INSTALACIÓN DE COLUMNA.-

1. Purgue el sistema de bombeo de cualquier fase mobil que contenga buffer y conecte la columna al inyector.

2. Hacer pasar por la columna un solvente orgánico al 100% (metanol o acetonitrilo) a un flujo de 0,1 mL/min e incrementar el flujo a 0,5 mL/min cada 5 minutos.

3. Cuando la fase móvil está pasando libremente por la columna, detener el flujo y conecte la columna al detector. Esto evita la entrada de aire al sistema de detección y da un mas rápido equilibrio.

4. Gradualmente incrementar el flujo según lo indicado en el paso 2.5. Una vez conseguida una contrapresión constante y la línea base lograda, proceder como

indica la siguiente sección.

Nota.- Si los aditivos de la fase móvil se encuentran en baja concentraciones (ejm: reactivos de pares iónicos), 100 a 200 volúmenes pueden ser requeridos para completar el equilibrio. Adicionalmente, fases móvil que contienen formato (ejm: amonio formiato, ácido fórmico, etc) puede también requerir grandes tiempos de equilibrio inicial.

EQUILIBRIO DE COLUMNA.-Las columnas ACQUITY UPLC BEH son transportadas en 100% de acetonitrilo. Es importante asegurar la compatibilidad de la fase móvil antes de cambiar el sistema a una diferente fase móvil. Equilibre la columna con un mínimo de 10 volúmenes de columna de la fase móvil a ser utilizada. La columna puede ser considerada termalmente equilibrada una vez que una constante contrapresión en lograda.

Para evitar precipitación de los buffers de la fase móvil en tu columna o en tu sistema, haga pasar por la columna cinco volúmenes de columna de una mezcla de agua / disolvente orgánico, usando el mismo o un más bajo contenido de solvente como en el buffer de fase móvil deseado. (Por ejemplo: Flush por la columna y sistema con una solución en agua de metanol al 60%; antes de introducir la fase móvil de metanol / buffer 40%).Para las columnas ACQUITY UPLC BEH HILIC, flush con 50 volúmenes de columna de 50:50 acetonitrilo: agua con 10mM de concentración de final del buffer. Para las columnas ACQUITY UPLC BEH Amidas, flush con 50 volúmenes de columna de 60:40 acetonitrilo: acuoso. Antes de la primer inyección, equilibrar con 20 volúmenes de columna de la fase móvil requerida.

INICIAL DETERMINACIÓN DE LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA1. Desarrollar una prueba de eficiencia en la columna antes de usarla. Está prueba puede

consistir de:a. Una mezcla de analito de prueba que es comúnmente utilizado en el laboratorio. y/o

b. Una mezcla de analito como se detalla en el “Cromatograma de prueba de desempeño” el cual acompaña a la columna.

2. Determine el número de platos teóricos y use este valor para comparaciones periódicas.3. Repita la prueba en intervalos predeterminados para verificar el desempeño de la columna en

el tiempo. Ligeras variaciones pueden ser obtenidas en dos diferentes sistemas UPLC, debido a la calidad de las conexiones, operaciones ambientales, sistemas electrónicos, calidad del reactivo, condiciones de columna y a la técnica del operador.

PRE-COLUMNAS VanGuard.-Las precolumnas VanGuard son columnas de protección de 2,1 mm ID x 5 mm de largo, diseñadas específicamente para usarse en el sistema ACQUITY UPLC. C son empacadas con la misma UPLC química y fritas. Las pre-columnas VanGuard son diseñadas para ser instaladas directamente por el lado de la conexión de entrada de la columna.

USO DE COLUMNA.-Preparación de Muestras.-1. Es preferible preparar la muestra en la fase móvil de trabajo o en una fase móvil que sea mas

débil la fase móvil de trabajo, para mejorar la forma del pico y la sensibilidad. La acetona no debe ser utilizada como solvente de muestra a menos que un Hexano tetrahidrofurano kit compatible haya sido instalado.

2. Si la muestra no es disuelta en la fase móvil, asegure que la muestra, solvente y fase móviul son miscibles a razón de evitar la precipitación de la muestra y/o buffer.

3. Filtre la muestra con filtros de membrena de 0,2 um para remover las partículas. Si la muestra es disuelta en un solvente que contiene modificador orgánico (ejm: acetonitrilo, metabol, etc) asegure que el material de la membrana no se disuelva en este solvente.

4. Para separación de cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC), las muestras deben ser preparadas en un alto porcentaje de solventes orgánicos (ejm: 95% acetonitrilo).

Rango de pH.-El recomendado rango de operación de pH para las columnas ACQUITY UPLC BEH es de 1 a 12 para la química de las C18, C8 y fenil; 2 a 11 para las química de las Shield RP18 y las BEH amida; 1 a 9 para química de BEH HILIC. Adicionalmente, el tiempo de vida útil de la columna variará dependiendo de la temperatura de funcionamiento, el tipo y la concentración del buffer utilizado. Por ejemplo; el uso de buffer fosfato en pH 8 en combinación de una elevada temperatura, producirá tiempo de vida útil mas cortos.

Solventes.-Para mantener el máximo el desempeño de la columna, use solventes de alta calidad grado cromatografico. Filtre todo los buffers acuosos antes de usar con filtro de 0,2 um. Solventes que contienen materiales en partículas en suspensión generalmente obstruyen la superficie exterior de la frita de distribución de entrada de la columna. Esto dará lugar a una presión más alta de funcionamiento y el rendimiento más pobre.

Presión.-Las columnas ACQUITY UPLC BEH pueden tolerar presiones de operación superiores a los 18000 psi.

Temperatura.- Las temperaturas entre 20°C-90°C son recomendadas para la operación de las columnas ACQUITY UPLC BEH a razón de que incrementan la selectividad, bajan la viscosidad del solvente e incrementan el promedio de transferencia de masa. Cuando se opera en altos pH, las bajas temperaturas son recomendadas para a largar el tiempo de vida útil de la columna. Bajo las condiciones HILIC, las columnas ACQUITY UPLC BEH amida pueden ser utilizadas en altos pH y altas temperaturas sin problema.

LIMPIEZA, REGENERACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE COLUMNAS.-Limpieza y regeneración.-Los cambios en la forma del pico, pico de la división, los hombros sobre el pico, los cambios en la retención, el cambio en la resolución o el aumento de la contrapresión puede indicar contaminación de la columna. Lavar con un solvente orgánico puro, tomando la precaución de no precipitar los buffers, es usualmente suficiente para remover la contaminación. Si el procedimiento de lavado no resuelve el problema, purgar la columna usando el procedimiento de limpieza y regeneración. Utilice la rutina de limpieza que coincida con las propiedades de las muestras y / o lo que usted cree que está contaminando la columna (ver tabla de abajo). Lave la columna con 20 volúmenes de columna de solvente. Incrementar la temperatura de columna para mejorar la eficiencia de la limpieza. Lavar las columnas ACQUITY UPLC BEH HILIC con 50:50 acetonitrilo:agua para remover los contaminantes polares. Si este procedimiento de lavado no resuelve el problema, purge la columna con 5:95 acetonitrilo:agua.La limpieza de contaminantes polares de las columnas ACQUITY UPLC BEH Amida, correr unos 10 minutos de gradientes desde 0 – 100% de agua. Por favor note que a medida que incrementa la concentración acuosa, la contrapresión rápidamente incrementará también. Reduzca el flujo cuando se trabaja en concentraciones mayores de 60% de acuoso. Repetir si es necesario.

Secuencia de limpieza de columnas de fase reversa

*.- Use bajo contenido de solventes organicos para evitar precipitación de buffers.

**.- A menos que un hexano tetrahidrofurano kit de compatibilidad esté instalado, correr solventes como THF o hexano debería ser considerado cuando

la columna no pueda ser limpiada por una corrida de limpieza, con solventes orgánicos de fase reversa, tal como el acetonitrilo. Un flujo reducido, baja

temperatura de operación y límite la exposición del sistema a THF /o Hexano.

Almacenamiento.-Por periodos mas largos que 4 días a temperatura ambiente, almacene las columnas de fase reversa e HILIC en 100% acetonitrilo. Para elevada temperaturas de aplicación, almacene inmediatamente despúes de usar en 100% acetonitrilo para mejorar la vida útil de columna. No guarde las columnas en buffer. Si la fase móvil contiene sales de buffer, lave la columna ACQUITY UPLC BEH con 10 volúmenes de columna con agua grado HPLC y reemplace con 100% acetonitrilo para guardarla. Sino se realiza esté paso intermedio producirá la precipitación de la sal de buffer en contacto con el acetonitrilo 100% introducido. Corra una gradiente a acetnonitrilo 100% a razón de lavar todos los solventes acuosos de una columna ACQUITY UPLC BEH amida antes de guardarla en 100% acetonitrilo. Completamente selle la columna para evitar evaporación y sequedad.Por periodos mas largos de cuatro días, guarde las columnas ACQUITY UPLC BEH HILIC columnas en 95:5 acetnoitrilo:agua. No las guarde con buffer. Si la fase móvil contine sal de buffer, lave la columna con 10 volúmenes de columna de 95:5 acetonitrilo:agua.NOTA.- Si una columna ha sido corrida con una fase móvil que contiene formiato (ejm: formiato de amonio, ácido fórmico, etc) y es luego flushed con acetonitrilo 100%, levemente incrementará el tiempo de equilibrio necesario, cuando la columna es re-instalada y corrida con fase móvil con formiato de amonio.

ADICIONAL INFORMACIÓN.-Tips para máximar la vida útil de las columnas ACQUITY UPLC BEH.1. Para maximar la vida útil de la columna ACQUITY UPLC, presta atención a:

Calidad del agua (incluyendo sistema de purificación de agua). Calidad del solvente. Preparación de fase móvil, almacenamiento y edad. Muestra, buffer y solubilidad de la fase móvil. Calidad de la muestra y preparación.

2. Cuando un problema se presenta, a menudo solamente una practica inadecuada debe ser cambiada.

3. Siempre recordar Usar unidad filtración en línea o preferiblemente pre columna. Descarte el crecimiento bacteriano, minimizando (cuando sea posible) el

uso de fase móvil con 100% acuosa.

Cambie la fases móviles acuosa cada 24-48 horas. Descarte las fases móviles 100% acuosas cada 24-48 horas. Añade de 5% a 10% de modificador orgánico a la fase móvil y ajustar el

perfil de gradiente. Filtre las porciones acuosas de la fase móvil a través de filtro de 0,2 um. Mantenga su sistema de purificación de agua, para siempre tenga buen

funcionamiento. Utilice únicamente agua ultra pura (18 megohm-cm) y solventes de la

más alta calidad posible. Agua de calidad HPLC no es agua de calidad UPLC.

4. Evitar (donde sea posible). Fases móviles 100% acuosas. Agua embotellada de grado HPLC. Rellenar o añadir nueva fase móvil a una nueva fase móvil. Antiguas fase móvil acuosa. Recordar lavar las botellas y preparar fase

móvil nueva cada 24 a 48 Horas. Usar sal de buffer fosfato en combinación con altas concentraciones de

Acetonitrilo (ejm: >70%) debido a la precipitación.5. No asumir que una columna está mala cuando se presenta elevadas contrapresiones o picos

partidos son observados. Investigar las causas de la fallas de la columna: Contrapresión. Fase móvil, bacteria, precipitación y/o muestras. División de pico. Calidad de la muestra. Fuerza del solvente de inyección.

Poner en marcha columna ACQUITY UPLC BEH HILIC.-Dado que las columnas ACQUITY UPLC BEH HILIC no poseen un fase unida, el rango de operación de pH es de 1 a 9, y pueden funcionar a temperaturas de hasta 45 ° C.Como con cualquier LC Columna, operar en los extremos de pH, presiones y temperatura resultará en disminución de la vida útil de la columna.

Equilibrio de la columna.Cuando la columna es por primera vez recibida, flush 50% acetonitrilo: 50% agua con 10 mM concentración final buffer por 50 volúmenes de columna.Equilibre con 10 volúmenes de columna de fase móvil antes de realizar la primera inyección.Si condiciones de gradiente son utilizadas, equilibre con 8-10 volúmenes de columna entre inyecciones.Si no se equilibre adecuadamente la columna podría dar lugar a la deriva tiempos de retención.

Consideraciones de fase móvil.

Siempre mantenga al menos 3% de solvente polar en la fase móvil o gradiente (ejm: 3% acuosa/3% metanol o 2%acuosa/1%metanol, etc). Esto asegura que la calidad de las partículas ACQUITY UPLC BEH siempre estén bien hidratadas.Mantenga al menos 40% de solvente orgánico (ejm: acetonitrilo) en la fase móvil o gradiente.Evitar sales de buffer fosfato para evitar precipitación en fases móviles HILIC. El ácido fosfórico está bien.