TEMA 10

CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATÓGENOS VIABLES

ÍNDICE DE CONTENIDOS

IntroducciónPreparación de medios artificiales

Condiciones para el aislamiento de patógenos

Microorganismos y oxígeno

Incubación en condiciones anaerobias

Incubación de microorganismos capnófilos

Temperatura de incubación, pH, humedad

Medios artificiales. Ejemplos.

Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento)

Medios de enriquecimiento

Medios selectivos

Medios diferenciales

Medios cromogénicos

Cultivo de patógenos intracelulares obligados

Introducción

� Regla de oro de la microbiología

Muestra

Cultivo y aislamiento de microorganismos

Cultivo puro

identificación

Realización pruebas susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del diagnóstico microbiológico

Medios de cultivo

� Qué es un medio de cultivo

�Medios deshidratados

�Cientos de formulaciones

�Empresas del sector farmacéutico �Empresas del sector farmacéutico dedicadas a la producción y control de calidad de los medios

�Placas de petri y tubos con todos los medios necesarios

EXISTEN CIENTOS DE FORMULACIONES DISPONILES EN EL

MERCADOMERCADO

Preparación de medios de cultivo artificiales

� Preparación� Esterilización

� Autoclave� Tindalización� FiltraciónLuz UV� Luz UV

� Estufas a 180 ºC� Óxido de etileno

� Adición de sustancias termolábiles� Vertido en placas de petri (medios sólidos) o tubos (medios líquidos o medios sólidos)

Condiciones para el desarrollo de patógenos

� Medio de cultivo � No exigentes (nutrientes (C, N, S, P) sales, tampón)� Exigentes (ídem. + sustancias complejas (sangre, suero, huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas)

� Condiciones ambientales adecuadasAtmósfera adecuada� Atmósfera adecuada

� Temperatura adecuada� Humedad� Tiempo de incubación� pH� Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento

Relaciones de los microorganimos con el oxígeno

� Aerobios � Anaerobios facultativos

� Anaerobios� Estufas para anaerobios� Bolsas para anaerobios (generan H2 y CO2) (Gas-Pak)

Microaerófilos� Microaerófilos� Frascos con vela� Agar semisólido

� Capnófilos� Atmósfera de CO2

� Sistemas Gas Pak, Bio Bag (bicarbonato y ácidos)

� Utilización de estufas de CO2

Sistemas para anaerobiosis

Sistemas para incubación de microorganismos capnófilos

Jarra con vela

Estufas CO2

Sistemas Biobag, Gas Pak (bicarbonato y ácidos)

� Temperatura de incubación� 35-37 ºC� 30 ºC

� Otras temperaturas� Elevadas (42 ºC)Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío

CONDICIONES DE INCUBACIÓN

� Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío� Intermedias (22 ºC)

� Tiempo de incubación

� pH

Clasificación de los medios de cultivo

� Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento y medios enriquecidos)

� Medios de enriquecimiento

� Medios diferenciales

� Medios selectivos

� Medios cromogénicos

Ejemplos de medios de aislamiento primario o medios de crecimiento y medios enriquecidos

� Agar nutritivo � Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)� Agar triptona soja (TSA)� Agar sangreAgar chocolate� Agar chocolate

� Agar CLED (urocultivo)� Agar de Múeller-Hinton� Caldo de carne picada� Caldo tioglicolato

Agar BHIA (Infusión de cerebro y corazón )

Componentes

Extracto de cerebro

Extracto de corazón

Peptona

Dextrosa

Cantidad

7,8 g/l

9,7 g/l

10 g/l

2 g/l

Propiedad

Fuente de nutrientes

Fuente de nutrientes

Fuente de proteínas

Hidrato de carbono

Tampón fosfato

NaCl

Agar

2,5 g/l

5 g/l

15 g/l

Regulación pH

Sales

Agente solidificante

Objetivo

Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayoría de microorganismos no exigentes

Ausencia de agentes inhibidores

CLED (cistina-lactosa-deficiente en electrolitos

Componentes Cantidad

Digerido pancreático de gelatina 4 g/L

Digerido pancreático de caseína 4 g/L

Extracto de carne 3 g/L

Lactosa 10 g/L

L-cistina 0,128 g/LL-cistina 0,128 g/L

Azul de Bromotimol 0,02 g/L

Agar 15 g/L

Medio rico y selectivo

Específico para urocultivo

Deficiencia de electrolitos inhibe la movilidad de Proteus

Agar sangre� Triptona� Hidratos de carbono� NaCl� Tampón

Características y usos de algunos medios más frecuentemente utilizados

� Agar� 5% sangre desfibrinada

Medio enriquecido y selectivoMedio enriquecido y selectivo

Permite ver distintos tipos de hemolisis, es diferencial

Recuento de patógenos mediante la técnica de estría en placa

También se utiliza para cuantificación de resultados:

Estimación del número de microorganismos en la muestra microorganismos en la muestra original en función del crecimiento:

Crecimiento escaso

Crecimiento moderado

Crecimiento abundante

Recuento de patógenos mediante el uso del asa calibrada (u.f.c.)

Y también se utiliza para recuento de microorganismos mediante siembra con asa calibrada, recuento de unidades formadoras de colonias por mililito (u.f.c./mL)

Caldo con carne picada para cultivo de anaerobios

� Es un medio rico , pero es un caldo, un medio líquido

� Caldo con carne picada fuente de proteínas y nutrientes, potencial redox proteínas y nutrientes, potencial redox bajo (ambiente reductor)

� Añadido o no de glucosa

� Anaerobios (parafina líquida)

Ejemplos de caldos de enriquecimiento

Son medios líquidos que llevan una concentración baja de agentes inhibidores

Retrasan el crecimiento de los microorganismos comensales de la microbiota

Permiten enriquecer la muestra en un determinado patógeno que era menos abundante respecto al resto de la microbiota

� Caldo selenito Salmonella� Caldo tetrationato Salmonella y Shigella� Caldo Gram negativos Salmonella y Shigella

� Subcultivar en medios más selectivos al cabo de 6-8 horas

Caldo selenito

Componentes

Peptona

Lactosa

Selenito de sodio

Cantidad

5 g/l

4 g/l

4 g/l

Propiedad

Fuente de proteínas

Hidrato de carbono

Agente inhibidor de la mayoría de Enterobacterias, incluyendo muchas especies de Shigella

Fosfato de sodio 10 g/lTampón

Objetivo

Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas fecales, etc.

Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (agar SS o agar sulfito de bismuto)

Medios selectivos

� Llevan una concentración alta de agentes inhibidores

� Permiten crecer a unos microorganismos pero inhiben el crecimiento de otros

� Los agentes inhibidores son sustancias de diferente naturaleza química

Agentes inhibidores: colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina), antibióticos, metales (Se, Bi), sales biliares, azida, alcoholes (alcohol feniletílico), cloruro sódico a alta concentración

Ejemplos de medios selectivos

� Moderadamente selectivos� MacConkey� EMB

� Altamente selectivos� Agar salino manitol Staphylococcus

� Medio SS Salmonella y Shigella� Medio SS Salmonella y Shigella� Agar Hektoen Salmonella y Shigella� Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella� Agar xylosa-lisina-dexosicolato Salmolella y Shigella

� Agar PEA Gram positivos

� Agar Columbia CNA Gram positivos

Agar MacConkey

Componentes

Peptona

Polipeptona

Lactosa

Sales biliares (conc. moderada)

Cantidad

17 g/l

3 g/l

10 g/l

1,5 g/l

Propiedad

Fuente de proteínas

Fuente de proteínas

Azúcar fermentable

Inhibidor de gram positivos

Cristal violeta

NaCl

Rojo neutro

Agar

0,001 g/l

5 g/l

13,5 g/l

Inhibidor de gram positivos

sales

Indicador de pH

Agente solidificante

Objetivo

Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa

Diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa

Colonias rojas/rosa

Fermentadores de lactosa

Agar MacConkey

No patógenos (E. coli, Klebsiella, Citrobacter)

Colonias transparentes

No fermentan la lactosa

Patógenos (Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Yersinia,

Proteus)

Agar entérico Hektoen

Componentes

Peptona

Extracto de levadura

Sales biliares (alta conc.)

Lactosa

Sacarosa

Cantidad

12 g/l

3 g/l

9 g/l

12 g/l

12 g/l

Propiedad

Fuente de C y N

Fuente de N

Inhibidor de gram positivos

Azúcar fermentable

Azúcar fermentableSacarosa

NaCl

Tiosulfato de sodio

Citrato férrico amónico

Azul de timol

Agar

12 g/l

5 g/l

5 g/l

1,5 g/l

0,04 g/l

14 g/l

Azúcar fermentable

Sales

Fuente de azufre e inhibidor

Producción sulfuro Salmonella/ inhibidor

Indicador de pH

Agente solidificante

Objetivo: Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros bacilos entéricos gram negativos en muestras fecales

Propiedades diferenciales del medio Agar entérico Hektoen

Los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven amarillas. Los no fermentadores se ven incoloros. Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfuro. La mayoría de las especies de Shigella no producen sulfuro.

Medio agar salino manitol (agar de Chapman)

� Agente inhibidor

� NaCl al 7,5% sólo crecen Staphylococcus y Microccocus

� Incluye manitol y rojo fenol como � Incluye manitol y rojo fenol como indicador (medio diferencial)

� Los microorganismos que fermentan el manitol se observan como colonias amarillas

� Los que no fermentan el manitol se observan blancos o del color del medio

Componentes

Extracto de carne

Triptosa

Feniletanol

Cloruro de sodio

Cantidad

3 g/L

10 g/L

2,5 g/L

5 g/L

Propiedad

Fuente de C y N

Fuente de N

Inhibidor de Gram negativos

Estabilizador osmótico

Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Cloruro de sodio

Agar

5 g/L

15 g/L

Estabilizador osmótico

Agente solidificante

Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente

estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota

mixta. La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el

crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN.

Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.

El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que

también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y

perfumería. Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.

Agar Alcohol Feniletílico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se

convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias

anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una

microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram

negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.

Medios diferenciales

Permiten distinguir entre bacterias diferentes en base a un comportamiento bioquímico (p.e., fermentación o no de la lactosa, fermentación del manitol, producción o no de sulfuro, distintos tipos de hemolisis, etc.).

Pueden ser, a su vez, ricos, enriquecidos o selectivos

Ejemplos de medios diferenciales

� MacConkey (moderadamente selectivo y diferencial)� EMB (moderadamente selectivo y diferencial)� Agar CLED (no selectivo, medio rico y diferencial)� Agar sangre (no selectivo, medio enriquecido y diferencial)� SM, SS, HE, XLD (altamente selectivos y diferenciales)

� Agar sangre, CLED

� Agar XLD,EMB, MacConkey;SS; HE; ADC

� Agar SM

Medios cromogénicos

Medios diferenciales

Incorporan sustancias cromogénicas

Detección de actividades enzimáticas características

de determinados géneros o especies de bacterias

β- galactosidasa

β- glucosidasa

β- glucuronidasa

Producción de un color característico identificación

ONPG ONP + galactosa

Incoloro amarillo

β- galactosidasa

Ejemplos de medios cromogénicos

� CPS ID3� Chromogenic UTI (infecciones tracto urinario)� ChromAgar Orientation� UriSelect 4 (urocultivos)

� Identificación bacterias en infecciones urinarias� Tres tipos de enzimas� Se puede añadir triptófano (prueba del indol o TDA) se incrementa el número de microorganismos que se pueden identificar

Medios diferenciales cromogénicos para la identificación de bacterias en muestras de orina

E. coli Klebsiella pneumoniaeE. coli

Enterococcus faecalis

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Un ejemplo de medio cromogénico

ChromAgar Candida

Permite diferenciar e

MEDIOS CROMOGÉNICOS PARA LEVADURAS

Permite diferenciar e identificar tres especies de este género (colonias verdes, azules y transparentes)

Medios específicos

BCYE (agar tamponado con carbón

y extracto de levadura) Legionella

Bordet-Gengou Bordetella pertussis

Regan-Lowe Bordetella pertussis

Thayer-Martin Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae

New York City Neisseria gonorrhoeae y micoplasmas

genitales

Lowestein-Jensen Mycobacterium tuberculosis

CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina) Yersinia

TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) Vibrio cholerae

Pico de flauta de Loeffler Corynebacterium difteriae

Diamond Trichomonas vaginalis

Sabouraud Hongos

CCF, CCYE Clostridium difficile

Patógenos intracelulares obligados

� Crecen sólo dentro de las células� No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo� Treponema pallidum

Mycobacterium leprae

No se pueden cultivar en medios artificiales� Mycobacterium leprae

� (Legionella pneumophila BCYE)

� Cultivos de tejidos en el laboratorio

en medios artificiales

Cultivos celulares

� Cultivos primarios nº Cromosomas=2n� Células de riñón� Fibroblastos

� Líneas celulares continuas aberraciones en el nº de cromosomas aneuploidíael nº de cromosomas aneuploidía

� Hep-2, HeLa, Vero efecto citopático de latoxina de Clostridiumdifficile

� McCoy Clamidias� A-549, RD, MDCK Virus