CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALESMara Elena Daorden E.E.A. INTA SanPedro

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de clulas o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas.

Los tejidos vegetales pueden cultivarse in vitro

La clula retiene toda la informacin para regenerar una planta completa

Diferenciacin celularLa clula adquiere propiedades diferentes a las de la clula que la origin DesdiferenciacinClula diferenciada Clula diferenciada Clula desdiferenciada Retiene informacin

Totipotencialidad

CULTIVO IN VITRO DE TEJIDOS VEGETALES Conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento y/o crecimiento de clulas o tejidos en un medio nutritivo y en condiciones ambientales controladas.

Medio nutritivoLas porciones del vegetal que se cultivan in vitro: explantos No son autotrficos

Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de rganos y tejidos vegetales Agua Macro Micro Sustancias orgnicas Nutrientes Fe Zn Azcares N B Aminocidos P Mn Vitaminas K Cu Auxinas Ca Ni Citocininas Mg Co Giberelinas S Al Mo I

Medio nutritivo: Fitohormonas Auxinas0.01 a 10 mg/lAcido indol Actico (AIA) Acido Indol Butirico (IBA) Acido Naftaln Actico (ANA) 2-4 D

Citocininas0.03 a 10 mg/lBencil adenina-(BA) Bencilaminopurina (BAP) 2ip Zeatina Tridiazuron

Se disuelven en NaOH 1N

Giberelinas

Se disuelven en HCl 1N En cultivo de meristemas y para elongacin: Acido Giberlico(GA3)

Medio nutritivo

Auxinas Citocininas

Auxinas

Citocininas

Parte area

Enraizamiento

Modalidades de cultivo in vitro Cultivo de meristemas Cultivo de yemas

Cultivo in vitro de plantas superiores

Cultivo de anteras

Cultivo de embriones

Cultivo de protoplastos

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)

Multiplicacin en plantas SemillasReproduccin sexual Progenie con distinto genotipo

Vegetativa:

bulbos, esquejes, estacas, tubrculos

Reproduccin asexual Progenie con idntico genotipo Descendencia uniforme Se transmiten enfermedades

Produccin de plantas libres de enfermedadesMtodos Tratamientos con calor: Cultivo de meristemas Ambos Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.

para algunos virus y micoplasmas

Cultivo de meristemas

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture)

Obtencin de plantas de sanidad controlada (Cultivo de meristemas)Por qu el meristema?

La concentracin del patgeno no es uniforme en la planta infectadaMeristema Sistema vascular poco diferenciado Elevada actividad metablica Elevada concentracin de auxinas

Esquema para la obtencin de plantas de sanidad controladaExtraccin del pice (0.2-0.5 mm) Cultivo del pice en un medio adecuado Planta regenerada Planta establecida en sustrato Planta saneada Cultivo libre de virusCuidadoso control de la humedad Rigurosas evaluaciones (plantas indicadoras, injertos, serologa etc)

Mantenimiento, multiplicacin, Monitoreo de reinfecciones virsicas

Cultivo de meristemasConsideraciones generales El proceso no ofrece total seguridad Importancia de las tcnicas de diagnstico Anlisis confiables Sistemas de deteccin sensibles Especificar de qu virus se ha liberado y la tcnica de diagnstico empleada

Produccin de plantas libres de enfermedadesMtodos Tratamientos con calor: Cultivo de meristemas Ambos Microinjerto: Injerto de meristemas sobre un pie sano.para algunos virus y micoplasmas

MicroinjertosInjertar pices caulinares en un portainjerto

Etapas: Germinacin in vitro de las semillas del portainjerto Preparacin de la plntula para ser injertada Extraccin del pice de la planta infectada Mantenimiento de la plntula injertada en cultivo Mantener la planta obtenida en invernadero Indexar las plantas obtenidas

Microinjertos

Plntula especialmente acondicionada

Dos a cuatro semanas

Ubicacin del pice en la plntulaPublished as a special insert to Caliiformia Agriculture, Nov-Dec. 1982 Universtiy of California, Berkeley, California.94720

Microinjertos

http://www.ivia.es/germo/Foto1.jpg

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)

Influencia del material de partida: Planta madre Capacidad regenerativaGenotipo Edad Estado del rgano o tejido Estado fisiolgico Estado sanitario Ao Condiciones de crecimiento Posicin del explanto Tamao del explanto Condiciones fisiolgicasSegn Pierik, R.L.M. In vitro Culture of higher plants

Influencia del material de partida: Planta madre Capacidad regenerativaGenotipo: Dicotiledneas mejorque monocotiledneas, y entre ellas las Solanceas, crucferas muy fcil regeneracin

Edad: Partes juveniles mejor que las adultas Estado del rgano o tejido: Mejor no leosos Estado fisiolgico: Partes vegetativasmejor que partes generativas

Influencia del material de partida: Planta madre

Capacidad regenerativaEstado sanitario: Las ms saludablesy vigorosas

Ao: sobre todo si el material provienede campo (inviernos severos veranos secos)

Condiciones de crecimiento: diferente respuesta si crece encampo que en invernadero

Influencia del material de partida: Planta madre

Capacidad regenerativaPosicin del explanto: Hay un gradientede regeneracin en la planta

Tamao del explanto: En general a mayortamao mayor capacidad regenerativa

Preparacin de la planta madreRecomendable que crezca en invernadero o cmara de crecimiento Usar material homogneo Elegir plantas vigorosas Promover nuevas brotaciones: podas En maceta con sustrato estril Programa sanitario Controles y manipulacin de intensidad de luz, fotoperodo y temperatura Aplicacin de fitoreguladores

Preparacin de la planta madre

Prevenir insectos de cualquier tipo Prevenir hongos y bacterias Regar slo en la maceta (evitar riegos por encima) Mantener baja la humedad

Obtencin de explanto y desinfeccinEn invernaderoElementos limpios en la coleccin Ubicarlos en bolsas identificadas En conservadoras

Obtencin de explanto y desinfeccinEn laboratorioAgua corriente Se retiran hojas Soluciones desinfectantes (etanol-hipoclorito de sodio) Enjuagues con agua estril en cabina de flujo laminar Antibiticos y/o fungicidas

Contaminaciones

Micropropagacin

Segmentos uninodales

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Micropropagacin

Tipos de micropropagacin

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture. p 59)

Tipos de micropropagacin

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture.)

Tipos de micropropagacin

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant Biotechnology in Agriculture.)

Micropropagacin:Etapa I

Etapas (Murashige)

Seleccin y desinfeccin de explantos Cultivo en medio nutritivo

Etapa IIMultiplicacin a travs de subcultivos

Etapa IIIEnraizamiento

MicropropagacinTransplante y aclimatacin

Planta entera Microtnel

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

MicropropagacinTransplante y aclimatacin

Invernadero

Fuente: http://www.etsea2.udl.es

Tnel de aclimatacin

Plntulas en aclimatacin

Plntulas aclimatadas

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. p 59)

Morfognesis directaRegeneracin en hojas de Violeta africana

Fuente: http://www.unizar.es

Tipos de cultivo in vitro

Esquema modificado a partir de Lindsey y Jones, 1989, en Plant biotechnology in agriculture. p 59)

Fuente: Books Cole, a division of Thomson Learning. Inc

Morfognesis indirectaMasas de callos indiferenciados

Regeneracin a partir de callos

Cultivo de AnterasEn qu consiste?Polen inmaduro en medios adecuados para la formacin de embriones o callos

Cultivo de AnterasAplicaciones en fitomejoramientoCruzamiento A X B Plantas F1Fuente: Cultivo de tejidos en la Agricultura. CIAT 1991

Cultivo de anteras

Lneas haploides SeleccinFuente:

Cultivo de embriones cigticosPara qu se usa?Superar dormicin Inhibidores en el endosperma Estudios fisiolgicos y nutricionales Acortar el ciclo en mejora Rescatar hbridos de cruzamientos

Recuperacin de hbridosBarreras a los cruzamientos interespecficos Precigticas: el grano de polen no germina o no atraviesa el estilo. Postcigticas: relacionadas con el desarrollo del embrin

Cultivo in vitro de embriones

Cultivo de embriones cigticosMejoramiento Cruzamientos interespecficos Incompatibilidades Embriones abortivos Embriones cultivados in vitro

Cultivo de embriones cigticosEn el gnero PrunusDuraznero X Almendro Portainjertos resistentes a nematodes Mariana 2624 Resistencia a Ring spot virus Cultivar Colt (Cerezo)

P. cerasifera X P. munsoniana

P. avium X P. seudocerasus

En la EEA San PedroEn la EEA San PedroDuraznero x Duraznero

rboles polinizados

Cruzamientos: MetodologaParental Maculino

Recoleccin de flores en estado globoso

Extraccin y tamizado del polen

Parental femenino Ramas con flores emasculadas

PolinizacinUbicacin del polen

Embolsado de ramas

Frutos cuajados

Desembolsado de ramas a los 40 das de la polinizacin

En laboratorioAcondicionamiento del fruto y extraccin de semilla

Siembra de embriones en condiciones aspticas

Germinacin in vitro

Embrin germinado in vitro

Alternativas

In vitro

A sustrato

Hbridos ambientados

Hbridos injertados sobre portainjertos francos

Hbridos en campo

Hbridos en campo Hbridos a campo

Gracias por su atencin!www.inta.gov.ar/sanpedro Dra. Mara Elena Daorden daorden@correo.inta.gov.ar