efectiva en mejorar la biodisponibilidad sistémica

de NO que las terapias con antioxidantes, por lo que es probable que dichos hábitos tiendan

a reducir también la reabsorción Na+ en la RAG.

103

Capítulo 5

RESUMEN

Resumen

5. RESUMEN

El uso de modelos animales de hipertensión arterial (HTA) en etapas tempranas de la

enfermedad, es fundamental para estudiar los factores que contribuyen a elevar la presión

y distinguirlos de las adaptaciones compensatorias a dicho aumento. La desregulación del

sistema renina‐angiotensina (SRA), en favor de un aumento de los niveles de angiotensina

(Ang) II, contribuye al desarrollo de HTA sensible a la sal en diferentes modelos

experimentales y en humanos. Este tipo de HTA tiene una prevalencia cercana al 50% entre

los pacientes hipertensos. Las estrategias farmacológicas para controlar la HTA sensible a la

sal son más efectivas cuando combinan fármacos tendientes a reducir las acciones del SRA y

un diurético. Esto sugiere que los pacientes con HTA sensible a la sal poseen una reabsorción

renal de sodio y fluidos aumentada.

La rama ascendente gruesa (RAG) del asa de Henle reabsorbe ~30% del Na+ filtrado en

el glomérulo, y es fundamental en la generación del gradiente osmótico necesario para

reabsorber agua en el túbulo colector. Estudios epidemiológicos y en animales de

experimentación indican que aumentos en la velocidad de transporte en la RAG contribuyen

al desarrollo de HTA sensible a la sal. Sin embargo, la contribución de la RAG en los estadios

tempranos de modelos de infusión de Ang II no se conoce en detalle.

Los objetivos de este trabajo fueron:

Estudiar la participación de la RAG, en el desarrollo de la HTA inducida por Ang II,

Estudiar los parámetros cinéticos de la Na+/K+‐ATPasa que podrían contribuir a elevar el

transporte neto de Na+,

Estudiar el sistema del óxido nítrico durante etapas tempranas del desarrollo de HTA

dependiente de Ang II,

Estudiar los mecanismos por los cuales la Ang II induce la producción de O2‐ por parte de

las enzimas NOSs en la RAG.

105

Resumen

El protocolo experimental consistió en la infusión subcutánea de Ang II, en dosis que causan

un efecto hipertensivo lento, a ratas Sprague‐Dawley macho por un periodo de 1, 5 y 7 días.

Finalizado el tratamiento, se determinó la presión arterial y se obtuvieron preparados de RAGs

en los cuales se evaluó el transporte neto, los parámetros cinéticos de la Na+/K+‐ATPasa y el

sistema del óxido nítrico. Además, se realizaron experimentos sobre los efectos del tratamiento

agudo con Ang II sobre las enzimas NOSs.

El presente trabajo demostró que la infusión de Ang II, en dosis que causan HTA sensible a

la sal, aumenta la actividad de la Na+/K+‐ATPasa en la RAG y disminuye la capacidad de producción

del intermediario natriurético NO en respuesta a estímulos fisiológicos.

Los resultados de la primera etapa de este estudio indican que la infusión de Ang II durante

7 días aumenta el transporte neto en la RAG. Estos cambios están dados por un aumento en la

entrada apical de Na+ a través del NKCC2 y no por cambios en la abundancia o parámetros

cinéticos de la Na+/K+‐ATPasa. Sin embargo, la actividad de la Na+/K+‐ATPasa aumenta como

consecuencia del mayor ingreso de Na+ a la célula.

En una segunda etapa, se investigó la vía de señalización del NO luego de 24 hs y 5 días de

iniciada la infusión de Ang II, momento en que el modelo presenta mayor sensibilidad a la sal. El

NO es un importante intermediario natriurético que actúa inhibiendo la entrada apical de Na+

mediada por el transportador NKCC2. Se demostró que la infusión de Ang II reduce la expresión

de la enzima NOS3 y aumenta la fosforilación del residuo de Thr 495. Cuando se evaluó la

capacidad de producción de NO en respuesta a endotelina‐1, se encontró que la infusión de Ang

II daña la vía de activación de la NOS3, afectando la capacidad de la enzima Akt de fosforilar el

residuo estimulatorio de Ser 1177. Así, las RAGs de animales infundidos con Ang II producirían

menor cantidad de NO en respuesta a variados estímulos que compartan la vía de activación de

NOS3 dependiente de Akt.

Finalmente, se demostró que la estimulación aguda con Ang II induce la producción de O2‐

por parte de las enzimas NOSs, posiblemente NOS3. Este mecanismo podría ser importante en

los modelos de infusión crónica de Ang II contribuyendo al desbalance entre la producción de NO

y O2‐ en la RAG.

106

Resumen

En conclusión, los hallazgos de este estudio indican que en los modelos de HTA sensible

a la sal dependientes de Ang II el transporte neto de Na+ en la RAG se encuentra aumentado,

posiblemente por un desbalance entre la producción de NO y O2‐ que impactaría

negativamente sobre los efectos de intermediarios natriuréticos. El conocimiento de los

mecanismos que afectan la reabsorción de Na+ en este segmento es primordial para trazar

estrategias tendientes a prevenir y controlas la HTA sensible a la sal. Los resultados de este

Trabajo de Tesis refuerzan la idea de reducir el consumo de Na+ en grupos etarios que

naturalmente poseen un elevado transporte neto en la RAG. Los efectos positivos de una

dieta adecuada no se limitarían a reducir la ingesta de Na+, ya que desbalances en el

contenido de macronutrientes pueden también elevar el transporte, la producción de O2‐ o

incluso la sensibilidad a la Ang II en varios segmentos de la nefrona.

107

Capítulo 6

ANEXO

Arginine, % 0.73

Biotin, ppm 0.4

Calcium, % 0.61

Chloride, % 0.93

Choline Chloride, ppm 1,400

Cobalt, ppm 3.2

Copper, ppm 15.0

Fat, % 10.0

Fiber (max), % 4.3

Folic Acid, ppm 4.2

Histidine, % 0.54

Iodine, ppm 0.57

Iron, ppm 67

Isoleucine, % 1.00

Leucine, % 1.82

Lysine, % 1.53

Magnesium, % 0.07

Manganese, ppm 65

Methionine, % 0.69

Pantothenic Acid, ppm 56

Phenylalanine, % 1.00

Phosphorus, % 0.57

Potassium, % 1.10

Protein, % 18.6

Pyridoxine, ppm 16.5

Riboflavin, ppm 20.7

Selenium, ppm 0.30

Sodium, % 0.24

Thiamin Hydrochloride, ppm 20.7

Threonine, % 0.81

Tryptophan, % 0.23

Tyrosine, % 1.06

Valine, % 1.20

Vitamin A, IU/g 22.1

Vitamin B-12, mcg/kg 24

Vitamin D-3 (added), IU/g 2.2

Vitamin E, IU/kg 50.1

Vitamin K, ppm 10.40

Zinc, ppm 27

Niacin, ppm 90

Ascorbic Acid, ppm 0.0

Cystine, % 0.08

Minerals

Vitamins

3/1/2016

Fluorine, ppm 5.0

Chromium (added), ppm 3.0

N U T R I T I O N A L P R O F I L E 1

1. Formulation based on calculated values from the latest ingredient analysis information. Since nutrient composition of natural ingredients varies and some nutrient loss will occur due to manufacturing processes, analysis will differ accordingly. Nutrients expressed as percent of ration on an As-Fed basis except where otherwise indicated. 2. Energy (kcal/gm) - Sum of decimal fractions of protein, fat and carbohydrate x 4,9,4 kcal/gm respectively.

D E S C R I P T I O N

1.1% Potassium Purified Diet.

F E E D I N G D I R E C T I O N SFeed ad libitum. Plenty of fresh, clean water should be available at all times.

I N G R E D I E N T S (%)

Carbohydrates, % 59.3

Energy (kcal/g) 4.02

Molybdenum, ppm 0.82

2

CAUTION: Perishable - store properly upon receipt.For laboratory animal use only; NOT for human consumption.

w w w . t e s t d i e t . c o m

1.1% Potassium Purified Diet

Cholesterol, ppm 48

5876

Product Forms Available* Catalog #

*Other Forms Available On Request

Protein 18.6

Fat (ether extract) 22.4

Carbohydrates 59.0

%kcalFrom:

0.745

0.900

2.370

Linoleic Acid, % 3.34

Linolenic Acid, % 0.07

Arachidonic Acid, % 0.01

Omega-3 Fatty Acids, % 0.07

Total Saturated Fatty A 2.72

Total Monounsaturated Fatty Acids, % 3.31

Glycine, % 0.41

Serine, % 1.16

Aspartic Acid, % 1.35

Glutamic Acid, % 4.29

Alanine, % 0.58

Proline, % 2.47

Taurine, % 0.00

Polyunsaturated Fatty Acids, % 3.42

CAUTION: Contains a new animal drug for investigational use only in laboratory research animals or for tests in vitro. Not for use in humans.

Storage conditions are particularly critical to TestDiet® products, due to the absence of antioxidants or preservative agents. To provide maximum protection against possible changes during storage, store in a dry, cool location. Storage under refrigeration (2° C) is recommended. Maximum shelf life is six months. (If long term studies are involved, storing the diet at -20˚ C or colder may prolong shelf life.) Be certain to keep in air tight containers.

42.3100Dextrin21.0000Casein - Vitamin Tested

15.0000Sucrose

5.0000RP Mineral Mix #10 (adds 1.29% fiber)

5.0000Lard

5.0000Corn Oil

3.0000Powdered Cellulose

2.0000RP Vitamin Mix (adds 1.94% sucrose)

1.3400Potassium Chloride

0.2000Choline Chloride

0.1500DL-Methionine

72891/2" Pellet

109

Capítulo 7

BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía

7. BIBLIOGRAFÍA

1. Gonzalez‐Vicente A, Garvin JL. Angiotensin II‐induced hypertension increases plasma membrane Na pump activity by enhancing Na entry in rat thick ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol. 2013;305:F1306‐1314.

2. Ramseyer VD, Gonzalez‐Vicente A, Carretero OA, Garvin JL. Angiotensin II‐induced hypertension blunts thick ascending limb NO production by reducing NO synthase 3 expression and enhancing threonine 495 phosphorylation. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308:F149‐156.

3. Gonzalez‐Vicente A, Saikumar JH, Massey KJ, Hong NJ, Dominici FP, Carretero OA, et al. Angiotensin II stimulates superoxide production by nitric oxide synthase in thick ascending limbs. Physiological reports. 2016;4.

4. Gonzalez‐Vicente A, Garvin JL. Effects of Reactive Oxygen Species on Tubular Transport along the Nephron. Antioxidants (Basel). 2017;6.

5. Gonzalez‐Vicente A, Saez F, Monzon CM, Asirwatham J, Garvin JL. Thick Ascending Limb Sodium Transport in the Pathogenesis of Hypertension. Physiol Rev. 2018.

6. Gonzalez‐Vicente A, Cabral PD, Garvin JL. Resveratrol increases nitric oxide production in the rat thick ascending limb via Ca2+/calmodulin. PLoS One. 2014;9:e110487.

7. Gonzalez‐Vicente A, Cabral PD, Hong NJ, Asirwatham J, Yang N, Berthiaume JM, et al. Dietary Fructose Enhances the Ability of Low Concentrations of Angiotensin II to Stimulate Proximal Tubule Na(+) Reabsorption. Nutrients. 2017;9:885.

8. Gonzalez‐Vicente A, Hopfer U, Garvin JL. Developing Tools for Analysis of Renal Genomic Data: An Invitation to Participate. J Am Soc Nephrol. 2017.

9. Lim SS, Vos T, Flaxman AD, Danaei G, Shibuya K, Adair‐Rohani H, et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990‐2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2012;380:2224‐2260.

10. Kearney PM, Whelton M, Reynolds K, Muntner P, Whelton PK, He J. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 2005;365:217‐223.

11. Collaborators GBDRF. Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990‐2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 2016;388:1659‐1724.

12. Marin MJ, Fábregues G, Rodríguez PD, Díaz M, Paez O, Alfie J, et al. Registro Nacional de Hipertensión Arterial. Conocimiento, tratamiento y control de la hipertensión arterial. Estudio RENATA. Revista Argentina de Cardiología. 2012:121‐129.

13. Schargrodsky H, Hernandez‐Hernandez R, Champagne BM, Silva H, Vinueza R, Silva Aycaguer LC, et al. CARMELA: assessment of cardiovascular risk in seven Latin American cities. The American journal of medicine. 2008;121:58‐65.

14. Carbajal HA. Situación de la hipertensión arterial en Argentina. Hipertensión y Riesgo Vascular. 2013;30:101‐106.

15. Weinberger MH. Salt sensitivity of blood pressure in humans. Hypertension. 1996;27:481‐490. 16. Guyton AC. Physiologic regulation of arterial pressure. The American journal of cardiology.

1961;8:401‐407.

111

Bibliografía

17. Guyton AC. Dominant role of the kidneys and accessory role of whole‐body autoregulation in the pathogenesis of hypertension. Am J Hypertens. 1989;2:575‐585.

18. Izzo JL, Sica DA, Black HR. Hypertension Primer: The essentials of High Blood Pressure.: Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.

19. Brown‐Sequard CE. On a New Therapeutic Method Consisting in the Use of Organic Liquids Extracted from Glands and Other Organs. Br Med J. 1893;1:1212‐1214.

20. Brown‐Sequard CE. On a New Therapeutic Method Consisting in the Use of Organic Liquids Extracted from Glands and Other Organs. Br Med J. 1893;1:1145‐1147.

21. Tigerstedt R, Bergman PQ. Niere und Kreislauf1. Skandinavisches Archiv Für Physiologie. 1898;8:223‐271.

22. Marks LS, Maxwell MH. Tigerstedt and the discovery of renin. An historical note. Hypertension. 1979;1:384‐388.

23. Phillips MI, Schmidt‐Ott KM. The Discovery of Renin 100 Years Ago. News Physiol Sci. 1999;14:271‐274.

24. Goldblatt H, Lynch J, Hanzal RF, Summerville WW. Studies on Experimental Hypertension : I. The Production of Persistent Elevation of Systolic Blood Pressure by Means of Renal Ischemia. The Journal of experimental medicine. 1934;59:347‐379.

25. Kohlstaedt KG, Helmer OM, Page IH. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 1938;39. 26. Page IH, McSwain B, Knapp GM, Andrus WD. The origin of renin‐activator. American Journal of

Physiology. 1941;135:0214‐0222. 27. Page IH, Helmer OM. A Crystalline Pressor Substance (Angiotonin) Resulting from the Reaction

between Renin and Renin‐Activator. The Journal of experimental medicine. 1940;71:29‐42. 28. Menendez EB, Fasciolo JC, Leloir LF, Munoz JM. La substancia hipertensora de la sangre en el

riñon isquemiado. Rev. Soc. Argent. Biol. 1939. 29. Munoz JM, Menendez EB, Fasciolo JC, Leloir LF. Hypertensin the substance causing renal

hypertension. Nature. 1939;144:980‐980. 30. Braun‐Menendez E, Fasciolo JC, Leloir LF, Munoz JM. The substance causing renal hypertension.

J Physiol. 1940;98:283‐298. 31. Braun‐Menendez E, Page IH. Suggested Revision of Nomenclature‐‐Angiotensin. Science.

1958;127:242. 32. Plentl AA, Page IH. The enzymatic nature of angiotonin formation from renin and renin activator.

Journal of Biological Chemistry. 1943;147:135‐141. 33. Plentl AA, Page IH, Davis WW. The nature of Renin Activator. J. Biol. Chem. 1943;147:143 ‐ 154. 34. Skeggs LT, Jr., Marsh WH, Kahn JR, Shumway NP. The existence of two forms of hypertensin. The

Journal of experimental medicine. 1954;99:275‐282. 35. Mirabito Colafella KM, Danser AHJ. Recent Advances in Angiotensin Research. Hypertension.

2017;69:994‐999. 36. Simon G, Abraham G, Cserep G. Pressor and subpressor angiotensin II administration. Two

experimental models of hypertension. Am J Hypertens. 1995;8:645‐650. 37. Zou LX, Imig JD, von Thun AM, Hymel A, Ono H, Navar LG. Receptor‐mediated intrarenal

angiotensin II augmentation in angiotensin II‐infused rats. Hypertension. 1996;28:669‐677. 38. Rugale C, Delbosc S, Cristol JP, Mimran A, Jover B. Sodium restriction prevents cardiac

hypertrophy and oxidative stress in angiotensin II hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;284:H1744‐1750.

39. Crowley SD, Zhang J, Herrera M, Griffiths R, Ruiz P, Coffman TM. Role of AT(1) receptor‐mediated salt retention in angiotensin II‐dependent hypertension. Am J Physiol Renal Physiol. 2011;301:F1124‐1130.

112

Bibliografía

40. Crowley SD, Gurley SB, Herrera MJ, Ruiz P, Griffiths R, Kumar AP, et al. Angiotensin II causes hypertension and cardiac hypertrophy through its receptors in the kidney. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:17985‐17990.

41. Gonzalez‐Villalobos RA, Janjoulia T, Fletcher NK, Giani JF, Nguyen MT, Riquier‐Brison AD, et al. The absence of intrarenal ACE protects against hypertension. J Clin Invest. 2013;123:2011‐2023.

42. Ignarro LJ. Nitric oxide. A novel signal transduction mechanism for transcellular communication. [Review] [49 refs]. Hypertension. 1990;16:477‐483.

43. Navar LG, Kobori H, Prieto MC, Gonzalez‐Villalobos RA. Intratubular renin‐angiotensin system in hypertension. Hypertension. 2011;57:355‐362.

44. Navar LG, Prieto MC, Satou R, Kobori H. Intrarenal angiotensin II and its contribution to the genesis of chronic hypertension. Curr Opin Pharmacol. 2011;11:180‐186.

45. Navar LG, Harrison‐Bernard LM, Wang CT, Cervenka L, Mitchell KD. Concentrations and actions of intraluminal angiotensin II. [Review] [55 refs]. Journal of the American Society of Nephrology. 1999;10 Suppl 11:S189‐S195.

46. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, Kobori H, et al. Liver angiotensinogen is the primary source of renal angiotensin II. J Am Soc Nephrol. 2012;23:1181‐1189.

47. Ohsawa M, Tamura K, Wakui H, Maeda A, Dejima T, Kanaoka T, et al. Deletion of the angiotensin II type 1 receptor‐associated protein enhances renal sodium reabsorption and exacerbates angiotensin II‐mediated hypertension. Kidney Int. 2014;86:570‐581.

48. Prieto‐Carrasquero MC, Botros FT, Kobori H, Navar LG. Collecting Duct Renin: A major player in Angiotensin II‐dependent Hypertension. Journal of the American Society of Hypertension : JASH. 2009;3:96‐104.

49. Boron WF, Boulpaep EL. Medical Physiology. Saunders. ELSEVIER; 2012. 50. Mount DB. Thick ascending limb of the loop of Henle. Clin J Am Soc Nephrol. 2014;9:1974‐1986. 51. Burg MB, Green N. Function of the thick ascending limb of Henle's loop. Am J Physiol.

1973;224:659‐668. 52. Gamba G, Miyanoshita A, Lombardi M, Lytton J, Lee WS, Hediger MA, et al. Molecular cloning,

primary structure, and characterization of two members of the mammalian electroneutral sodium‐(potassium)‐chloride cotransporter family expressed in kidney. J Biol Chem. 1994;269:17713‐17722.

53. Ares GR, Caceres PS, Ortiz PA. Molecular regulation of NKCC2 in the thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2011;301:F1143‐1159.

54. Payne JA, Forbush B, 3rd. Molecular characterization of the epithelial Na‐K‐Cl cotransporter isoforms. Curr Opin Cell Biol. 1995;7:493‐503.

55. Payne JA, Forbush B. Alternatively Spliced Isoforms of the Putative Renal Na‐K‐Cl Cotransporter Are Differentially Distributed within the Rabbit Kidney. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994;91:4544‐4548.

56. Gimenez I, Isenring P, Forbush B. Spatially distributed alternative splice variants of the renal Na‐K‐Cl cotransporter exhibit dramatically different affinities for the transported ions. J Biol Chem. 2002;277:8767‐8770.

57. Yang T, Huang YG, Singh I, Schnermann J, Briggs JP. Localization of bumetanide‐ and thiazide‐sensitive Na‐K‐Cl cotransporters along the rat nephron. Am J Physiol. 1996;271:F931‐939.

58. Igarashi P, Vanden Heuvel GB, Payne JA, Forbush B, 3rd. Cloning, embryonic expression, and alternative splicing of a murine kidney‐specific Na‐K‐Cl cotransporter. Am J Physiol. 1995;269:F405‐418.

59. Schiessl IM, Rosenauer A, Kattler V, Minuth WW, Oppermann M, Castrop H. Dietary salt intake modulates differential splicing of the Na‐K‐2Cl cotransporter NKCC2. Am J Physiol Renal Physiol. 2013;305:F1139‐1148.

113

Bibliografía

60. Edwards A, Castrop H, Laghmani K, Vallon V, Layton AT. Effects of NKCC2 isoform regulation on NaCl transport in thick ascending limb and macula densa: a modeling study. Am J Physiol Renal Physiol. 2014;307:F137‐146.

61. Mutig K. Trafficking and regulation of the NKCC2 cotransporter in the thick ascending limb. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26:392‐397.

62. Richardson C, Sakamoto K, de los Heros P, Deak M, Campbell DG, Prescott AR, et al. Regulation of the NKCC2 ion cotransporter by SPAK‐OSR1‐dependent and ‐independent pathways. J Cell Sci. 2011;124:789‐800.

63. Bachmann S, Mutig K. Regulation of renal Na‐(K)‐Cl cotransporters by vasopressin. Pflugers Arch. 2017;469:889‐897.

64. Schiessl IM, Castrop H. Regulation of NKCC2 splicing and phosphorylation. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2015;24:457‐462.

65. Ortiz PA. A small fraction of total NKCC2 is located in the apical membrane of thick ascending limbs under basal conditions. Faseb Journal. 2006;20:A1223‐A1223.

66. Gimenez I, Forbush B. Short‐term stimulation of the renal Na‐K‐Cl cotransporter (NKCC2) by vasopressin involves phosphorylation and membrane translocation of the protein. J Biol Chem. 2003;278:26946‐26951.

67. Jaykumar AB, Caceres PS, Sablaban I, Tannous BA, Ortiz PA. Real‐time monitoring of NKCC2 endocytosis by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F183‐191.

68. Ares GR, Ortiz PA. Constitutive endocytosis and recycling of NKCC2 in rat thick ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;299:F1193‐1202.

69. Gunaratne R, Braucht DW, Rinschen MM, Chou CL, Hoffert JD, Pisitkun T, et al. Quantitative phosphoproteomic analysis reveals cAMP/vasopressin‐dependent signaling pathways in native renal thick ascending limb cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107:15653‐15658.

70. Feric M, Zhao B, Hoffert JD, Pisitkun T, Knepper MA. Large‐scale phosphoproteomic analysis of membrane proteins in renal proximal and distal tubule. Am J Physiol Cell Physiol. 2011;300:C755‐770.

71. Ponce‐Coria J, San‐Cristobal P, Kahle KT, Vazquez N, Pacheco‐Alvarez D, de Los Heros P, et al. Regulation of NKCC2 by a chloride‐sensing mechanism involving the WNK3 and SPAK kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:8458‐8463.

72. Dimke H, Flyvbjerg A, Bourgeois S, Thomsen K, Frokiaer J, Houillier P, et al. Acute growth hormone administration induces antidiuretic and antinatriuretic effects and increases phosphorylation of NKCC2. Am J Physiol Renal Physiol. 2007;292:F723‐735.

73. Fraser SA, Gimenez I, Cook N, Jennings I, Katerelos M, Katsis F, et al. Regulation of the renal‐specific Na+‐K+‐2Cl‐ co‐transporter NKCC2 by AMP‐activated protein kinase (AMPK). Biochem J. 2007;405:85‐93.

74. Hebert SC. An ATP‐regulated, inwardly rectifying potassium channel from rat kidney (ROMK). Kidney Int. 1995;48:1010‐1016.

75. Hibino H, Inanobe A, Furutani K, Murakami S, Findlay I, Kurachi Y. Inwardly rectifying potassium channels: their structure, function, and physiological roles. Physiol Rev. 2010;90:291‐366.

76. Boim MA, Ho K, Shuck ME, Bienkowski MJ, Block JH, Slightom JL, et al. ROMK inwardly rectifying ATP‐sensitive K+ channel. II. Cloning and distribution of alternative forms. Am J Physiol. 1995;268:F1132‐1140.

77. Xu JZ, Hall AE, Peterson LN, Bienkowski MJ, Eessalu TE, Hebert SC. Localization of the ROMK protein on apical membranes of rat kidney nephron segments. Am J Physiol. 1997;273:F739‐748.

78. Isacoff EY, Jan YN, Jan LY. Evidence for the formation of heteromultimeric potassium channels in Xenopus oocytes. Nature. 1990;345:530‐534.

114

Bibliografía

79. Liman ER, Tytgat J, Hess P. Subunit stoichiometry of a mammalian K+ channel determined by construction of multimeric cDNAs. Neuron. 1992;9:861‐871.

80. Ruppersberg JP, Schroter KH, Sakmann B, Stocker M, Sewing S, Pongs O. Heteromultimeric channels formed by rat brain potassium‐channel proteins. Nature. 1990;345:535‐537.

81. Jan LY, Jan YN. Potassium Channels and Their Evolving Gates. Nature. 1994;371:119‐122. 82. Hebert SC, Wang WH. Structure and function of the low conductance KATP channel, ROMK.

Wien Klin Wochenschr. 1997;109:471‐476. 83. Lu M, Wang T, Yan QS, Wang WH, Giebisch G, Hebert SC. ROMK is required for expression of the

70‐pS K channel in the thick ascending limb. Am J Physiol‐Renal. 2004;286:F490‐F495. 84. Quamme GA, De Rouffignac C. Epithelial magnesium transport and regulation by the kidney.

Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 2000:D694‐711. 85. Mandon B, Siga E, Roinel N, de Rouffignac C. Ca2+, Mg2+ and K+ transport in the cortical and

medullary thick ascending limb of the rat nephron: influence of transepithelial voltage. Pflugers Arch. 1993;424:558‐560.

86. de Rouffignac C, Quamme G. Renal magnesium handling and its hormonal control. Physiol Rev. 1994;74:305‐322.

87. Wang T. The effects of the potassium channel opener minoxidil on renal electrolytes transport in the loop of henle. J Pharmacol Exp Ther. 2003;304:833‐840.

88. Good DW, Knepper MA, Burg MB. Ammonia and bicarbonate transport by thick ascending limb of rat kidney. Am J Physiol. 1984;247:F35‐44.

89. Chambrey R, Warnock DG, Podevin RA, Bruneval P, Mandet C, Belair MF, et al. Immunolocalization of the Na+/H+ exchanger isoform NHE2 in rat kidney. Am J Physiol. 1998;275:F379‐386.

90. Yip KP, Tse CM, Donowitz M, Marsh DJ. Immunolocalization of NAVH exchanger isoform NHE‐2 in rat kidney with confocal fluorescence microscopy. FASEB J. 1996;10.

91. Sun AM, Liu Y, Dworkin LD, Tse CM, Donowitz M, Yip KP. Na+/H+ exchanger isoform 2 (NHE2) is expressed in the apical membrane of the medullary thick ascending limb. J Membr Biol. 1997;160:85‐90.

92. Biemesderfer D, Pizzonia J, Abu‐Alfa A, Exner M, Reilly R, Igarashi P, et al. NHE3: a Na+/H+ exchanger isoform of renal brush border. Am J Physiol. 1993;265:F736‐742.

93. Chu TS, Tsuganezawa H, Peng Y, Cano A, Yanagisawa M, Alpern RJ. Role of tyrosine kinase pathways in ETB receptor activation of NHE3. Am J Physiol. 1996;271:C763‐771.

94. Honegger KJ, Capuano P, Winter C, Bacic D, Stange G, Wagner CA, et al. Regulation of sodium‐proton exchanger isoform 3 (NHE3) by PKA and exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:803‐808.

95. Hayashi H, Tamura A, Krishnan D, Tsukita S, Suzuki Y, Kocinsky HS, et al. Ezrin is required for the functional regulation of the epithelial sodium proton exchanger, NHE3. PLoS One. 2013;8:e55623.

96. Collazo R, Fan L, Hu MC, Zhao H, Wiederkehr MR, Moe OW. Acute regulation of Na+/H+ exchanger NHE3 by parathyroid hormone via NHE3 phosphorylation and dynamin‐dependent endocytosis. J Biol Chem. 2000;275:31601‐31608.

97. Hebert SC, Culpepper RM, Andreoli TE. NaCl transport in mouse medullary thick ascending limbs. II. ADH enhancement of transcellular NaCl cotransport; origin of transepithelial voltage. Am J Physiol. 1981;241:F432‐442.

98. Craig WS, Kyte J. Stoichiometry and Molecular Weight of the Minimum Asymmetric Unit of Canine Renal Sodium and Potassium Ion‐activated Adenosine Triphosphatase. J Biol Chem. 1980;255:6262‐6269.

115

Bibliografía

99. Farman N, Coutry N, Logvinenko N, Blot‐Chabaud M, Bourbouze R, Bonvalet JP. Adrenalectomy reduces alpha 1 and not beta 1 Na(+)‐K(+)‐ATPase mRNA expression in rat distal nephron. Am J Physiol. 1992;263:C810‐C817.

100. Tumlin JA, Hoban CA, Medford RM, Sands JM. Expression of Na‐K‐ATPase alpha‐ and beta‐subunit mRNA and protein isoforms in the rat nephron. Am J Physiol. 1994;266:F240‐245.

101. Shull GE, Schwartz A, Lingrel JB. Amino‐acid sequence of the catalytic subunit of the (Na+ + K+)ATPase deduced from a complementary DNA. Nature. 1985;316:691‐695.

102. Farley RA, Tran CM, Carilli CT, Hawke D, Shively JE. The Amino Acid Sequence of a Fluorescein‐labeled Peptide from the Active Site of (Na,K)‐ATPase. J Biol Chem. 1984;259:9532‐9535.

103. Bastide F, Meissner G, Fleischer S, Post RL. Similarity of the Active Site of Phosphorylation of the Adenosine Triphosphatase for Transport of Sodium and Potassium Ions in Kidney to That for Transport of Calcium Ions in the Sarcoplasmic Reticulum of Muscle. J Biol Chem. 1973;248:8485‐8391.

104. Kawakami K, Nagano K. The transmembrane segment of the human Na,K‐ATPase beta‐subunit acts as the membrane incorporation signal. J Biochem 1988;103:54‐60.

105. Farley RA, Miller RP, Kudrow A. Orientation of the beta subunit polypeptide of (Na+ + K+) ATPase in the cell membrane. Biochim Biophys Acta. 1986;873:136‐142.

106. Zamofing D, Rossier BC, Geering K. Role of the Na,K‐ATPase Beta‐subunit in the cellular accumulation and maturation of the enzyme as assessed by glycosylation inhibitors. J Membr Biol. 1988;104:69‐79.

107. Zamofing D, Rossier BC, Geering K. Inhibition of N‐glycosylation affects transepithelial Na+ but not Na+‐K+‐ATPase transport. Am J Physiol. 1989;256:C958‐C966.

108. Geering K. FXYD proteins: new regulators of Na‐K‐ATPase. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F241‐250.

109. Kuster B, Shainskaya A, Pu HX, Goldshleger R, Blostein R, Mann M, et al. A new variant of the gamma subunit of renal Na,K‐ATPase. Identification by mass spectrometry, antibody binding, and expression in cultured cells. J Biol Chem. 2000;275:18441‐18446.

110. Pu HX, Cluzeaud F, Goldshleger R, Karlish SJ, Farman N, Blostein R. Functional Role and Immunocytochemical Localization of the gammaa and gammab Forms of the Na,K‐ATPase gamma Subunit. J Biol Chem. 2001;276:20370‐20378

111. Kiroytcheva M, Cheval L, Carranza ML, Martin PY, Favre H, Doucet A, et al. Effect of cAMP on the

activity and the phosphorylation of Na+,K(+)‐ATPase in rat thick ascending limb of Henle. Kidney Int. 1999;55:1819‐1831.

112. Waldegger S, Jeck N, Barth P, Peters M, Vitzthum H, Wolf K, et al. Barttin increases surface expression and changes current properties of ClC‐K channels. Pflugers Arch. 2002;444:411‐418.

113. Kieferle S, Fong P, Bens M, Vandewalle A, Jentsch TJ. Two highly homologous members of the ClC chloride channel family in both rat and human kidney. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:6943‐6947.

114. Uchida S, Sasaki S, Furukawa T, Hiraoka M, Imai T, Hirata Y, et al. Molecular Cloning of a Chloride Channel That Is Regulated by Dehydration and Expressed Predominantly in Kidney Medulla. J Biol Chem. 1993;268:3821‐3824.

115. Fisher SE, Van Bakel I, Lloyd SE, Pearce SH, Thakker RV, Craig IW. Cloning and characterization of CLCN5, the human kidney chloride channel gene implicated in Dent disease (an X‐linked hereditary nephrolithiasis). Genomics. 1995;29:598‐606.

116

Bibliografía

116. Estevez R, Boettger T, Stein V, Birkenhager R, Otto E, Hildebrandt F, et al. Barttin is a Cl‐ channel Beta‐subunit crucial for renal Cl‐ reabsorption and inner ear K+ secretion. Nature. 2001;414:558‐561.

117. Greger R, Schlatter E. Properties of the basolateral membrane of the cortical thick ascending limb of Henle's loop of rabbit kidney. A model for secondary active chloride transport. Pflugers Arch. 1983;396:325‐334.

118. Kaji DM. Effect of membrane potential on K‐Cl transport in human erythrocytes. Am J Physiol. 1993;264:C376‐C382.

119. Velazquez H, Silva T. Cloning and localization of KCC4 in rabbit kidney: expression in distal convoluted tubule. Am J Physiol Renal Physiol. 2003;285:F49‐F58.

120. Mount DB, Delpire E, Gamba G, Hall AE, Poch E, Hoover RS, et al. The electroneutral cation‐chloride cotransporters. The Journal of experimental biology. 1998;201:2091‐2102.

121. Gillen CM, Brill S, Payne JA, Forbush B, 3rd. Molecular cloning and functional expression of the K‐Cl cotransporter from rabbit, rat, and human. A new member of the cation‐chloride cotransporter family. J Biol Chem. 1996;271:16237‐16244.

122. Mount DB, Mercado A, Song L, Xu J, George AL, Jr., Delpire E, et al. Cloning and characterization of KCC3 and KCC4, new members of the cation‐chloride cotransporter gene family. J Biol Chem. 1999;274:16355‐16362.

123. Hamilton KL, Devor DC. Basolateral membrane K+ channels in renal epithelial cells. Am J Physiol Renal Physiol. 2012;302:F1069‐1081.

124. Hebert SC, Andreoli TE. Control of NaCl transport in the thick ascending limb. Am J Physiol. 1984;246:F745‐756.

125. Greger R. Cation selectivity of the isolated perfused cortical thick ascending limb of Henle's loop of rabbit kidney. Pflugers Arch. 1981;390:30‐37.

126. Angelow S, El‐Husseini R, Kanzawa SA, Yu AS. Renal localization and function of the tight junction protein, claudin‐19. Am J Physiol Renal Physiol. 2007;293:F166‐177.

127. Mitic LL, Van Itallie CM, Anderson JM. Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions I. Tight junction structure and function: lessons from mutant animals and proteins. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 2000;279:G250‐254.

128. Kortenoeven ML, Pedersen NB, Rosenbaek LL, Fenton RA. Vasopressin regulation of sodium transport in the distal nephron and collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;309:F280‐299.

129. Hall DA, Varney DM. Effect of vasopressin on electrical potential difference and chloride transport in mouse medullary thick ascending limb of Henle's loop. J Clin Invest. 1980;66:792‐802.

130. Sasaki S, Imai M. Effects of vasopressin on water and NaCl transport across the in vitro perfused medullary thick ascending limb of Henle's loop of mouse, rat, and rabbit kidneys. Pflugers Arch. 1980;383:215‐221.

131. Hebert SC, Culpepper RM, Andreoli TE. NaCl transport in mouse medullary thick ascending limbs. I. Functional nephron heterogeneity and ADH‐stimulated NaCl cotransport. Am J Physiol. 1981;241:F412‐431.

132. Molony DA, Reeves WB, Hebert SC, Andreoli TE. ADH increases apical Na+, K+, 2Cl‐ entry in mouse medullary thick ascending limbs of Henle. Am J Physiol. 1987;252:F177‐187.

133. Sun A, Grossman EB, Lombardi M, Hebert SC. Vasopressin alters the mechanism of apical Cl‐ entry from Na+:Cl‐ to Na+:K+:2Cl‐ cotransport in mouse medullary thick ascending limb. J Membr Biol. 1991;120:83‐94.

117

Bibliografía

134. Imbert‐Teboul M, Chabardes D, Montegut M, Clique A, Morel F. Vasopressin‐dependent adenylate cyclase activities in the rat kidney medulla: evidence for two separate sites of action. Endocrinology. 1978;102:1254‐1261.

135. Imbert M, Chabardes D, Montegut M, Clique A, Morel F. Vasopressin dependent adenylate cyclase in single segments of rabbit kidney tubule. Pflugers Arch. 1975;357:173‐186.

136. Caceres PS, Ares GR, Ortiz PA. cAMP stimulates apical exocytosis of the renal Na(+)‐K(+)‐2Cl(‐) cotransporter NKCC2 in the thick ascending limb: role of protein kinase A. J Biol Chem. 2009;284:24965‐24971.

137. Flores‐Santana W, Switzer C, Ridnour LA, Basudhar D, Mancardi D, Donzelli S, et al. Comparing the chemical biology of NO and HNO. Arch Pharm Res. 2009;32:1139‐1153.

138. Stuehr DJ. Structure‐function aspects in the nitric oxide synthases. Annual review of pharmacology and toxicology. 1997;37:339‐359.

139. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001;357:593‐615.

140. Forstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 2012;33:829‐837, 837a‐837d.

141. Plato CF, Stoos BA, Wang D, Garvin JL. Endogenous nitric oxide inhibits chloride transport in the thick ascending limb. Am J Physiol. 1999;276:F159‐163.

142. Ortiz PA, Garvin JL. NO inhibits NaCl absorption by rat thick ascending limb through activation of cGMP‐stimulated phosphodiesterase. Hypertension. 2001;37:467‐471.

143. Ortiz PA, Garvin JL. Autocrine effects of nitric oxide on HCO(3)(‐) transport by rat thick ascending limb. Kidney Int. 2000;58:2069‐2074.

144. Ortiz PA, Garvin JL. Interaction of O‐2(‐) and NO in the thick ascending limb. Hypertension. 2002;39:591‐596.

145. Mount PF, Power DA. Nitric oxide in the kidney: functions and regulation of synthesis. Acta physiologica. 2006;187:433‐446.

146. Plato CF, Shesely EG, Garvin JL. eNOS mediates L‐arginine‐induced inhibition of thick ascending limb chloride flux. Hypertension. 2000;35:319‐323.

147. Ortiz PA, Hong NJ, Wang D, Garvin JL. Gene transfer of eNOS to the thick ascending limb of eNOS‐KO mice restores the effects of L‐arginine on NaCl absorption. Hypertension. 2003;42:674‐679.

148. Ares GR, Caceres P, Alvarez‐Leefmans FJ, Ortiz PA. cGMP decreases surface NKCC2 levels in the thick ascending limb: role of phosphodiesterase 2 (PDE2). Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295:F877‐887.

149. Ortiz PA, Hong NJ, Garvin JL. NO decreases thick ascending limb chloride absorption by reducing Na(+)‐K(+)‐2Cl(‐) cotransporter activity. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281:F819‐825.

150. Morla L, Crambert G, Mordasini D, Favre G, Doucet A, Imbert‐Teboul M. Proteinase‐activated receptor 2 stimulates Na,K‐ATPase and sodium reabsorption in native kidney epithelium. J Biol Chem. 2008;283:28020‐28028.

151. Varela M, Herrera M, Garvin JL. Inhibition of Na/K ATPase in thick ascending limbs by NO depends on O2‐ and is diminished by high‐salt diet. Am.J Physiol Renal Physiol. 2004;287:F224‐F230.

152. Guzman NJ, Fang MZ, Tang SS, Ingelfinger JR, Garg LC. Autocrine Inhibition of Na+/K+‐Atpase by Nitric‐Oxide in Mouse Proximal Tubule Epithelial‐Cells. Journal of Clinical Investigation. 1995;95:2083‐2088.

153. Garvin JL, Hong NJ. Nitric oxide inhibits sodium/hydrogen exchange activity in the thick ascending limb. Am J Physiol. 1999;277:F377‐382.

118

Bibliografía

154. Wu P, Gao Z, Ye S, Qi Z. Nitric oxide inhibits basolateral 10‐pS Cl‐ channels through the cGMP/PKG signaling pathway in the thick ascending limb of C57BL/6 mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F755‐F762.

155. Monzon CM, Garvin JL. Nitric oxide decreases the permselectivity of the paracellular pathway in thick ascending limbs. Hypertension. 2015;65:1245‐1250.

156. Monzon CM, Occhipinti R, Pignataro OP, Garvin JL. Nitric oxide reduces paracellular resistance in rat thick ascending limbs by increasing Na+ and Cl‐ permeabilities. Am J Physiol Renal Physiol. 2017;312:F1035‐F1043.

157. Mattson DL, Higgins DJ. Influence of dietary sodium intake on renal medullary nitric oxide synthase. Hypertension. 1996;27:688‐692.

158. Herrera M, Garvin JL. A high‐salt diet stimulates thick ascending limb eNOS expression by raising medullary osmolality and increasing release of endothelin‐1. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;288:F58‐64.

159. Herrera M, Silva G, Garvin JL. A high‐salt diet dissociates NO synthase‐3 expression and NO production by the thick ascending limb. Hypertension. 2006;47:95‐101.

160. Ortiz P, Stoos BA, Hong NJ, Boesch DM, Plato CF, Garvin JL. High‐salt diet increases sensitivity to NO and eNOS expression but not NO production in THALs. Hypertension. 2003;41:682‐687.

161. Zou AP, Li N, Cowley AW, Jr. Production and actions of superoxide in the renal medulla. Hypertension. 2001;37:547‐553.

162. Massey KJ, Hong NJ, Garvin JL. Angiotensin II stimulates superoxide production in the thick ascending limb by activating NOX4. Am J Physiol Cell Physiol. 2012;303:C781‐789.

163. Schreck C, O'Connor PM. NAD(P)H oxidase and renal epithelial ion transport. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011;300:R1023‐1029.

164. Mori T, Cowley AW, Jr. Angiotensin II‐NAD(P)H oxidase‐stimulated superoxide modifies tubulovascular nitric oxide cross‐talk in renal outer medulla. Hypertension. 2003;42:588‐593.

165. Herrera M, Silva GB, Garvin JL. Angiotensin II stimulates thick ascending limb superoxide production via protein kinase C(alpha)‐dependent NADPH oxidase activation. J Biol Chem. 2010;285:21323‐21328.

166. Hong NJ, Silva GB, Garvin JL. PKC‐alpha mediates flow‐stimulated superoxide production in thick ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F885‐891.

167. Wu P, Wang M, Luan H, Li L, Wang L, Wang WH, et al. Angiotensin II stimulates basolateral 10‐pS Cl channels in the thick ascending limb. Hypertension. 2013;61:1211‐1217.

168. Silva GB, Garvin JL. Angiotensin II‐dependent hypertension increases Na transport‐related oxygen consumption by the thick ascending limb. Hypertension. 2008;52:1091‐1098.

169. Juncos R, Garvin JL. Superoxide enhances Na‐K‐2Cl cotransporter activity in the thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;288:F982‐987.

170. Juncos R, Hong NJ, Garvin JL. Differential effects of superoxide on luminal and basolateral Na+/H+ exchange in the thick ascending limb. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2006;290:R79‐83.

171. Feng D, Yang C, Geurts AM, Kurth T, Liang M, Lazar J, et al. Increased expression of NAD(P)H oxidase subunit p67(phox) in the renal medulla contributes to excess oxidative stress and salt‐sensitive hypertension. Cell metabolism. 2012;15:201‐208.

172. Hong NJ, Garvin JL. NADPH oxidase 4 mediates flow‐induced superoxide production in thick ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol. 2012;303:F1151‐1156.

173. Fridovich I. Superoxide dismutases. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1986;58:61‐97. 174. Makino A, Skelton MM, Zou AP, Cowley AW, Jr. Increased renal medullary H2O2 leads to

hypertension. Hypertension. 2003;42:25‐30.

119

Bibliografía

175. Chen YF, Cowley AW, Jr., Zou AP. Increased H(2)O(2) counteracts the vasodilator and natriuretic effects of superoxide dismutation by tempol in renal medulla. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003;285:R827‐833.

176. Ohsaki Y, O'Connor P, Mori T, Ryan RP, Dickinson BC, Chang CJ, et al. Increase of sodium delivery stimulates the mitochondrial respiratory chain H2O2 production in rat renal medullary thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2012;302:F95‐F102.

177. Ortiz PA, Garvin JL. Superoxide stimulates NaCl absorption by the thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2002;283:F957‐962.

178. Amlal H, LeGoff C, Vernimmen C, Soleimani M, Paillard M, Bichara M. ANG II controls Na(+)‐K+(NH4+)‐2Cl‐ cotransport via 20‐HETE and PKC in medullary thick ascending limb. Am J Physiol. 1998;274:C1047‐1056.

179. Baum M. Effect of catecholamines on rat medullary thick ascending limb chloride transport: interaction with angiotensin II. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2010;298:R954‐958.

180. Baum M. Luminal angiotensin II stimulates rat medullary thick ascending limb chloride transport in the presence of basolateral norepinephrine. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F294‐299.

181. Lerolle N, Bourgeois S, Leviel F, Lebrun G, Paillard M, Houillier P. Angiotensin II inhibits NaCl absorption in the rat medullary thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;287:F404‐410.

182. Nguyen MT, Han J, Ralph DL, Veiras LC, McDonough AA. Short‐term nonpressor angiotensin II infusion stimulates sodium transporters in proximal tubule and distal nephron. Physiological reports. 2015;3.

183. Silva GB, Juncos LI, Baigorria ST, Garcia NH. Angiotensin II inhibits ADH‐stimulated cAMP: role on O2‐ and transport‐related oxygen consumption in the loop of Henle. J Biol Regul Homeost Agents. 2013;27:569‐578.

184. Hong NJ, Garvin JL. Angiotensin II type 2 receptor‐mediated inhibition of NaCl absorption is blunted in thick ascending limbs from Dahl salt‐sensitive rats. Hypertension. 2012;60:765‐769.

185. Herrera M, Garvin JL. Angiotensin II stimulates thick ascending limb NO production via AT(2) receptors and Akt1‐dependent nitric‐oxide synthase 3 (NOS3) activation. J Biol Chem. 2010;285:14932‐14940.

186. Poumarat JS, Houillier P, Rismondo C, Roques B, Lazar G, Paillard M, et al. The luminal membrane of rat thick limb expresses AT1 receptor and aminopeptidase activities. Kidney Int. 2002;62:434‐445.

187. Gu RM, Yang L, Zhang Y, Wang L, Kong S, Zhang C, et al. CYP‐omega‐hydroxylation‐dependent metabolites of arachidonic acid inhibit the basolateral 10 pS chloride channel in the rat thick ascending limb. Kidney Int. 2009;76:849‐856.

188. Escalante B, Erlij D, Falck JR, McGiff JC. Effect of cytochrome P450 arachidonate metabolites on ion transport in rabbit kidney loop of Henle. Science. 1991;251:799‐802.

189. Escalante B, Erlij D, Falck JR, McGiff JC. Cytochrome P‐450 arachidonate metabolites affect ion fluxes in rabbit medullary thick ascending limb. Am J Physiol. 1994;266:C1775‐1782.

190. Good DW, George T, Wang DH. Angiotensin II inhibits HCO‐3 absorption via a cytochrome P‐450‐dependent pathway in MTAL. Am J Physiol. 1999;276:F726‐736.

191. Martyn KD, Frederick LM, von Loehneysen K, Dinauer MC, Knaus UG. Functional analysis of Nox4 reveals unique characteristics compared to other NADPH oxidases. Cell Signal. 2006;18:69‐82.

192. Thallas‐Bonke V, Jandeleit‐Dahm KA, Cooper ME. Nox‐4 and progressive kidney disease. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2015;24:74‐80.

193. Inoue A, Yanagisawa M, Kimura S, Kasuya Y, Miyauchi T, Goto K, et al. The human endothelin family: three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three separate genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86:2863‐2867.

120

Bibliografía

194. Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi M, Mitsui Y, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells [see comments]. Nature. 1988;332:411‐415.

195. Itoh Y, Yanagisawa M, Ohkubo S, Kimura C, Kosaka T, Inoue A, et al. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding the precursor of a human endothelium‐derived vasoconstrictor peptide, endothelin: identity of human and porcine endothelin. FEBS Lett. 1988;231:440‐444.

196. Pollock DM. Endothelin Receptor Subtypes and Tissue Distribution. In: Highsmith RF, ed. Endothelin. Totowa, NJ: Humana Press; 1998:1‐29.

197. Gariepy CE, Ohuchi T, Williams SC, Richardson JA, Yanagisawa M. Salt‐sensitive hypertension in endothelin‐B receptor‐deficient rats. J Clin Invest. 2000;105:925‐933.

198. Pollock DM, Pollock JS. Evidence for endothelin involvement in the response to high salt. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281:F144‐150.

199. Kohan DE. Endothelin synthesis by rabbit renal tubule cells. Am J Physiol. 1991;261:F221‐226. 200. Ramseyer VD, Cabral PD, Garvin JL. Role of endothelin in thick ascending limb sodium chloride

transport. Contrib Nephrol. 2011;172:76‐83. 201. de Jesus Ferreira MC, Bailly C. Luminal and basolateral endothelin inhibit chloride reabsorption

in the mouse thick ascending limb via a Ca(2+)‐independent pathway. J Physiol. 1997;505 ( Pt 3):749‐758.

202. Plato CF, Pollock DM, Garvin JL. Endothelin inhibits thick ascending limb chloride flux via ET(B) receptor‐mediated NO release. Am J Physiol Renal Physiol. 2000;279:F326‐333.

203. Herrera M, Hong NJ, Ortiz PA, Garvin JL. Endothelin‐1 inhibits thick ascending limb transport via Akt‐stimulated nitric oxide production. J Biol Chem. 2009;284:1454‐1460.

204. Bostanjoglo M, Reeves WB, Reilly RF, Velazquez H, Robertson N, Litwack, et al. 11Beta‐hydroxysteroid dehydrogenase, mineralocorticoid receptor, and thiazide‐sensitive Na‐Cl cotransporter expression by distal tubules [published erratum appears in J Am Soc Nephrol 1998 Nov;9(11):2179]. Journal of the American Society of Nephrology. 1998;9:1347‐1358.

205. Ackermann D, Gresko N, Carrel M, Loffing‐Cueni D, Habermehl D, Gomez‐Sanchez C, et al. In vivo nuclear translocation of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in rat kidney: differential effect of corticosteroids along the distal tubule. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;299:F1473‐1485.

206. Good DW, George T, Watts BA, 3rd. Aldosterone inhibits HCO absorption via a nongenomic pathway in medullary thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2002;283:F699‐706.

207. Good DW, George T, Watts BA, 3rd. Nongenomic regulation by aldosterone of the epithelial NHE3 Na(+)/H(+) exchanger. Am J Physiol Cell Physiol. 2006;290:C757‐763.

208. Watts BA, 3rd, George T, Good DW. Aldosterone inhibits apical NHE3 and HCO3‐ absorption via a nongenomic ERK‐dependent pathway in medullary thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;291:F1005‐1013.

209. Herrera M, Garvin JL. Endothelin stimulates endothelial nitric oxide synthase expression in the thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;287:F231‐235.

210. Skatchkov MP, Sperling D, Hink U, Mulsch A, Harrison DG, Sindermann I, et al. Validation of lucigenin as a chemiluminescent probe to monitor vascular superoxide as well as basal vascular nitric oxide production. Biochem Biophys Res Commun. 1999;254:319‐324.

211. Hernandez‐Rios R, Hernandez‐Estrada S, Cruz‐Robles D, Hernandez‐Lobato S, Villalobos‐Martin M, Johnson RJ, et al. Low fructose and low salt diets increase mitochondrial DNA in white blood cells of overweight subjects. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2013;121:535‐538.

212. Andrew PJ, Mayer B. Enzymatic function of nitric oxide synthases. Cardiovasc Res. 1999;43:521‐531.

121

Bibliografía

213. Fleming I. Molecular mechanisms underlying the activation of eNOS. Pflugers Arch. 2010;459:793‐806.

214. Forstermann U, Closs EI, Pollock JS, Nakane M, Schwarz P, Gath I, et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 1994;23:1121‐1131.

215. Chen F, Kumar S, Yu Y, Aggarwal S, Gross C, Wang Y, et al. PKC‐dependent phosphorylation of eNOS at T495 regulates eNOS coupling and endothelial barrier function in response to G+ ‐toxins. PLoS One. 2014;9:e99823.

216. Ramachandran J, Peluffo RD. Threshold levels of extracellular l‐arginine that trigger NOS‐mediated ROS/RNS production in cardiac ventricular myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 2017;312:C144‐C154.

217. Ulker E, Parker WH, Raj A, Qu ZC, May JM. Ascorbic acid prevents VEGF‐induced increases in endothelial barrier permeability. Mol Cell Biochem. 2016;412:73‐79.

218. Solini A, Rossi C, Duranti E, Taddei S, Natali A, Virdis A. Saxagliptin prevents vascular remodeling and oxidative stress in db/db mice. Role of endothelial nitric oxide synthase uncoupling and cyclooxygenase. Vascular pharmacology. 2016;76:62‐71.

219. Silva GB, Ortiz PA, Hong NJ, Garvin JL. Superoxide stimulates NaCl absorption in the thick ascending limb via activation of protein kinase C. Hypertension. 2006;48:467‐472.

220. Takenaka T, Nobe K, Okayama M, Kojima E, Nodaira Y, Sueyoshi K, et al. Aliskiren reduces morning blood pressure in hypertensive patients with diabetic nephropathy. Clinical and experimental hypertension. 2012;34:243‐248.

221. van Vark LC, Bertrand M, Akkerhuis KM, Brugts JJ, Fox K, Mourad JJ, et al. Angiotensin‐converting enzyme inhibitors reduce mortality in hypertension: a meta‐analysis of randomized clinical trials of renin‐angiotensin‐aldosterone system inhibitors involving 158,998 patients. Eur Heart J. 2012;33:2088‐2097.

222. Burnier M. Angiotensin II type 1 receptor blockers. Circulation. 2001;103:904‐912. 223. Alexander BT, Cockrell KL, Rinewalt AN, Herrington JN, Granger JP. Enhanced renal expression of

preproendothelin mRNA during chronic angiotensin II hypertension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001;280:R1388‐1392.

224. Kopkan L, Castillo A, Navar LG, Majid DS. Enhanced superoxide generation modulates renal function in ANG II‐induced hypertensive rats. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;290:F80‐86.

225. Granger JP, Schnackenberg CG. Renal mechanisms of angiotensin II‐induced hypertension. Semin Nephrol. 2000;20:417‐425.

226. Agarwal R, Campbell RC, Warnock DG. Oxidative stress in hypertension and chronic kidney disease: role of angiotensin II. Semin Nephrol. 2004;24:101‐114.

227. Chin SY, Wang CT, Majid DS, Navar LG. Renoprotective effects of nitric oxide in angiotensin II‐induced hypertension in the rat. Am J Physiol. 1998;274:F876‐882.

228. Edwards BS, Schwab TR, Zimmerman RS, Heublein DM, Jiang NS, Burnett JC, Jr. Cardiovascular, renal, and endocrine response to atrial natriuretic peptide in angiotensin II mediated hypertension. Circ Res. 1986;59:663‐667.

229. DeClue JW, Guyton AC, Cowley AW, Jr., Coleman TG, Norman RA, Jr., McCaa RE. Subpressor angiotensin infusion, renal sodium handling, and salt‐induced hypertension in the dog. Circ Res. 1978;43:503‐512.

230. Cervenka L, Kramer HJ, Maly J, Heller J. Role of nNOS in regulation of renal function in angiotensin II‐induced hypertension. Hypertension. 2001;38:280‐285.

231. Hamaguchi A, Kim S, Yano M, Yamanaka S, Iwao H. Activation of glomerular mitogen‐activated protein kinases in angiotensin II‐mediated hypertension. J Am Soc Nephrol. 1998;9:372‐380.

122

Bibliografía

232. Harrison‐Bernard LM, El‐Dahr SS, O'Leary DF, Navar LG. Regulation of angiotensin II type 1 receptor mRNA and protein in angiotensin II‐induced hypertension. Hypertension. 1999;33:340‐346.

233. McCubbin JW, DeMoura RS, Page IH, Olmsted F. Arterial hypertension elicited by subpressor amounts of angiotensin. Science. 1965;149:1394‐1395.

234. Passmore JC, Jimenez AE. Effect of chloride on renal blood flow in angiotensin II induced hypertension. Canadian journal of physiology and pharmacology. 1991;69:507‐511.

235. Collidge TA, Lammie GA, Fleming S, Mullins JJ. The role of the renin‐angiotensin system in malignant vascular injury affecting the systemic and cerebral circulations. Prog Biophys Mol Biol. 2004;84:301‐319.

236. Woods RL, Abrahams JM, Kincaid‐Smith P, Johnston CI. Vascular lesions and angiotensin in malignant hypertension in the absence of vasopressin. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1982;9:297‐301.

237. Mislovicova M, Kettmann V, Moncek F, Drimal J, Jr., Drimal D, Doherty AM, et al. Plasma‐levels of endothelin‐1 and angiotensin‐II and reactivity of arterial blood pressure to exogenous sympathomimetics and vasoactive peptides in rat model of malignant renal hypertension. Bratisl Lek Listy. 2000;101:123‐129.

238. Fleming S. Malignant hypertension ‐ the role of the paracrine renin‐angiotensin system. J Pathol. 2000;192:135‐139.

239. De Bruyn B. Asymmetric spatial distributions of motion vectors yield characteristic errors in direction judgements. Vision Res. 1995;35:1541‐1545.

240. Casare FA, Thieme K, Costa‐Pessoa JM, Rossoni LV, Couto GK, Fernandes FB, et al. Renovascular remodeling and renal injury after extended angiotensin II infusion. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F1295‐1307.

241. Wakui H, Dejima T, Tamura K, Uneda K, Azuma K, Maeda A, et al. Activation of angiotensin II type 1 receptor‐associated protein exerts an inhibitory effect on vascular hypertrophy and oxidative stress in angiotensin II‐mediated hypertension. Cardiovasc Res. 2013;100:511‐519.

242. Rajagopalan S, Kurz S, Munzel T, Tarpey M, Freeman BA, Griendling KK, et al. Angiotensin II‐mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NADPH oxidase activation. Contribution to alterations of vasomotor tone. J Clin Invest. 1996;97:1916‐1923.

243. Kost CK, Jr., Herzer WA, Li P, Notoya M, Mizuhira V, Inagami T, et al. Angiotensin II‐induced structural and functional alterations in spontaneously hypertensive rat kidney. Am J Physiol. 1996;270:F229‐236.

244. Dhande IS, Zhu Y, Braun MC, Hicks MJ, Wenderfer SE, Doris PA. Mycophenolate mofetil prevents cerebrovascular injury in stroke‐prone spontaneously hypertensive rats. Physiol Genomics. 2017;49:132‐140.

245. Modlinger P, Chabrashvili T, Gill PS, Mendonca M, Harrison DG, Griendling KK, et al. RNA silencing in vivo reveals role of p22phox in rat angiotensin slow pressor response. Hypertension. 2006;47:238‐244.

246. Ferrandi M, Salardi S, Parenti P, Ferrari P, Bianchi G, Braw R, et al. Na+/K+/Cl(‐)‐cotransporter mediated Rb+ fluxes in membrane vesicles from kidneys of normotensive and hypertensive rats. Biochim Biophys Acta. 1990;1021:13‐20.

247. Liang B, Leenen FH. Prevention of salt induced hypertension and fibrosis by angiotensin converting enzyme inhibitors in Dahl S rats. Br J Pharmacol. 2007;152:903‐914.

248. Wang M, Luan H, Wu P, Fan L, Wang L, Duan X, et al. Angiotensin II stimulates basolateral 50‐pS K channels in the thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2014;306:F509‐516.

123

Bibliografía

249. Cogan MG. Angiotensin II: a powerful controller of sodium transport in the early proximal tubule. Hypertension. 1990;15:451‐458.

250. Peti‐Peterdi J, Warnock DG, Bell PD. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. Journal of the American Society of Nephrology. 2002;13:1131‐1135.

251. Kittikulsuth W, Pollock JS, Pollock DM. Sex differences in renal medullary endothelin receptor function in angiotensin II hypertensive rats. Hypertension. 2011;58:212‐218.

252. Zhou X, Zhang Z, Shin MK, Horwitz SB, Levorse JM, Zhu L, et al. Heterozygous disruption of renal outer medullary potassium channel in rats is associated with reduced blood pressure. Hypertension. 2013;62:288‐294.

253. Zuo E, Cai YJ, Li K, Wei Y, Wang BA, Sun Y, et al. One‐step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9‐mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 2017;27:933‐945.

254. Longenecker G, Kulkarni AB. Generation of gene knockout mice by ES cell microinjection. Curr Protoc Cell Biol. 2009;Chapter 19:Unit 19 14 19 14 11‐36.

255. Carlson SH, Wyss JM. Long‐term telemetric recording of arterial pressure and heart rate in mice fed basal and high NaCl diets. Hypertension. 2000;35:E1‐5.

256. Crowley SD, Gurley SB, Oliverio MI, Pazmino AK, Griffiths R, Flannery PJ, et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin‐angiotensin system. J Clin Invest. 2005;115:1092‐1099.

257. Kobori H, Harrison‐Bernard LM, Navar LG. Urinary excretion of angiotensinogen reflects intrarenal angiotensinogen production. Kidney Int. 2002;61:579‐585.

258. Nguyen MT, Lee DH, Delpire E, McDonough AA. Differential regulation of Na+ transporters along nephron during ANG II‐dependent hypertension: distal stimulation counteracted by proximal inhibition. Am J Physiol Renal Physiol. 2013;305:F510‐519.

259. Giani JF, Janjulia T, Taylor B, Bernstein EA, Shah K, Shen XZ, et al. Renal generation of angiotensin II and the pathogenesis of hypertension. Curr Hypertens Rep. 2014;16:477.

260. Kwon TH, Nielsen J, Kim YH, Knepper MA, Frokiaer J, Nielsen S. Regulation of sodium transporters in the thick ascending limb of rat kidney: response to angiotensin II. Am J Physiol Renal Physiol. 2003;285:F152‐165.

261. Cinelli AR, Efendiev R, Pedemonte CH. Trafficking of Na‐K‐ATPase and dopamine receptor molecules induced by changes in intracellular sodium concentration of renal epithelial cells. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295:F1117‐1125.

262. Vinciguerra M, Deschenes G, Hasler U, Mordasini D, Rousselot M, Doucet A, et al. Intracellular Na+ controls cell surface expression of Na,K‐ATPase via a cAMP‐independent PKA pathway in mammalian kidney collecting duct cells. Mol Biol Cell. 2003;14:2677‐2688.

263. Soltoff SP, Asara JM, Hedden L. Regulation and identification of Na,K‐ATPase alpha1 subunit phosphorylation in rat parotid acinar cells. J Biol Chem. 2010;285:36330‐36338.

264. Efendiev R, Bertorello AM, Pressley TA, Rousselot M, Feraille E, Pedemonte CH. Simultaneous phosphorylation of Ser11 and Ser18 in the alpha‐subunit promotes the recruitment of Na(+),K(+)‐ATPase molecules to the plasma membrane. Biochemistry. 2000;39:9884‐9892.

265. Budu CE, Efendiev R, Cinelli AM, Bertorello AM, Pedemonte CH. Hormonal‐dependent recruitment of Na+,K+‐ATPase to the plasmalemma is mediated by PKC beta and modulated by [Na+]i. Br J Pharmacol. 2002;137:1380‐1386.

266. Aperia A, Holtback U, Syren ML, Svensson LB, Fryckstedt J, Greengard P. Activation/deactivation of renal Na+,K(+)‐ATPase: a final common pathway for regulation of natriuresis. FASEB J. 1994;8:436‐439.

124

Bibliografía

267. Braam B, Mitchell KD, Fox J, Navar LG. Proximal tubular secretion of angiotensin II in rats. Am J Physiol. 1993;264:F891‐898.

268. Seikaly MG, Arant BS, Jr., Seney FD, Jr. Endogenous angiotensin concentrations in specific intrarenal fluid compartments of the rat. J Clin Invest. 1990;86:1352‐1357.

269. Von Thun AM, Vari RC, el‐Dahr SS, Navar LG. Augmentation of intrarenal angiotensin II levels by chronic angiotensin II infusion. Am J Physiol. 1994;266:F120‐128.

270. Heberlein W, Wodopia R, Bartsch P, Mairbaurl H. Possible role of ROS as mediators of hypoxia‐induced ion transport inhibition of alveolar epithelial cells. Am J Physiol‐Lung C. 2000;278:L640‐L648.

271. Elmoselhi AB, Butcher A, Samson SE, Grover AK. Free radicals uncouple the sodium pump in pig coronary artery. Am J Physiol. 1994;266:C720‐728.

272. Rohn TT, Hinds TR, Vincenzi FF. Ion‐Transport Atpases as Targets for Free‐Radical Damage ‐ Protection by an Aminosteroid of the Ca2+ Pump Atpase and Na+/K+ Pump Atpase of Human Red‐Blood‐Cell Membranes. Biochemical Pharmacology. 1993;46:525‐534.

273. Shattock MJ, Matsuura H. Measurement of Na+‐K+ Pump Current in Isolated Rabbit Ventricular Myocytes Using the Whole‐Cell Voltage‐Clamp Technique ‐ Inhibition of the Pump by Oxidant Stress. Circulation Research. 1993;72:91‐101.

274. Kukreja RC, Weaver AB, Hess ML. Sarcolemmal Na(+)‐K(+)‐ATPase: inactivation by neutrophil‐derived free radicals and oxidants. Am J Physiol. 1990;259:H1330‐1336.

275. Squadrito GL, Pryor WA. The formation of peroxynitrite in vivo from nitric oxide and superoxide. Chem Biol Interact. 1995;96:203‐206.

276. Leenen FH. Diuretic and cardiovascular effects of furosemide in rats. Canadian journal of physiology and pharmacology. 1981;59:1002‐1007.

277. Kim N, Cheema‐Dhadli S, Hare GM, Chong CK, Halperin ML, Kamel KS, et al. Non‐natriuretic doses of furosemide: potential use for decreasing the workload of the renal outer medulla with minimal magnesium wasting in the rat. Nephron. Physiology. 2012;122:7‐12.

278. Haugan K, Petersen JS, Spannow J, Shalmi M, Christensen S. Antihypertensive action of non‐natriuretic doses of furosemide in Dahl salt‐sensitive rats. J Hypertens. 1997;15:775‐782.

279. Garvin JL. Angiotensin stimulates bicarbonate transport and Na+/K+ ATPase in rat proximal straight tubules. J Am Soc Nephrol. 1991;1:1146‐1152.

280. Yingst DR, Massey KJ, Rossi NF, Mohanty MJ, Mattingly RR. Angiotensin II directly stimulates activity and alters the phosphorylation of Na‐K‐ATPase in rat proximal tubule with a rapid time course. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;287:F713‐721.

281. Gutman Y, Shamir Y, Glushevitzky D, Hochman S. Angiotensin increases microsomal (Na + ‐K + )‐ATPase activity in several tissues. Biochim Biophys Acta. 1972;273:401‐405.

282. Goecke A, Kusanovic JP, Serrano M, Charlin T, Zuniga A, Marusic ET. Increased Na,K,Cl cotransporter and Na, K‐ATPase activity of vascular tissue in two‐kidney Goldblatt hypertension. Biological research. 1998;31:263‐271.

283. Dahl LK, Heine M, Tassinari L. Effects of chronia excess salt ingestion. Evidence that genetic factors play an important role in susceptibility to experimental hypertension. The Journal of experimental medicine. 1962;115:1173‐1190.

284. Klein JD, Murrell BP, Tucker S, Kim YH, Sands JM. Urea transporter UT‐A1 and aquaporin‐2 proteins decrease in response to angiotensin II or norepinephrine‐induced acute hypertension. Am J Physiol Renal Physiol. 2006;291:F952‐959.

285. McDonough AA, Nguyen MT. Maintaining Balance Under Pressure: Integrated Regulation of Renal Transporters During Hypertension. Hypertension. 2015;66:450‐455.

125

Bibliografía

286. Gurley SB, Riquier‐Brison ADM, Schnermann J, Sparks MA, Allen AM, Haase VH, et al. AT1A angiotensin receptors in the renal proximal tubule regulate blood pressure. Cell metabolism. 2011;13:469‐475.

287. Wakui H, Tamura K, Masuda S, Tsurumi‐Ikeya Y, Fujita M, Maeda A, et al. Enhanced angiotensin receptor‐associated protein in renal tubule suppresses angiotensin‐dependent hypertension. Hypertension. 2013;61:1203‐1210.

288. Tiwari S, Li L, Riazi S, Halagappa VK, Ecelbarger CM. Sex differences in adaptive downregulation of pre‐macula densa sodium transporters with ANG II infusion in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298:F187‐195.

289. Wickman A, Andersson IJL, Jia J, Hedin L, Bergstrom G. Endothelial nitric oxide synthase protein is reduced in the renal medulla of two‐kidney, one‐clip hypertensive rats. Journal of Hypertension. 2001;19:1665‐1673.

290. Ramseyer VD, Garvin JL. Angiotensin II decreases nitric oxide synthase 3 expression via nitric oxide and superoxide in the thick ascending limb. Hypertension. 2009;53:313‐318.

291. Chin SY, Pandey KN, Shi SJ, Kobori H, Moreno C, Navar, et al. Increased activity and expression of Ca(2+)‐dependent NOS in renal cortex of ANG II‐infused hypertensive rats. American Journal of Physiology. 1999;277:F797‐F804.

292. Navar LG, Ichihara A, Chin SY, Imig JD. Nitric oxide‐angiotensin II interactions in angiotensin II‐dependent hypertension. Acta Physiol Scand. 2000;168:139‐147.

293. Moreno C, Lopez A, Llinas MT, Rodriguez F, Lopez‐Farre A, Nava E, et al. Changes in NOS activity and protein expression during acute and prolonged ANG II administration. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2002;282:R31‐37.

294. Olson SC, Dowds TA, Pino PA, Barry MT, Burke‐Wolin T. ANG II stimulates endothelial nitric oxide synthase expression in bovine pulmonary artery endothelium. Am J Physiol. 1997;273:L315‐321.

295. Li D, Tomson K, Yang B, Mehta P, Croker BP, Mehta JL. Modulation of constitutive nitric oxide synthase, bcl‐2 and Fas expression in cultured human coronary endothelial cells exposed to anoxia‐reoxygenation and angiotensin II: role of AT1 receptor activation. Cardiovasc Res. 1999;41:109‐115.

296. Xu L, Liu Y. Administration of telmisartan reduced systolic blood pressure and oxidative stress probably through the activation of PI3K/Akt/eNOS pathway and NO release in spontaneously hypertensive rats. Physiol Res. 2013;62:351‐359.

297. Tambascia RC, Fonseca PM, Corat PD, Moreno H, Jr., Saad MJ, Franchini KG. Expression and distribution of NOS1 and NOS3 in the myocardium of angiotensin II‐infused rats. Hypertension. 2001;37:1423‐1428.

298. Kobayashi N, Mori Y, Nakano S, Tsubokou Y, Kobayashi T, Shirataki H, et al. TCV‐116 stimulates eNOS and caveolin‐1 expression and improves coronary microvascular remodeling in normotensive and angiotensin II‐induced hypertensive rats. Atherosclerosis. 2001;158:359‐368.

299. Silva GB, Garvin JL. Akt1 mediates purinergic‐dependent NOS3 activation in thick ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol. 2009;297:F646‐652.

300. Cabral PD, Garvin JL. Luminal flow regulates NO and O2(‐) along the nephron. Am J Physiol Renal Physiol. 2011;300:F1047‐1053.

301. Plato CF, Garvin JL. Alpha(2)‐adrenergic‐mediated tubular NO production inhibits thick ascending limb chloride absorption. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281:F679‐686.

302. Ortiz PA, Hong NJ, Garvin JL. Luminal flow induces eNOS activation and translocation in the rat thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;287:F274‐F280.

303. Ortiz PA, Hong NJ, Garvin JL. Luminal flow induces eNOS activation and translocation in the rat thick ascending limb. II. Role of PI3‐kinase and Hsp90. Am J Physiol Renal Physiol. 2004;287:F281‐288.

126

Bibliografía

304. Harris MB, Ju H, Venema VJ, Liang H, Zou R, Michell BJ, et al. Reciprocal phosphorylation and regulation of endothelial nitric‐oxide synthase in response to bradykinin stimulation. J Biol Chem. 2001;276:16587‐16591.

305. Signorello MG, Segantin A, Passalacqua M, Leoncini G. Homocysteine decreases platelet NO level via protein kinase C activation. Nitric Oxide. 2009;20:104‐113.

306. Liu J, Gao Y, Negash S, Longo LD, Raj JU. Long‐term effects of prenatal hypoxia on endothelium‐dependent relaxation responses in pulmonary arteries of adult sheep. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:L547‐554.

307. Thomas SR, Chen K, Keaney JF, Jr. Hydrogen peroxide activates endothelial nitric‐oxide synthase through coordinated phosphorylation and dephosphorylation via a phosphoinositide 3‐kinase‐dependent signaling pathway. J Biol Chem. 2002;277:6017‐6024.

308. Barauna VG, Mantuan PR, Magalhaes FC, Campos LC, Krieger JE. AT1 receptor blocker potentiates shear‐stress induced nitric oxide production via modulation of eNOS phosphorylation of residues Thr(495) and Ser(1177.). Biochem Biophys Res Commun. 2013;441:713‐719.

309. Rios NB, Esparragon FR, Rodriguez Perez JC. Telmisartan‐induced eNOS gene expression is partially independent of its PPAR‐gamma agonist property. Clinical and investigative medicine. Medecine clinique et experimentale. 2012;35:E55‐64.

310. Ramseyer VD, Ortiz PA, Carretero OA, Garvin JL. Angiotensin II‐mediated hypertension impairs nitric oxide‐induced NKCC2 inhibition in thick ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F748‐F754.

311. Dickhout JG, Mori T, Cowley AW, Jr. Tubulovascular nitric oxide crosstalk: buffering of angiotensin II‐induced medullary vasoconstriction. Circ Res. 2002;91:487‐493.

312. Bec N, Gorren AC, Voelker C, Mayer B, Lange R. Reaction of neuronal nitric‐oxide synthase with oxygen at low temperature. Evidence for reductive activation of the oxy‐ferrous complex by tetrahydrobiopterin. J Biol Chem. 1998;273:13502‐13508.

313. Adak S, Wang Q, Stuehr DJ. Arginine conversion to nitroxide by tetrahydrobiopterin‐free neuronal nitric‐oxide synthase. Implications for mechanism. J Biol Chem. 2000;275:33554‐33561.

314. Landmesser U, Dikalov S, Price SR, McCann L, Fukai T, Holland SM, et al. Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension. J Clin Invest. 2003;111:1201‐1209.

315. Kang KT, Sullivan JC, Spradley FT, d'Uscio LV, Katusic ZS, Pollock JS. Antihypertensive therapy increases tetrahydrobiopterin levels and NO/cGMP signaling in small arteries of angiotensin II‐infused hypertensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2011;300:H718‐724.

316. Okada D. Differential effects of protein kinase C on neuronal nitric oxide synthase activity in rat cerebellar slices and in vitro. Journal of chemical neuroanatomy. 1996;10:213‐220.

317. Okada D. Protein kinase C modulates calcium sensitivity of nitric oxide synthase in cerebellar slices. J Neurochem. 1995;64:1298‐1304.

318. Riccio A, Esposito E, Eboli ML. Modulation by protein kinase C of nitric oxide and cyclic GMP poffation in cultured cerebellar granule cells. Brain Res. 1996;718:159‐164.

319. Bandyopadhyay A, Chakder S, Rattan S. Regulation of inducible and neuronal nitric oxide synthase gene expression by interferon‐gamma and VIP. Am J Physiol. 1997;272:C1790‐1797.

320. Zhang C, Walker LM, Mayeux PR. Role of nitric oxide in lipopolysaccharide‐induced oxidant stress in the rat kidney. Biochem Pharmacol. 2000;59:203‐209.

321. Stumm MM, D'Orazio D, Sumanovski LT, Martin PY, Reichen J, Sieber CC. Endothelial, but not the inducible, nitric oxide synthase is detectable in normal and portal hypertensive rats. Liver. 2002;22:441‐450.

127

Bibliografía

322. Fleming I, Fisslthaler B, Dimmeler S, Kemp BE, Busse R. Phosphorylation of Thr(495) regulates Ca(2+)/calmodulin‐dependent endothelial nitric oxide synthase activity. Circ Res. 2001;88:E68‐E75.

323. Lin MI, Fulton D, Babbitt R, Fleming I, Busse R, Pritchard KA, Jr., et al. Phosphorylation of threonine 497 in endothelial nitric‐oxide synthase coordinates the coupling of L‐arginine metabolism to efficient nitric oxide production. J Biol Chem. 2003;278:44719‐44726.

324. Luo S, Lei H, Qin H, Xia Y. Molecular mechanisms of endothelial NO synthase uncoupling. Curr Pharm Des. 2014;20:3548‐3553.

325. Mollnau H, Wendt M, Szocs K, Lassegue B, Schulz E, Oelze M, et al. Effects of angiotensin II infusion on the expression and function of NAD(P)H oxidase and components of nitric oxide/cGMP signaling. Circ Res. 2002;90:E58‐65.

326. Sullivan JC, Pollock DM, Pollock JS. Altered nitric oxide synthase 3 distribution in mesenteric arteries of hypertensive rats. Hypertension. 2002;39:597‐602.

327. Oak JH, Cai H. Attenuation of angiotensin II signaling recouples eNOS and inhibits nonendothelial NOX activity in diabetic mice. Diabetes. 2007;56:118‐126.

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