Curso de Microbiología cap v

CAPÍTULO V

FISIOLOGÍA

BACTERIANACURSO DE MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS

UDLA

ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

OBJETIVOS

Conocer las particularidades fisiológicas, desarrollo y crecimiento de los

microorganismos y su importancia para la Biosfera.

Identificar las rutas metabólicas microbianas comunes a todos los organismos

vivos y específicas para estos, en especial las de obtención de energía.

Analizar los mecanismo de reproducción de microorganismos.

Comparar los mecanismos de motricidad microbiana con la de los organismos

eucariotas.

CONTENIDO

Fisiología bacteriana:

1. Crecimiento. Cinética microbiana

2. Metabolismo: Catabolismo y anabolismo. Rutas metabólicas

3. Nutrición: Procesos de membrana. Obtención de energía

4. Reproducción: Tipos

5. Movimiento.

CINÉTICA MICROBIANA

CRECIMIENTO MICROBIANO

“El crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales,

puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.

a) Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado

para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio.

b) División estocástica de la población, o división al azar.


MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO .

El cálculo del número de células que existen en una suspensión se

puede llevar a cabo mediante :

1. el recuento celular (microscopía),

2. número de colonias),

3. masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular,

turbidimetría) o

4. actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al

tamaño de la población).

Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos

directos y métodos indirectos.


Métodos directos:

Recuento del número

de células en una

cámara Thoma

Peso seco celular

Determinación de

nitrógeno o de

proteínas totales

Determinación de DNA


Métodos indirectos:

1. Recuento de colonias en placa

2. Recuento sobre filtro de membrana

3. Consumo de oxígeno

4. Liberación de dióxido de carbono

5. Concentración de un enzima constitutivo

6. Decoloración de un colorante

7. Incorporación de precursores radiactivos

8. Medida de la turbidez


El peso seco (contenido de sólidos) de las

células bacterianas que se encuentran en una

suspensión se obtiene por el secado de un

volumen en un horno a 105°C hasta peso

constante. Esta técnica es útil para grandes

volúmenes de muestra.

La desventaja de este método es que

componentes volátiles de la célula pueden

perderse por el secado y puede existir alguna

degradación.

También la muestra seca puede recobrar

humedad durante el pesado, principalmente si

el ambiente tiene una humedad relativa alta.


PESO ESPECÍFICO ANHIDRO:

ρ0 = Peso anhidro

Volumen Anhidro

PESO ESPECÍFICO A H% DE HUMEDAD

ρk = Peso al H% de humedad

Volumen al H% de humedad

Cuando la humedad es del 12 %,se llama peso

específico normal


ABSORCIÓN:

La nefelometría mide la luz dispersada por

una solución de partículas.

La turbidimetría mide la luz dispersada

como un decrecimiento de la luz

transmitida a través de la solución.

Los métodos de dispersión de la luz son las

técnicas más utilizadas para monitorear el

crecimiento de los cultivos bacterianos.


Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luzdebido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.


RECUENTO MICROSCÓPICO:

Para estos recuentos se utilizangeneralmente cámaras de recuentos,aunque también pueden realizarse apartir de muestras filtradas enmembranas y transparentes o teñidascon colorantes fluorescentes (Naranjade acridina).

Las cámaras más utilizadas son las deHawksley y la de Petroff-Hausser. Laprimera tiene la ventaja que puede serutilizada con objetivos de inmersión,aunque la mayoría de los recuentos serealizan con objetivos secos.


Recuento de microorganismos.

Tipo de cuadroArea

[cm2]

Volumen

[ml]

Factor

[1/Volumen]

Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107


CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO INTERMITENTE


La fase Lag, en la que el microorganismo se adapta a lasnuevas condiciones y pone en marcha su maquinariametabólica para poder crecer activamente. La duración deesta fase es variable y en general es mayor cuanto másgrande sea el cambio en las condiciones en las que seencuentra el microorganismo.

La fase de crecimiento exponencial. El número debacterias crece en forma exponencial en un tiemporelativamente corto


La fase estacionaria, en la que no hay aumento netode microorganismos, lo que no significa que no sedividan algunos, sino que la aparición de nuevosindividuos se compensa por la muerte de otros.

La fase de muerte, en la que el número demicroorganismos vivos disminuye de formaexponencial con una constante k que depende dediferentes circunstancias.

16


EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO .

la generación del producto se mantiene constante mientras la concentración delsustrato no sea limitante. Esto se definiría como

[ES] = [Et] [S]

[S] + (k2 + k -1) / k1

La velocidad inicial de la reacción está determinada por

v = k2 [ES]

Si definimos KM como (k2 + k -1) / k1 y Vmax como k2 [Et], obtenemos que

v = Vmax [S] / KM + [S]

Esta es la ecuación de Michaelis-Menten.


Estos últimos dos parámetros son importantes, porque nos dan información

directa sobre cuán bien el microorganismo se une al sustrato (KM) y sobre

cuán bien el microorganismo convierte el sustrato en producto una vez se une

(Vmax).

De hecho, KM es la constante de disociación dinámica del microorganismo con

el sustrato, y

Vmax es la concentración molar del microorganismo por la constante catalítica

(Kcat).

Km, es igual a la concentración de sustrato, bajo la cual la concentración

molar microbiana (velocidad de reacción);es igual a la mitad de la

concentración molar máxima. Cada sepa, se caracteriza por una valor de Km

específico.


RELACIONES MATEMÁTICAS:

En un cultivo estático con crecimiento

exponencial el tiempo de generación celular es

equivalente al tiempo de generación del cultivo y

viene dado por 1/k. En un quimiostato, el tiempo

de generación en cultivo es la inversa del ritmo de

crecimiento instantáneo de un cultivo, el cual se

expresa por la siguiente ecuación diferencial:

dx = μx ó μ= 1 dx

dt x dt


Donde x es el número de células o la concentración del organismo (miligramos

de peso seco por mililitro) a un tiempo t, y μ es el ritmo o velocidad de

crecimiento instantáneo. Con la integración de la ecuación anterior entre los

límites xo y xt, se obtienen la siguiente ecuación:

ln xt -ln xo = μt

o, como se expresa generalmente la solución,

Xf = xo e μt

μ = k(ln 2) = 0.693 k

Con esta fórmula, se puede calcular μ, el ritmo de crecimiento instantáneo para

un quimiostato, multiplicando k por 0.693

Tasa (µ) ideal de crecimiento

microbiano

21

Ecuación del proceso

La ecuación de un proceso aeróbico, muestra como el

conocimiento de la fórmula del contaminante, es

fundamental, para determinar la cantidad de O2. A

partir de la ecuación es factible hacer el cálculo

(extrapolación), del volumen de oxígeno necesario por

m3 de residuos.

22

CnHaObNc + (2n + 0,5 a - 1,5c –b)/2 O2→nCO2 + cNH3 + a-3c/2 H2O

Grafico construido a partir datos

experimentales

23

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

CO

NCEN

TRACIÓ

N E

N p

pm

ln UFC

DEGRADACIÓN VS UFC

TPHs

Ufc

Ejemplo de cálculo de tasa de

crecimiento microbiano

24

CEPAS 4 horas 24 Horas lnN1 lnN2 K

Cepa 132 160 3,40 5,07 0,081

Cepa 221 92 3,04 4,52 0,124

Cepa325 112 3,21 4,71 0,075

Cepa 415 63 2,70 4,13 0,071

Cepa 59 42 2,19 3,73 0,077

Cepa 641 85 3,71 4,44 0,036

Cepa 763 154 4,14 5,03 0,044

Cepa 86 41 1,79 3,71 0,126

Cepa 912 43 2,48 3,76 0,064

𝑲 =𝒍𝒏𝑵𝟐 − 𝒍𝒏𝑵𝟏

𝒕𝟐 − 𝒕𝟏

Conteo rutinario de control durante un proceso de

biorremediación

25

CEPAUfc x106

I II III IV V

Cepa 132 0,08 0,51 0,09 0,78

Cepa 221 1,10 1,80 2,60 3,70

Cepa325 0,70 0,40 0,80 0,95

Cepa 415 0,05 0,90 0,70 1,00

Cepa 59 0,03 0,20 0,50 0,84

Cepa 641 0,80 0,92 1,40 1,70

Cepa 763 0,70 0,92 1,10 1,20

Cepa 86 0,02 0,04 0,05 0,08

Cepa 912 0,03 0,80 0,67 0,97

Tiempo 24h 30 días 60 días 90 días 120 días

Ejemplo de cálculo de la Tasa de

Biodegradación

26

CepaMuestra A ppm Muestra B ppm

I II III IV V I II III IV V

X1 5000 4629 3731 2978 2120 850 837 819 798 720

X2 5000 4896 4662 4132 3700 850 652 387 105 78

X3 5000 4021 3657 2133 1867 850 812 779 721 720

X4 5000 4729 4119 3027 2630 850 845 832 812 801

X5 5000 4502 4194 3645 3112 850 827 814 802 798

X6 5000 4679 4510 4467 4230 850 721 413 156 94

X7 5000 4003 3729 2765 2079 850 691 396 138 97

X8 5000 4867 4622 4139 4002 850 800 784 726 710

X9 5000 4902 4762 4473 4137 850 770 625 251 112

Tiempo/días

0 30 60 90 120 0 30 60 90 120

27

Capa X1 Capa X2 Capa X3

lnCo/C=kt lnCo/C=kt lnCo/C=kt

Ln 5000/4629= 0,07

Ln 5000/3731=0,29

Ln 5000/2978=0,51

Ln 5000/2120=0,85

ln5000/4896= 0,02

ln5000/4662= 0,06

ln5000/4132= 0,19

ln5000/3700= 0,30

ln5000/4021= 0,21

ln5000/3657= 0,31

ln5000/2133= 0,85

ln5000/1867= 0,98

Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1

K=0,85-0,07/1-120

K=0,78/119

K= 0,0065

K=0,30-0,02/1-120

K=0,28/119

K= 0,0023

K=0,98-0,21/1-120

K=0,77/119

K= 0,0064



ln5000/4729= 0,05

ln5000/4119= 0,19

ln5000/3027= 0,50

ln5000/2630= 0,64

ln5000/4502= 0,10

ln5000/4194= 0,17

ln5000/3645= 0,31

ln5000/3112= 0,47

ln5000/4679= 0,06

ln5000/4510= 0,10

ln5000/4467= 0,11

ln5000/4230= 0,16


K=0,64-0,05/1-120

K=0,59/119

K= 0,0049

K=0,47-0,10/1-120

K=0,37/119

K= 0,0031

K=0,16-0,06/1-120

K=0,1/119

K= 0,00084



ln5000/4003= 0,22

ln5000/3729= 0,29

ln5000/2765= 0,59

ln5000/2079= 0,87

ln5000/4867= 0,02

ln5000/4622= 0,07

ln5000/4139= 0,18

ln5000/4002= 0,22

ln5000/4902= 0,019

ln5000/4762= 0,048

ln5000/4473= 0,11

ln5000/4137= 0,18


K=0,87-0,22/1-120

K=0,65/119

K= 0,0054

K=0,22-0,02/1-120

K=0,20/119

K= 0,0016

K=0,18-0,019/1-120

K=0,161/119

K= 0,0013

Variación de lnCo/C sustrato

28

X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9

lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,07 0,02 0,21 0,05 0,10 0,06 0,22 0,02 0,019

0,29 0,06 0,31 0,19 0,17 0,10 0,29 0,07 0,048

0,51 0,19 0,85 0,50 0,31 0,11 0,59 0,18 0,11

0,85 0,30 0,98 0,64 0,47 0,16 0,87 0,22 0,18

Variación comparativa de lnCo/c de

sustrato

29

Tiempo de vida media

30

X1 X2 X3

t= - ln (0,5)/0,0065

t= -(-0,69)/0,0065

t= 106,6 días.

t= - ln (0,5)/0,0023

t= -(-0,69)/0,0023

t= 300 días.

t= - ln (0,5)/0,0064

t= -(-0,69)/0,0064

t= 107,8 días.

X4 X5 X6

t= - ln (0,5)/0,0049

t= -(-0,69)/0,0049

t= 140,8 días.

t= - ln (0,5)/0,0031

t= -(-0,69)/0,0031

t= 222,5 días.

t= - ln (0,5)/0,00084

t= -(-0,69)/0,00084

t= 821,4 días.

X7 X8 X9

t= - ln (0,5)/0,0054

t= -(-0,69)/0,0054

t= 127,7 días.

t= - ln (0,5)/0,0016

t= -(-0,69)/0,0016

t= 431,2 días.

t= - ln (0,5)/0,0013

t= -(-0,69)/0,0013

t= 530,7 días.

Tiempos de vida media de los

residuos

31

Cepa TIEMPO (días) A TIEMPO (días)B

X1 106,6 575,0

X2 300,0 40,58

X3 107,8 690,0

X4 140,8 1533,3

X5 222,5 1916,6

X6 821,4 40,8

X7 127,7 43,2

X8 431,2 750,0

X9 530,7 43,1

Tiempos de vida comparativos

32

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tie

mp

o/d

ías

Cepa microbiana

Tiempos de vida comparativos de Sustrato A y SustratoB

TPHs

HAPs

Eficiencia comparativa

33

𝒀 = 𝑪𝒇 𝒙 100

𝑪𝒐

Cepa % A % B

X1 57,60 15,29

X2 26,00 90,80

X3 62,60 15,29

X4 47,40 5,76

X5 37,76 6,11

X6 15,40 88,94

X7 58,42 88,58

X8 19,96 16,47

X9 2,60 86,82

Testigo 0 0

RUTAS METABÓLICAS

Clasificación de los microorganismos

Según la fuente de carbono que

emplean

Según el punto de vista biosintético

Según la fuente de energía

QUIMIOTROFOS

ANABOLISMO Y CATABOLISMO

Dos procesos simultáneos, como la oxidación y reducción

ANABOLISMO Y CATABOLISMO

Una expresión del flujo permanente de materia y energía

Transformaciones biológicas del carbono

OXIDACIÓN BIOLÓGICA

Visión general

metabolismos

Metabolismo

intermedio

METABOLISMO INTERMEDIO

Biosíntesis de aminoácidos

Reacciones

de óxido

reducción

bacteriana

Alternativas

metabólicas

Obtención de ATP

Fosforilación de sustrato

Obtención de ATP

Flujo de electrones en la fosforilación oxidativa

Comparativo

de los dos

tipos de

fosforilización

Rutas del piruvato

Carboxilación del piruvato

CUESTIONARIO

Para qué es necesario la determinación de la tasa de crecimiento microbiano?

¿Qué importancia tiene la determinación del tiempo de vida media de u

sustrato?

¿Cómo se determina la tasa de degradación (consumo del sustrato) y cuál es

su importancia ambiental y práctica en ingeniería ambiental?

¿Cuál es la relación entre la curva de crecimiento microbiano y curva de la

tasa de degradación? ¿Que relevancia técnico legal tiene?

¿Cuál s le metabolito central de todo el metabolismo microbiano y por qué se

dice eso?

¿Cuáles son las etapas del esquema general del metabolismo?

¿Cuáles son las rutas que sigue el piruvato?

CUESTIONARIO

¿En qué se diferencian los dos tipos de fosforilación?

Esquemáticamente represente la cadena respiratoria y diga ¿cuál es su

importancia en el metabolismo biológico?

¿Qué tipo de reacciones de oxido reducción biológica se implementan en el

metabolismo intermedio?

¿Qué rol cumplen en el metabolismo NAD+, FAD+ y ADP?

Elabore un esquema que represente al anabolismo ligado al catabolismo.

¿Por qué acetil coenzima A es importante para la síntesis de proteína?

Elabore una tabla de clasificación de los microorganismos por la fuente de

energía que utilizan.

Cuestionario

¿Qué representa Km (Ks) y cuál es su importancia para ciencias ambientales?

Describa las etapas de la curva de crecimiento microbiano.

Diferencias entre medición turbidimétrica y nefelométrica.

Enumere los métodos indirectos de conteo microbiano

BIBLIOGRAFÍA

Jeffrey C. Pommerville. (2011). Alcamo´s Fundamental of Microbiology, Ninth

edition. Jones and Bartlett Publishers. Cap IV.

Kurt Konhauser. (2007). Introduction to Geomicrobiology. Blackwell

Publishing. Cap III.

Trivedi P.C. (2010). Text Book of Microbiology. Aavishkar Publishers. India.

Anne Maczulak. (2011). Encyclopedia of Microbiology. Facts On File, Inc.

Curso de Microbiología cap v

Education

Transcript of Curso de Microbiología cap v