Cuestionario restricción del plásmido y su corrimiento

electroforético

Para resolver el cuestionario que se encuentra en la última transparencia se te proporcionan datos:

1. Vector de clonación

2. Vector recombinante

3. Datos de estándares

4. Resultados de la restricción con las enzimas NdeI y BamHI

Vector de clonación

MCS=Sitio múltiple de clonación

Vector con inserto= Vector recombinante=Plásmido recombinante

• El inserto se encuentra entre los sitios de restricción BamHIy NdeI

6500pb

Estándar de peso molecular 1

El máximo peso molecularDel estándar es de 23,130

Descripción experimento.

Una vez realizada la transformación se crecieron las células de E. coli en medio líquido durante toda la noche. Se extrajo el vector recombinante a través de un kit basado en el método de lisis alcalina y una columna de intercambio iónico, se cuantificó y luego se dividió la cantidad de vector obtenido en tres tubos.

A un tubo se le marco como P, es decir el plásmido y a los otros tubos se les etiquetó como Enz1 y Enz2.

A todos se les añadió amortiguador TANGO y luego se llevó a calentar a 100°C por 5 min. Se enfrío en hielo y luego al tubo Enz1 se le añadió la enzima BamHI, mientras que al tubo Enz2 se le añadieron la enzima BamHI y también NdeI. Lamentablemente el amortiguador y las condiciones de incubación con las enzimas no son las más óptimas para cada enzima, así que podría haber una reducción en la formación de los productos de la restricción.

Se separó electroforéticamente tanto el plásmido sin restringir como los restringidos. Los resultados son los que se presentan en el gel.

Se proporcionan los resultados de 4 equipos. Elige cualquiera o todos para contestar el cuestionario

Estándar Plásmido Enz1 Enz2

A

B

D

P Enz1 Enz2 Std P Enz1 Enz2

EQ1 EQ2

C

A

C

A

B

D

P Enz1 Enz2 Std P Enz1 Enz2

EQ3 EQ4

C

E

Con los datos que se te proporcionaron y lo que sabes de la obtención del plásmido contesta lo siguiente1. ¿Qué son los topoisomeros?

2. ¿En algún carril observas topoisomeros?

3. Explica porqué se usó para la restricción del plásmido una enzima de restricción

4. Explica porqué se usaron dos enzimas de restricción para la restricción del plásmido y en específico NdeI y BamHI

5. ¿Cuál es el peso molecular del vector recombinante y en que carril y banda lo observas?

6. ¿Cuál es el peso molecular del vector de clonación y en que carril y banda lo puedes observar?

7. ¿Cuál es el peso molecular del gen de interés y en que carril y banda lo puedes observar?

8. ¿Cuáles serían los principales componentes contaminantes posibles del DNA plasmídico extraído?

9. ¿Observas en algún carril alguna banda que puedas identificar como un contaminante? Si lo hay cual carril y banda es y menciona el nombre del contaminante. Si dices que no hay contaminante, coloca uno y da su nombre.

10. Si crees que puede haber algún contaminante en tu extracción de DNA plasmídicocon que tipo de reactivo o procedimiento lo eliminarías